Mechanizm reakcji katalizowanej przez syntazę tymidylanową
STRESZCZENIE
Wojciech Rode
Adam Jarmuła
Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcele-
go Nenckiego PAN, Warszawa

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M.
Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02-093
Warszawa; e-mail: rode@nencki.gov.pl
Artykuł otrzymano 20 lipca 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 27 lipca 2015 r.
Słowa kluczowe: modyfikacje potranslacyjne,
N4-hydroxy-dCMP, syntaza tymidylanowa
Stosowane skróty: DHF, 7,8-dihydrofolian;
FdUMP, 5-fluoro-dUMP; meTHF, 6R-N5,10-me-
tyleno-5,6,7,8-tetrahydrofolian; N4-OH-dCMP,
N4-hydroksy-dCMP; RDHF, reduktaza dihy-
drofolianowa; ST, syntaza tymidylanowa
274
S yntaza tymidylanowa ThyA (EC 2.1.1.45; kodowana przez gen Tyms), stanowiąca od 60
lat cel molekularny chemioterapii, katalizuje reakcję metylacji węgla C(5) w pierście-
niu pirymidynowym 2’-dezoksyurydylanu (dUMP), obejmującą reakcję przeniesienia reszty
jednowęglowej (metylenowej, czyli na poziomie utlenienia aldehydu) z 6R-N5,10-metyleno-
tetrahydrofolianu i sprzężoną z nią reakcję redukcji przeniesionej grupy metylenowej do
metylowej, z równoczesnym powstaniem 7,8-dihydrofolianu i tymidylanu. Praca prezentuje
stan wiedzy na temat (i) molekularnego mechanizmu reakcji, z uwzględnieniem mechani-
zmu swoistości substratowej, (ii) mechanizmu inhibicji tej reakcji przez szczególny analog
substratu, jakim jest N4-hydroksy-dCMP, (iii) właściwości strukturalnych enzymu, (iv) loka-
lizacji w komórce, (v) potencjalnych modyfikacji potranslacyjnych białka ST i ich wpływu
na właściwości katalityczne oraz (vi) aktywności niekatalitycznych enzymu.
WPROWADZENIE
Omawiane w niniejszej pracy badania związane są ściśle z okresem współ-
pracy prof. dr hab. Wojciecha Rode i kierowanego przez niego zespołu z prof. dr
hab. Davidem Shugarem. Do współpracy tej zespół został zaproszony na począt-
ku lat 80-tych ubiegłego stulecia, wkrótce po powrocie W. Rode z dwuletniego
stażu podoktorskiego w Zakładzie Farmakologii Szkoły Medycznej Uniwersy-
tetu Yale w New Haven, Connecticut. Tematem badań była syntaza tymidyla-
nowa, enzym stanowiący już wtedy od dawna cel molekularny w chemioterapii
przeciwnowotworowej. Niewątpliwie to ta tematyka stanowiła obiekt zainte-
resowania profesora Shugara, który indukował interdyscyplinarną współpracę
pomiędzy polskimi zespołami. Celem tej współpracy było poszukiwanie no-
wych możliwości takiego wpływu na metabolizm nukleotydów, który mógłby
mieć charakter przeciwnowotworowy lub przeciwpasożytniczy. Podejście to
było bardzo cenne w czasach, gdy współpraca zagraniczna urastała do rangi
„złotego cielca” (do dziś czasami bywa tak prowincjonalnie traktowana), a w
szczególności pozbawione prowincjonalności.
