HOOFDSTUK 9: Biotechnologie

Wat roept dit begrip bij jou op?

1
Inleiding

→Vooraf: mutaties: genoom-, chromosoom- en genmutaties

*Chromosoommutatie: genen of fragmenten ervan kunnen blijkbaar

verplaatst worden in het genoom en eventueel terug ingebouwd
worden op andere plaatsen.
*Crossing-over

Deze natuurlijke genoverdracht deed het onderzoek ontstaan om deze

eigenschappen gecontroleerd te kunnen uitvoeren: kunstmatige genoverdracht.
De hierbij gebruikte technieken behoren tot het domein van de biotechnologie;

het gebruik van levende organismen of delen ervan, om producten te maken(1)

of te wijzigen, planten of dieren aan te passen(2) of micro-organismen te
wijzigen voor specifieke doeleinden(3°)

1° kaas, wijn, bierbereiding,….

2° gewasbescherming tegen vraat, tegen herbiciden,…

Hogere voedingswaarde van een plant of vrucht bekomen
Therapeutisch klonen

3° productie van insuline, antibiotica, vaccins,…. door micro-organismen

1 Voorbeelden van natuurlijke genoverdracht

Onder genoverdracht verstaan we het inbouwen van stukjes DNA in het eigen
genoom of in het genoom van een ander organisme.

Genoverdracht in de natuur is mogelijk:

* tussen plasmide en chromosoom van 1 bacterie

* tussen bacteriën onderling

* van bacterie naar plant

* ook via virussen

2
Even opfrissen: Opbouw van bacteriën

Bacteriën bezitten1 grote, ringvormige DNA-molecule (het chromosoom), als een

kluwen opgerold, vrij in het cytoplasma

Daarnaast bezitten ze ook nog 1 of

meerdere kleine ringvormige DNA-
moleculen: plasmiden
Deze plasmiden bevatten meerdere
genen en zijn in staat zich zelf te
vermenigvuldigen.

A Uitwisseling tussen een plasmide en het chromosoom binnen 1

bacterie door transpositie.

Verloop van transpositie bij bacteriën:

→geen afgifte, wel kopie tijdens overdracht!

3
B Overdracht tussen bacteriën onderling

Door conjugatie kunnen kopieën van plasmiden worden overgedragen naar

andere bacteriën. Ze vormen hiervoor een tijdelijke cytoplasmabrug of pilus. Via
deze weg slagen bacteriën er in om zeer snel resistentie genen tegen bvb
antibiotica met elkaar uit te wisselen.

SEM foto van conjugatie.

C Overdracht van bacterie naar plant: Plasmiden als vector

Een vector is een DNA-molecule die optreedt als transportmiddel voor het te
introduceren DNA.
Een plasmide en het DNA van een virus voldoet aan die voorwaarde: het zijn
DNA-moleculen die ingebouwd kunnen worden in het genoom van een ander
organisme en ze bevatten uiteraard DNA.

Hoe fungeert een plasmide als vector?

→ De agrobacterie (Agrobacterium)

Chromosoom met code voor vitale eiwitten

Reuzenplasmide coderend voor niet vitale eiwitten zoals o.a. resistentie-
eiwitten →resistentiegenen of R-genen

4
 levenscyclus van de agrobacterie

Bodembacterie dringt in plantencel via wonde en vestigt zich aan de

plantencelwand.

Deel van het plasmide: het T-gebied, wordt overgedragen aan plantencel
en ingebouwd in het chromosomaal DNA ervan.
*wegens kankerveroorzakend; Ti-plasmide genoemd (Tumor inducerend)

T-gebied bevat 4 fragmenten:

1 gen dat aanzet tot ongeordend delen→gal=plantentumor

1 gen dat codeert voor het enzym nopalinesynthetase

→nopaline wordt door plant in de gal gemaakt als voedsel
voor de bacterie

2 “sticky-ends” die insertie in het plantengenoom mogelijk maken

→ Opmerking: Genoverdracht tussen bacteriën gebeurt ook via plasmiden.

Deze plasmiden zijn dus eveneens een voorbeeld van plasmiden als vector. (Zie
1B)

5
D Virussen als vector

Figuur van een bacteriofaag:

Bacteriofagen zijn virussen die

zich hebben gespecialiseerd in
het parasiteren van bacteriën.

Virussen slagen er in om zowel bij

prokaryoten als eukaryoten hun
erfelijk materiaal over te brengen
en in te bouwen.

D1 DNA overdracht van faag naar bacterie

Faag injecteert DNA in de bacterie waarna 2 mogelijkheden;

Lytische fase:
Virus dwingt gastheer om hem te laten vermenigvuldigen met de
dood van de bacterie als eindresultaat.

6
 Lysogene fase:
Soms wordt het DNA mee ingebouwd in het chromosoom van de
gastheer = profaag. →bij elke celdeling wordt dit dan ook mee
gekopieerd alsof het een deel was van het eigen DNA.
Vele mitosedelingen later kan het DNA weer vrijkomen uit het
chromosoom en opnieuw de lytische weg bewandelen

Opmerking: HIV volgt ook eerst de lysogene fase.

7
D2 Restrictie- enzymen als tegenaanval

Als in de natuur een bepaalde strategie wordt gebruikt om te kunnen

parasiteren, dan mag je er haast zeker van zijn dat in de natuur ook een
strategie voorkomt om deze aanvallen te neutraliseren of af te blokken!

Dat antwoord zijn de knipenzymen = restrictie- enzymen = “moleculaire

scharen”
Deze enzymen knippen soortvreemd DNA in stukken waardoor het vernielend
vermogen ervan beperkt wordt.

Sommige restrictie- enzymen knippen alleen nucleotide sequenties door die

uitsluitend in het viraal DNA voorkomen. Hierdoor blijft het eigen DNA intact.

→knipenzymtechniek ook veel gebruikt bij kunstmatige genoverdracht!

Knipenzymen knippen steeds sequenties door die elkaars spiegelbeeld zijn =

palindromen

8
2 Kunstmatige genoverdracht

A De recombinant – DNA – techniek

= veranderen van het DNA van een organisme door gentransplantatie

=genmanipulatie = genetische manipulatie
Doel: Door een vreemd gen (donor – DNA) in te bouwen in het DNA van een
micro-organisme, plant of dier, een organisme trachten te bekomen waarvan de
cellen eigenschappen bezitten die ze voordien niet hadden. Op die manier
ontstaan genetisch gemodificeerde organismen = de GGO's = transgene
organismen

Recombinant DNA-technologie De recombinant - DNA -

techniek bestaat uit 3
stappen:
Restrictie-
enzyme
Stap 1:
Donor DNA beschikbaar
Sticky-ends
maken en de vector
doorknippen, hiervoor
hebben we
2x restrictie-enzymen
DNA-recombinant nodig

stap 2: Donor-DNA inbouwen in de vector: Ligasen nodig die de DNA

fragmenten met elkaar verbinden.

stap 3: Donor-DNA tot expressie laten komen

In natuurlijke situaties vertaalt de ontvangende cel het vreemde gen naar mRNA
en eiwitten.

In kunstmatige situaties blijkt dat de regulatiegenen van prokaryoten en

eukaryoten te verschillend zijn. Plasmiden worden dus zelden gebruikt als vector
om een eukaryoot te wijzigen.
Bij gebruik van virussen als vector ondervinden we geen
transcriptiemoeilijkheden.

Daarom vaak bacteriën genetisch gemanipuleerd (prokaryoot →prokaryoot )

9
B toepassingen van genetische manipulatie

GGO’s; toepassingen
 Zalm  “Flavr savr”
 Tomaat  “Uraniumvangers”
 Maïs  “Zware metalen
 Sinaasappel zonder vangers”
pitten  Vaccin Hep B door
 Planten bestand tegen gistcellen
herbiciden  Biodegradeerdbare
 Insulineproductie door polyesters (plastics)
bacteriën en gisten voor inwendig gebruik
 EPO productie door  “6 schijfjes tomaat” MD
transgene
zoogdiercellen

Geneeskunde
Milieu
Plantenteelt
Veelteelt
Voeding
...

10
3 Gentherapie: Gentransplantatie bij de mens.

Toenemende kennis; vele ziekten tgv “defect” in een gen. Vaak slechts 1 gen
“defect”

Oplossen via gentherapie: Een therapeutisch gen inbrengen en inbouwen in

de cel van de mens ter vervanging van het defect
gen of om het te herstellen.

Relatief “eenvoudige” techniek wanneer slechts 1 enkel gen dient vervangen te

worden.
Momenteel deels succesvol voor hemofilie (beperkte hoeveelheid stollingsfactor
wordt geproduceerd)
Volledig succes bij SCID (severe combined immuno-deficiency(→bubble baby’s))

Werking?

“Naakt” erfelijk materiaal wordt zelden opgenomen door een cel→verpakken in

vector (viraal of niet viraal) noodzakelijk

Eens ingebracht ( vaak met doelgerichte vectoren*) moet het gen ingebouwd
worden in het DNA van de lichaamscellen.
Als dit lukt kan het gen ook worden afgelezen en tot expressie gebracht worden

*doelgerichte vectoren = virussen die zodanig werden aangepast dat ze

slechts bepaalde weefsels of organen zullen
binnendringen, daar waar het therapeutisch gen nodig
is.
Zeer vaak beschadigde adeno-virussen (→verkoudheid)

11
Genezend effect:

3 mogelijkheden:

1° nieuw gen zorgt voor

productie van het ontbrekend
eiwit

2° therapeutisch gen
corrigeert het defecte
gen→ontbrekend eiwit
gevormd

3° Therapeutisch gen
blokkeert de vertaling van het
defecte gen→ziekmakend eiwit
wordt niet langer gevormd.

Efficiëntie?

Genoeg weefselcellen of cellen in het orgaan ontvingen het therapeutisch

gen en produceren voldoende eiwit.

SCID: 100% succesvol

Hemofilie +/- maar wel zinvol

12
Kankeronderzoek→+/- 30% van de genen is defect!

Gentherapie en kankerbestrijding:
mogelijke pistes
 Injecteer in de  “Locale chemo” gen;
tumorcellen:
Gen zorgt voor specifieke
eiwit/enzym productie A in
 Corrigerend gen om deling kankercellen
normaal te laten verlopen

→”onschuldig” chemisch product

 Gen dat afweerreactie tegen B inspuiten
eigen tumorcellen uitlokt

A+B = RIP
 Gen dat aanmaak nieuwe
bloedbanen in het gezwel A + B = uitsluitend in kankercellen
verhindert (vb: verhinder de mogelijk
beschikbaarheid van vetzuren
(2015))

4 Biotechnologische technieken

A PCR TECHNIEK (= Polymerase Chain Reaction)

Te beschouwen als een kunstmatige vorm van DNA-replicatie, afgekeken van de

natuur en met behulp van DNA-polymerasen die werden geïsoleerd uit bacteriën.

Doel: Snel en specifiek een gewenst fragment van het DNA isoleren en
vermenigvuldigen.

13
Werkwijze PCR:

Een PCR cyclus bestaat uit 3 stappen en wordt 20 tot 30 keer herhaald vooraleer
men voldoende DNA bezit om te onderzoeken.

STAP 1: DENATURATIE --> Bvb bij 95°C gedurende 30s

Dubbelstrengen→enkelstrengen, warmte verbreekt de H-bruggen tussen de

complementaire basen.

STAP 2: RENATURATIE--> Bij 37°C gedurende bvb 1min

Korte stukjes complementair en enkelstrengig DNA (= primers) worden massaal

toegevoegd. Deze primers vinden hun complementaire basen in de
matrijsstrengen sneller terug dan dat de complementaire strengen in hun geheel
elkaar terugvinden. Resultaat: op elke DNA-streng bindt een primer en een
recombinatie wordt verhinderd.

STAP 3: POLYMERISATIE --> Bvb bij 72°C gedurende bvb 2 min.

Elke enkelstreng wordt vanaf de primer opnieuw opgebouwd door

complementaire basenparing en mbv DNA-polymerase.
Intramoleculaire complementaire basenparing komt bij deze temperatuur niet
voor.

Het resultaat van deze cyclus is een verdubbeling van de aanwezige DNA-
helixen.

14
Toepassingen waarbij PCR noodzakelijk is:

Kleine stukjes DNA in speeksel op sigarettenpeuk, een haarwortel, bloed of

spermavlekken volstaan om een genetische vingerafdruk te kunnen opstellen.

Diagnose van ziekten (AIDS test)

Vruchtwateronderzoek om genetische defecten op te sporen

Pre-implantatie diagnostiek

zygote 8 cellig stadium

zaadcel

eicel
+
reageerbuis
bevruchting afwijking
gevonden gericht
onderzoek
Aan DNA:
geen PCR!
KIND afwijking
gevonden
implanteren in de
baarmoeder

Genetica, systematiek, ecologisch onderzoek,….

15
B RESTRICTIEFRAGMENT – LENGTEPOLYMORFISME

Indirecte manier om DNA stalen met elkaar te vergelijken

→genetische vingerafdruk = streepjescode

DNA wordt via restrictie-enzymen in fragmenten geknipt en gescheiden via

gelelektroforese.
Aangezien deze knipenzymen specifieke plaatsen doorknippen, zal dit in het
geval van identiek DNA uiteraard op dezelfde plaatsen gebeuren. Daardoor zullen
de fragmenten dan ook identiek zijn en een zelfde bandenpatroon vertonen
tijdens de gelektroforese.

Gelektroforese:

In een gel bevinden zich kleine uitsparingen waarin het mengsel van fragmenten
wordt aangebracht. Over deze gel wordt nu een elektrisch veld aangelegd, met
de negatieve pool ter hoogte van de uitsparingen. De negatief geladen
fosfaatgroepen van de DNA fragmenten worden aangetrokken door de positieve
pool aan de andere zijde van de gel. Kleine fragmenten ondervinden onderweg
minder weerstand en zullen dus snel en ver migreren in de gel. Hoe langer de
fragmenten, des te groter de weerstand. Deze fragmenten zullen dus niet zo ver
migreren.

Positieve pool

Fragmenten in
uitsparingen
Negatieve pool

Toepassingen: gerechtelijk onderzoek/ erfelijke aandoeningen

opsporen/ouderschapstest

16
C DNA – SEQUENTIEBEPALING

DNA sequentiebepaling via de ketenterminatiemethode.

Uit het hoofdstuk eiwitsynthese weten we dat de volgorde van de

aminozuren bepaald wordt door de volgorde van de nucleotiden. De
ketenterminatiemethode maakt van deze kennis gebruik en werd
ontwikkeld met als doel de juiste samenstelling van een eiwit te kennen.

Benodigdheden:
1° Voldoende DNA waarvan we de code wensen te kennen (ev. bekomen
na PCR)
2° DNA polymerase
3° primers
4° "gewone" nucleotiden A T C en G
5° Stopnucleotiden A* T* C* en G* (niet te verwarren met
stopcodons tijdens de eiwitsynthese!)
-->Stopnucleotiden zijn nucleotiden die lichtjes gewijzigd zijn. Als gevolg
hiervan zal er aan dit nucleotide geen nieuw nucleotide kunnen gekoppeld
worden door DNA polymerase. Met als gevolg dat de keten niet verder
kan afgewerkt/verdubbeld worden.

Werkwijze
We voeren met het bestaande DNA opnieuw de PCR techniek uit. We doen
dit in 4 verschillende proefbuisjes. In elk van de buisjes worden alle
benodigdheden toegevoegd + 1 van de 4 stopnucleotiden.
Tijdens het verloop van de PCR techniek zullen de
stopnucleotiden in elk van de buisjes ad random
ingebouwd worden. Soms helemaal vooraan al, in
andere gevallen pas op het einde van de keten.
Hierdoor ontstaan er nu veel DNA ketens die niet
volledig werden afgewerkt.
Als we na afloop van de PCR de nieuwe ketens
laten denatureren, ontstaan er in elk van de vier
proefbuisjes dus zeer veel enkelstreng fragmenten
met een verschillende lengte, maar met allemaal
een stopnucleotide A*, T*, C* of G* (afhankelijk
van de proefbuis) als eindnucleotide.

17
Als we deze fragmenten onderwerpen aan gel elektroforese, dan kunnen
we al deze verschillende fragmenten van elkaar scheiden en ontstaat er
een bandenpatroon. Een sequencer kan daarna de verschillende
fragmenten van elkaar onderscheiden tot op het niveau van de
afzonderlijke nucleotiden. Door de info van de 4 verschillende buisjes te
combineren kennen we nu de juiste volgorde van de nucleotiden.

Deze techniek is ondertussen ook mogelijk in een enkel buisje, men

gebruikt dan fluogemarkeerde stopnucleotiden.

18
E KLONEREN ( KLONEN) (zie ook bijlage)

Klassiek klonen: embryosplitsing (blastomerenstadium)

Modern klonen: celkernoverdracht

*Progressief-geïntegreerd klonen:

genetisch identieke nakomelingen produceren (Dolly)

→Bvb omdat ouderpaar via geslachtelijke voortplanting niet in

staat is kinderen te krijgen.

*Therapeutisch of niet-reproductief klonen:

Mbv kerntransplantatie lichaamscellen creëren en

produceren die kunnen bijdragen aan de genezing van
bepaalde ziekten, herstel van organen,…
Hiervoor zijn stamcellen nodig waarin de kernen van de
patiënt zelf zullen worden ingebracht zodat deze cellen
“immunologisch compatibel” zullen zijn.

*Maternale overerving en behandeling van mitochondriële aandoeningen;

een tussenvorm van reproductief en therapeutisch klonen.

Vrouwen met een erfelijke aandoening ter hoogte van de mitochondriën

geven dit door aan hun kinderen. Door na de bevruchting alleen de kern
uit de zygote te transplanteren naar een gezonde, lege eicel, kan
verhinderd worden dat de aandoening nog voorkomt.
Of er kan vooraf een haploïde kern uit de originele eicel worden
weggenomen en ingebracht in een lege en gezonde donoreicel, waardoor
na de bevruchting eveneens een gezond kind zal kunnen ontwikkelen.

19
F XENOTRANSPLANTATIE

Xenofobie= angst voor het onbekende, het vreemde.

Overplaatsen van cellen, weefsels of organen van dier naar mens.

Zou alternatief kunnen zijn voor donororganen van mens, maar; 3 risico’s:

1° Afstoting

→proberen te voorkomen
door donordier genetisch te
modificeren. (→varkens)

2° Functieverlies

→Donororganen moeten zich

aanpassen aan het menselijk
lichaam, goed functioneren
is geen garantie.

3° kans op infectie

→opkweek in steriele
omstandigheden
noodzakelijk om overdracht van virussen, bacteriën of schimmels via het orgaan
te voorkomen.

→Endogene retrovirussen: Verstoppen zich in het DNA, zijn onschadelijk voor het
varken maar zouden een patiënt kunnen infecteren. Vrees voor ontstaan van een
nieuwe besmettelijke ziekte.

Bio-ethiek: Moet alles kunnen?

Is het verantwoord dat de mens ingrijpt in de erfelijke

eigenschappen van een ander organisme?

__________________________

20
Bijlage

2019 06 04
Hartinfarcten komen overal ter wereld - helaas - enorm vaak voor.
Bovendien kunnen dokters er weinig aan doen dat het bij veel
patiënten niet bij één aanval blijft. Maar daar komt binnenkort
waarschijnlijk verandering in. Britse onderzoekers werken
namelijk aan stamcelpleisters die het hart helpen herstellen van
een infarct.
Elk jaar krijgen ongeveer 15.000 Belgen een hartaanval. In bijna de helft
van de gevallen loopt dat fataal af en bovendien is het een terugkerende
aandoening. Dat wil zeggen dat patiënten die een infarct overleven, best
veel kans maken op nog een hartaanval. Onderzoekers die samenwerken
met de Britse Hartstichting (British Heart Foundation) zijn op zoek naar
een oplossing daarvoor. En ze zijn op de goede weg.

De onderzoekers zijn stamcelpleisters aan het ontwikkelen. Die moeten

het hart helpen herstellen na een infarct, zodat de kans kleiner wordt dat
de patiënt er nog een krijgt. De pleisters zijn ondertussen getest op dieren
en zien er veelbelovend uit. Binnenkort gaan de onderzoekers dan ook
over op testen op mensen.

Hoe komt het nu dat een hartinfarct vaak niet eenmalig is? Wel, tijdens
een aanval krijgt een hart de voedingsstoffen en zuurstof niet meer die
het nodig heeft om te kunnen blijven kloppen. Dat zorgt ervoor dat de
spieren in het hart afsterven, waardoor het orgaan fel verzwakt. En een
verzwakt hart kan aan de basis liggen van hartfalen.

Het is dus belangrijk dat een hart sneller en beter kan herstellen na een
infarct om er nog een te voorkomen. De stamcelpleisters die de
wetenschappers aan het ontwikkelen zijn, moeten daarbij helpen. Ze
ondersteunen de verzwakte hartspieren, helpen het orgaan om efficiënter
te pompen en lossen chemische stoffen die de hartcellen helpen
herstellen.

Veelbelovende testen
De pleisters zijn niet groter dan een duim, maar kunnen tot wel vijftig
miljoen stamcellen bevatten. Die cellen zijn geprogrammeerd om te
transformeren in echt werkende hartspieren als de pleister in het hart is
ingeplant. De testen op dieren waren een succes: na drie dagen begonnen
de pleisters mee te kloppen met het hart en na een maand begonnen ze
natuurlijk hartweefsel te imiteren. Anders gezegd hielpen de pleisters echt
om de hartfunctie na een hartaanval te verbeteren.

Het ultieme doel van de onderzoekers is om een voorraad pleisters te

hebben die voor alle patiënten werken. Op die manier kunnen dokters hun
patiënten na een hartinfarct ook een stamcelpleister voorschrijven, naast
de medicijnen die nu vooral gebruikelijk zijn.

21