BIOLOGIA MOLEKULARNA TECHNOLOGIA BIOMEDYCZNA, II ROK STOPIEŃ I

Centrum Immunoterapii Komórkowych SGGW

Przepisywanie RNA na cDNA i reakcja PCR

ĆWICZENIE NR 8

1. WPROWADZENIE

W ostatnich latach kwasy nukleinowe stały się ważnymi biomateriałami, które

zrewolucjonizowały dziedzinę biomedycyny. Kwasy nukleinowe, w tym kwas
dezoksyrybonukleinowy (DNA) i kwas rybonukleinowy (RNA) posiadają unikalne właściwości,
takie jak zdolność rozpoznawania molekularnego, programowalność i łatwość syntezy, co czyni je
wszechstronnymi narzędziami w regulacji genów, dostarczaniu leków i terapii celowanej. Kwasy
nukleinowe znalazły zastosowanie jako samoorganizujące się elementy budulcowe, co
doprowadziło do powstania nanostruktur o wysokiej stabilności biologicznej i o dużej sprawności
wychwytu komórkowego. Zwłaszcza krótkie sekwencje kwasów nukleinowych odgrywają
kluczową rolę w rozwikłaniu złożonych mechanizmów biologicznych. Służą jako sondy do
badania ekspresji genów, interakcji białek i szlaków komórkowych, zapewniając bezcenny wgląd
w podstawowe procesy biologiczne. Badając synergistyczne wzajemne oddziaływanie kwasów
nukleinowych jako biomateriałów i oligonukleotydów jako niezbędnych narzędzi do badań
biologicznych i biomarkerów można zauważyć znaczny wpływ tych cząsteczek na prowadzone
obecnie badania biomedyczne. Ich wszechstronne zastosowania nie tylko pogłębiają naszą wiedzę
o układach biologicznych, ale także stanowią siłę napędową innowacji w diagnostyce i terapii,
ostatecznie przyczyniając się do postępu w dziedzinie biomedycyny. Jedną z najważniejszych
reakcji wykorzystującej kwasy nukleinowe w biologii molekularnej jest reakcja PCR
(polymerase chain reaction).

1.1. Przepisanie RNA na cDNA

Odwrotna transkrypcja to synteza DNA z matrycy RNA (Rycina 1). Proces ten jest
przeprowadzany przez zależne od RNA polimerazy DNA, znane również jako odwrotne
transkryptazy.
Rycina 1. Uniwersalny przepływ informacji genetycznej w przyrodzie. Źródło: Thermofisher.com

W latach siedemdziesiątych XX wieku dwa zespoły naukowe, jeden kierowany przez

Howarda Temina z Uniwersytetu Wisconsin i drugi pod kierownictwem Davida
Baltimore'a z MIT, niezależnie zidentyfikowały nowe enzymy związane z replikacją
wirusów RNA zwane retrowirusami. Enzymy te, zwane odwrotnymi transkryptazami,
przekształcają wirusowy RNA w komplementarną cząsteczkę DNA (cDNA), która
następnie integruje się z genomem gospodarza. W 1975 roku Temin i Baltimore otrzymali
Nagrodę Nobla.
Odwrotne transkryptazy zidentyfikowano w wielu organizmach, w tym w bakteriach,
zwierzętach i roślinach, a także w wirusach. Naturalną rolą odwrotnej transkryptazy jest
przekształcanie sekwencji RNA w sekwencje cDNA, które można wstawić w różne
obszary genomu. W ten sposób odwrotna transkrypcja przyczynia się do:
 Rozmnażania retrowirusów — np. ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV),
wirusa mysiej białaczki Moloneya (M-MuLV) i wirusa ptasiej mieloblastozy
(AMV) [1,2]
 Różnorodności genetycznej u eukariontów poprzez mobilne elementy
transpozycyjne zwane retrotranspozonami
 Replikacji końców chromosomów zwanych telomerami
 Syntezy pozachromosomalnych elementów chimerycznych DNA/RNA zwanych
wielokopiowymi jednoniciowymi DNA (msDNA) w bakteriach

Chociaż odwrotne transkryptazy pełnią funkcjonalną rolę w układach biologicznych,

służą również jako ważne narzędzia do badania RNA. W biologii molekularnej po raz
pierwszy zastosowano odwrotne transkryptazy do produkcji cDNA w celu
zbudowania bibliotek. Biblioteki cDNA zawierają kopie DNA mRNA z komórek i
tkanek i służą do zrozumienia aktywnie ulegających ekspresji genów i ich funkcji w
określonym punkcie czasowym. Chociaż utworzenie bibliotek cDNA było ważnym
krokiem w charakteryzowaniu genów podlegających ekspresji, badania materiału z
małą ilością RNA nadal pozostawały wyzwaniem. Problem ten rozwiązano
opracowując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), technikę amplifikującą małe
 ilości materiału genetycznego. Odwrotna transkrypcja połączona z PCR, czyli PCR z
odwrotną transkrypcją (RT-PCR), umożliwia detekcję RNA nawet przy bardzo niskim
poziomie ekspresji genów. cDNA może też służyć jako szablon w zastosowaniach
takich jak mikromacierze i sekwencjonowanie RNA, co umożliwia
scharakteryzowanie nieznanych RNA w szybki sposób.

1.2. Metoda PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR, to jedna z kluczowych technik w biologii

molekularnej, polegająca na amplifikacji pojedynczej cząsteczki DNA w milionach kopii w
krótkim czasie. Ma szeroki zakres zastosowań, od badań podstawowych po diagnostykę chorób,
agrigenomikę i kryminalistykę. W swoim założeniu przypomina nieco naturalną replikację DNA
w komórce.

Replikację jednoniciowego DNA z matrycy przy użyciu syntetycznych starterów i polimerazy

DNA po raz pierwszy opisano już w latach 70. XX wieku. Niemniej jednak metoda PCR, jaką
znamy dzisiaj, służąca do amplifikacji docelowego DNA, została opracowana jako narzędzie
badawcze dopiero w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa. Za swoje badania Kary Mullis otrzymał w
1993 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

PCR to proces biochemiczny umożliwiający amplifikację pojedynczej cząsteczki DNA.

Amplifikację przeprowadza się w trzech etapach:

(1) denaturacja, podczas której dwuniciowe matryce DNA są podgrzewane w celu rozdzielenia
nici

(2) hybrydyzacja, podczas której krótkie cząsteczki DNA zwane starterami (primerami) wiążą się
z regionami flankującymi docelowego DNA

(3) wydłużenie, podczas którego polimeraza DNA wydłuża koniec 3' każdego startera wzdłuż nici
matrycy.

Etapy te powtarza się („cyklicznie”) 25–35 razy, aby w wykładniczy sposób uzyskać dokładne
kopie docelowego DNA (Rycina 2). Przez lata podstawowe zasady PCR pozostały takie same, ale
metody ewoluowały i stawały się coraz bardziej wydajne.
Rycina 2. Etapy reakcji PCR i tempo amplifikacji DNA

Polimerazy DNA są kluczowymi składnikami reakcji PCR, ponieważ syntetyzują nowe

komplementarne nici z jednoniciowych matryc DNA. Wszystkie polimerazy DNA wykazują
aktywność polimerazy 5′ → 3′, która polega na włączaniu nukleotydów w celu wydłużania starterów
na ich końcach 3′ w kierunku od 5’ do 3’ (Rycina 3).

Rycina 3. Polimeraza DNA dodająca nukleotydy do końca 3' primera (startera)

Jako pierwszy w reakcjach PCR używany był fragment Klenowa polimerazy DNA I z E. coli, który
wykorzystano do wytworzenia nowych nici potomnych. Jednakże ten enzym jest wrażliwy na ciepło i
łatwo ulega zniszczeniu w wysokich temperaturach denaturujących, które normalnie poprzedzają
etapy przyłączania i wydłużania. Zatem enzym wymagał uzupełnienia na etapie drugim (annealing) w
każdym cyklu całego procesu.
Odkrycie termostabilnych polimeraz DNA okazało się ważnym krokiem, otwierającym ogromne
możliwości udoskonalenia metod PCR poprzez umożliwienie długoterminowej stabilności reakcji.
Jedną z najbardziej znanych termostabilnych polimeraz DNA jest polimeraza DNA Taq, wyizolowana
z termofilnego gatunku bakterii Thermus aquaticus w 1976 roku. W pierwszym raporcie z 1988 r.
badacze wykazali, że polimeraza DNA Taq utrzymuje aktywność powyżej 75°C, umożliwiając ciągłą
pracę cykliczną bez ręcznego dodawania świeżego enzymu, a tym samym umożliwiając
automatyzację przepływu pracy. Co więcej, w porównaniu z polimerazą DNA z E. coli, polimeraza
DNA Taq wytwarzała dłuższe amplikony PCR z wyższą czułością, specyficznością i wydajnością.
Pomimo tego, że polimeraza DNA Taq znacząco poprawiła protokoły PCR, enzym nadal wykazywał
pewne wady. Polimeraza DNA Taq jest stosunkowo niestabilna w temperaturze powyżej 90°C
podczas denaturacji nici DNA. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku matryc DNA o dużej
zawartości GC i/lub silnych struktur drugorzędowych, które wymagają wyższych temperatur do
separacji. Enzymowi brakuje również działania korygującego; dlatego polimeraza DNA Taq może
błędnie włączyć nukleotydy podczas amplifikacji. Tam, gdzie dokładność sekwencji ma kluczowe
znaczenie, amplikony PCR zawierające błędy nie są pożądane. Tak dzieje się w przypadku
klonowania i sekwencjonowania. Ponadto podatna na błędy natura polimerazy DNA Taq przyczynia
się do jej niezdolności do amplifikacji fragmentów dłuższych niż 5 kb. Aby przezwyciężyć te
niedociągnięcia, stale opracowuje się skuteczniejsze polimerazy DNA, aby wykorzystać moc PCR w
różnych zastosowaniach biologicznych.
Termocykler to instrument, który automatyzuje cykle temperaturowe i czas inkubacji podczas PCR.
Przed wprowadzeniem termocyklerów PCR był pracochłonnym procesem polegającym na
przenoszeniu próbek pomiędzy łaźniami wodnymi o różnych temperaturach i wymagającym
dokładnego określenia czasu każdego etapu. Termocykler wraz z odkryciem polimerazy DNA Taq
sprawiły, że automatyzacja PCR stała się możliwa. Termocyklery utorowały także drogę do
opracowania instrumentów do ilościowego PCR, które łączą amplifikację PCR z wykrywaniem w
czasie rzeczywistym akumulacji produktu PCR (Real Time PCR).

1.3 Wizualizacja i analiza przy użyciu elektoforezy żelowej

Elektroforeza żelowa jest powszechną techniką laboratoryjną w biologii molekularnej służącą do

identyfikacji, oznaczania ilościowego i oczyszczania kwasów nukleinowych. Ze względu na swoją
szybkość, prostotę i wszechstronność metoda ta jest szeroko stosowana do rozdzielania i analizy
kwasów nukleinowych. Za pomocą elektroforezy żelowej kwasy nukleinowe w zakresie około 100
bp–25 kb można oddzielić do analizy w ciągu kilku minut do kilku godzin, a oddzielone kwasy
nukleinowe można ponownie odzyskać z żeli ze stosunkowo wysoką czystością i wydajnością.

Elektroforeza żelowa polega na przyłożeniu pola elektrycznego do matrycy żelowej, przez którą
migruje mieszanina fragmentów kwasów nukleinowych. Szybkość migracji cząsteczek zależy od
rozmiaru, ładunku i struktury cząsteczki. Grupy fosforanowe szkieletów rybozo-fosforanowych
kwasów nukleinowych są naładowane ujemnie przy pH obojętnym do zasadowego (Rycina 4A). W
związku z tym każdy nukleotyd niesie netto ładunek ujemny, a całkowity ładunek cząsteczki kwasu
nukleinowego jest proporcjonalny do całkowitej liczby nukleotydów lub jej masy.

Poddane działaniu pola elektrycznego kwasy nukleinowe migrują z elektrody ujemnej (katody) w
kierunku elektrody dodatniej (anody); krótsze fragmenty o mniejszej masie poruszają się szybciej niż
dłuższe fragmenty o większej masie, co skutkuje separacją na podstawie rozmiaru (Rycina 4B).
Odległości, na jakie migrują fragmenty kwasów nukleinowych w matrycy żelowej, korelują z ich
rozmiarem.
Rycina 3 Mechanizm elektroforezy żelowej. A. Negatywny ładunek kwasów nukleinowych wynika z negatywnego ładunku
reszty fosforanowej. B. Kwasy nukleinowe nałożone na żel w okolicy ujemnej katody będą wędrowały w kierunku dodatnio
naładowanej anody.

Separacja na podstawie wielkości jest wiarygodna, gdy fragmenty mają porównywalną strukturę. W
przypadku liniowych dwuniciowych fragmentów DNA odległość migracji jest odwrotnie
proporcjonalna do log masy cząsteczkowej. W celu uzyskania przybliżonego rozmiaru odległości
migracji próbek porównuje się z odległościami migracji cząsteczek o znanych rozmiarach (standardy
masy cząsteczkowej), czasami nazywanych drabinkami.

2. Ćwiczenia Praktyczne – reakcja PCR i wizualizacja przy użyciu elektroforezy

żelowej

Cel: Ocena wpływu hipoksji na ekspresję genu NDRG1 za pomocą metody PCR.

2.1 Przepisanie RNA na jednoniciowe cDNA (wykonano przed ćwiczeniami przez

prowadzącego ćwiczenia ze względu na ograniczenia czasowe)

Uwaga! Wszystkie czynności dotyczące RNA i DNA bezwzględnie przeprowadzamy w

jednorazowych rękawiczkach – kwasy nukleinowe ulega degradacji pod wpływem
enzymów znajdujących się na naszej skórze
 Uwaga! Wszystkie czynności dotyczące obróbki RNA i RNA wykonujemy za pomocą
jałowych tipsów z filtrami i w probówkach, które posiadają certyfikaty RNAse i DNAse
free

Na poprzednich zajęciach wyizolowano RNA z hodowli komórkowych MDA-MB-231 p.

15, które hodowano przez 24h w warunkach normoksyjnych (20% O 2), albo hipoksyjnych
(1%O2). RNA zamrożono w -80°C.

Do przepisania RNA na cDNA wykorzystano zestaw High-Capacity cDNA Reverse

Tanscription Kit firmy ThermoFisher Scientific.

1. Wyliczono* w jakiej objętości znajduje się 1ug (1000ng) RNA dla każdej próbki. Jeśli
stężenie próbki wynosiło <100ng/uL, to do reakcji dodano maksymalną objętość
RNA, czyli 10uL RNA

* W sprawozdaniu należy samodzielnie wykonać te obliczenia dla własnych próbek

2. Elementy zestawu zostały rozmrożone na lodzie

3. Obliczono objętość składników potrzebnych do przygotowania odpowiedniej ilości
reakcji (22+3 zapasowe próbki studenckie*……uL) i zmieszano w probówce o
pojemności 1,5 mL.

Składnik tworzący 2X RT master mix Objętość na 1 reakcję

10X RT Buffer 2,0 uL
25X dNTP MIX (100mM) 0,8 uL
10X RT Random Primers 2,0 uL
MultiScribe Reverse Transcriptase 1,0 uL
Nuclease-free H2O 4,2 uL
Total per Reaction 10,0 uL

4. Przeniesiono po 10uL 2XRT master mix do 22 probówek o objętości 200uL.

5. Przeniesiono po 1ug RNA do każdej probówki i uzupełniono wodą jałową do
końcowej objętości 20uL.
6. Zamknięto probówki.
7. Wykonano szybkie wirowanie, żeby pozbyć się bąbelków powietrza i przenieść
zawartość płynna na dno probówki.
8. Probówki przechowywano na lodzie aż do czasu przeniesienia do termocyklera.
 9. Termocykler zaprogramowano w następujący sposób, zgodnie z zaleceniami
producenta zestawu do przepisywania RNA na cDNA

Ustawienia Krok 1 Krok 2 Krok 3 Krok 4

Temp. 25°C 37°C 85°C 4°C
Czas 10 minut 120 minut 5 minut Hold

10. Po włożeniu probówek do termocyklera rozpoczęto proces.

11. Po zakończeniu przepisywania probówki z uzyskanym jednoniciowym cDNA
przełożono ponownie na lód, dodano do nich po 80uL wody jałowej, przepipetowano i
zmierzono stężenie w NanoDrop.
2.2 Wykonanie reakcji PCR
Uwaga! Wszystkie składniki reakcji przechowujemy na lodzie
1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną do PCR (w sumie 25uL na próbkę) – każda grupa
przygotowuje w sumie 4 próbki:
a. Hipoksja i starter NDG1
b. Hipoksja i starter EDF1
c. Normoksja i starter NDG1
d. Normoksja i starter EDF1
Mieszaninę reakcyjną przygotowujemy w probówkach 200uL przeznaczonych do
reakcji PCR.

Odczynnik Objętość
2x PCR Master Mix 12,5uL
Mieszanina Primerów 1uL
Matryca cDNA ____uL (100ng)
Woda ultraczysta Dopełnić do 25uL

2. Wybrać gotowy schemat na termocyklerze przeznaczony do zestawu MCE

MedChemExpress PCR Master Mix (with Dye)
3. Po reakcji przechowywać próbki na lodzie

2.3 Przygotowanie 1,5% żelu agarozowego i wizualizacja reakcji PCR

Uwaga! Składniki żelu są potencjalnie rakotwórcze- pracujemy pod wyciągiem i w

rękawiczkach!
1. Odważ 1,5grama agarozy firmy BioRad na wadze laboratoryjnej
2. Upewnij się, że wyciąg jest uruchomiony
3. Do szklanej zlewki znajdującej się pod wyciągiem odmierz szklanym cylindrem
miarowym 100 ml odczynnika numer 138 (1xTBE) i wsyp agarozę i wymieszaj
4. Zlewkę podgrzej w mikrofalówce (maksymalna moc, około 1 minuty). Zawartość ma
stać się przeźroczysta
5. Ochłodzić zlewkę do temperatury ciała
6. Dodaj do zlewki barwnik do DNA 5uL firmy Syngen (z chłodni)
7. Zmontuj zestaw do wylewania żelu
8. Wylej zawartość zlewki na zestaw, włóż drabinkę do wycinania dołków w
odpowiednie zagłębienie i zostaw na 15 minut pod wyciągiem
9. Zalej urządzenie roztworem TBE do kreski maksymalnej
10. Nałóż drabinkę DNA (DNA marker) z lodówki numer 3 – po 5uL do pierwszego i
ostatniego dołka
11. Nałóż po 20uL próbki na każdy dołek w kolejności – Normoksja NDG1, Hipoksja
NDG1, Normoksja EDF1, Hipoksja EDF1
12. Puść żel w 100V, około 30-40 minut, aż widoczny przód drabinki osiągnie ok. 70-
80% żelu
13. Żel odczytujemy w iBright1500 invitrogen Thermo Fisher na ustawieniu Nucleic
Acids i automatycznym odczycie (maszyna dobrze samodzielnie ustawia parametry
naświetlania naszego żelu).