Bardzo ważna rola w naszej współpracy przypadała zespołowi, kierowane-
mu przez niezapomnianego prof. dr hab. Tadeusza Kulikowskiego, specjali-
zującemu się w syntezie nukleozydów/nukleotydów. Zwykle badaliśmy serie
pochodnych nukleotydowego substratu, zmodyfikowanych w wybranym re-
gionie cząsteczki. Poznanie wpływu modyfikacji na oddziaływanie z enzymem,
skorelowanego z wpływem na właściwości fizykochemiczne tych pochodnych,
pozwoliło rozpoznać szereg nowych elementów molekularnego mechanizmu
wiązania substratu przez enzym. Do najciekawszych wyników należały: (i) od-
krycie formy tautomerycznej dUMP wiązanej przez enzym, (ii) poznanie zna-
czenia stanu dysocjacji reszty 5’-fosforanowej dla wiązania substratu (iii) odkry-
cie nowych elementów mechanizmu inhibicji przez N4-hydroksy-dCMP, w tym
określenie wiązanej przez enzym formy tautomerycznej/rotametrycznej tego
szczególnego analogu dUMP oraz (iv) zbadanie pewnych aspektów potencjalnej
modyfikacji potranslacyjnej białka enzymu przez fosforylację.
REAKCJA KATALIZOWANA PRZEZ SYNTAZĘ
TYMIDYLANOWĄ I JEJ MECHANIZM
Syntaza tymidylanowa (ST) ThyA (EC 2.1.1.45; kodowana przez gen Tyms)
katalizuje reakcję metylacji węgla C(5) w pierścieniu pirymidynowym 2’-dezok-
syurydylanu (dUMP), obejmującą reakcję przeniesienia reszty jednowęglowej
(metylenowej, czyli na poziomie utlenienia aldehydu) z 6R-N5,10-metylenotetra-
hydrofolianu (meTHF) i sprzężoną z nią reakcję redukcji przeniesionej grupy
metylenowej do metylowej, z równoczesnym powstaniem 7,8-dihydrofolianu
(DHF) i tymidylanu (dTMP). In vivo tetrahydrofolian i jego pochodne występują
zwykle w formach γ-oligoglutaminianowych, które nie są transportowane przez
www.postepybiochemii.pl

Rycina 1. Reakcja katalizowana przez syntazę tymidylanową i mechanizm hamo-
wania jej przez FdUMP (z prawej).
błonę komórkową, co zapobiega utracie tych związków
przez komórkę [1,2].
Niezbędnym etapem katalizy realizowanej przez ST jest
utworzenie kompleksu trójcząsteczkowego enzym-substrat-
-kofaktor [3], z którego, po pewnej reorganizacji wiązań,
uwalniają się produkty, czyli tymidylan (dTMP) i 7,8-dihy-
drofolian (powstający w wyniku utlenienia 5,6,7,8-tetrahy-
drofolianu (Ryc. 1).
Mechanizm reakcji prezentuje rycina 2. Pirymidynowy
substrat ulega aktywacji w wyniku ataku nukleofilowego
Rycina 2. Mechanizm reakcji katalizowanej przez syntazę tymidylanową (opis w tekście); R — 5’-monofosforan 2’-deoksyurydyny, R’ — glutaminian kwasu paraamino-
benzoesowego.
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
reszty cysteinowej centrum aktywnego na węgiel C(6) pier-
ścienia pirymidynowego (2). Na tym etapie ujemny ładunek
reszty cysteinowej ulega delokalizacji, prawdopodobnie w
kierunku grupy C(4)=O dUMP, tworząc anion enolanowy.
Uważa się, że węgiel C(5) tego jonu ma charakter mocno nu-
kleofilowy, co ułatwia następujący teraz atak reszty metyle-
nowej (3), w formie jonu iminiowego, powstałego w wyniku
otwarcia pierścienia imidazolidynowego kofaktora (1). W
konsekwencji powstaje kowalencyjnie powiązany pośred-
nik, trójcząsteczkowy kompleks enzymu z dUMP i meTHF.
Następnie oddysocjowuje z węgla C(5) pierścienia pirymi-
dynowego dUMP proton, którego akceptorem jest prawdo-
podobnie uporządkowana cząsteczka wody (4). Prowadzi
to do β-eliminacji tetrahydrofolianu, pozostającego jednak
w dalszym ciągu związanym niekowalencyjnie w centrum
aktywnym, co umożliwia przeniesienie jonu wodorkowego
(proton z dwoma elektronami; H-) z węgla C(6) pterydyny,
prowadząc do redukcji grupy metylenowej na węglu C(5)
pierścienia pirymidynowego. Z redukcją tą sprzężona jest
regeneracja podwójnego wiązania C(5) = C(6) w pierścieniu
pirymidynowym, z następującą eliminacją (5), której pro-
duktami są dTMP i enzym [3-6], a którą poprzedza uwol-
nienie DHF.
Ten złożony mechanizm reakcji pozostawia stale szereg
wątpliwości, dlatego w ostatnich latach zintensyfikowa-
no badania poświęcone dwom końcowym etapom reakcji
katalizowanej przez syntazę tymidylanową (ST): odwra-
calnemu uwolnieniu protonu z węgla C5 pierścienia pi-
rymidynowego substratu (etap 4) oraz nieodwracalnemu
przeniesieniu wodorku z węgla C(6) kofaktora na pod-
stawnik metylenowy na węglu C(5) substratu (etap 5) [6-
13]. Mechanizmy obu etapów badane były przy pomocy
metod eksperymentalnych (technika kinetycznych efektów
izotopowych (KIE)) i teoretycznych (hybrydowe oblicze-
nia mechaniki kwantowej/mechaniki molekularnej (QM/
MM)). Wyniki eksperymentalne wykazały odmienną zależ-
ność temperaturową efektu KIE na obu etapach: o ile efekt
KIE związany z transferem protonu zależał od temperatury
[7], o tyle ten związany z przeniesieniem wodorku nie zale-
żał [8], sugerując wyższą organizację stanu przejściowego
dla etapu przeniesienia wodorku [9]. Sukcesywne badania
QM/MM w modelu wariacyjnej teorii stanu przejściowego
z uwzględnieniem wielowymiarowego tunelowania oraz
wprowadzeniem uśrednienia konformacji i ścieżek reakcji
275
(EA-VTST/MT), w połączeniu z teorią Grote-Hynes wska-
zały iż przeniesienie wodorku z węgla C(6) kofaktora na
podstawnik metylenowy na węglu C(5) substratu może
przebiegać zarówno na drodze klasycznej, tj. ponad barie-
rą potencjału, jak i w następstwie przenikania przez barierę
potencjału (efekt tunelowania) [9]. Proces ten jest skoor-
dynowany z zerwaniem wiązania pomiędzy katalityczną
resztą cysteiny 146 (numeracja wg sekwencji ST z E. Coli)
oraz węglem C(6) pierścienia pirymidynowego dUMP, co
prowadzi do regeneracji wolnej formy enzymu. Ważną rolę
odgrywają dostosowawcze ruchy białka, które akomodują
zmiany w geometrii i elektrostatyce ligandów zachodzące
na tym etapie. Szczególnie istotne jest zbliżenie zachowanej
w ewolucji reszty argininy 166 do reszty cysteiny 146, skut-
kujące polaryzacją gęstości elektronowej w otoczeniu ato-
mu siarki, a w konsekwencji stabilizujące zerwanie adduktu
na węglu C(6) [9].
