Họ và tên: Nguyễn Hữu Ba

Mssv: 20211421
Mã lớp: 739273
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT THỰC PHẨM
Bài 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT
I. Mục đích thí nghiệm.
II. Cơ sở lý thuyết.
1. Canh trường tập trung
a. Định nghĩa
- Canh trường tập trung là canh trường trong đó một loài (hoặc vài loài) vi sinh vật
xác định chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng
- Từ canh trường tập trung ta có thể phân lập canh trường thuần khiết hoặc có thể sử
dụng nó trong sản xuất hoặc thí nghiệm.
b. Phương pháp phân lập canh trường tập trung
- Sử dụng môi trường chọn lọc hoặc điều kiện chọn lọc. Để có môi trường chọn lọc, ta
có thể thay đổi thành phần, nguồn các bon, nitơ, độ pH, nhiệt độ,môi trường,lưu
lượng khí được cấp
- Tuỳ đặc tính sinh lý của từng loài mà ta có những môi trường và điều kiện chọn lọc
khác nhau.
2. Canh trường thuần khiêt
a. Định nghĩa
Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả các vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ
một tế bào ban đầu. Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện từ canh
trường tập trung.
Nguyên tắc của việc phân lập vi sinh vật tạo canh trường thuần khiết là tách các tế bào
ra khỏi hỗn hợp tế bào trong mẫu vật nghiên cứu, để từ một tế bào riêng biệt đó phát
triển thành canh trường thuần khiết chỉ chứa những tế bào do nó sinh ra. Việc tách tế
bào và để tế bào riêng lẻ đó phát triển thành canh trường thuần khiết được thực hiện
bằng một trong những phương pháp dưới đây
b. Phương pháp phân lập vi sinh vật hiếu khí
- Phương pháp pha loãng môi trường lỏng: Phương pháp này do Pasteur đưa ra,
tiến hành như sau:
 Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn
 Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất
 Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai
 Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn...
Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là
tổ tiên cho canh trường thuần khiết.
Phương pháp này đơn giản dễ làm nhưng không phải bao giờ cũng bảo đảm, vì vậy nó
thường được dùng như giai đoạn đầu của các phương pháp phân lập khác.
- Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương pháp này là
tách tế bào trong mẫu vật ra thành từng tế bào riêng lẻ trên môi trường đặc, sau bđó
từ một tế bào phát triển thành khuẩn lạc mọc riêng lẻ. Cách tiến hành như sau:
 Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng dần đến mức độ nhất
định trong các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý (0.85%) đã vô trùng. Đem vật
phẩm đã pha loãng cấy trên môi trường thạch hộp đã vô khuẩn theo một trong các
cách sau:
 Dùng que cấy vòng cấy cấy như được mô tả ở bài 1
 Dùng pipet đưa một lượng canh trường nhất định vào hộp petri, sau đó dùng que
trang dàn đều vật gieo cấy trên mặt thạch hộp.
 Trộn vật gieo cấy vào ống thạch đã vô trùng và làm nguội đến 45 độ C, sau đó đổ
vào hộp Petri.
Phương pháp này có thể áp dụng để phân lập vi sinh vật có nhu cầu oxy thấp. Hạn
chế là không dùng để phân lập những vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ.
Trong ba cách trên thì hai cách sau hay dùng vì nó thường cho các khuẩn lạc riêng
biệt.
Gieo cấy xong, nuôi ở điều kiện thích hợp nhất cho loài vi sinh vật định phân lập.
Sau 1 - 2 ngày, đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy
lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch. Mỗi khuẩn lạc
cấy lên một ống. Sau đó nuôi ở nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần
khiết
 Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết quả tương đối đảm bảo.
 Nhược điểm và cách khắc phục: Khuẩn lạc có thể không phải phát sinh từ
một tế bào ban đầu mà nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu. Các khuẩn
lạc lúc mới mọc thì riêng lẻ nhưng để để quá thời gian chúng lại dính liền
nhau. có thể khắc phục bằng cách phân lập như trên vài lần, đồng thời làm
tiêu bản để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách. Khi nuôi vi sinh vật
trên đĩa Petri, đĩa Petri được đặt sao cho phần đáy nhỏ chứa thạch hướng lên
trên vì nếu để ở vị trí ngược lại, hơi nước sinh ra trong quá trình nuôi ngưng
tụ trên nắp đĩa Petri rơi xuống bề mặt thạch, có thể làm loang khuẩn lạc ra
khắp mặt thạch và không còn là những khuẩn lạc riêng biệt nữa.
- Phương pháp tách từng tế bào: Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có
kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc. Có thể thực hiện theo cách
sau:
 Tách từng giọt chỉ chứa một tế bào có kiểm tra bằng kính hiển vi:
 Pha loãng canh trường vi sinh vật bằng các ống nghiệm chứa môi trường
lỏng vô khuẩn. Pha loãng đến mức là trong mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai
tế bào vi sinh vật.
 Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulator)
Ưu điểm: Phương pháp này tương đối nhanh chóng, chính xác nhưng đòi hỏi
cẩn thận, khéo léo.
3. Phương pháp phân lập vi sinh vật yếm khí
a. Tủ nuôi yếm khí: phân lập bằng những phương pháp trên sau đó đem
nuôi trong tủ nuôi yếm khí
 b. Pipet pasteur
- Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ nhất định
- Lấy một giọt của canh trường pha loãng cuối cùng cho vào ống thạch
(đã đun chảy trước và làm nguội đến 45 – 50 độ C lắc đều.
- Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói trên vào pipet Pasteur rồi
dùng đèn cồn hàn kín đầu nhỏ của pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích
hợp
- Sau 1 - 2 ngày các khuẩn lạc của vi sinh vật sẽ mọc trong ống thạch
- Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho
vào môi trường nuôi cấy thích hợp.
Động tác này phải tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng, ngoài
ra, để nhận biết vùng có vi sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm
vào ống thạch 0,2% indigocacmin. Những vùng có vi sinh vật phát
triển indigocacmin bị khử và chuyển thành màu vàng.
c. Sử dụng hộp petri lộn ngược
- Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên
- Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy nhỏ của hộp lên lớp
thạch, sau đó dùng paraphing bôi xung quanh mép hộp. (Hộp petri đã
vô trùng và đặt lộn ngược trước).
- Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách thạch có khuẩn lạc đem
cấy vào môi trường thích hợp
d. Sử dụng phương pháp đổ thạch hai lớp
- Pha loãng rồi cấy bằng pipet lên hộp petri có sẵn môi trường
- Dùng que trang dàn đều canh trường
- Đổ thêm một lớp thạch đã đun sôi và để nguội để tạo môi trường yếm
khí

III. Tiến hành thí nghiệm.

1. Mẫu phân lập
- Vi sinh vật hiếu khí: Men thuốc Bắc_ môi trường đặc,cần hòa tan trong môi trường
lỏng và sử dụng phương pháp pha loãng
- Vi sinh vật yếm khí: Sữa chua Yakult_môi trường lỏng-sử dụng phương pháp pha
loãng mẫu và đổ thạch hai lớp.
2. Chuẩn bị môi trường: Trong thí nghiệm này chuẩn bị môi trường và khử
trùng môi trường để chuẩn bị cho nhom thi nghiệm sau. Các thiết bị, bình tam
giác(99ml), ống falcon(35ml),môi trường MRS,Crapek đều đã được chuẩn bị
trước. Môi trường Agar được sử dụng sau khi thanh trùng xong.
a. Pha chế môi trường hiếu khí: Môi trường Czapek_Tinh bột
- 250ml môi trường Czapek thay saccharose bằng tinh bột hoà tan ( chia làm 4 phần
cho 4 nhóm: 3 bình tam giác 60ml, 1 bình tam giác 70ml). Vì tinh bột không tan
nên phải cân riêng. Sau khi bổ sung tinh bột thì ta thêm 2% khối lượng agar theo
thể tích môi trường (60ml thì thêm 1,2g agar; 70ml thì thêm 1,4g agar). Các thành
phần bao gồm:
• 7,5g tinh bột
• NaNO3: 0,5g
• KCl: 0,125g
 • KH2PO4: 0,25g
• MgSO4 :0,125g
• FeSO4 : 0,0025g
• Nước: 250ml
b. Pha chế môi trường yếm khí: Môi trường MRS_CaCO3
- Cân 13,7875g hỗn hợp môi trường MRS đã pha chế sẵn trên cân điện tử. Sau đó cho
vào cốc thủy tinh 500ml. Cho vào cốc 150ml nước cất,sử dụng đũa thủy tinh khuấy
đều để hỗn hợp tan hết trong cốc. Đổ dung dịch này vào ống đong, sử dụng 100ml
để tráng rửa cốc, đũa thủy tinh và định mức đến 250ml dung dịch.
- Phân phối 250ml dung dịch vào 4 bình tam giác với thể tích lần lượt là 60-60-60-
70ml. Cân CaCO3 trên cân điện tử với lượng 0,3g/60ml và 0,35g/70ml cho vào
những bình tam giác tương ứng.
- Bổ xung thêm Agar với lượng 1.2g/60ml và 1,4g/70ml vào các bình tam giác tương
ứng. Đậy nắp bằng nút bông,bao cuốn bên ngoài bình bằng giấy báo.
c. Pha chế môi trường thạch Agar
- Sử dụng ống đong đong lấy 50ml nước cất đưa vào bình tam giác. Chuẩn bị 4 bình
tam giác chứa 50ml nước cất. Bổ xung thêm vào mỗi mình 1,5% Agar tương ứng là
0,75g Agar cho mỗi mình tam giác trên. Đậy nắp bằng nút bông và bao gói bên
ngoài bằng giấy báo
d. Chuẩn bị bình tam giác pha loãng mẫu(99ml) và ống falcon(35ml)
- Chuẩn bị 4 bình tam giác, đong vào mỗi bình 99ml nước cất,đậy bằng nút bông, bao
gói bên ngoài bằng giấy báo.
- Chuẩn bị 4 ống falcon, mỗi ống thêm vào 35ml nước cất , đậy kín.
e. Khử trùng môi trường: Đưa tất cả các bình tam giác chứa môi trường
Czapek,MRS, Agar, ống falcol, bình chứa 99ml nước cất đi thanh trùng
trong thiết bị thanh trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất.
