Bài 3 PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY

SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

1. Cơ sở lý thuyết

- Nêu ý nghĩa của việc phân tích Salmonella trong thực phẩm:

Việc phân tích Salmonella trong thực phẩm là quan trọng vì nó giúp xác định sự hiện
diện của vi khuẩn gây bệnh này trong các sản phẩm thực phẩm. Salmonella là nhóm vi
sinh vật gây bệnh đường ruột nguy hiểm vì khả năng gây bệnh rất nghiêm trọng.

Phân tích Salmonella trong thực phẩm giúp xác định liệu thực phẩm có an toàn để tiêu
thụ hay không. Bằng cách phát hiện sớm và ngăn chặn sự lan truyền của Salmonella
trong thực phẩm, chúng ta có thể bảo vệ sức khỏe của cộng đồng và ngăn chặn các đợt
dịch bệnh liên quan đến thực phẩm.

Hầu hết yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm trong nước cũng như trên toàn thế giới có quy
định là không cho phép có sự hiện diện của Salmonella trong 25g/25ml mẫu.

- Trình bày cơ sở lý thuyết

Cơ sở lý thuyết:
Salmonella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có khả năng di động (trừ
S.gallinarian và S.pullorum), sinh acid từ glucose và mannitol nhưng không lên men
saccharose và lactose, không sinh indol và không phân giải ure. Hầu hết các chúng đều
sinh H.S (trừ S. typhi).
Salmonella là nhóm vi sinh vật gây bệnh đường ruột nguy hiểm, được quan tâm bởi các
nhà nghiên cứu bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường và an toàn vệ sinh thực phẩm.
Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm vì khả năng gây bệnh rất nghiêm trọng.
Ngộ độc thực phẩm do Salmonella xảy ra khi ăn phải thức ăn có số lượng vi khuẩn sống
khá lớn. Bệnh thường xảy ra trong mùa hè do trời nóng ẩm, vi khuẩn dễ phát triển, nhiệt
độ cao làm con người dễ mệt mỏi, sức đề kháng của cơ thể kém.
Phạm vi áp dụng:
Phương pháp này (tham chiếu theo TCVN 8342:2010) dùng để phát hiện Salmonella
trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp PCR
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích (một đoạn trong gen invA) có
được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản
phẩm khuếch đại trên gel agaroza, nhuộm màu ADN bằng ethyl bromua và quan sát bằng
đèn cực tím (UV) ở bước sóng 302 nm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di
sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ đài của đoạn ADN đích
đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel điện di không xuất hiện sản phẩm
khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.
2. Hóa chất, môi trường, dụng cụ và thiết bị

a-Hóa chất-môi trường

- Bảng 1: danh mục hóa chất, môi trường bài thí nghiệm

STT Hóa chất , môi trường

1 Kít tách chiết DNA (cột)

2 Hỗn hợp dùng trong khuyếch đại PCR - Mytaq Mix, 2x: 48µl

3 Ethanol 70%: 100ml

4 Nước cất 2 lần khử ion: 100 µl

5 Mồi xuôi (5 µM): 8 µl

Mồi ngược (5 µM): 8 µl

6 Agarose: 1g loại dùng để điện di AND có kích thước <1000bp

7 Đệm điện di: TAX 1x: 500ml

8 GelRedTM Loading Buffer with TriColor: 10µl

9 Thang DNA: 100bp

10 Dung dịch đệm peptone: BPW

 11 Primer cho Salmonella spp

- Tính toán hóa chất cần dùng, qui trình pha

b-Dụng cụ, thiết bị

- Bảng 2: danh mục dụng cụ, thiết bị

STT Dụng cụ

1 Pipet 0.5-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl (mỗi loại 1 cái)

2 Đầu típ 10 µl 100 cái, 100 µl 40 cái, 1000 µl 20 cái

3 Tube PCR: 8 cái

4 Eppendorf: 0.2; 0.5; 1.5ml

5 Đĩa petri

6 Que cấy (que cấy vòng, que trang)

7 Đèn cồn

8 Kẹp kim loại

9 Bình tia

10 Đũa thủy tinh

11 Bình tam giác

STT Thiết bị
 1 Máy lắc Eppendorf

2 Máy ly tâm

3 Máy luân nhiệt PCR

4 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di

5 Máy đọc gel.doc,…

6 Tủ ấm

7 Tủ sấy

8 Tủ cấy

9 Nồi hấp

10 Lò vi sóng

11 Kính hiển vi

12 Cân điện từ

- Trình bày cách vận hành các thiết bị

1. Máy ly tâm lạnh
 Hình ảnh thiết bị
 Model thiết bị:
  Cách vận hành

Bước 1: Cung cấp nguồn điện cho máy

Bước 2: Bật công tắc nguồn (phía trước máy) sang vị trí ON, mở nắp bằng cách nhấn vào
nút "lid".
Bước 3: Đặt mẫu có cùng trọng lượng đối xứng qua trục ly tâm.
Bước 4: Nhấn vào nút rpm/ref để lựa chọn tốc độ vòng quay hoặc lực ly tâm (lúc này rpm
hoặc ref sẽ nhấp nháy). Dùng núm tròn để cài đặt tốc độ mong muốn (lưu ý đối với rotor
ống 50ml và 15ml chỉ củi đặt tốc độ tối đa 5500 vòng/phút; rotor dùng cho ống 1.5ml tốc
độ tối đa 13000 vòng/phút)
Bước 6: Cài đặt nhiệt độ: nhấn vào nút temp dùng núm tròn để cài đặt nhiệt độ mong
muốn. Để làm lạnh nhanh: nhấn đồng thời 2 nút temp và time.
Bước 7: Cài đặt thời gian: nhấn vào nút time  dùng núm tròn để cài đặt thời gian mong
muốn.
Bước 8: Đóng nắp và nhấn start để bắt đầu quá trình ly tâm (nếu xảy ra sự cố hoặc muốn
dừng quá trình ly tâm: nhấn nút stop).
Bước 9: Kết thúc quá trình ly tâm: nhấn vào nút “lid” để mở nắp máy ly tâm và lấy ống ly
tâm ra khỏi thiết bị.
 Hình ành vận hành thiết bị của tổ/cá nhân
2. Máy PCR
 Hình ảnh thiết bị
 Model thiết bị
  Cách vận hành

Bước 1: cung cấp nguồn điện

Bước 2: bật công tắt nguồn phía
sau máy
Bước 3: Cài đặt các chương trình:
+ Tạo chương trình
 + Nhập tên chương trình
+ Insert new stage
+ Cài nhiệt độ
+ Cài thời gian
+ Thiết lập vòng lập cycle
+ Save

Bước 4: mở nắp, đặt các ống chứa

mẫu vào các giếng

Bước 5: chạy chương trình view

files => Start

Bước 6: kết thúc chương trình, lấy

mẫu ra khỏi máy. Tắt công tắc
nguồn, rút phích cắm và vệ sinh
máy và khu vực làm việc

 Hình ành vận hành thiết bị của tổ/cá nhân

3. Bộ điện di ngang
 Hình ảnh thiết bị
  Model thiết bị

 Cách vận hành

B1: Cấp điện vào bộ nguồn của bộ điện di

B2: Bật công tắc nguồn phía sau bộ nguồn
B3: kết nối buồng điện di và bộ nguồn
B4: Sử dụng các phím mô tả như hình để cài đặt mức điện áp và thời gian điện di
B5: Đặt mẫu gel cần điện di vào buồng điện, nạp dung tích đệm điện đi vào buồng và đậy
nắp buồng
B6: Nhấn nút RUN để tiến hành điện di
B7: Khi điện di xong hoặc muốn ngừng quá trình chạy ta nhấn nút STOP
B8: Tắt công tắc nguồn
B9: Lấy mẫu gel ra khỏi buồng điện di. Vệ sinh buồng điện di và khu vực thao tác.
 Hình ành vận hành thiết bị của tổ/cá nhân

4. Máy chụp ảnh gel

 Hình ảnh thiết bị
  Model thiết bị

Máy chụp gel Bio – Print TX4

 Cách vận hành

Bước 1:Bật nguồn máy tính. Sau khi máy tính đã khởi động xong hoàn toàn, bật nguồn
điện cho tủ, sau đó mở UV tủ để chụp. Click đúp chuột vào biểu tượng QUANTUM-
CAPT

Bước 2: Bấm auto exposure  start  chụp ảnh

Bước 3: Kết quả chụp

Bước 4: Sau khi chụp xong tắt máy, tắt công tắc tủ và rút điện

 Hình ành vận hành thiết bị của tổ/cá nhân

5. Kính hiển vi Camera

 Hình ảnh thiết bị
  Model thiết bị
 Cách vận hành

Bước 1: Di chuyển kính hiển vi đến vị trí ngồi (lưu ý di chuyển kính hiển vi bằng 2 tay: 1
tay nằm phần thân và 1 tay giữ phần bệ đỡ của kính hiển vi). Kiểm tra cáp kết nổi giữa
kinh hiển vi và màn hình cảm ứng

Bước 2: Cung cấp nguồn điện cho kính hiển vi và màn hình cảm ứng

Bật công tắc nguồn của kinh hiển vi sang vị trị I, lăn ốc điều chỉnh độ sáng của đèn, tối
đa khoảng ¾.

- Nhấn giữ nút nguồn trên CPU để khởi động máy tính.

Bước 3: Rút chắn sáng màu đen( nằm phía trước 2 thị kính) ra.
Bước 4: Đặt tiêu bản mẫu lên bàn soi, dùng kẹp để giữ cố định tiêu bản.

Bước 5: Mở phần mềm Opika Vision Pro trên màn hình máy tính.

Bước 6: Tại mục Capture control, click vào vật kính cần dùng để quan sát mẫu (lưu ý
chọn vào vật kính nào thì phải xoay mâm về đúng vật kính đó)

Bước 7: Chỉnh tụ quang phù hợp

Lưu ý: đối với vật kinh 4X, 10X hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính 40X để tụ ở đoạn
giữa, vật kính 100X nâng tụ quang lên tối đa

Bước 8: xoay mâm vật kính, chọn vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất để quan sát và tìm
vị trí của mẫu trước khi chọn vật kính có độ phóng đại cao hơn.

Bước 9: vặn ốc chỉnh thô từ từ để nâng lên hoặc hạ bàn soi xuống cho đến khi tìm thấy
vùng hình ảnh mờ của mẫu.

 Hình ành vận hành thiết bị của tổ/cá nhân

 3. Cách tiến hành

3.1 Tăng sinh

Cân một lượng 25g mẫu rắn của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng, bổ
sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) trong 60
giây. Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,00C ± 1,00C trong khoảng 18 h ± 2 h.
3.2. Tách DNA từ khuẩn lạc
Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, phá vỡ tế bào để giải phóng
DNA.

Kết quả kiểm tra DNA sau tách chiết bằng đo quang phổ bước sóng 260, 280nm
OD 260 nm OD 280 nm

3.3 PCR
Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt
bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30-35 chu kỳ.
3.3.1. Chuẩn bị ống khuếch đại
Hút 12,5ml hỗn hợp khuếch đại PCR MyTaq Mix, 2x cho vào trong eppendorf dung
tích 0,2ml, thêm vào 1ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 0,4µM và 3ml mẫu khuôn
ADN. Thêm nước cất để đạt tổng dung tích trong một ống khuếch đại là 25µl.
Tiến hành mix các mẫu:
- DEPC: 3ml
- Mytag Mix: 6ml
- M-F: 1ml - 5ml
- M-R: 1ml
- DNA pha từ khuẩn lạc: 1ml
- DNA tổng số: 50ng/ml
Sau khi mix các mẫu xong, đem ly tâm để loại bỏ các bọt khí tránh sai số trong quá trình
chạy.
 Đối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch DNA của Salmonella
chuẩn đã biết.
 Đối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước.
3.4 Chương trình khuếch đại
Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như
sau:
Duy trì nhiệt độ 950C trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi DNA trong mẫu.
Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ, có 3 bước như sau: 950C/60 giây; 540C/45 giây và
720C/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72 0C trong 10 phút,
sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ -200C cho đến khi điện di.
3.5 Điện di sản phẩm khuếch đại
- Chuẩn bị gel điện di agaroza 1,5 %
Gel agaroza 1,5 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào
khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3
mm đến 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.
- Tiến hành
+ Cho 2ml TAE vào ống đong 100ml.
+ Sau đó cho dung dịch đệm ( nước cất 2 lần đã hấp ) vào. Pha đủ 100ml rồi cho
vào bình tam giác 250ml.
 + Quay lò vi sóng khoảng 5 phút. Sau đó lấy ra đổ vào khay. Đợi tầm 15 phút để
gel đông lại.
+ Đo pH của TAE
3.6 Chuẩn bị đi điện di

- Lấy 5µl mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 1ml GelRedTM Loading Buffer
with TriColor rồi trộn thật đều.
- Tiến hành: Dùng đầu típ hút 5 microlit mẫu mix 3 đến 4 lần với 1 microlit
GelRedTM Loading Bufer with TriColor
3.7 Điện di

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang DNA chuẩn hay mẫu đối chứng
dương. Nạp 6ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agaroza. Tiến hành điện di trong
60 phút ở hiệu điện thế 100 V.
3.8 Quan sát, chụp hình
Cho bản gel đã điện di vào máy chụp gel hoặc lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo
vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng của DNA xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình
để lưu trữ kết quả.

4. Tính toán kết quả

4.1- Kết quả tách và tăng sinh vi khuẩn phân tích, kiểm tra hình thái vi khuẩn

Giải thích kết quả

4.2 Kết quả tách DNA

a- Tách DNA bằng hóa chất

- Đo OD ở 2 bước sóng (260nm; 280nm)

 - Tính toán

Nồng độ DNA(ul/ml)= OD260 * 50* độ pha loãng

= 0.082*50*200

= 820 (ul/ml)

Nếu 1,8 < OD260/OD280 <2 là mẫu tinh sạch

Kết quả: OD260/OD280=1,49

Vậy OD260/OD280<1,8 nên DNA lẫn tạp chất.

b- Tách DNA bằng cột

4.3. Khuếch đại PCR DNA tách từ cột

Giải thích kết quả

4.4. Điện di và xác định kích thước DNA

a-DNA chứng dương tách khuẩn lạc Salmonella gốc

b-DNA tách hóa chất từ khuẩn lạc phân tích

c-DNA tách từ cột kết hợp PCR từ khuẩn lạc phân tích
4.5. Kết luận phân tích

Rút kinh nghiệm

a/ Các kiến thức đã được cũng cố sau khi làm xong bài thí nghiệm

- Biết được cách xác định Salmonella bằng phường pháp PCR

b/ Các kỹ năng đã học được

- Biết cách vận hành nhiều loại máy thiết bị: PCR, máy điện di, ksinh hiển vi
camera, máy chụp gel, tủ cấy, tủ hút,….
- Lên kế hoạch ghi chép báo cáo kết quả
- Quản lý thời gian hoàn thành đúng thời hạn
- Sử dụng tài nguyên có sẵn phù hợp, hiệu quả, không gây lãng phí tài nguyên.
- Làm việc nhóm

c/ Ý thức an toàn trong phòng thí nghiệm phân tích vi sinh phân tử

- Tuân thủ: mặc áo blouse cài khuy áo, khẩu trang, bao tay y tế
- Thực hiện việc xử lý và tiêu hủy chất thải một cách an toàn và đúng quy trình
- Làm việc với hóa chất trong tủ hút