W odróżnieniu od lepiej zdefiniowanego mechanizmu
przeniesienia wodorku, mechanizm uwolnienia protonu
pozostawia więcej wątpliwości. Z uwagi na skompliko-
wanie sieci wiązań wodorowych w centrum aktywnym
białka, nie jest pewne, która reszta aminokwasowa bądź
cząsteczka wody spełnia rolę zasady przechwytującej
uwalniany proton [4,10]. Ponadto, deprotonacja węgla
C(5) w pierścieniu pirymidynowym substratu pozostaje w
ścisłym powiązaniu z następującą β-eliminacją kofaktora
[3,14], co utrudnia zdiagnozowanie rzeczywistej natury
aktywacji wiązania C-H. Tym niemniej, badania QM/MM
w modelu B3LYP/6-31(G,d) wskazały na prawdopodob-
ny mechanizm uwolnienia i transferu protonu, w którym
rolę pierwotnej zasady spełnia uporządkowana cząsteczka
wody (WAT 47) [11]. Abstrakcja protonu z atomu węgla
C(5) w dUMP prowadzi do czasowego zerwania wiązania
pomiędzy sąsiednim atomem węgla C(6) a Cys146 enzy-
mu. Protonowana cząsteczka wody WAT 47, wchodząca
w skład sieci wiązań wodorowych w centrum aktywnym,
transferuje proton do N5 kofaktora. Następuje teraz po-
nowna addycja katalitycznej Cys146 do węgla C(6) pier-
ścienia pirymidynowego dUMP, prowadząca do elimina-
cji z kompleksu trójcząsteczkowego dotąd kowalencyjnie
związanego kofaktora [11].
Wspólną cechą obu proponowanych mechanizmów jest
labilny charakter wiązania C(6)-S, silnie polaryzowanego
przez Arg166, sąsiadującą z katalityczną cysteiną. Istotnym
składnikiem jest również dynamika białka, modulująca
środowisko reakcji i przygotowująca centrum aktywne do
kolejnych etapów katalizy. W proponowanych wariantach
mniejsza rola niż zakładano wcześniej przypada formie
enolowej/enolanowej na węglu C(4) pierścienia pirymidy-
nowego dUMP [11,12], która występuje we wcześniejszych
etapach reakcji. Warto również zaznaczyć wpływ jonów
Mg2+, które wiążąc się do powierzchni enzymu faworyzują
ruchy białka ustawiające korzystnie donor i akceptor prze-
niesienia wodorku, przyspieszając ok. 7-krotnie ten transfer
[13].
Reakcja katalizowana przez ST ThyA jest jedyną znaną
reakcją enzymatyczną, w której 5,6,7,8-tetrahydrofolian
(THF) służy zarówno jako czynnik przenoszący, jak i redu-
kujący resztę jednowęglową [3,15]. Co ciekawe, niedawno
276
odkryto inne białka, nazwane syntazami tymidylanowymi
ThyX (EC 2.1.1.148), wykorzystujące jako czynnik redukują-
cy resztę jednowęglową parę NADPH/FADH2 [16,17]. Biał-
ka te, których pochodzenie bywa bakteryjne (np. Helicobac-
ter pylori lub Mycobacterium tuberculosis) lub wirusowe, mają
całkowicie odmienną od ST ThyA (a więc także ludzkiej)
strukturę pierwszo-/trzeciorzędową, a więc budzą nadzieję
jako potencjalne cele molekularne selektywnej chemiotera-
pii przeciwbakteryjnej/przeciwwirusowej.
Warto tu też wspomnieć o tym, że w przypadku pier-
wotniaków, a także roślin wyższych, białka ST oraz DHFR
są kodowane przez jeden gen i podlegają syntezie jako
dwufunkcyjne białko RDHF-ST, którego koniec aminowy
zajmuje RDHF, natomiast ST — koniec karboksylowy łań-
cucha polipeptydowego. Obydwie domeny katalityczne
białka dwufunkcyjnego oddziaływują wzajemnie między
sobą i są potrzebne dla aktywności biologicznej białka [18].
Co więcej, wyniki badań kinetycznych wskazują, że w przy-
padku ST Leishmania występuje „kanałowanie” DHF od ak-
tywnego miejsca ST do takiegoż RDHF [19].
BUDOWA PODJEDNOSTKOWA
Do niedawna ST uważano za obligatoryjny dimer.
Przekonanie to było konsekwencją poznania struktury
trójwymiarowej jej białka [20], wskazującej na występo-
wanie w dimerze dwóch miejsc aktywnych, z których
każde zbudowane jest w większości z reszt aminokwa-
sowych jednej podjednostki, ale przy udziale reszt ami-
nokwasowych drugiej podjednostki. W szczególności,
miejscu aktywnym każdej podjednostki dwie spośród
czterech reszt argininowych, koordynujących resztę
5’-fosforanową dUMP, pochodzą z drugiej podjednostki.
Dlatego aktywność katalityczna tego enzymu jest związa-
na z dimerem. Stwierdzono jednak, że dimer ten można
przy użyciu mocznika zdenaturować, a powstałe rozfał-
dowane monomery poddają się fałdowaniu do postaci
katalitycznie aktywnego białka [21]. Co więcej, zaprezen-
towano wyniki wskazujące na występowanie w przypad-
ku białka ST równowagi monomer-dimer [22,23].
Wspomnieć należy, że chociaż ST jest homodimerem z
dwoma jednakowymi centrami aktywnymi (wyżej wspo-
mniano o udziale obu podjednostek w budowie każdego
z nich), to wykazuje „reaktywność połowy miejsc” (ang.
half-the sites reactivity). Polega to na tym, że centra aktywne
katalizują na zmianę, co jest konsekwencją negatywnego
współdziałania między tymi centrami, czyli występowa-
nia takiego oddziaływania między podjednostkami/cen-
trami aktywnymi, które w sytuacji zaangażowania jedne-
go centrum (poprzez związanie substratów) uniemożliwia
zaangażowanie drugiego [24-26]. Ze zjawiskiem tym wy-
daje się mieć związek obserwowany przez nas wielokrot-
nie profil hamowania ST przez inhibitory powoli wiąza-
ne (ang. slow-binding inhibitors), np. FdUMP i pochodne.
Cechą szczególną takich inhibitorów jest uzależnienie ich
działania od czasu, czyli występowanie zjawiska wzmac-
niania się hamowania z upływem czasu, w którym inhi-
bitor ma kontakt z enzymem [27]. Otóż w przypadku ST
inhibicja tego typu demonstrowała dwufazową zależność
prędkości inaktywacji od czasu, sugerując różne oddzia-
www.postepybiochemii.pl
ływanie z dwoma miejscami wiążącymi na cząsteczce
enzymu. Można to interpretować jako objaw negatywnej
kooperacji [28-35].
SYNTAZA TYMIDYLANOWA JAKO CEL
MOLEKULARNY CHEMIOTERAPII
Reakcję katalizowaną przez ST ThyA uważano do nie-
dawna za jedyne źródło tymidylanu syntetyzowanego de
novo w komórce, natomiast po odkryciu ST ThyX pogląd
taki pozostaje uprawniony przynajmniej w stosunku do ko-
mórek eukariotycznych. Dlatego od wielu lat enzym ten jest
celem molekularnym w chemioterapii przeciwnowotworo-
wej [36], przeciwwirusowej, przeciwgrzybiczej i przeciw-
pierwotniaczej [15]. Aktywnymi formami leków są analogi
dUMP lub N5,10-metylenotetrahydrofolianu o charakterze
inhibitorów reakcji katalizowanej przez ST, przy czym te
aktywne formy leków są często produktami metabolizmu
proleków, stosowanych w praktyce klinicznej. Dotyczy to
pochodnych dUMP, których reszta fosforanowa uniemożli-
wia efektywny transport przez błonę komórkowa oraz tych
antyfolianów (analogów N5,10-metylenotetrahydrofolianu),
które ulegają γ-poliglutamylacji [37], których transport
przez błonę komórkową jest możliwy tylko w postaci mo-
noglutaminianu.
