Vid 10: Sắc ký pha thuận

Đối tượng phân tích của sắc ký lỏng: rất đa dạng, ngoại trừ chất phân tích là chất khí thì hầu
hết các chất đều có thể phân tích bằng sắc ký lỏng, vì nó không bị giới hạn bởi tính bền nhiệt
và khả năng hóa hơi như GC.

Nhiều kiểu tương tác khác nhau được khai thác cho từng nhóm đối tượng tạo ra nhiều loại sắc
ký lỏng, VD như:

Sắc ký pha thuận/ pha thường (Normal-phase chromatography – NPC):

Loại sắc ký dùng nhiều nhất trong sắc ký cột/sắc ký bản mỏng phục vụ cho mục đích sàng lọc,
tách phân đoạn và điều chế.

Lý do gọi là sắc ký pha thuận: vì bản chất pha tĩnh và pha động tương tự kiểu sắc ký lần đầu
tiên xuất hiện (SP: canxi carbonat, MP: ete dầu hỏa)

 Pha động kém phân cực hơn pha

tĩnh Trong sắc ký pha thuận:

 Pha tĩnh: silica, alumina,...

 Pha động: hỗn hợp các dung môi hữu cơ kém phân cực không chứa nước
 Pha tĩnh phân cực => Chất càng phân cực di chuyển càng chậm

Các nhóm silanol phân cực => Tương tác với các nhóm phân cực của chất phân tích theo kiểu
lưỡng cực – lưỡng cực hoặc lưỡng cực – lưỡng cực cảm ứng

VD:

Sắc ký pha thuận còn được gọi là sắc ký hấp phụ do chất phân tích tiếp cận sát bề mặt pha
tĩnh để tương tác tại các tâm hoạt động (silanol trong silica gel)

Nhược điểm của sắc ký pha thuận (khiến cho sắc ký pha thường không được sử dụng rộng
như sắc ký pha đảo trong phân tích):

 Cân bằng diễn ra chậm => khó sử dụng chế độ gradient (mà chế độ đẳng dung môi
thường chỉ hạn chế khi mẫu chỉ chứa không quá khác nhau về lực tương tác)
 Sử dụng toàn bộ là dung môi hữu cơ: đắt tiền và độc hại, cần xử lý riêng sau khi sử dụng
  Silica và alumina hấp phụ nước rất mạnh => bất hoạt các tâm tương tác (nhóm silanol
trong silica tạo liên kết hydrogen với nước => mất khả năng lưu giữ chất phân tích)
=> Cần sử dụng dung môi khan nước.
 Bề mặt silica tồn tại nhiều nhóm silanol => Nhóm silanol cách nhau > 3.3Å là nhóm
silanol tự do, tương tác rất mạnh với chất phân tích => KÉO ĐUÔI PEAK SẮC KÝ.
o Cách giải quyết: Thêm một lượng nước rất nhỏ để “khóa” những nhóm silanol tự
do. Tuy nhiên việc duy trì lượng nước nhỏ và không đổi trong pha động là không dễ.

Khi nào sử dụng NPC?

Ngoài việc sử dụng cho sắc ký cột trong việc tách các phân đoạn và sắc ký điều chế, NPC
thường dùng để:

 Tách các chất có nhóm thế khác nhau (về bản chất và về số lượng)
 Tách tốt các đồng phân hình học: o- , m- , p- hay đồng phân cis- , trans-

 Tách các chất phân cực (vì bản chất pha tĩnh là phân cực)
 Tách các hợp chất rất không phân cực (vì hợp chất không phân cực không tan trong pha
động của sắc ký pha đảo-dung môi phân cực): VD đường rất phân cực, tưởng là tách tốt
trên sắc ký pha thường, tuy nhiên đường không tan trong dung môi không phân cực
(hexane, dichloromethane,...) nên không thực hiện được

Yêu cầu của chất phân tích dùng trong NPC:

 Phải tương tác ít nhiều với pha tĩnh

 Phải tan được trong pha động
VD: Vitamin E (bao gồm 2 nhóm tocopherol và tocotrienol (tocotrienol có nối đôi trong mạch
C, tocopherol không có nối đôi này). Ngoài ra tùy vào nhóm thế R1, R2, R3 là CH3 hay H =>
chia nhỏ thành 4 đồng phân là , ,  hay . Các chất khác nhau sẽ có hoạt tính sinh học khác
nhau.

Vitamin E tan trong dầu (như vitamin A và vitamin D) nhưng vẫn có thể được phân tích bằng
sắc ký pha thường trên pha tĩnh silica phân cực

Độ mạnh của dung môi tăng theo độ phân cực của nó

Thứ tự rửa giải của các hợp chất trong NPC: đi theo độ phân cực của các hợp chất phân
tích
 Vid 11: Sắc ký pha đảo (RPC)

Ra đời sau sắc ký pha thuận nhưng sắc ký pha đảo nhanh chóng đã áp đảo sắc ký pha thuận
về mặt ứng dụng. Với việc cải tiến cấu trúc hóa học của pha tĩnh và thay đổi thành phần pha
động, sắc ký pha đảo có thể sử dụng cho rất nhiều đối tượng có độ phân cực trải dài từ kém
phân cực đến khá phân cực và cho cả polymer.

Lý do gọi là sắc ký pha đảo:Tính phân cực của pha tĩnh và pha động trái ngược với sắc ký pha
thuận

 Pha tĩnh kém phân cực hơn pha

động Trong sắc ký pha đảo:

 Pha tĩnh: thường là sợi alkyl có chiều dài thay đổi (2C, 4C, 8C, 18C). Trong đó C18
được dùng phổ biến nhất.
 Pha động: hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (kém phân cực hơn và tan hoàn toàn trong
nước) như ACN và MeOH

Tương tác chủ yêu là tương tác không phân cực hoặc theo lực Van der Waals

 Dây alkyl càng dài và mật độ dây alkyl trên bề mặt pha tĩnh càng dày đặc thì tương tác
sẽ càng mạnh
 Tùy vào đối tượng mà chọn lựa pha tĩnh phù hợp (VD: trong phân tích protein, để
tránh tương tác quá mạnh với pha tĩnh làm biến tính protein, thường sử dụng cột có
dây alkyl ngắn như cột C2 hay C4)
Thứ tự rửa giải của hợp chất trong sắc ký pha đảo

 Lực tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh không phân cực là tương tác Van der
Waals. Lực này tăng rất nhanh theo kích thước phân tử => Trong dãy đồng đẳng, nếu
mạch carbon càng dài thì sự lưu giữ càng mạnh
 Sự phân nhánh làm cho diện tích tiếp cận với dây alkyl giảm => lực tương tác giảm theo
 Các liên kết bất bão hào làm tăng độ phân cực => giảm thời gian lưu

Hệ số phân bố octanol/nước (logKO/W): dự đoán độ phân cực của chất. Hệ số logKO/W càng
bé thì chất càng phân cực

Ưu điểm của RPC:

 Pha tĩnh không sợ nước => Không cần kiểm soát chặt chẽ lượng vết nước như trong NPC.
 Cân bằng xảy ra nhanh => dễ dàng sử dụng chế độ gradient để rửa giải
 Sử dụng được cho hợp chất khá phân cực. Khi hợp chất tương tác yếu, mình sử dụng pha
động yếu để làm chậm quá trình rửa giải

Lưu ý: Nếu mua cột bình thường, khi pha động chứa quá nhiều nước (<10%) để rửa giải chất
rất phân cực, nó sẽ không solvat hóa được dây alkyl. Lúc đó dây alkyl bị co cụm và không còn
khả năng lưu giữ nữa

Các tăng cường khả năng lưu giữ của hợp chất trong RPC:

Kỹ thuật ức chế ion: Hợp chất có tính acid-base khi bị ion hóa, nó sẽ mang điện tích và trở nên
phân cực => lưu giữ kém hơn

 Để tăng cường sự lưu giữ, ta có thể điều chỉnh pH (đối với acid mình sử dụng pH thấp,
hoặc với base mình chọn pH cao để đưa về trạng thái trung hòa điện => lưu giữ tốt
hơn)

Tuy nhiên lưu ý pH sử dụng cho nền silica nằm trong khoảng 2-8
Đối với acid mạnh và base mạnh, như hợp chất có chứa nhóm sulfonic acid hoặc amin bậc 4,
hầu như tồn tại dạng mạng điện tích trong khoảng pH chúng ta chạy sắc ký

 Thêm vào pha động tác chất ghép cặp ion (chất hoạt động bề mặt có điện tích trái dấu
với chất phân tích)
 Sau khi ghép cặp, cặp ion sẽ tương tác với pha tĩnh (dây alkyl) thông qua carbon không
phân cực của chất ghép cặp ion

Giải pháp tránh sự co cụm dây alkyl do pha động quá phân cực (nhiều nước-ít dung
môi hữu cơ):

Trên dây alkyl được ghép các nhóm chức phân cực: amide, ether, ure,… để dây alkyl vẫn có
thể solvat hóa được ở các vị trí phân cực và giúp nó không bị co cụm lại

Kí hiệu cột: AquaSep col.

VD:
 Vid 12: Nguyên lý, cấu tạo thiết bị, pha động-pha tĩnh trong sắc ký khí

Đây là kỹ thuật sắc ký có hiệu năng rất cao (peak rất hẹp nên dễ tách) và quá trình phân tích
rất thuận lợi (không cần lọc, đuổi khí dung môi vì pha động được cung cấp từ bình khí nén có
độ tinh khiết rất cao và sẵn sàng được sử dụng)

Trong sắc ký khí:

Pha động:

 Là những khí trơ, không tương tác với chất phân tích, nó chỉ nhiệm vụ duy nhất là tải
chất phân tích di chuyển khi nó được giải hấp ra khỏi pha tĩnh => còn được gọi là khí
mang (carrier gas) có độ tinh khiết rất cao (99.995 – 99.9995%)
 N2, He, H2 là các khí mang sử dụng phổ biến

Pha tĩnh:

 Hiện nay chỉ còn sử dụng cột mao quản mở (là cột trống không nhồi hạt và pha tĩnh được
ghép lên trên thành trong của cột mao quản).
 Pha tĩnh có thể ở dạng lỏng hoặc dạng rắn tạo ra 2 loại sắc ký khí:
o Sắc ký khí lỏng (Non-valatile liquids – GLC)
o Sắc ký khí rán (Solid porous materials – GSC)

Cột sắc ký khí thường khá dài, dài hơn nhiều so với sắc ký lỏng (có thể >100m) => cuộn tròn
lại để nằm vừa trong lò cột

Nhiệt độ: vì pha động là khí trơ không tương tác với chất phân tích => tăng nhiệt độ để tăng
khả năng rửa giải của pha động vì ở nhiệt độ cao, chất phân tích dễ bay hơi nên giải hấp ra
khỏi pha tĩnh nhanh hơn

2 yếu tố cơ bản quyết định sự lưu giữ:

 Độ mạnh tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh: phụ thuộc vào tính tương đồng về
độ phân cực – chất có độ phân cực càng gần với pha tĩnh thì lưu giữ càng mạnh. VD trên
cột không phân cực thì chất càng khó bay hơi và di chuyển càng chậm
  Khả năng bay hơi của chất phân tích: thể hiện qua nhiệt độ sôi

Yêu cầu của chất phân tích:

Trong sắc ký khí ta thường nâng nhiệt độ cột lên khá cao so với nhiệt độ phòng để rửa giải

 Chất phân tích phải bền nhiệt và tương đối dễ bay hơi trong điều kiện của GC
(BP < 400°C, MW < 1000 do phân tử càng lớn càng khó bay hơi)

Ứng dụng của sắc ký khí: Phân tích thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm, chất ô nhiễm môi
trường, công nghiệp hóa dầu, hóa dược,…

Các bộ phận chính của máy GC:

Khí mang: Dù sử dụng khí mang có độ tinh khiết rất cao, người ta vẫn cho khí mang qua tuần
tự các bẫy lọc (hydrocarbon, độ ẩm và bẫy O2):

Bẫy hydrocarbon: giảm nhiễu nền bởi tạp chất là hydrocarbon

Bẫy nước: tránh thủy phân nối siloxane làm mất pha tĩnh

Bẫy O2: tránh sự oxi hóa pha tĩnh ở nhiệt độ cao

Lưu ý: Tăng tốc độ pha động lên bao nhiêu lần thì chất sẽ ra sớm bấy nhiêu

Tuy nhiên việc lựa chọn khí mang không chỉ phụ thuộc vào hiệu năng và thời gian phân
tích mà còn phụ thuộc vào bản chất đầu dò. Một số đầu dò đặc biệt như đầu dò bắt giữ
điện tử ECD thì chỉ dùng khí N2, còn đầu dò khối phổ chỉ sử dụng khí He.

Hiện nay ưu tiên dùng He và N2 hơn là H2 do lo sợ vấn đề cháy nổ mặc dù H2 rẻ hơn và có

thể tự tạo ngay trong PTN (bằng các máy sinh khí H2)
Cột sắc ký:

Có khả năng tách >100 chất trong 1 lần chạy, chỉ cần sự khác nhau rất nhỏ về nhiệt độ
sôi/năng lượng tương tác thì các chất có thể tách ra mà không cần nhiều loại cột với cơ chế
lưu giữ khác nhau như trong sắc ký lỏng.

Khác với cột nhồi của sắc ký lỏng, GC hiện nay chỉ tồn tại cột mao quản mở:

 Pha tĩnh chỉ là lớp mỏng ghép ở thành trong của cột mao quản bằng silica, ở giữa cột
hoàn toàn trống, khí mang sẽ chạy trong lòng cột và kéo chất đi khi nó giải hấp khỏi pha
tĩnh.
 Để tăng tính linh động của cột, người ta phủ quanh cột một lớp polyimide chịu nhiệt
=> giúp mình cuộn cột lại để vừa trong lò cột

Vì là cột trống nên cột có thể dài đến 150m mà không tạo lực cản đáng kể đối với dòng khí
mang => tổng số đĩa lý thuyết của cột GC rất lớn (gần vài trăm nghìn đĩa) so với sắc ký
lỏng (vài chục nghìn đĩa)

Pha tĩnh: có 2 loại

 Pha tĩnh lỏng (Wall Coated Open Tubular column – WCOT) : thường tạo thành lớp
film rất mỏng, bề dày < 1m được ghép trên thành của silica thông qua liên kết cộng hóa
trị => rất bền vững. Phổ biến, dùng cho hầu hết chất phân tích trừ chất khí (vì chất
khí lưu giữ kém trên pha tĩnh lỏng)
 Pha tĩnh rắn (Porous Layer Open Tubular column – PLOT): cột có loại vật liệu rắn
có độ xốp cao để hấp phụ chất khí để làm pha tĩnh như:
o Silica, aluminum oxide
o Rây phân tử (Molecular sieve)
o Polystyrene

Khác với cột WCOT có pha tĩnh lỏng, pha tĩnh rắn có bề dày dày hơn rất nhiều lần nên có
thể nhìn thấy bằng mắt thường
VD: