บทที่ 3

วัสดุอุปกรณ์ และวิธีการทดลอง

3.1 วิธีดำเนินการวิจัย

ในการศึกษานี้ใช้แผนการทดลองแบบสุ่มอย่างสมบูรณ์ (Completely
Randomized Design; CRD) มีการใช้ถั่วเขียวทั้งหมด 10 พันธุ์/สาย
พันธุ์ และลักษณะเฉพาะและต้นกำเนิดได้อธิบายไว้ใน ตารางที่

แปลตาราง

พันธุ์/สาย ต้น
แหล่งที่มา ลักษณะเฉพาะ
พันธุ์ กำเนิด

a
Selection from mutated Thaila
CN3 Large seed, high yield, uniform maturity
CN36 nd

b
Thaila High yield, high suitability for harvest, moderate
SUT1 UTHONG1 x NP-29 d e
nd resistance to PM and CLS
Selection from mutated Thaila
CN84-1 Large seed, high yield, high percentage of starch
CN36 nd
Development from
double cross lines
f
c
[(CN72×V4758 ) × Thaila
S5 f
High resistance to PM and CLS
(CN72×V4718 )] × nd
[(CN72×V4718) ×
f
(CN72×V4785 )]
P08 Selected from Thaila Large seed, uniform maturity, moderate resistance
backcrossing between nd to PM and CLS
P12 CN84-1 and double Thaila Large seed, high yield , uniform maturity, rather
 drought tolerlance, high resistance to PM,
nd
moderate resistance to CLS
Thaila High yield, uniform maturity, moderate resistance
P22
cross lines nd to PM and CLS
[(CN72×V4758) × Thaila Large seed, uniform maturity, moderate resistance
P24
(CN72×V4718)] × nd to PM and CLS
Selected from
backcrossing between
CN72 and double cross
lines [(CN72×V4758) × Thaila High seed weight per plant, high suitability for
W5
(CN72×V4718)] × nd harvest, high resistance to PM and CLS
[(CN72×V4718) ×
(CN72×V4785)]

Selected from
backcrossing between
SUT1 and double cross
lines [(CN72×V4758) × Thaila High yield, high suitability for harvest, trichomeless
D5
(CN72×V4718)] × nd pods, moderate resistance to PM and CLS
[(CN72×V4718) ×
(CN72×V4785)]

Selected from
backcrossing between
g
King and double cross
Thaila Large seed, high suitability for harvest, trichomeless
H3 lines [(CN72×V4758) ×
nd pods, moderate resistance to PM and CLS
(CN72×V4718)] ×
[(CN72×V4718) ×
(CN72×V4785)]
a b
The certified mungbean varieties from Chainat Field crops research center, Thailand, The certified
c
mungbean varieties from Suranaree University of Technology, Thailand, The mungbean resistant lines
 d e
developed by Pookhamsak et al. (unpublished data), Thailand, Powdery midew, Cercospora leaf spot,
f g
and The mungbean lines originated from India. The mungbean variety originated from Australia.

3.2 วัสดุอุปกรณ์ (มีชื่อไทย+ภาษาอังกฤษทั้งหมด)

3.2.1 เครื่องชั่งทศนิยม 2 ตำแหน่ง
3.2.2 เครื่องชั่งทศนิยม 4 ตำแหน่ง
3.2.3 ไม้บรรทัด
3.2.4 เวอร์เนียคาลิปเปอร์ (Vernier Calipers)
3.2.5 กระดาษเพาะเมล็ด
3.2.6 แกลบดำ
3.2.7 ขุยมะพร้าว
3.2.8 ถุงกระดาษ
3.2.9 ถาดเพาะไมโครกรีน
3.2.10 บีกเกอร์ (Beaker)
3.2.11 ตู้อบลมร้อน (Hot air oven)
3.2.12 Hotplate
3.2.13 โถดูดความชื้น (Desiccator)
3.2.14 จานเพาะเลี้ยง (Petri dich)
3.2.15 บิวเรตต์ (Burette)
3.2.16 หลอดเจลดาห์ล (Kjeldahl tube)
3.2.17 กระดาษกรอง
3.2.18 Furnace
3.2.19 Crucible
 3.2.20 ขวดรูปชมพู่ (Erlenmeyer flask)
3.2.21 ถาดอลูมิเนียม
3.2.22 Cellulose thimble
3.2.23 Extraction beaker
3.2.24 เครื่องสกัดไขมัน (Soxtex 2050)
3.2.25 ชุดวิเคราะห์โปรตีน (Protein Analyzer and
Accessories)
3.2.26 เครื่องวิเคราะห์เยื่อใยอาหาร (Fibertec 8000)
3.2.27 ตู้ควบคุมสภาพแวดล้อม (Growth chamber)

3.3สารเคมีที่ใช้ในการทดลอง
3.3.1 กรดซัลฟิ วริก
3.3.2 ตัวเร่ง (สารผสมระหว่าง copper sulfate : potassium
sulfate อัตราส่วน 1:10)
3.3.3 Methyl red
3.3.4 Bromocresol green
3.3.5 Boric acid
3.3.6 NaOH
3.3.7 HCl
3.3.8 ปิ โตรเลียมอีเธอร์
3.3.9 Acetone
 3.3.10 N-octanol

3.4 วิธีการทดลอง
3.4.1 การเตรียมตัวอย่างพืช
ล้างทำความสะอาดเพื่อกำจัดสิ่งสกปรก นำเมล็ดใส่ในบีกเกอร์
เติมน้ำอุ่นอุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส จากนั้นแช่ทิ้งไว้นาน 8 ชั่วโมง
3.4.1.1.1 การเพาะถั่วงอก: หลังจากแช่เมล็ดแล้ว นำมาเพาะ
ถั่วงอกโดยใช้วิธี Between paper เรียงเมล็ดให้กระจาย
สม่ำเสมอ 50 เมล็ดต่อแผ่น ใส่ลงในกล่องพลาสติกป้ องกัน
แสง วางไว้ในตู้ควบคุมสภาพแวดล้อมอุณหภูมิ 25 องศา
เซลเซียส รดน้ำปริมาณ 1 ลิตร 2 ครั้งเช้าและเย็นเป็ น
เวลา 72 ชั่วโมงหรือ 3 วัน
3.4.1.1.2 การเพาะไมโครกรีน: ผสมขุยมะพร้าวกับแกลบดำ
ในอัตราส่วน 1:1 โดยปริมาตร แล้วคลุกเคล้าให้เข้ากัน นำ
วัสดุที่คลุกเคล้าแล้วนำมาใส่ถาดเพาะไมโครกรีนและเกลี่ย
วัสดุปลูกให้เรียบ จากนั้นโรยเมล็ดถั่วเขียวที่ผ่านการแช่ลง
ในถาดเพาะไมโครกรีน กระจายเมล็ดให้มีความสม่ำเสมอ
กลบด้วยวัสดุปลูกบาง ๆ วางถาดเพาะในตู้ควบคุม
อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียล รดน้ำให้ชุ่มตลอดเวลา โดย
เก็บไว้ในที่มืดนาน 3 วัน และให้แสงสว่างด้วยแสงเทียม
 (artificial light) ตลอดเวลานาน 4 วัน รวมเป็ นระยะ
เวลา 7 วัน
3.4.2 การบันทึกข้อมูลลักษณะทางสัณฐานวิทยา

ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของถั่วงอกและไมโครกรีนทำการเก็บ
ข้อมูลทั้งหมด 6 ซ้ำ แต่ละซ้ำประกอบไปด้วย 20 ตัวอย่าง

3.4.2.1 ถั่วงอก
3.4.2.1.1 ความยาวของลำต้นของถั่วงอกวัดด้วยไม้บรรทัดจาก
บริเวณโคนรากจนถึงปลายยอด
3.4.2.1.2 ความยาวรากของถั่วงอกวัดด้วยไม้บรรทัดบริเวณ
โคนรากจนถึงปลายราก
3.4.2.1.3 ความกว้างลำต้นของถั่วงอกวัดด้วยเวอร์เนียคาลิป
เปอร์บริเวณกึ่งกลางของลำต้น
3.4.2.2 ไมโครกรีน
3.4.2.2.1 การวัดความยาวลำต้นของไมโครกรีนวัดด้วย
ไม้บรรทัดตั้งแต่โคนรากถึงปลายยอด
3.4.2.2.2 ความยาวใบของไมโครกรีนวัดด้วยไม้บรรทัด จาก
บริเวณโคนใบถึงปลายใบ
3.4.2.2.3 ความกว้างใบของไมโครกรีนวัดด้วยไม้บรรทัด จาก
บริเวณจุดที่กว้างที่สุดของใบ
 3.4.3การบันทึกข้อมูลลักษณะกายภาพ ไปเรียบเรียงมาใหม่, จัด
ย่อหน้า, จัดหมายเลข, เช็คคำผิด, แก้สมการให้เป็ นรูปแบบ
เดียวกัน, ไม่ต้องก๊อปมาทั้งหมด
3.1 ความชื้น
ชั่งตัวอย่างใส่ในภาชนะหาความชื้นที่ทราบน้ำหนักแน่นอน นำ
ไปใส่ในตู้อบลมร้อน (Hot air oven) ที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียส
นาน 3 ชั่วโมง นำตัวอย่างใส่ในโถดูดความชื้นนาน 30 นาที จนกระทั่ง
อุณหภูมิภาชนะเท่ากับอุณหภูมิห้อง จากนั้นนำภาชนะพร้อมตัวอย่าง
ไปชั่งน้ำหนักด้วยเครื่องชั่งทศนิยม 4 ตำแหน่ง อบซ้ำที่อุณหภูมิ 105
องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง หรือจนกระทั่งน้ำหนักสองครั้งแตกต่าง
กันไม่เกิน 3 มิลลิกรัม
การคำนวณ
ปริมาณความชื้น = W2-
W3x100
(เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก) W2-W1
W1 คือ น้ำหนักของภาชนะสำหรับหาความชื้น (กรัม)
W2 คือ น้ำหนักของภาชนะสำหรับหาความชื้นพร้อมตัวอย่างก่อนอบ
(กรัม)
W3 คือ น้ำหนักของภาชนะสำหรับหาความชื้นพร้อมตัวอย่างหลังอบ
(กรัม)
 3.2 การคำนวณ Output ratio
การคำนวณ
Output ratio = น้ำหนักผลผลิตสด / น้ำหนักเมล็ด

1. การวิเคราะห์คุณค่าทางโภชนาการ
4.1 การเตรียมตัวอย่าง
นำตัวอย่างพืชอบที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียส ประมาณ 2-3
ชั่วโมง ทำให้เย็นใน โถดูดความชื้น (Desiccator) และบดให้ละเอียด
เป็ นผง ร่อนด้วยตะแกรงขนาด 1 มิลลิเมตร เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20
องศาเซลเซียส เพื่อนำไปวิเคราะห์ ปริมาณเส้นใยหยาบ ปริมาณเถ้า
และปริมาณไขมัน นำตัวอย่างพืชอบที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส
นาน 24 ชั่วโมง และบดให้ละเอียด ร่อนผ่านตะแกรงขนาด 1
มิลลิเมตร เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส เพื่อนำไปวิเคราะห์
ปริมาณโปรตีน

4.2 ปริมาณโปรตีน

นำตัวอย่างน้ำหนัก 1.00 กรัม ใส่ลงในหลอดเจลดาห์ล เติมตัว

เร่งผสม 3.00 กรัม และ conc. H2SO4 ปริมาณ 20 มิลลิลิตร จากนั้น
นำตัวอย่างไปย่อยด้วยเครื่อง Digestion System ที่อุณหภูมิ 280
องศาเซลเซียส นาน 45 นาที หลังจากนั้นเพิ่มอุณหภูมิเป็ น 380 องศา
เซลเซียส ย่อยต่อไปอีก 2 ชั่วโมง จนได้สารละลายสีฟ้ าใส ทิ้งไว้ให้เย็น
 ประมาณ 20 นาที จากนั้นเตรียมการกลั่นโปรตีน โดยเตรียม 4%
boric acid ที่ผสม Mixed Indicator ปริมาณ 60 มิลลิลิตร ใส่ลงใน
ขวดรูปชมพู่ ใส่หลอดตัวอย่างกับเครื่องซ้ายมือให้หลอดสวมกับลูกยาง
พอดี ใส่ขวดบอริกซ้ายมือวางบนแท่นวางให้หลอดจุ่มในสารละลาย
ตลอดจากนั้นทำการกลั่นตัวอย่าง นำสารละลายที่กลั่นได้ไทเทรตด้วย
0.1 M HCl จุดยุติสารละลายจะมีสีม่วง บันทึกปริมาณ HCl ที่ใช้

การคำนวณ
ปริมาณโปรตีน (%) = (A-B)×N×1.4007×F
Wt

A คือ ปริมาตรของกรด HCl ที่ใช้ในการไทเทรตกับ ตัวอย่าง

(มิลลิลิตร)

B คือ ปริมาตรของกรด HCI ที่ใชในการไทเทรตกับ blank (มิลลิลิตร)

Wt คือ น้ำหนักของตัวอย่าง N = ความเข้มข้นของกรด HCI (N)

F คือ ค่าแฟคเตอร์ (factor ในถั่วเขียว = 6.40)

4.3 ปริมาณเส้นใยหยาบ

ชั่งตัวอย่างที่บดแล้วประมาณ 0.5-1.0 กรัม ใส่ใน crucible

และนำตัวอย่างไปวางบน crucible stand นำ crucible ใส่ในเครื่อง
ย่อย (hot extraction unit) เติม 1.25% Sulfuric acid หลอดละ
150 ml เติม n-Octanol antifoam 3-5 หยด กรองสารและล้างด้วย
น้ำร้อน 3 ครั้ง เติม NaOH 1.25% หลอดละปริมาณ 150 มิลลิลิตร
ต้มตัวอย่างจนเดือด จับเวลา 45 นาที กรองสารและล้างด้วยน้ำร้อน 3
ครั้ง ล้างด้วย Acetone ปริมาณ 2-3 ครั้ง ๆ ละปริมาณ 25 มิลลิลิตร
นำ Crucible อบที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียส นาน 2 ชั่วโมง และ
ทำให้เย็นใน โถดูดความชื้น (Desiccator) นาน 20 นาที เผาถ้วย
กระเบื้องพร้อมตัวอย่างที่อบในเตาเผาที่อุณหภูมิ 550 องศาเซลเซียส
นาน 2 ชั่วโมง ทำให้เย็นใน โถดูดความชื้น (Desiccator) นาน 20
นาที ชั่งน้ำหนัก

การคำนวณ

ปริมาณเส้นใย (% โดยน้ำหนัก) =
W2-W3 × 100
W1
W1 คือ น้ำหนักตัวอย่าง (กรัม)
W2 คือ น้ำหนักตัวอย่างหลังการอบแห้ง (กรัม)
W3 คือ น้ำหนักตัวอย่างหลังการเผา (กรัม)

4.4 ปริมาณเถ้า (AOAC, 2000)

อบ Crucible ที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียสนาน 20 นาที ชั่ง

น้ำหนักบันทึกผล ชั่งตัวอย่างประมาณ 3 กรัม ใส่ลงในถ้วยกระเบื้อง
เคลือบ เผาบนเตาไฟฟ้ าจนหมดควันและนำไปเผาที่อุณหภูมิ 550
องศาเซลเซียสนาน 3 ชั่วโมง หรือจนกระทั่งได้เถ้าสีเทาอ่อน หรือสี
ขาวสม่ำเสมอ นำออกจากเตาเผาปล่อยให้เย็น ใน โถดูดความชื้น
(Desiccator) นาน 30 นาที และชั่งน้ำหนักบันทึกผล

การคำนวณ
ปริมาณเถ้า (%) = (W2-W1) × 100
S
W1 คือ น้ำหนัก Crucible
W2 คือ น้ำหนัก Crucible และตัวอย่างหลังอบ
S คือ น้ำหนักตัวอย่าง

4.5 ปริมาณไขมัน

ชั่งน้ำหนัก Extraction beaker จากนั้นอบที่อุณหภูมิ 105

องศาเซลเซียส นาน 20 นาที และทำให้เย็นในโถดูดความชื้น
(Desiccator) ชั่งน้ำหนักตัวอย่างปริมาณ 1 กรัม ใส่ลงในกระดาษ
กรอง จากนั้นพับกระดาษกรองพร้อมตัวอย่างใส่ใน Cellulose
thimble เติมปิ โตรเลียมอีเธอร์ปริมาณ 125 มิลลิลิตร ลงใน
extraction beaker ปริมาณ 125 มิลลิลิตร นำบีกเกอร์ที่มีไขมันอบ
ให้แห้งนาน 1 ชั่วโมง ในตู้อบที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียส ทำให้เย็น
ในโถดูดความชื้น (Desiccator และชั่งน้ำหนักบีกเกอร์ที่มีไขมัน

การคำนวณ
ร้อยละของไขมัน = (B - A) x 100
W
 W คือ น้ำหนักตัวอย่างที่ทำการทดสอบ
A คือ น้ำหนักคงที่ของ extraction beaker
B คือ น้ำหนัก extraction beaker และไขมันที่สกัดได้

4.6 ปริมาณแป้ ง

วิเคราะห์ปริมาณคาร์โบไฮเดรต ด้วยวิธีการของ Hailu (2018)

โดยคำนวณจากการหักค่าองค์ประกอบเคมีอื่นๆ
การคำนวณ
คาร์โบไฮเดรต (%) = 100 – (เปอร์เซ็นต์
ความชื้น+โปรตีน+ไขมัน+เยื่อใย+เถ้า)
2. วิธีการวิเคราะห์ข้อมูล

ทำการวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติตามแผนการทดลอง
Completely Randomized Design (CRD) โดยใช้โปรแกรมทางสถิติ
SPSS version 16.0 (Levesque and SPSS, 2006)