3. Pha loãng mẫu: Sử dụng bình tam giác chưa nước cất đã vô trùng được
chuẩn bị trước.
a. Mẫu vi sinh vật hiếu khí
- Nghiền khoảng 3g mẫu trên cối. Sau khi nghiền nhuyễn, cân lấy 1g mẫu hòa vào
bình tam giác chứa 99ml nước cất, lắc đều cho mẫu tan hết trong dung dịch.
- Dùng pipette 1000 lấy 0,9ml nước trong ống falcon (35ml) vào 4 ống effendorf
- Dùng pipette 100 lấy 0,1ml mẫu vào ống effendorf đầu tiên(10-3), pha loãng theo
hệ số 10 đến độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, đánh dấu trên tứng ống effendorf. Sau
mỗi lần lấy thì cần thay đầu côn và lắc đều các ống effendorf bằng votex.
b. Mẫu vi sinh vật yếm khí
- Sử dụng pipet 1000 lấy 0,9ml nước trong ống falcon vào 6 ống effendorf
- Sử dụng pipet 100 lấy 0,1ml sữa chua cho vào ống effendorf đầu tiên, lắc đều bằng
votex, đánh dấu là -1( 10-1), Thực hiện thao tác tương tự để pha loãng theo hệ số 10
đến độ pha loãng 10-4,10-5,10-6. Đánh dấu trên từng ống effendorf. Sau mỗi lần lấy
thì đều thay đầu côn và lắc đều ống effendorf bằng votex
4. Phân lập
a. Phân lập vi sinh vật hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp amylase
- Vệ sinh tay và môi trường xung quanh trước khi gieo cấy
- Bật ngọn lửa đèn cồn, trước khi gieo cấy, ta lật ngược hộp petri xuống, ghi tên
nhóm, ngày gieo cấy, độ pha loãng
 - Sử dụng pipette hút 0,1ml dung dịch từ các effendorf 10-6, 10-5, 10-4 ra hộp petri
chứa môi trường Czapek-tinh bột, sử dụng que trang đã vô trùng trang đều cho đến
khi dung dịch hơi dít lại, không còn mượt nữa (trước khi dùng pipette hút ta sử
dụng votex lắc đều các ống effendorf và nhớ thay đầu côn cho mỗi ống)
b. Phân lập vi sinh vật yếm khí sử dụng phương pháp đổ thạch hai lớp
- Vệ sinh tay và môi trường xung quanh khu vực gieo cấy
- Bật đèn cồn, thao tác trên ngọn lửa đèn cồn
- Chuẩn 3 hộp petri chứa môi trường MRS, ghi tên nhóm, độ pha loãng và ngày nuôi
cấy dưới bề mặt hộp, dùng pipette hút 0,1ml dung dịch ở ống 10-6, 10-5, 10-4 rồi
cho vào giữa hộp petri, dung que trang trang đều đến khi bề mặt dít lại, sau đó ta
đổ lớp thạch agar lên ( khi nhiệt độ vừa đủ, nếu nóng quá sẽ làm chết vi sinh vật,
còn nguội quá thạch sẽ đông lại khó đổ hơn )
- Đợi lớp thạch đông, ta đem gói lại, ghi tên nhóm, ngày nuôi, yếm khí lên vỏ bao
gói, đưa vào tủ nuôi tĩnh 300C, từ 2-4 ngày.
5. Nuôi trong tủ nuôi: Bọc giất kín hộp petri và nhớ khi tên nhóm, ngày nuôi,
loại vi sinh vật .Nuôi cấy trong tủ nuôi tĩnh tại 30 oC, trong 2 ngày, quan sát
khuẩn lạc, nhận xét
IV. Kết quả và thảo luận.
1. Kết quả nuôi cấy:
a. Vi sinh vật hiếu khí

Độ pha loãng 10-4

Độ pha loãng 10-5

Độ pha loãng 10-6

 - Độ pha loãng 10-4: Xuất hiện những khuẩn lạc nhỏ hình tròn phân bố không
đều rất khó để quan sát được. Các khuẩn lạc phân bố không đều có thể do thao
tác chang không đều. Bên cạnh đó còn xuất hiện những khuẩn lạc hình sợi tập
trung với nhau vào một chỗ.
- Độ pha loãng 10-5: Có xuất hiện những khuẩn lạc hình tròn nhỏ, khó quan sát
được.
- Độ pha loãng 10-6: Có xuất hiện khuẩn lạc hình tròn nhỏ khá ít phân bố không
đều và rất khó để nhìn thấy
b.Vi sinh vật yếm khí

Độ pha loãng 10-4

- Độ pha loãng 10-4: Xuất hiện các khuẩn lạc hình tròn phân bố không đồng đều, có
những khuẩn lạc dính vào nhau tạo thành các cụm. Nguyên nhân là do thao tác trong
quá trình chang không đều khiến cho các khuẩn lạc phân bố không đều dình vào. Bên
cạnh đó còn có các khuẩn lạc có kích thước lớn hơn xuất hiện.
 Độ pha loãng 10-5
- Pha loãng 10-5: Xuất hiện các khuẩn lạc hình tròn phân bố không đều tập trung
chủ yếu ở giữa hộp. Có một số khuẩn lạc bị dính lại với nhau thành cụm có thể do
thao tác chang không đều. Bên cạnh đỏ có xuất hiện các bọt khí của lớp thạch
khiến chúng ta khó quan sát hơn do quá trình lắc làm nguội môi trường Agar quá
mạnh tạo nên bọt khí. Có thể khắc phục bằng cách sử dụng pipet với đầu tip vô
trung hút các bong bóng khí này đi trước khi đổ thạch
 Độ pha loãng 10-6
- Pha loãng 10-6: Xuất hiện các khuẩn lạc nhưng có kích thước không đều, phân bố
không đều có các khuẩn lạc dính vào nhau. Nguyên nhân có thể do trong quá trình
gieo cấy chang không đều, thao tác không chuẩn. Xuất hiện thêm khuẩn lạc phía bên
trên 2 lớp thạch,to lớn hơn khuẩn lạc bình thường rất nhiều điều này chứng tỏ đây
không phải là loại vi khuẩn yếm khí đang nuôi cấy. Đây là vi sinh vật hiếu khí đã
nhiễm vào mẫu nghiên cứu trong quá trình thao tác
- Sơ bộ đã phân lập Vi sinh vật thành công.
2. Thảo luận
- Thí nghiệm về cơ bản là thành công, đã quan sát được các khuẩn lạc
- Khuẩn lạc còn dính vào nhau và phân bố không đều do trang chưa đều và chưa khô
- Chưa đảm bảo quá trình gieo cấy vô trùng, bằng chứng là trên mặt thạch xuất hiện các
khuẩn lạc to lớn hơn bình thường, màu sắc khác lạ.
- Ở các hộp Petri nuôi cấy vsv yếm khí ít khuẩn lạc do đổ lớp thạch trên không đều và
đổ lúc còn nóng.
- Khi sử dụng que trang có lúc quên không hơ qua ngọn lửa đèn cồn.
- Sau bài thí nghiệm
 Hiểu rõ phương pháp pha loãng để phân lập vi sinh vật, các dụng cụ cần thiết
để phân lập vi sinh vật.
 Nắm rõ được quy trình và thực hành phân lập vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí