IZOLACJA RNA CAŁKOWITEGO

Z KOMÓREK ZWIERZĘCYCH,
OCENA JEGO JAKOŚCI ORAZ
REAKCJA PCR

Zuzanna Kochańska, Dominika Filkowska,

Kamila Chwedorczuk, Małgorzata Słowińska
Grupa II
05.06.2024

1. WPROWADZENIE
Celem izolacji kwasów nukleinowych jest uzyskanie czystego materiału genetycznego
pozbawionego takich związków jak białka, polisacharydy. Izolacji RNA można dokonać na
wiele różnych sposobów. Do głównych metod należą: metoda fenolowo-chloroformowa,
metoda TRIzolowa, metoda kolumnowa, metoda magnetycznych mikrokulek. Metoda
TRIzolowa opiera się na trizolowym reagencie, który składa się między innymi z fenolu i
izotiocyjanianu guanidyny. Mieszanina reagentu ma za zadanie inaktywować endogenne
RNAzy oraz doprowadzić do lizy komórek. Do roztworu dodawany jest następnie
chloroform, tak przygotowane próbki wiruje się. Chloroform odpowiada za rozdzielenie
DNA, RNA oraz białek. Pod wpływem wirowania składniki lizatu dzielą się na trzy warstwy,
szukany RNA znajduje się w górnej frakcji wodnej. RNA może być wytrącony za pomocą
izopropanolu. Powstały osad RNA jest następnie osuszany i rozpuszczany w wodzie.

RNA jest niezwykle podatny na degradację, dlatego dobór odpowiedniej metody

homogenizacji, izolacji RNA oraz warunki przechowywania próbek mają ogromny wpływ na
jakość izolowanego RNA, a co za tym idzie - poprawność i wiarygodność eksperymentów.
Aby określić stężenie oraz jakość RNA stosuje się NanoDrop, którego mechanizm działania
opiera się na spektrofotometrii. Wykorzystuje ona prawo Lamberta-Beer'a, które określa
zależność absorbancji od stężenia molowego badanego roztworu, molarnego współczynnika
absorbancji oraz grubości warstwy absorbującej. Wartość stosunku A260/A280 dla czystego
RNA wynosi 1,8-2,0; w przypadku A260/A230 wartość stosunku powinna wynosić 2,0-2,3.

Przepisanie RNA na cDNA odbywa się w obecności polimeraz DNA zależnych od RNA
(odwrotnych transkryptaz). Otrzymane sekwencje cDNA można umieścić w różnych
rejonach genomu. Dzięki temu umożliwione jest między innymi rozmnażanie retrowirusów,
replikacja telomerów i synteza msDNA w bakteriach. cDNA odgrywa rolę w tworzeniu
bibliotek cDNA, zawierają one kopie DNA mRNA komórek, umożliwia to badanie genów
ulegających ekspresji oraz określenie ich funkcji. Dzięki temu cDNA może służyć dziś jako
szablon w mikromacierzach oraz pozwala na szybkie charakteryzowanie nieznanych RNA.

Badanie materiału zawierającego małą ilość materiału genetycznego umożliwiła technika

PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy. Pozwala ona na amplifikację pojedynczej cząsteczki
DNA w bardzo krótkim czasie i wielu kopiach. PCR składa się z trzech etapów:

1. Denaturacja – rozdzielenie nici dwuniciowej matrycy DNA pod wpływem

wysokiej temperatury (92-96°C) poprzez rozerwanie wiązań wodorowych
2. Annealing - przyłączenie starterów do nici matrycowych
3. Elongacja - wydłużenie, polimeraza DNA wydłuża koniec 3’ każdego startera,
budowa nowych nici

Polimerazy DNA wydłużają startery na końcach 3’ w kierunku od 5’ do 3’. Najczęściej

stosowaną polimerazą jest polimeraza Taq, ze względu na jej termostabilność.

PCR umożliwia identyfikację patogenów, takich jak wirusy (np. HIV, SARS-CoV-2),
bakterie, grzyby i pasożyty. Technika ta pozwala również na analizę polimorfizmu
pojedynczych nukleotydów (SNPs) oraz innych wariantów genetycznych, co jest ważne w
badaniach populacyjnych i identyfikacji markerów genetycznych związanych z chorobami.
Jest ona podstawą procesu klonowania genów, gdzie specyficzne fragmenty DNA są
powielane i wprowadzane do wektorów plazmidowych w celu dalszych badań lub produkcji
białek.W kryminalistyce PCR jest używana do amplifikacji mikroskopijnych ilości DNA z
próbek dowodowych (np. włosy, ślina, krew), co pozwala na identyfikację osób na podstawie
ich profilu genetycznego.

2. CEL DOŚWIADCZENIA
Celem doświadczenia było wyizolowanie RNA całkowitego z komórek eukariotycznych linii
MDA-MB-231, ocena jego jakości oraz stężenia, a następnie zbadanie wpływu hipoksji na
ekspresję genu NDRG1 przy pomocy metody PCR.

3. OPIS DOŚWIADCZENIA

I) Izolacja RNA całkowitego z komórek eukariotycznych i ocena jego stężenia i

jakości

a. Izolacja całkowitego RNA fenozolem z hodowli komórkowej.

Przed zajęciami przygotowano hodowle komórkowe na płytkach 12-dołkowych. Przez 24
godziny część komórek była przechowywana w warunkach standardowych (inkubator z 20%
O2, 5% CO2 i 37°C), a druga część w warunkach hipoksyjnych (komora hipoksyjna z 1% O2
i 37°C). Następnie usunięto z nich medium komórkowe, a następnie przepłukano je PBS-
em. Do każdego dołka dodano 400 µl fenozolu, aż do całkowitej lizy komórek. Następnie
przeniesiono zawiesinę do probówek o pojemności 1,5 ml i zamrożono w temperaturze -20°C
aż do rozpoczęcia zajęć.
Ćwiczenia rozpoczęto od ustawienia termobloku na 50°C. Następnie wyjęto próbki z
zamrażarki i, po ich rozmrożeniu w temperaturze pokojowej, umieszczono je w termobloku
na 5 minut. Następnie dodano do lizatów po 150 mL wody jałowej i intensywnie
worteksowano przez 15 sekund. Pozostawiono próbkę w temperaturze pokojowej na 5 minut,
a następnie zwirowano ją przez 15 minut w 10 000 - 15 000 RPM. Po wirowaniu pobrano
400 µl supernatantu i przeniesiono do nowej probówki o objętości 1,5 mL. Do każdej
probówki dodano po 400 µl izopropanolu. Zawartość każdej probówki wymieszano i
przeniesiono na mikrokolumnę. Następnie wirowano w 10 000 - 12 000 RPM przez 1 minutę.
Mikrokolumnę przeniesiono do nowej probówki o pojemności 2 mL. Następnie dodano 700
µL roztworu płuczącego A1. Wirowano 1 minutę w 10 000 - 12 000 RPM. Mikrokolumnę
przeniesiono do nowej probówki 2 mL, dodano 700 µL buforu płuczącego a następnie
wirowano 1 minutę w 10 000 - 12 000 RPM. Mikrokolumnę wyjęto z probówki, wylano
przesącz i ponownie umieszczono w niej mikrokolumnę. Następnie dodano po 300 µL buforu
płuczącego A1, wirowano przez 2 minuty w 10 000 - 12 000 RPM, po czym przeniesiono
mikrokolumnę do nowej probówki o objętości 1,5 mL. Do znajdującego się na dnie
mikrokolumny białego złoża dodano 50 µL wody jałowej, starając się nie przedziurawić
złoża tipsem. Pozostawiono próbkę na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Próbkę
wirowano przez 1 minutę w 10 000 - 12 000 RPM. Podpisane probówki przechowywano na
lodzie.

b. Ocena jakościowa RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop.

Na ekranie wybrano pomiar RNA. Metalową końcówkę pomiarową urządzenia NanoDrop
wyczyszczono specjalną serwetką bezpyłową. Na końcówkę pomiarową nałożono pipetą 1
µL wody ultra czystej, upuszczono ramię urządzenia, i ustawiono jako próba ślepa. Po
zakończeniu pomiaru podniesiono ramię i wyczyszczono obie końcówki pomiarowe przy
pomocy serwetki. Nałożono pipetą 1 µL badanej próbki RNA, opuszczono ramię, opisano
nazwę próbki, a następnie wciśnięto “pomiar”. Obie końcówki pomiarowe przeczyszczono
serwetką. W ten sposób dokonano pomiaru wszystkich próbek. Po zakończeniu analizy
naciśnięto “zakończ eksperyment”, uniesiono ramię urządzenia i wytarto dokładnie obie
końcówki pomiarowe serwetką. Urządzenie wyłączono, po czym przykryto je plastikową
torebką ochronną. Próbki zamrożono w -80°C.

II) Reakcja PCR i wizualizacja przy użyciu elektroforezy żelowej.

a. Przepisanie RNA na jednoniciowe cDNA.

Do przepisania RNA na cDNA wykorzystano zestaw High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit firmy ThermoFisher Scientific. Następnie wyliczono, w jakiej objętości
znajduje się 1 µg RNA dla każdej próbki.
 warunki standardowe:  warunki hipoksyjne:
 150,109 ng/µL  127,515 ng/µL
 150,109 ng - 1 µL  127,515 ng - 1 µL
 1000 ng - 6,662 µL  1000 ng - 7,842 µL

Następnie elementy zestawu rozmrożono na lodzie. Obliczono objętość składników

tworzących 2X RT master mix potrzebnych do przygotowania odpowiedniej ilości reakcji, po
czym zmieszano w probówce o pojemności 1,5 mL.
Do 22 probówek o objętości 200 µL przeniesiono po 10 µL 2XRT master mix. Do każdej
probówki przeniesiono po 1 µg RNA i uzupełniono wodą jałową do końcowej objętości 20
µL. Następnie zamknięto probówki i wykonano szybkie wirowanie w celu pozbycia się
bąbelków powietrza i przeniesienia płynnej zawartości na dno probówki. Probówki
przechowywano na lodzie aż do momentu przeniesienia do termocyklera. Termocykler
zaprogramowano w sposób przedstawiony w poniższej tabeli:

Próbki włożono do termocyklera i rozpoczęto proces. Po zakończeniu przepisywania RNA na

cDNA probówki z uzyskanym jednoniciowym cDNA ponownie przełożono na lód, dodano
po 80 µL wody jałowej, przepipetowano i zmierzono stężenie w NanoDrop.

b. Wykonanie reakcji PCR

Na początku przygotowano mieszaninę reakcyjną do PCR (25 µL na próbkę). Próbki
przygotowano w probówkach o pojemności 200 µL przeznaczonych do reakcji PCR. Każda
grupa przygotowała 4 próbki:
 Hipoksja i starter NDG1
 Hipoksja i starter EDF1
 Normoksja i starter NDG1
 Normoksja i starter EDF1

 Początkowe stężenie: 320 ng/µL

10x rozcieńczenie: 32 ng/µL
32 ng - 1 µL
100 ng - 3,125 µL ≈ 3,120 µL

Na termcyklerze wybrano gotowy schemat przeznaczony do zestawu MCE

MedChemExpress PCR Master Mix (with Dye). Po reakcji przechowywano próbki na lodzie.

c. Przygotowanie 1,5% żelu agarozowego i wizualizacja reakcji PCR.

Na wadze laboratoryjnej odważono 1,5 g agarozy firmy BioRad. Po upewnieniu się, że

wyciąg jest unieruchomiony, odmierzono do szklanej zlewki znajdującej się pod wyciągiem
100 ml odczynnika nr 138 (1x TBE) za pomocą cylindra miarowego, po czym wsypano
agarozę i wymieszano. Podgrzano zlewkę w mikrofalówce przy maksymalnej mocy, około 1
minutę, do momentu aż zawartość stała się przeźroczysta. Zlewkę ochłodzono do
temperatury ciała i dodano do niej 5 µL barwnika do DNA firmy Syngen. Następnie
zmontowano zestaw do wylewania żelu. Zawartość zlewki wylano na zestaw, włożono
drabinkę do wycinania dołków w odpowiednie zagłębienie i pozostawiono pod wyciągiem na
15 minut. Urządzenie zalano roztworem TBE do kreski maksymalnej. Nałożono drabinkę
DNA - po 5 µL do pierwszego i ostatniego dołka. Na każdy dołek nałożono po 20 µL próbki
w kolejności: Normoksja NDG1, Hipoksja NDG1, Normoksja EDF1, Hipoksja EDF1.
Puszczono żel w 100 V na około 30-40 min, do momentu aż widoczny przód drabinki
osiągnął około 70-80% żelu. Żel odczytano w iBright1500 invitrogen Thermo Fisher na
ustawieniu Nucleic Acids i automatycznym odczycie.

4. WYNIKI

Rycina 1. Żel agarozowy po elektroforezie odczytany w iBright1500 invitrogen Thermo

Fisher. Obok drabinka znaczników DNA.

Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić jaki wpływ na ekspresję genów mają
warunki inkubacji oraz poszczególne startery. Wielkość poszczególnych produktów określa
się na podstawie markerów DNA o znanej wielkości (po prawej stronie na rycinie 1.).
Analizie będą podlegały 4 ostatnie prążki (nie licząc markera DNA).

Poszczególne prążki:
1. Normoksja i starter NDG1
2. Normoksja i starter EDF1
3. Hipoksja i starter NDG1
4. Hipoksja i starter EDF1

Na bazie otrzymanych wyników można zauważyć, że prążki, do których użyto startera NDG1
są bardziej intensywne niż pozostałe, niezależnie od warunków inkubacji. Dodatkowo ich
wielkość to około 200 par zasad. Natomiast jeśli chodzi o starter EDF1, otrzymane prążki
znajdują się na wysokości około 250 par zasad, czyli wyżej niż w przypadku startera NDG1 i
są mniej intensywne.

5) WNIOSKI
Wielkość produktów PCR wskazuje, że startery NDG1 i EDF1 amplifikują różne fragmenty
DNA. To sugeruje, że każdy z tych starterów jest zaprojektowany do rozpoznawania różnych
sekwencji docelowych lub różnych regionów genów. Starter NDG1 jest bardziej efektywny
w amplifikacji specyficznych fragmentów DNA, co jest widoczne w intensywniejszych
prążkach. Fragmenty DNA mają wielkość około 200 par zasad. Starter EDF1 amplifikuje
dłuższe fragmenty DNA (około 250 par zasad), jednak z mniejszą intensywnością. Wykazuje
to, że ten starter jest mniej skuteczny w tych warunkach lub mniej dopasowany do sekwencji
docelowych. Efektywność starterów NDG1 i EDF1 ma istotne znaczenie w kontekście
projektowania eksperymentów PCR. Wysoka intensywność prążków przy użyciu NDG1
powoduje, że ten starter może być preferowany w przypadkach, gdzie wymagana jest
większa ilość produktu PCR lub większa czułość detekcji. Mniejsza intensywność prążków
przy użyciu EDF1 może wymagać optymalizacji warunków reakcji, takich jak stężenie
startera, temperatura czy ilość cykli PCR, aby zwiększyć wydajność amplifikacji.

Nie zaobserwowano istotnych różnic w intensywności prążków pomiędzy normoksją a

hipoksją. Oznacza to, że warunki tlenowe nie mają znaczącego wpływu na efektywność
amplifikacji z użyciem tych starterów. Wyniki te mogą być wykorzystane do badań nad
ekspresją genów w różnych warunkach tlenowych, szczególnie w kontekście badań nad
chorobami związanymi z hipoksją, takimi jak nowotwory.