SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

(HighPerformance Liquid Chromatography)

Lòch söû
Ether daàu hoûa  1906: Mikhail Tswett – saéc kyù loûng haáp
phuï treân coät
Saéc toá  1938: Izmailov & Schraiber – xaây döïng
TV phöông phaù p SKLM
 1958: Stahl – hoaøn thieän phöông phaùp
Chlorophyl SKLM
Xanthophyl  1941: Martin & Synge – ñaët neàn taûng
cho saéc kyù phaân boá: SKG vaø SKK
CaCO 3
 1946 - 1949: Cremer, Prior và Keulemans
– Máy SKK đầu tiên
 1952: Martin & James – baøi baùo ñaàu tieân
veà SKK
 Cuoái naêm 1960: saéc kyù loûng cao aùp ra ñôøi
 1937 – 1972: 12 giaûi Nobel veà saéc kyù
 1990: sắc ký lỏng siêu tới hạn
 2004: saéc kyù loûng sieâu aùp
 2012: Sắc ký hội tụ siêu hiệu năng
t0 t1
SKL cao aù p hay SKL hieäu naêng cao
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) coù öu ñieåm laø:
• Thôøi gian saéc kyù
• Kích thöôùc haït
• Ñoä phaân giaûi
 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
(HighPerformance Liquid Chromatography)

MUÏC TIEÂU
 Ñònh nghóa.
 Phaân loaïi.
 Trang thieát bò cô baûn.
 Caùc thoâng soá ñaëc tröng.
 ÖÙng duïng.
1. ÑÒNH NGHÓA

- HPLC taùch hỗn hôïp treân coät ñöôïc nhoài ñaày baèng caùc haït coù
kích thöôù c ≤ 10 µm.

- Duøng moät bôm coù aùp suaát cao ≈ 300 atm ñeå ñaåy pha ñoäng qua
pha tænh vôùi toác ñoä doøng khoaûng vaøi ml/phuùt

- Löôïng mẫu nhoû: 20 µg.

 HPLC ra ñôøi töø 1960 aùp duïng nhieàu lónh vöïc do:

+ Coù ñoä nhaïy cao.

+ Ñoä ñuùng vaø ñoä chính xaùc cao ñaùp öùng caùc yeâu caàu veà ñònh löôï n g.

+ Thích hôïp vôùi caùc hôïp chaát khoâng bay hôi vaø chòu nhieät.
 A

(A) Hỗn hợp chất cần phân tích khi bơm vào cột.
 Tập trung ưu tiên ở pha động (B)
Tập trung ưu tiên ở pha tĩnh (B)
(C) Cân bằng mới được thiết lập
(D) Quá trình lặp lại liên tục, sau 1 thời gian 2 chất tách rời nhau
Bơm mẫu Chiều di chuyển của pha động Detector
T=0

T=10’

T=20’

Mạnh Tương tác với pha tĩnh Yếu

Rf tr
Điều kiện SK: mẫu: 40 ng mỗi thành phần; cột: 3 cm4,6 nm, ID; pha tĩnh:
ChromSphere UOP C18, 1,5 m; pha động: hỗn hợp nước: acetonitril (85:15); tốc độ
dòng: 3,5 ml/phút; nhiệt độ phân tích: 350C; phát hiện: detector UV 254 nm; các peak
được tách hoàn toàn: 1= bromazepam, 2= nitrazepam; 3 = clorazepam;
4 = oxazepam; 5= flunitrazepam; 6 = hydroxydiazepam(ternazepam);
7 = desmethyldiazepam ( nordazepam); 8 = diazepam(valium)
PHÂN LOẠI
Dựa vào cơ chế tách chiết: HPLC chia làm 4 loại:
 Sắc ký phân bố (partition chromatography)
 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)
 Sắc ký ion (ion chromatography)
 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)
 Sắc ký ái lực (affinity chromatography)

SKPB được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ
không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối
lượng phân tử không quá lớn (< 3000).
11
Sắc ký rây phân tử
(size exclusion/gel permeation chromatography)
ADSORPTION CHRT: PARTITION CHRT:

13
Sắc ký ái lực
(affinity
chromatography)
PHÂN LOẠI
SKPB: Có 2 loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:
- SK pha thường (NP- Normal phase chromatography):
Pha tỉnh: phân cực do chất mang được phủ hoặc liên kết với những chất phân
cực (nước, -oxydipropionitril, PEG, trimethylenglycol….)

Pha động: DM hữu cơ ít phân cực. Trong NP, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực
cao hơn pha động. NP dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao
với phân tử lượng không lớn lắm.

- Sắc ký pha đảo (RP- Reversed phase chromatography):

Pha tỉnh: là những chất lỏng ít phân cực (hydrocarbon….)

Pha động: là DM phân cực (nước, methanol, acetonitril…). Trong RP pha tĩnh
ít phân cực hơn pha động, dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến
phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài.
 2. TRANG THIEÁT BÒ

1. Bình ñöïng pha ñoä n g 5. Loïc tieàn coät

2. Boä phaän khử khí 6. Coät saéc kyù
3. Heä thoáng bôm cao aùp 7. Boä phaän phaùt hieän
4. Boä phaän naïp maãu 8. Boä phaän xöû lyù vaø ghi tín hieäu
HEÄ THOÁNG HPLC Agilent 1260
HEÄ THOÁNG HPLC Water
2.1. Bình chöùa dung moâi

- Thuûy tinh trung tính, röûa saïch theå tích 100 ml → 2 lít
- Thuûy tinh maøu neáu chöùa nhöõng chaát nhaïy cảm vôùi aùnh saùng.
- Naép ñaäy thích hôïp ñeå traùnh bay hôi dung moâi.
Xöû lyù dung moâi
 Loïc qua maø ng loïc thích hôïp (kích thöôùc 0,22 & 0,45 µm)
 Dung moâ i laø nöôù c : cellulose nitrat hay cellulose acetat
 Hoã n hôïp dung moâ i höõ u cô vaø nöôù c : maø ng loïc RC (regenerated
cellulose, cellulose taùi sinh), polyamid hay nylon
 Dung moâ i höõ u cô: loïc qua maø ng loïc teflon
Pha động trong HPLC:

- Hòa tan được mẫu cần phân tích.

- Phù hợp với đầu dò.
- Không hòa tan, làm mòn hay hủy hoại pha tĩnh.
- Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
- Đạt độ tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).
Boä phaän loïc dung moâi:
 Thöôøng baèng thuûy tinh, KT 5 → 10 µm
 Thöôøng xuyeân laøm veä sinh (DD HNO3 5% + sieâu aâm khoaûng 15’, röûa laïi
baèng nöôùc caát ñaõ ñöôïc loïc qua maøng loïc 0,45 µm.
 2.2. Boä phaä n loaïi khí dung moâ i (Degasser in line)
- Loaï i khí ngay trong bình chöù a dung moâ i hoặc treâ n doø n g chảy của pha
ñoäng tröôùc khi dung moâi vaøo bôm.
Khử khí ngay treâ n doø n g (On-line membrane degassing)
Pha ñoäng chaûy qua moät sôïi rỗng laøm baèng maøng baùn thaám.

Maøng khöû khí naøy hay ñöôïc ñaët thaúng ñöùng ngay treân ñöôøng dung moâi vaøo bôm ñeå khoâng
khí khoâng theå hoaø tan trôû laïi vaøo dung moâi.
2.2. Boä phaä n loaïi khí dung moâ i (Degasser in line)

Ngoaøi ra coøn coù caùc kieåu hay söû duïng ñeå ñuoåi khí:
- Loïc döôùi aùp suaát giaûm (chaân khoâng = vacuum)
- Sieâu aâm (sonication)
- Suï c khí helium (helium sparge)
2.3. Heä thoáng bôm HPLC:
Haàu heát heä thoáng bôm HPLC coù baùn teân thò tröôøng laø döïa treân moâ hình piston thuaä n
nghòch.
Dung moâi ra

Piston
Van đi ra
Chậm
Vieân bi

Nhanh Van đi vào

Dung moâi vaøo

- Ñaàu bôm coù 2 van ñieàu tieát, mỗi van coù moät lỗ nhoû với 1 bi.
- Thaân bôm coù moät pisston ñeå chuyeån ñoäng ñi laïi.
Bôm HPLC duøng ñeå huùt pha ñoäng töø bình chöùa vaø ñaåy chuùng qua coät saéc kyù,
goàm caùc loaïi khaùc nhau:
2.3.1.Bôm coù löu löôïng haèng ñònh:
Bôm moä t pisston:
- Ñieàu khieån baèng heä thoáng taâm sai, löu löôïng khoâng ñoåi nhöng aùp suaát thay ñoåi.
B ô m 2 pisston:
- Khi pisston ñaåy pha ñoäng vaøo coät thì pisston khaùc seõ huùt pha ñoäng vaøo thaân bôm.
- Löu löôïng thöôøng khoâng ñoåi & aùp suaát cuõng khoâng ñoåi.
2.3.2. HT Bôm ñaú n g doø n g (isocratic pump):
Chæ laáy ñöôïc moät loaïi dung moâi khoâng töï ñoäng pha troän ñöôïc dung moâi
Ñieàu chænh söï
thay đổi aùp suaát Van loïc
Van ra

I
Van vaøo

Hai piston

Nhöõng ñieàu caàn chuù yù khi duøng bôm ñaúng doøng:

• Khoâng taêng toác ñoä doøng ñoät ngoät.
• Theo doõi aùp suaát bôm trong quaù trình phaân tích.
• Ñònh kyø röûa loïc dung moâi ñaàu vaøo.
• Naï p ñaà y heä thoá n g HPLC baè n g methanol, acetonitril hay hỗn hôï p
methanol, acetonitril vôùi nöôùc khi khoâng tieán haønh phaân tích
2.3.3. HT Bôm nhò phaâ n (binary pump):
• Coù theå laáy ñoàng thôøi 2 loaïi dung moâi ñaàu vaøo.
• Coù theå chaïy ñöôïc chöông trình hoùa dung moâi (gradient).
• Tieát kieäm dung moâi.
2.3.4. Heä thoáng bôm töù phaân (quaternary pump)
• Coù theå laáy ñoàng thôøi 4 loaïi dung moâi ñaàu vaøo.
• Coù theå chaïy ñöôïc chöông trình dung moâi (gradient) moät caùch uyeån chuyeån vaø ña
daïng.
• Tieát kieäm dung moâi.

Löu yù khi söû duïng bôm nhò phaân vaø bôm töù phaân
• Töông töï nhö bôm ñẳng doø ng.
• Phoái hôïp dung moâi hôïp lyù traùnh keát tuûa chaát ñieän giaûi treân ñöôøng oáng.
• Duøng dung moâi trung gian moät caùch hôïp lyù khi phoái hôïp dung moâi.
• Caân baèng coät baèng hỗn hôïp dung moâi – nöôùc vôùi tyû leä töông töï nhö hỗn hôïp dung moâi
ñeäm.
• Röûa kyõ ñöôøng oáng chöùa ñeäm baèng nöôùc sau khi keát thuùc quaù trình phaân tích.
2.4. Boä phaän tieâm mẫu
Nguyeân taéc chung: khi ñöa mẫu thöû vaøo coät laø khoâng ñöôïc laøm xaùo troän chaát nhoài
trong coät
 Phöông phaùp duøng syringe tröïc tieáp.
 Phöông phaùp duøng van bôm vôùi theå tích xaùc ñònh (loop).
 Boä phaän bôm mẫu töï ñoäng auto-sampler.
2.4.1. Phöông phaù p söû duïng syringe tröïc tieáp
Laø phöông phaùp ñöa mẫu phaân tích vaøo coät baèng bôm tieâm (syringe)
Phaûi duøng ñeán vaùch ngaên (septum): teflon, silicone
 Yeâu caàu baét buoäc
 Khoâng ñöôïc töông kî vôùi pha ñoäng cuûa heä thoáng saéc kyù.
 Khoâng ñöôïc chöùa caùc chaát deûo hoaù, chaát choáng oxy hoùa.
 Öu ñieåm
 Tieän lôïi, ñôn giaûn.
 Coù hieäu löïc cao vì maãu ñöôïc ñöa tröïc tieáp vaøo coät, haïn cheá ñöôïc theå tích ngoaøi coät.
 Nhöôïc ñieå m
 Ñoä laëp laïi khoâng cao, vì theå tích mỗi laàn bôm khaùc nhau.
 Ñöa thaúng mẫu thöû vaøo coät thì nhöõng hoaït chaát coù theå laøm taéc kim, hoaëc chaát lieäu cuûa
vaùch ngaên coù theå laøm baån coät.
 Mỗi laàn tieâm mẫu, phaûi cho ngöng doøng chaûy, ñôïi ñeán khi aùp suaát baèng aùp suaát khoâng khí
roài môùi tieâm mẫu do ñoù doøng chaûy bò giaùn ñoaïn.
2.4.2. Phöông phaù p sử duï n g van bôm
(Valse – loop injector hay Syringe loop injection)

PP ñöa mẫu phaân tích vaøo coät baèng van bôm vôùi theå tích xaùc ñònh.

Ñaëc ñieåm:
- Van bôm coù theå hoaït ñoäng döôùi aùp suaát cao.
- Nhôø ñöôïc trang bò moät coät coù chöùa mẫu coù theå tích nhaát ñònh (loop) neân theå tích mẫu
ñöôïc ñöa vaøo coät luùc naøo cuõng haèng ñònh.
- Löôïng maãu bôm vaøo thöôøng nhieàu hôn löôïng caàn thieát (10-100 µl).
 Öu ñieåm

 Heä thoáng bôm coù theå laøm vieäc döôùi aùp suaát raát cao maø khoâng bò giaùn ñoaïn doøng
chaûy.
 Coät taùch khoâng bò taét hay bò baån do caùc maõnh ñeäm ngaên (Septum).
 Theå tích mẫu thöû ñöôïc ñöa vaøo coät luùc naøo cuõng haèng ñònh vì vaäy ñoä laëp laïi seõ raát cao.

 Chuù yù
 Lượng mẫu thöû > theå tích loop (Ví duï: phaûi duøng tôùi 100 µl mẫu thöû ñeå laø m ñaày
cho 1 loop 20 µl).

Thoâ n g thường duø n g loaï i microsyrine vôù i caù c theå tích chính xaù c : 25, 50, 100, 250
µl. Ñieàu naøy coù öu ñieåm laø loaïi haún ñöôïc aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá kyõ thuaät ñoái vôùi keát quaû
treân saéc kyù ñoà.
2.4.3. Heä thoáng bôm maãu töï ñoäng (autosampler)
- Ñöa mẫu phaân tích vaøo coät baèng van bôm vôùi theå tích xaùc ñònh, heä thoáng naøy seõ töï
ñoäng bôm mẫu. Heä thoáng coù theå bôm lieân tuïc 100 mẫu vaø coù theå bôm chính xaù c töø 1-100
µl.

- Hoaït ñoäng cuûa haàu heát caùc autosampler laø söï xuyeân thaáu qua caùc loï chöùa mẫu phaân tích
ñaõ ñöôïc ñaäy naép baèng moät baèng moät kim gaén vôùi oáng dẫn. Mẫu phaân tích ñöôïc huùt töø loï
chöùa mẫu qua kim vaøo loop cuûa boä phaän tieâm mẫu vaø ñöa vaøo coät saéc kyù.
2.5. Loïc tieàn coät (precolumn filter) hay coät baûo veä (guard column)

- Muïc ñích: haáp phuï, giöõ laïi taïp hay caùc tieåu phaân nhoû coù trong maãu phaân tích hay taïp coù
trong pha ñoäng coù theå gaây ngheït vaø phaù huyû coät chính.
2.6. Coät HPLC
- Baèng theùp khoâng ræ, baèng thuûy tinh ñaëc bieät (chæ duøng khi aùp suaát
khoaû ng 60 psi) hoặc baè ng oá ng nhöï a polyethylen.
- Veà cô cheá phaân 2 loaïi coät: coät phaân tích vaø coät cheá hoaù
Coät phaân tích
- Daøi 5, 10, 15, 25 cm, muoán taêng chieàu daøi ngöôøi ta noái nhieàu coät vôùi nhau. ÑK trong
khoaûng 2 →10 mm. Kích thöôùc cuû a chaát nhoài laø 3,5 - 10 µm. Coät thöôøng duø ng chieàu
daøi 10, 25 cm, ÑK trong töø 4 → 6 mm. Chaá t nhoài coät kích thöôùc 5 µm. Mỗi coät chöùa
khoaûng 40.000 → 60.000 ñóa lyù thuyeát/ meùt.
- 1 loaïi coät môù i coù hieäu naê ng cao, kích thöôù c nhoû hôn caù c coät treâ n . ÑK trong khoaûng
1 → 4,6 mm. Kích thöôùc cuûa chaát nhoài laø 3 → 5 µm. Duø kích thöôùc haït nhoài raát nhoû nhöng
vôùi kyõ thuaät tieân tieán, caùc haït naøy ñöôïc saép xeáp caùc lỗ xoáp noái vôùi nhau thaønh moät oáng theo
chieàu daøi cuûa coät. Do ñoù raát tieän lôïi veà toác ñoä chaûy vaø tieâu toán ít dung moâi. Mỗi coät chöùa
khoaûng 100.000 ñóa lyù thuyeát/meùt raát tieän lôïi veà toác ñoä chaûy vaø tieâu toán ít dung moâi.
Moät vaøi loaïi coät SK thöôøng gaëp
Novapak C18, Nucleosil C18, Zorbax, Micropak, Spherisorb, Chromolith
Performance (RP – 18, RP 8)

 Pha tĩnh: Trong SKPB nói chung pha tĩnh là những CHC được gắn lên chất mang
rắn hoặc cấu thành từ silica như sau:
a. Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền => sắc ký pha liên kết (bonded phase
chromatography). Kết quả cho thấy BPC có nhiều ưu điểm hơn SK pha lỏng-lỏng do:
- Pha tĩnh trong hệ SL lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất pha tĩnh trong
thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
- Do pha tĩnh của SK lỏng-lỏng dễ tan/ pha động nên không thể ứng dụng kỹ thuật rửa giải
gradient dung môi để phân tích hỗn hợp đa thành phần.
Pha tĩnh:
b. Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý => SK lỏng- lỏng
(liquid-liquid chromatography).
Hiện nay trong HPLC thường chỉ quan tâm đến loại SKPB pha liên kết và phần lớn các
loại cột sử dụng hiện nay trong SKPB đều có cấu trúc dạng này.

Bề mặt các hạt silica – SiO2 (đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng
cách đun nóng với HCl 0,1 M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH
(thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):

Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra
các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn
vào. Tùy theo bản chất gốc R, ta có chất nhồi khác nhau
Nhóm chức Công thức Nhóm chức Công thức
Triacontyl - (CH2)29CH3 Amino - NH2
Docosyl - (CH2)21CH3 Nitro - NO2
Octadecyl - (CH2)17CH3 Nitril(Cyano) - CN
Octyl - (CH2)7CH3 Oxypropionitril -OCH2CH2CN
Hexyl - (CH2)5CH3 vic –Hydroxyl( diol) CH CH2

Trimethyl - Si(CH3)3 OH OH

Alkylcarbamat - CO(CO)NH-(CH2)nCH3 Fluoroalkyl -(CF2)nCF3

Cyclohexyl - C6H11 Polycaprolactam -[NH(CH2)5C=O]n-
(polyamid, nylon)
Phenyl - C6H5

Diphenyl - (C6H5)2

Dimethylamino -N(CH3)2
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH bị ester hóa (nghĩa là < 4 µmol/m2 bề mặt bị silan
hóa) vì sự kết hợp bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl người ta còn sử
dụng –OCH3.

Hợp chất tan và pha tĩnh. chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực
tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh

Trong RP, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân
cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS
(octadecylsilan):
Si – OH + Cl3 – (CH2)7 – CH3  SiO – Si (CH2)7 CH3
Si – OH + Cl3 – (CH2)17 – CH3  SiO – Si (CH2)17 CH3

hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó
nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Thực nghiệm cho thấy các alkyl dây
dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều
nhất.
Do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản ứng, gây
ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích:
+ Môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi
nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với
pha tĩnh nữa.

+ Môi trường base (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2
thành silicat) => là số đĩa lý thuyết giảm, số nhánh ghép cũng giảm, pic dãn rộng ra và
thời gian lưu cũng có thể giảm. KQ phân tích sẽ mất đi độ chính xác.

Để khắc phục hiện tượng này một số hãng sắc ký đã dùng kỹ thuật End-Capping: sử
dụng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH 3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử
dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH chưa bị ester hóa. Lúc này pha tĩnh sẽ ít
tương tác với chất phân tích có tính base (cột InertSustain AQ –C8, C18 (End-Capping triệt
để), LC-DB của hãng SUPELCO….. ).
+ Có thể loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần dùng kỹ thuật end-
capping là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như
isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –
OH với chất cần phân tích hoặc ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm
độ phân cực của dây C 18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất
phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).

+ Ngoài khung silica, thời gian gần đây các vật liệu như nền nhựa polystyren
(Polystyren Reversed Phase – PRP) đã được sử dụng cho phép phân tích các pha động có
pH môi trường từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và baz mạnh.
Chất mang: không được có hoạt tính, nghĩa là không còn khả năng hấp phụ nữa.
Thông thường các chất mang có lỗ xốp ở bề mặt khi tẩm các hạt chất mang lỗ xốp bằng
pha tĩnh, các thể tích lỗ xốp sẽ được lấp đầy.
Các chất mang thường dùng: diatomid (diachrom, spherosil dorasil)., silic
(Lichrosorb, Zipax…).

Coät cheá hoaù:

Thöôøng caùc loaïi coät cheá hoaù coù ñöôøng kính trong lôùn hôn so vôùi coät phaân tích.
Ñöôøng kính trong cuûa coät cheá hoaù thöôøng töø 10 - 50 mm, chieàu daøi coät cheá hoaù thöôøng
daøi hôn nhieàu so vôùi coät phaân tích. Do ñoù toác ñoä doøng seõ lôùn hôn nhieàu so vôùi coät phaân
tích. Coät naøy thöôøng öùng duïng nhieàu trong lónh vöïc döôïc lieäu ñeå sô boä taùch caùc nhoùm
hôïp chaát.
2.7. Boä phaän phaùt hieän (Detector)
Duøng ñeå phaùt hieän caùc chaát sau khi chuùng ñöôïc taùch ra khoûi coät saéc kyù.
Löïa choïn Detector döïa treân tính chaát hoùa lyù cuûa chaát phaân tích.
Moät boä phaän phaùt hieän lyù töôûng
 Ñoä nhaïy cao, khaû naêng phaùt hieän < 0,1 µg mẫu/ 1 cm3 pha ñoäng
 Ñaùp öùng roäng raõi ñoái vôùi caùc maãu caàn phaân tích hay coù nhöõng ñaëc tính coù theå ñoaùn
ñöôïc.
 Khoâng nhaïy caûm vôùi söï thay ñoåi cuûa nhieät vaø cuûa toác ñoä pha ñoäng, khoâng phaù hoûng
maãu thöû
 Vaän haønh lieân tuïc
 Theå tích ngoaøi coác ño nhoû
 Ñoä laëp laïi toát vaø dễ vaän haønh
 Coù raát nhieàu loaïi boä phaän phaùt hieän tuyø theo tính naêng cuûa noù
• Quang phoå keá khaû kieán vaø töû ngoaïi (UV-vis).
• PDA (Photo Diode Array Detector).
• Huyønh quang (Fluorescence Detector).
• Khuù c xaï keá vi sai (RI- Refractive Index Detector).
• ELSD (Evaporative Light Scattering Detector).
• Ño cöôø n g ñoä xung.
• Ñieän hoaù.
• Gheùp vôùi khoái phoå.
• Ñieän löôïng.
• Ño cöôøng ñoä doøng.
• Ño ñoä dẫn.
• AÙnh saùng khuyeát taùn.
2.7.1. Boä phaän phaùt hieänquang phoå khaû kieán vaø töû ngoaïi UV-Vis
(Ultraviolet Visible absorbance Detector)
Phoå bieán nhaát hieän nay

Ñeøn nguoàn Khe Caùch töû Diod quang

Coá c ño cho
doøng chaûy ñi qua
Khe

Göông phaûn chieáu Thuûy tinh Quartz Diod quang

Caáu taïo goàm 3 boä phaän chính

• Nguoà n aù n h saù n g ñôn saé c (Source of monochromatic light): Thöôø n g laø ñeøn
keát hôïp vôùi kính loïc hay ñeøn keát hôïp vôùi boä taïo aùnh saùng ñôn saéc. Laø boä phaän cho
pheùp choïn moät böôùc soùng töø ñeøn nguoàn phaùt ra aùnh saùng treân moät vuøng giaûi böôùc soùng
roäng.

• Flow cell (Coá c ño cho doø n g chaû y ñi qua): laø m baè ng thaï c h anh (quartz) coù hai
ñaàu oáng hình truï ñöôøng kính 1 mm, chieàu daøi 1 cm, thöôøng hoaït ñoäng ñöa chaát
loûng vaøo vaø ra theo hình chöû “Z”,
• Boä phaän ño söï thay ñoåi cöôøng ñoä aùnh saùng khi ñi qua coác ño: laø diod quang
(photodiod) hay oá n g nhaâ n quang (photomultiplier tube). Tín hieäu töø
diode quang hay oáng nhaân quang ñöôïc khuyeách ñaïi vaø truyeàn tôùi maùy ghi
(recorder), maùy tính tích phaân (integrator) hay maùy vi tính. Caùc pic treân saéc ñoà
bieåu thò cho söï ñaùp öùng vôùi caùc thaønh phaàn khi röûa giaûi khoûi coät saéc kyù.

Boä phaän phaùt hieän UV-Vis

Dễ daøng sử duïng vôùi ñoä tin caäy cao, giaù thaønh khoâng quaù ñaét, söû duïng ñöôïc trong
tröôøng hôïp chaïy gradient, khoâng phaù huûy maãu thöû, töông ñoái nhaïy vaø ñaëc hieäu.
Ñaùp öùng keùm ñoái vôùi caùc chaát khoâng haáp thu UV toát. Caùc pha ñoäng khoâng cho tia UV
truyeàn qua ñöôïc thì khoâng söû duïng ñöôïc.
2.7.2. Boä phaän phaùt hieän ña soùng PDA (Photodiode Array Detector)

- Ñöôïc aùp duïng vaøo HPLC ñaàu thaäp nieân 1980 baùo hieäu moät kyû nguyeân môùi trong kyõ
thuaät phaân tích HPLC
- Coù theå xem nhö laø boä phaän phaùt hieän ño ñoä haáp thu UV-Vis ña keânh, mỗi keânh phaùt hieän
aùnh saùng ôû moät böôùc soùng nhaát ñònh.
- Hoaït ñoäng theo nguyeân lyù: Caùc phaân töû hôïp chaát höõu cô haáp thu aùnh saùng UV vaø ñoä
haáp thu tyû leä vôùi noàng ñoä cuûa chuùng trong dung dòch

Coác ño cho doøng chaûy

ñi qua

Boä phaän taïo aùnh saùng

Ñeøn nguoàn ña saéc

Laêng kính

Daõy diod

200 nm 600 nm

Boä phaän xöû lyù vaø ghi tín hieäu

Caáùu taïo
• Boä taïo aùnh saùng ña saéc (Polychromator)
• Nguoàn saùng
• Coác ño cho doøng chaûy ñi qua
• Diode array
 Boä taïo aù n h saùng ña saéc:
 cho pheùp nhieàu böôùc soùng aù nh saùng ñi qua dung dòch mẫu ño. Ñieàu naøy traùi ngöôïc
vôùi caùc boä taïo aùnh saùng ñôn saéc thöôøng gaëp trong haàu heát caùc loaïi boä phaän phaùt
hieän chæ cho duy nhaát moät böôùc soùng aùnh saùng ñi qua maãu ño. Haàu heát caùc boä taïo aùnh
saùng ña saéc cho aùnh saùng traéng ñi qua maãu ño sau ñoù bieán ñoåi aùnh saùng truyeàn qua
thaønh caùc böôùc soùng hôïp phaàn tröôùc khi phaùt hieän.
 Boä phaä n phaù t hieän diode array duø ng heä quang hoïc ñaûo, thuaät ngữ heä quang hoï c
ñaû o (reverse optics) ñeå chæ caù c h truyeà n aù n h saù n g traé ng qua mẫu ño. Nguoàn
saùng cung caáp naêng löôïng ñi qua khe vaø heä thoáng quang hoï c taä p trung aù n h saù n g
vaø o mẫu ño. Khi aù n h saù n g ñi qua mẫu ño seõ phaân taùn thaønh caùc böôùc soùng hôïp
phaàn höôùng tôùi caùc töû nhiễu xaï vaø höôùng taäp trung vaøo daõy diode. Do aùnh saùng
taùc ñoäng leân caùc diode ñöôïc do moät caùc lieân tuïc vì vaäy ñoä haáp thu aùnh saùng cuûa maãu
ño ôû taát caû caùc böôùc soùng coù theå xaùc ñònh moät caùc ñoàng thôøi.
 Nguoàn saùng: ñeøn deterium, ñeøn tungsten.
 Coá c ño cho doø n g chaû y ñi qua: Heä thoá ng kính (lense) vaø heä thoá ng göông ñöôïc
duøng ñeå taäp trung aùnh saùng vaøo flow cell. Chöùc naêng: cho aùnh saùng töông taùc moät
caùch coù hieäu quaû vôùi caùc phaân töû maãu ño vaø laøm giaûm thieåu söï doaõng pic, chæ soá khuùc
xaï, söï taùn saéc vaø caùc hieäu öùng khoâng ñaëc hieäu.
 Diode array: Sau khi aù nh saù ng chuyeå n thaø n h caù c böôù c soù ng hôï p phaà n ñöôïc taäp
trung vaøo diode array. Caùc tieåu phaàn nhaïy saùng (caùc diode) ñöôïc saép xeáp theo
kieåu thaúng haøng. Coù ít nhaát moät tieåu phaàn öùng vôùi moät böôùc soùng caàn ñöôïc ño. Tuøy
theo soá löôïng caùc tieåu phaàn trong daõy diode vaø vuøng böôùc soùng cuûa boä phaän phaùt
hieän maø coù theå töø 2 ñeán 4 diode öùng vôùi moät böôùc soùng noäi. Soá löôïng diode laø yeáu toá
quan troïng xaùc laäp ñoä phaân giaûi cuûa boä phaän phaùt hieän diode array.
Öu ñieåm:
Dễ daøng söû duïng vôùi ñoä tin caäy cao, giaù thaønh ñaét hôn nhieàu so vôùi boä phaän phaùt hieän
UV thoâng thöôøng, söû duïng ñöôïc trong tröôøng hôïp trieån khai dung moâ i theo kieå u
gradient. Khoâ n g huû y hoaï i maã u thöû , töông ñoá i nhaïy vaø ñaëc hieäu, phaùt hieän nhieàu böôùc
soùng khaùc nhau vaø raát thuaän tieän cho vieäc nghieân cöùu.
2.7.3. Boä phaä n phaù t hieä n khuù c xaï keá vi sai (RI Refractive Index
Detcetor)
Khuùc xaï keá vi sai (Differential Refactometer) laø loaïi boä phaän phaùt hieän thöù 2 ñöôïc
duø ng phoå bieán trong saéc kyù loûng hieäu naê ng cao. Ñaëc tính chung laø raát beàn vaø nhaïy
ñöôïc söû duïng roäng raõi cho:
- Saéc kyù loûng hieäu naêng cao phaân tích
- Saéc kyù raây phaân töû (exclusion chromatography)
Dung dòch giaûi haáp
Thaáu kính
Giöông phaûn
chieáu Mask
Ñeøn nguoàn

Coác so saùnh Ñieàu chænh zero

Diode quang
Coác so saùnh

Ñeøn nguoàn

Diode
Taùch chuøm tia quang
Coác ño Taùch chuøm tia
2.7.3. Boä phaä n phaù t hieä n khuù c xaï keá vi sai (RI Refractive Index
Detcetor)

Nguyeân taéc: döïa treân söï khaùc nhau giöõa chæ soá khuùc xaï cuûa pha ñoäng vaø
pha ñoäng coù lẫn chaát tan sau quaù trình taùch qua coät saéc kyù.

- Boä phaän phaùt hieän khuùc xaï keá vi sai ñaùp öùng gaàn nhö toaøn boä caùc hôïp chaát töï nhieân, deã
vaän haønh.
- Ñoä nhaïy: phuï thuoäc vaøo raát nhieàu yeáu toá nhö: nhieät ñoä, aùp suaát vaø söï thay ñoåi thaønh
phaàn cuûa pha ñoäng, do ñoù khoâng theå trieån khai gradient hoaù dung moâi.
Maùy duøng detector khuùc xaï keá vi sai phải ñöôïc trang bò moät boä phaän ñieàu nhieät ñeå giöõ
cho ñoä bieán thieân nhieät ñoä cuûa heä thoáng khoaûng ± 0.5℃
2.7.4. Boä phaä n phaù t hieä n huyø n h quang (Fluorecence detector)
Daõy diode

Kính loïc tia phaùt xaï

Kính loï c tia kích thích

Ñeøn nguoàn Coác ño

Duøng ñeå phaùt hieän caùc hôïp chaát: dö löôïng thuoác tröø saâu, carbamate,
aflatoxin, vitamin vaø acid amin, caù c chaá t chuyeå n hoaù cuû a thuoá c trong cô theå…
Öu ñieåm:
- Khaû naêng taêng ñoä nhaïy haøng ngaøn laàn so vôùi phaùt hieän baèng ño ñoä haáp thu UV.
- Ñoä choïn loïc cao vì haàu heát caùc phaân töû höõu cô haáp thu aùnh saùng UV – Vis nhöng
khoâ n g phaû i taá t caû ñeà u phaù t quang, Söï phaù t quang duø n g hai böôùc soùng:  KT vaø  PX,
khaùc bieät so vôùi 1 böôùc soùng trong ño ñoä haáp thu. Duøng hai böôùc soùng laøm giaûm ñi caùc
pic gaây nhieãu.
Moät soá chaát nhö oxy coù theå laøm taét söï phaùt quang neân caàn phaûi ñuoåi khí thaät kyõ ñeå loaïi boû
chuùng.
2.7.5. Boä phaä n phaù t hieän taù n xaï aù n h saù n g bay hôi (ELSD:
Evaporative Light Scattering Detector)
Dung dịch giải hấp

Thieát bò phun
söông
Giọt nhỏ
Gia nhiệt

Phaân töû nhoû

Phaùt hieän

Caùc chaát sau khi röûa giaûi sẽ qua moät thieát bò phun söông (khí trô: nitrogen) ñeå phaân
taùn chuùng thaønh nhöõng gioït chaát loûng raát nhoû (daïng söông) ñaåy chuùng qua moät buoàng
kín ñöôïc gia nhieät. Caùc gioït chaát loûng nhoû cuûa pha ñoäng seõ hoaù hôi, caùc phaàn töû nhoû cuûa
mẫu thöû ñöôïc laøm khoâ vaø seõ xuyeân qua coác ño (flow cell), aùnh saùng laser seõ chieáu vaøo
caùc phaàn töû nhoû cuûa mẫu seõ taùn xaï aùnh saùng.
Hieän töôïng taùn xaï aùnh saùng ñöôïc ghi laïi bởi diode quang.
2.7.5. Boä phaä n phaù t hieän taù n xaï aù n h saù n g bay hôi (ELSD:
Evaporative Light Scattering Detector)

Öu ñieåm: Phaùt hieän gaàn nhö haàu heát caùc hôïp chaát. Phaùt hieän taát caû caùc hôïp chaát coù söï
bay hôi thaáp hôn söï bay hôi cuûa pha ñoäng (döôùi taùc duïng cuûa thieát bò phun söông).
Ñoä nhaïy cuûa boä phaän phaùt hieän ELSD raát cao, giôùi haïn phaùt hieän raát thaáp (ng), khoâng phöùc
taïp vaø deã vaän haønh.
Deã daøng söû duïng khi chaïy gradient vì ñoä oån ñònh cuûa ñöôøng neàn ñöôïc duy trì trong suoá t
thôø i gian chaï y gradient.
Nhöôïc ñieåm: chæ söû duïng ñöôïc vôùi caùc pha ñoäng deã bay hôi vaø maãu phaân tích phaûi coù
nhieät ñoä bay hôi cao hôn nhieät ñoä bay hôi cuûa pha ñoäng döôùi taùc ñoäng cuûa thieát bò
phun söông.
2.7.6. Boä phaä n phaù t hieä n ñieä n hoaù (electrochemical detector,
amperometric detector)

Boä phaän phaùt hieän ñieän hoaù tieän duïng trong vieäc phaùt hieän caùc hôïp chaát höõu cô coù tính
oxy hoaù-khöû vôùi ñoä choïn loïc cao. Giôùi haïn phaùt hieän thöôøng thaáp. Laø loaïi boä phaän
phaùt hieän ñôn giaûn vaø reû
Dung dòch giaûi haáp ñi vaøo Ñieàu chænh vaø ño theá
giöõa 2 ñieän cöïc
Ñieän cöïc
so saùnh

Dung dòch giaûi haáp ñi ra

Maøng ñeäm

Ñieän cöïc Ñieän cöïc chæ thò

Boä chuyeån Boä phaän xöû
ñieän theá lyù tín hieäu
2.7.7. Boä phaän phaùt hieän khoái phoå
Dung moâi sau khi ñöôïc röûa giaûi ra khoûi coät ñöôïc bôm vaøo khoái phoå
 Thuaän lôïi:
- Phaùt hieän gaàn nhö vaïn naêng vaø coù ñoä nhaïy cao, coù ñoä choïn loïc cao
- Coù theå ñònh danh ñöôïc caùc chaát tan ngay caû khi ñoä phaân giaûi chöa toát - Coù lôïi veà
thôøi gian
 Nhöôïc ñieåm
- Raát ñaét tieàn, vaän haønh phöùc taïp.
- Coù löôïng lôùn cuûa pha ñoäng ñi vaøo buoàng cuûa khoái phoå
- Söï nhaïy vôùi nhieät ñoái vôùi chaát phaân ly yeáu
Töø coät
Khí laøm OÁng chaát loûng Vuøng
muø hoaù taäp trung ion

P h u n söông

Hieäu ñieän theá

+
+
+ + +
+ + + + + + + + ++ +++ ++
++ ++++++++++++++++++
+ Töø coäät saééc kyùù++ +++ + + + ++ ++
+++++++
+ + +
+ + + +
+
 2.7.8. Boä phaä n phaù t hieä n ño cöôø n g ñoä xung (pulsed amperometry
detector)

 Heä thoáng goàm 3 ñieän cöïc:

• Ñieän cöïc ñoái chöùng
• Ñieän cöïc chæ thò
• Ñieän cöïc laøm vieäc coù beà maët nhoû laøm baèng thuûy tinh hay baèng vaøng.
 ÖÙng duïng: ñeå phaùt hieän ñöôøng, carbohydrat, alcool, aldehyd, amine,
acid amin… cuøng nhieàu chaát höõu cô coù löu huyønh.
2.7.9 Đầu dò độ dẫn điện (Conductivity detector)

• Loại đầu dò này đặc biệt hữu dụng khi thực hiện với
loại sắc ký trao đổi ion với hợp chất được ly giải ra
khỏi cột là loại hợp chất ion.
• Đầu dò này cũng bị ảnh hưởng bỏi nhiệt độ
2.8. Boä phaän xöû lyù vaø ghi tín hieäu:( Recorder or integrator)
Söû duïng trong HPLC ñoøi hoûi ñaùp öùng caùc yeâu caàu sau:
• Thaät chính xaùc vaø ña naêng
• Coù theå ño ñöôïc thôøi gian löu
• Töï ñoä ng hoaù trong vieäc phaù t hieän pic, ño dieän tích pic vaø ñieàu chænh
ñöôø n g neà n (base line correction)
• Coù khaû naêng phaân tích ñònh tính thaønh phaàn cuûa hoãn hôïp
• Xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä cuûa maãu
• Coù khaû naêng giöõ laïi caùc döõ lieäu trong boä nhôù
• Hieän nay caùc heä thoáng saéc kyù ñöôïc keát noái vôùi heä thoáng maùy vi tính, söû duïng
caùc phaàn meàm chuyeân duïng ñeå tính toaùn moät caùch nhanh choùng vaø chính
xaùc.
 CAÙC THOÂNG SOÁ ÑAËC TRÖNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP HPLC
Thôø i gian löu (Retention time)
Thôøi gian löu tR (phuùt) laø thôøi gian caàn ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi tieâm
maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho peak treân saéc kyù ñoà (tính töø luùc
tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa peak).

tR2

tR1

t0 W 1.1/2 W 2.1/2

W2
W1

to: thôøi gian caàn thieát ñeå pha ñoäng chaûy qua heä thoáng. tr1,tr2: thôøi gian löu cuûa
thaønh phaàn 1 vaø 2
w1, w2: beà roäng ñaùy cuûa ñænh haáp thu 1 vaø 2
w1/2, w2/2: beà roäng ñænh haáp thu 1 vaø 2 öùng vôùi ½ chieàu cao
tM (hoaëc to): thôøi gian löu cuûa moät chaát khoâng bò löu giöõ,
tR caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån
cuûa noù caøng nhoû.
Thôøi gian löu hieäu chænh t'R ñöôïc tính theo coâng thöùc:
t'R = t R - t M (hay t' R = t R - t o )
 CAÙC THOÂNG SOÁ ÑAËC TRÖNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP HPLC

Heä soá dung löôï ng k’ (Capacity Factor)

Heä soá dung löôïng k' laø moät ñaïi löôïng quan troïng ñöôïc duøng roäng raõi ñeå moâ taû
toác ñoä di chuyeån cuûa moät chaát.
k' phuï thuoäc vaøo baûn chaát caùc pha, baûn chaát chaát tan, nhieät ñoä vaø ñaëc ñieåm cuûa
coät.
Vôùi moät chaát, k' caøng lôùn toác ñoä di chuyeån caøng chaäm.
Ñeå taùch moät hoãn hôïp caùc chaát toát, k' töø 1 - 8. Neáu k' > 8 thì thôøi gian phaân
tích quaù daøi, neáu k' < 1 peak seõ xuaát hieän quaù sôùm deã laãn vôùi peak caùc taïp
chaát vaø dung moâi.
Giaù trò K’ toái öu 1 ≤ K’≤ 5

Ñoä choï n loï c : (Selectivity)

Heä soá choïn loïc laø ñaïi löôïng duøng ñeå moâ taû toác ñoä di chuyeån tỷ ñoái của hai chaát.
Theo qui öôùc B laø chaát bò löu giöõ maïnh hôn A vì vaäy 𝛼 luoân luoân lôùn hôn 1.
Ñeå taùch rieâng hai chaát, caàn coù 𝛼 > 1, thöôøng duøng 𝛼 töø 1,05 - 2,0.
𝛼 caøng lôùn hai chaát caøng taùch ra khoûi nhau quaù lôùn vaø thôøi gian
phaân tích seõ keùo daøi.
CAÙC THOÂNG SOÁ ÑAËC TRÖNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP HPLC
Heä soá baát ñoái xöùng T(Tailing factor/ asymetric factor)

Hình daùng lyù töôûng cuûa peak laø ñoái xöùng. Treân thöïc teá peak saéc kyù thöôøng chæ
gaàn ñoái xöùng. Ñeå ñaùnh giaù tính baát ñoái cuûa peak ngöôøi ta duøng heä soá baát ñoái.
𝑏
T=
𝑎

b: nửa chieà u roä n g phía sau của peak ñöôï c ño ở 1/10 chieà u cao của peak.
a: nửa chieà u roä n g phía trước của peak ñöôï c ño ở 1/10 chieà u cao của peak.

Tính baát ñoái cuûa peak.

Moät coät ñöôïc nhoài toát seõ coù T trong khoaûng 0.8 ≤ T≤1.2
(xaùc ñònh T vôùi ñænh cuûa caùc chaát tan chuaån).
 CAÙC THOÂNG SOÁ ÑAËC TRÖNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP HPLC
Hieäu löïc cuûa coät(Column efficiency)
Laø thoâng soá veà hieäu suaát taùch cuûa coät, ñöôïc bieåu thò bôûi hai thoâng soá: soá ñóa lyù thuyeát
N vaø chieàu cao ñóa lyù thuyeát H.
 Soá ñóa lyù thuyeát (Neff): (Theoretical Plates)

2
Neff caøng lôùn, hieäu löïc coät caøng cao (ñænh nhoïn, heïp, khoâng giaõn roäng).
 Chieà u cao ñóa lyù thuyeá t (H):
(High Equivalent to a Theoretical Plates) N: soá ñóa lyù thuyeát cuûa coät.
H: chieàu cao cuûa ñóa lyù thuyeát.

WB: chieàu roäng cuûa peak ở ñaùy peak.

W1/2: chieàu roäng cuûa peak ño ôû nöûa chieàu cao cuûa peak.
Nhö vaäy khi coät coù hieäu löïc cao (H nhoû, N lôùn) thì WB nhoû (ñoä daõng peak nhoû).
Trong saéc kyù loûng hieäu naêng cao, chieàu cao cuûa ñóa lyù thuyeát thöôøng
laø 0.03mm – 1mm. Trò soá H caøng nhoû thì hieäu löïc coät caøng cao
 CAÙC THOÂNG SOÁ ÑAËC TRÖNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP HPLC

 Ñoä phaân giaûi (hay heä soá taùch cuûa coät) (Resolution)
Ñoä phaân giaûi (Resolution) laø ñaïi löôïng ño möùc ñoä taùch hai chaát treân moät coät
saéc kyù.
Ñoä phaân giaûi Rs ñöôïc tính nhö sau:

 Rs = 0,75: hai peak khoâng taùch toát, coøn xen phuû nhau nhieàu.
 Rs = 1,0 : hai peak taùch khaù toát, coøn xen phuû nhau 4%.
 Rs = 1,5 : hai peak taùch hoaøn toaøn (chæ xen phuû 0,3%).
CAÙC THOÂNG SOÁ ÑAËC TRÖNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP HPLC

Söï taùch hai chaát A vaø B ôû 3 ñoä phaân giaûi khaùc nhau
4. ÖÙNG DUÏNG CUÛA PHÖÔNG PHAÙP SAÉC KYÙ LOÛNG HIEÄU NAÊNG CAO

HPLC laø PP PT hieän ñaïi ñöôïc öùng duïng nhieàu trong ngaønh döôïc
- Xaùc ñònh haøm löôïng cuûa thuoác trong caùc cheá phaåm,
- Xaùc ñònh ñöôïc ñoä tinh khieát cuûa caùc hoaït chaát.
- Xaùc ñònh löôïng hoaït chaát trong maùu vaø dòch sinh hoïc, caùc chaát chuyeån hoaù cuû a
chuù ng, goù p phaà n quan troïng trong vieäc ñaù n h giaù töông ñöông sinh hoïc vaø sinh khaû
duïng cuûa caùc thuoác…
- Ngoaø i ra phöông phaù p naø y cuõ n g quan troï n g trong lónh vöï c sinh hoï c , thöïc
phaåm, noâng nghieäp…
4.1. ÑÒNH TÍNH
a. Döïa vaøo thôøi gian löu
Thöôøng hai chaát gioáng nhau seõ coù thôøi gian löu truøng nhau

Maãu chuaån

Maãu chöa bieát

b. Döïa vaøo phöông phaùp theâm chaát chuaån

Maãu chöa bieát Chaát chuaån theâm vaøo
4.1. ÑÒNH TÍNH

b. Döïa vaøo phöông phaùp theâm chaát chuaån

Chaát chuaån

Maãu chöa bieát

Maãu chöa bieát + Maãu chuaån

c. Thu saûn phaåm ra khoûi coät vaø ñònh danh baèng nhöõng kyõ thuaät khaùc nhö
khoái phoå, coäng höôõng töø
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG

4.2.1. Döï a vaø o chieà u cao pic

Khi pic coù daï n g khoâ n g ñoå i thì chieà u cao pic (khoaû n g caù c h giöõ a ñöôøng neàn
vaø cöïc ñaïi cuûa ñænh) laø moät ñaïi löôïng tyû leä vôùi dieän tích cuûa pic. Chieàu cao pic
ñöôïc xaùc ñònh deã daøng baèng caùch ño thoâng thöôøng.
Ñieàu kieän ñeå aùp duïng vieäc ñaùnh giaù baèng chieàu cao pic laø caùc chæ soá k (capacity
factor) phaû i haè ng ñònh. Khi xaù c ñònh khoaû ng tuyeá n tính, vieäc ño chieàu cao
pic chæ thích hôïp khi noàng ñoä maã u töø thaáp ñeán trung bình. Tröôøng hôïp caùc
caáu töû ñöôïc röûa giaûi chaäm seõ coù khoaûng tuyeán tính roäng hôn so vôùi tröôøng
hôïp caùc caáu töû naøy ñöôïc röûa giaûi nhanh. Vôùi caùc pic coù ñöôøng neàn bò nhieãu,
vieäc xaùc ñònh chieàu cao seõ deã daøng hôn xaùc ñònh dieän tích.
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG
4.2.2. Döïa vaø o dieän tích pic
Dieän tích pic cuûa moät chaát laø töông öùng vôùi toång löôïng chaát ñoù. Ñeå tính dieä n
tích peak duø n g tích phaâ n keá hoaë c caù c phaà n meà m chuyeân duïng.
Duøng ñeå ñaùnh giaù caùc pic trong caû hai tröôøng hôïp ñöôøng neàn bò troâi hoaëc
ñöôøng neàn oån ñònh.
PP naøy chæ caàn ño ñieåm ñaàu vaø cuoái cuûa pic ñöôïc nhaän ra chính xaùc, keát quûa
toát ñoái vôùi noàng ñoä trung bình vaø cao.
Vieäc xaùc ñònh dieän tích pic phaûi ñöôïc söû duïng trong caùc tröôøng hôï p yeá u toá
dung löôï ng k’ (capacity factor) thay ñoå i vì aû n h höôû n g cuûa caùc chaát khaùc.
Vieäc tính toaùn dieän tích pic seõ gaëp khoù khaên khi pic coù cöôøng ñoä quaù cao
hoaëc bò daõn, khoâng ñoái xöùng vaø ñöôøng neàn khoâng oån ñònh.
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG
4.2.2. Döïa vaø o dieän tích pic

Mẫu chuẩn 1mg/ml

So sánh diện tích pic suy ra
Thể tích bơm 10𝝁l được hàm lượng của mẫu thử

Mẫu thử
Thể tích bơm 10𝝁l
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG
4.2.2.1. Chuaån hoùa vôùi chaát chuaån ngoaïi (PP chuaån ngoaïi)
So saùnh tröïc tieáp ñoä lôùn cuûa caùc tín hieäu (dieän tích pic hoaëc chieàu cao pic) cuûa
maãu thöû vaø maåu chuaån ñoái chieáu. Yeâu caàu bôm caùc theå tích xaùc ñònh trong
cuøng ñieàu kieän saéc ký. Coù theå tieán haønh ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau (chuaån hoùa
moät ñieåm hay nhieàu ñieåm). Trong phöông phaùp chuaån moät ñieåm noàng ñoä cuûa
maãu coù theå ñöôïc tính nhö sau:
Ca: noàng ñoä cuûa maãu thöû
Cst: noàng ñoä cuûa chaát chuaån

Sa: ñoä lôùn cuûa pic maãu thöû (dieän tích hoaëc chieàu cao pic)
Sst: ñoä lôùn cuûa pic maãu chuaån

Vôù i caù c phöông phaù p xaù c ñònh hai hay nhieà u ñieå m , phöông trình ñöôøng
cong chuaån phaûi ñöôïc xaùc ñònh qua vieäc khaûo saùt caùc ñieåm ño keát hôïp vôùi
phöông phaùp phaân tích hoài qui.
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG
4.2.2.2. Chuaån hoùa vôùi chaát chuaån noäi (PP chuaån noäi)
Chaát chuaån noäi: laø chaát coù caáu truùc hoùa hoïc töông öùng vôùi chaát khaûo saùt. Trong
cuøng ñieàu kieän saéc kyù, chaát chuaån noäi phaûi coù thôø i gian löu gaà n vôù i thôø i
gian löu cuû a chaá t caà n phaâ n tích trong maãu vaø phaûi ñöôïc taùch hoaøn toaøn. Ñoä
nhaïy phaùt hieän cuûa chaát chuaån noäi vaø chaát caàn phaân tích thöôøng khaùc nhau, vì
theá yeáu toá hieäu chænh F x phaûi ñöôïc xaùc ñònh ñaàu tieân vôùi dung dòch chuaån
tinh khieát.
Neáu goïi Cx laø noàng ñoä cuûa dung dòch chuaån
CIS laø noàng ñoä cuûa dung dòch chaát chuaån noäi
Sx laø ñoä lôùn cuûa pic chuaån (chaát chuaån ngoaïi)
SIS laø ñoä lôùn cuûa pic chuaån noäi

Thì
Neáu yeáu toá hieäu chænh Fx laø haèng soá trong vuøng noàng ñoä nghieân cöùu, thì noàng
ñoä Cs cuûa moät maãu maø trong ñoù ngöôøi ta ñaõ theâm chaát chuaån noäi coù theå tính
nhö sau
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG
4.2.2.3. Chuaån hoaù baèng phöông phaùp theâm
Ñöôïc söû duïng trong HPLC chuû yeáu khi coù vaán ñeà aûnh höôûng cuûa chaát phuï.
Dung dòch maãu thöû ñöôïc theâm moät löôïng xaùc ñònh cuûa chaá t chuaå n, caù c pic
thu ñöôï c cuû a caû hai dung dòch maã u thöû vaø maãu thöû theâm chaát chuaån vaøo phaûi
ñöôïc khaûo saùt trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù. PP theâm chaát chuaån coù theå ñöôïc
thöïc hieän moät laàn, hai hay nhieà u laà n . Trong tröôø ng hôï p ñôn giaû n nhaá t vôù i
moä t laà n theâm chaát chuaån, noàng ñoä chöa bieát cuûa maãu C a ñöôïc tính baèng söï
cheânh leäch noàng ñoä ∆C (löôïng chaát chuaån theâm vaøo) vaø ñoä taêng cuûa ñoä lôùn
pic ∆S theo coâng thöùc sau

Vôùi phöông phaùp theâm nhieàu laàn, noàng ñoä cuûa maãu chuaån ñöôïc tính toaùn
baèng PP phaân tích hoài qui.
Öu ñieåm cuûa PP theâm chaát chuaån laø coù ñoä chính xaùc cao vaø loaïi tröø ñöôïc caùc
yeáu toá aûnh höôûng khaùc. Söï thay ñoåi lôùn veà nhieät ñoä, aùp suaát ñaõ ñöôïc moâ taû buø tröø
trong ñoà thò chuaån maø khoâng aûnh höôûng ñeán keát quûa. Tuy nhieân PP naøy ñoøi
hoûi nhieàu thôøi gian phaân tích vì phaûi chuaån hoùa ñoái vôùi töøng maãu.
4.2. ÑÒNH LÖÔÏNG
4.2.2.4. Phöông phaù p qui veà 100% dieä n tích pic
PP ñôn giaû n nhöng öùng duïng haïn cheá trong HPLC, thöôøng hay ñöôï c
duø n g trong GC. PP naø y ñoø i hoû i moï i caá u töû trong hoã n hôï p caàn phaân tích ñeàu
phaûi ñöôïc röûa giaûi vaø phaùt hieän. Khi coù söï ñaùp öùng cuûa boä phaän phaùt hieän treân caùc
caáu töû X, Y, Z vôùi cuøng cöôøng ñoä tín hieäu, coâng thöùc tính:

%, X: giaù trò % cuûa caáu töû X trong hoãn hôïp X, Y, Z

Ax, Ay, Az: dieän tích pic cuûa caáu töû X, Y, Z.
Trong HPLC, coâng thöùc naøy chæ ñuùng khi söï ñaùp öùng cuûa boä phaän phaùt hieän treân
caùc caùu töû X, Y, Z laø nhö nhau.
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi lên độ phân
giải
30% 40% 50%
MeOH MeOH MeOH

70% MeOH
60% MeOH
Ảnh hưởng của dung môi lên độ phân
giải
50% 32% 25% THF
MeOH THF 17%
50% H2O 68% H2O MeOH
58% H2O
Ảnh hưởng của pha tĩnh lên độ phân
giải
Cột C18 Cột phenyl

Cột cyano

A. cortison; B. dexamethason; C. corticosteron; D. orthonitrophenol;

E. flourobenzen. Bước sóng phát hiện: 254 nm
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC
Sự cố Pump nguyên nhân Cách sử lý
1 – Áp suất pump Do đường dung môi Kiểm tra độ kín của
không kín đường dung môi vào.
không lên
hoặc có bọt khí nhỏ Đuổi dung môi cho
trong các đường dung đến khi hết bọt
môi

Tắc nghẽn check vane Tháo Check vane in

in và check vane out rửa, siêu âm bằng acid
do kết tủa ,bẩn HNO3 10 ->15%
Sau rửa lại nhiều lần
bằng nước cất đã lọc
qua 0.45 m
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố Pump nguyên nhân Cách sử lý

1 – Áp suất pump - Đường dẫn dung Kiểm tra đường dẫn
không lên môi đến cột không kín dung môi sau pump
đến cột .

- Hết dung môi ,pha Thay dung môi

động
- Hỏng đầu dò áp suất Thay đầu dò áp suất
2- Áp suất không ổn - Dung môi pha động Kiểm tra dung môi
định còn bọt khí pha động ,Degare
hoặc đường dẫn dung và đường dẫn
môi đến column
không kín
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố Pump nguyên nhân Cách sử lý

- Vane chia dung môi - Kiểm tra vane chia
không kín dung môi (nghe tiếng và
dòng dung môi)
3- Bơm không hoạt động -Cài đặt thông số áp suất Kiểm tra lại các thông
max,min. số trong method, pump,
-Column tắc nghẽn Vượt column
quá áp suất .

4- Đường nền không ổn -Dung môi còn bọt khí -Đuổi lại khí cho dung
-Vane chia dung môi môi, Degass
không kín -Kiểm tra vane chia mẫu
(có thể có bọt khí trong
vane làm cho vane đóng
không kín)
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố Pump nguyên nhân Cách sử lý

5- Bơm rửa hoạt động -Hết nước rửa sau piton -Kiểm tra thường xuyên
liên tục pump cao áp. và bổ sung đầy đủ nước
rửa (rất quan trọng)
-Hở, tuột hoặc rách -Kiểm tra chắc chắn kín
đường dẫn của pump và thay thế nếu cần thiết
nhu động khi bị rách
-Hỏng cảm ứng -Nhờ Kỹ thuật của hãng
kiểm tra thay thế
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố Nguyên nhân Cách sử lý

Autosample
1- Diện tích mẫu - Syring bơm mẫu còn bọt - Đuổi bọt xilanh
tiêm không lặp -Vòng chắn kim tiêm không - Thay vòng chắn kim tiêm
lại kín -Thay đầu piston của xy lanh
-Piston trong xylanh tiêm - Kiểm tra dung môi rửa kim
quá mòn , không kín tiêm mẫu (MeOH)
-Hết dung môi rửa kim tiêm
mẫu và vòng loop. -Rửa lại vòng loop cho sạch
-Vòng loop không sạch -Pha lại mẫu để giảm nồng
-Nồng độ mẫu quá cao nên độ hoặc tiêm thể tích nhỏ
rửa sau bơm không sạch hết hơn.
2- Autosample -Không có mẫu ở vị trí trong - Kiểm tra vị trí để dung môi
không chạy rack . trong rack có đúng với trong
Hoặc báo lỗi -Kẹt đầu kim bơm mẫu ở vị bảng sample không
trí rửa kim
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố Nguyên nhân Cách sử lý

Autosample
3- Autosample -Rack bị kênh chưa vào -Kiểm tra lại các rack cho
không khởi động đúng khớp đúng vị trí và khớp
được - Khai báo loại Rack trong -Khai báo đúng cấu hình của
cấu hình chưa đúng. loại Rack
4- Autosample -Không có mẫu tại vị trí tiêm -Đặt mẫu đầy đủ và đúng vị
không lấy được mẫu trí của khay chứa mẫu
mẫu. Treo phần - Các lọ đựng mẫu không - sử dụng lọ và nắp đúng qui
mềm đúng qui cách, nắp đậy mẫu định
không đúng
- Lệch hẳn các vị trí của toàn - Phải calibration (hiệu
khay đựng mẫu chỉnh) lại vị trí của kim tiêm
và khay đựng mẫu (thường
là kỹ thuật viên của hãng
thực hiện)
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố Detector Nguyên nhân Cách sử lý

1- Lỗi quá giới hạn hấp -Bước sóng quá thấp và - Điều chỉnh lại bước
thu làm treo phần mềm hệ pha động có độ hấp sóng đo.
điều khiển (monitor) thu cao . -Thay hệ pha động có độ
hấp thu nhỏ hơn.
- Đèn hết năng lượng - Thay các đèn hết năng
(D2 và W) lượng tương ứng.

2- Treo toàn hệ thống, - Tắc nghẽn đường ống -Phải rửa kỹ các đường
áp suất vượt qui định tại Detector dẫn theo đúng qui trình
(Nguy hiểm) rửa sau mỗi lần phân
tích.
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC
Sự cố Phần mềm Nguyên nhân Cách sử lý

1- Lỗi làm treo phần -Lỗi khai báo phần cứng - Khai báo lại phần cứng
mềm điều khiển không đúng . cho đúng
(monitor) -Lỗi trên phương pháp phân -Khai báo phương pháp
tích (khai báo không đúng phân tích đúng theo các
các điều kiện mà phần mềm điều kiện đã có .
có thể chấp nhận được.)
-Khai báo Detector không -Khai lại thông số đèn
đúng (vd đèn,bước sóng)và đúng bước sóng,khai
các cấu hình khác cấu hình đúng
- Đèn hết năng lượng (D2 và - Thay các đèn hết năng
W) lượng tương ứng.
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Sự cố column Nguyên nhân Cách sử lý

1-Áp suất column -Cột bị tắc nghẽn - Rửa , hoạt hoá lại
lên quá cao column
- Thay đổi pha động,
-Pha động không phù hợp điều kiện phân tích phù
với column ( Tỷ lệ pha hợp.
động, Tốc độ dòng
Flow/phút)
2- Column chảy -Lắp column chưa kỹ -Lắp lại Column
dung môi -vòng đệm không cân xứng -Thay vòng đệm bằng
dụng cụ chuyên dùng
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC
Các thông số peak Nguyên nhân Cách sử lý

1 -Peak không đối xứng -Column không tương -Thay đổi column nếu
2- Các Peak không tách ứng cần thiết trong điều kiện
giống như bình thường có thể (vd
3- Peak bị chẻ ,gãy -Hệ pha động chưa đạt R188CN..)
thành 02 peak yêu cầu. -Thay đổi tỷ lệ hệ pha
động(ACN,MeOH,
đệm.........)
-Điều chỉnh pH pha
động.
-Column bị dơ do rửa -Rửa lại column hay
không sạch,còn nhiều hoạt hoá lại column
tạp chất chứa trong - Thay column mới
column
 CÁC SỰ CỐ THƯỜNG GẶP TRONG HPLC

Các thông số peak Nguyên nhân Cách sử lý

-Nồng độ phân tích quá -Giảm nồng độ phân

cao (gây bão hòa cột) tích
- Thể tích tiêm mẫu quá -Giảm thể tích tiêm mẫu
lớn (thường khoảng 10-20
µl)
BẢO TRÌ HỆ THỐNG HPLC
 BẢO TRÌ HỆ THỐNG HPLC
YÊU CẦU CHUNG:
Để hệ thống HPLC luôn được hoạt động tốt, ổn định cần phải đáp ứng các yêu
cầu:
1- Vị trí lắp đặt hệ thống trong điều kiện môi trường tốt : Nhiệt độ, độ ẩm, môi
trường sạch bụi, đặc biệt là độ rung.
2- Điều kiện điện áp ổn định, có bộ lưu điện online, đủ dung lượng hoạt động ít
nhất 30 phút khi có sự cố mất điện
3- Người vận hành phải được đào tạo vận hành và có kiến thức về HPLC.
4- Mẫu phải chuẩn bị đúng qui định, lọc qua fill lọc phù hợp với column sử dụng.
Sử dụng đúng dung môi và hóa chất tinh khiết cho HPLC
5- Hệ thống HPLC phải được bảo trì và hiệu chuẩn theo đúng qui định để đẩm bảo
hệ thống hoạt động tốt và cho kết quả chính xác, có độ tin cậy cao. Hệ thống phải
được sử dụng thường xuyên.
 BẢO TRÌ HỆ THỐNG HPLC
BẢO TRÌ HỆ THỐNG HPLC:
Việc bảo trì hệ thông HPLC rất quan trọng để thiết bị luôn trong tình trạng
hoạt động tốt và sử dụng được lâu dài theo thời gian .
I- BẢO TRÌ PUMP
1- Vệ sinh bên ngoài pump hàng tháng. Bên trong pump ít nhất 2 năm/ lần (thông
thường nhờ kỹ thuật viên bảo trì của hãng) để đảm bảo các bản mạch của, bộ phận
giải nhiệt luôn sạch sẽ không bám bụi bẩn quá nhiều.
2- Các đường dẫn dung môi, các bình đựng hệ đệm, nước rửa phải chắc chắn luôn
sạch không đóng cặn, mốc. (trong trường hợp bị bẩn phải vệ sinh ngay bằng cách gỡ
đường ống và đem lắc siêu âm với dung môi chứa bên trong thích hợp)
3- Không bao giờ được để dung dịch rửa piton pump hết dung môi rửa cũng như
dung dịch đóng cặn
 BẢO TRÌ HỆ THỐNG HPLC
II- BẢO AUTOSAMPLER
1- Vệ sinh bên ngoài Autosampler hàng tháng. Bên trong ít nhất 2 năm/ lần (thông
thường nhờ kỹ thuật viên bảo trì của hãng) để đảm bảo các bản mạch của, bộ phận
giải nhiệt luôn sạch sẽ không bám bụi bẩn quá nhiều.
2- Phải tra dầu máy hoặc vaseline vào các trục cách tay tiêm mẫu của kim tiêm mẫu,
syringe tiêm để máy chạy nhẹ nhàng và êm. Thường 3 tháng 01 lần.
3- Dùng vải không sơ lau nhẹ nhàng kim tiêm và vòng bên ngoài vòng đệm kim
tiêm cho sạch (Trong trường hợp cần thiết có thể gỡ vòng đệm kim tiêm ra để siêu
âm cho sạch, sau đó lắp lại)
4- Lau toàn bộ khoang, khay chứa mẫu.
5- Không bao giờ được để dung dịch rửa syringe, loop hết dung môi rửa cũng như
dung dịch đóng cặn.
 BẢO TRÌ HỆ THỐNG HPLC
III- BẢO TRÌ AUVENCOLUMN
1- Vệ sinh bên ngoài Auvencolumn hàng tháng. Bên trong ít nhất 2 năm/ lần
(thông thường nhờ kỹ thuật viên bảo trì của hãng) để đảm bảo các bản mạch
của, bộ phận giải nhiệt luôn sạch sẽ không bám bụi bẩn quá nhiều.
2- Lau toàn bộ khoang chứa cột, cảm ứng rò rỉ sạch.
IV- BẢO TRÌ DETECTOR
Thường Detector chỉ cần vệ sinh sạch sẽ và kiểm tra các đường ống nối đầu
ra của hệ sắc kí.
Lưu ý : Không mở các nắp đậy của đèn, đường kết nối vào, ra của detector khi
không có chỉ dẫn.