Pomiędzy analogami dUMP aktywnymi w chemioterapii
wyróżnia się 5-fluoro-dUMP (FdUMP), silny inhibitor ST,
będący aktywną formą szeregu proleków, takich jak 5-flu-
orouracyl, 5-fluoro-2’-dezoksyurydyna i 5-fluorocytozy-
na [15]. Warto zauważyć, że 5-fluorouracyl, najstarszy lek
skierowany przeciwko ST, od czasów jego zaprojektowania
i syntezy w 1957 roku (przed odkryciem aktywności ST)
pozostaje podstawowym środkiem o dobrze udokumento-
wanej aktywności antyneoplastycznej w stosunku do wielu
guzów litych, w tym jelita grubego, trzustki, piersi, głowy i
szyi, a także w stosunku do raków przewodu pokarmowe-
go i jajników [36]. W szczególności jest podstawowym środ-
kiem w terapii jelita grubego [38]. Poza ST potencjalnymi
celami molekularnymi 5-fluorouracylu są RNA i DNA, do
których może być włączany [39]. Jak już wspomniano, 5-flu-
orouracyl jest prolekiem, a więc musi ulec wewnątrzkomór-
kowej metabolicznej aktywacji do postaci FdUMP (umożli-
wiającej inhibicję ST lub włączenie do DNA) lub FUMP (aby
było możliwe włączenie do RNA).
W związku z powyższym wspomnieć należy o tym, że
białko syntazy tymidylanowej, a w szczególności centrum
aktywne tego enzymu, należy do najsilniej zachowanych w
ewolucji [3,4]. Dlatego inhibitory o charakterze analogów
substratu lub kofaktora nie rokują dobrze z punktu widze-
nia możliwości gatunkowo selektywnej inhibicji enzymu
organizmu patogennego w stosunku do enzymu ssaka
(patrz porównanie oddziaływania szeregu takich analogów
z enzymem izolowanym z larw mięśniowych T. spiralis i re-
generującej wątroby szczura [31]), w tym ludzkiego. Sposób
na przełamanie tego impasu pokazała pionierska praca Sho-
icheta i wsp. [40], prezentująca wirtualną selekcję inhibitora
bakteryjnej ST, przeprowadzoną na podstawie struktury
trójwymiarowej białka enzymu, poprzez przeszukanie przy
pomocy programu DOCK bazy danych, zawierającej związ-
ki dostępne komercyjnie, pod kątem możliwości wiązania
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
z enzymem. Analiza oddziaływania z enzymem jednego z
trzech wyselekcjonowanych związków doprowadziła do
odkrycia zdolności fenoloftaleiny do silnego hamowania
bakteryjnej ST, a dalsze badania umożliwiły otrzymanie
pierwszego gatunkowo selektywnego inhibitora syntazy ty-
midylanowej (związek α-156), który hamował enzym bak-
teryjny 40-krotnie silniej niż ludzki [41]. Co ważne, badania
krystalograficzne zademonstrowały, że nowy inhibitor wią-
że się z enzymem w miejscu o sekwencji nie powtarzają-
cej się w innych białkach [42]. Cennym jest, że omawiany
sposób selekcji inhibitora, zwłaszcza jeśli uwzględnia po-
równanie struktur białkowych enzymu odpowiadających
organizmowi patogennemu i człowiekowi [42], umożliwia
znalezienie i „wykorzystanie” jako miejsca wiązania takiej
części cząsteczki, która te struktury różni. Dodatkowym
walorem jest komercyjna dostępność tak wyselekcjonowa-
nego(-ych) związku(-ów).
AKTYWNOŚCI NIEKATALITYCZNE BIAŁKA
SYNTAZY TYMIDYLANOWEJ
Szereg opublikowanych wyników wskazuje na poten-
cjalne niekatalityczne aktywności białka ST. Zademonstro-
wano mianowicie, że syntazy tymidylanowe ludzka i bak-
teryjna (E. coli) wiążą odpowiadające im mRNA w zakresie
ich regionów kodujących, przy czym w obydwóch przypad-
kach enzym był zdolny hamować translację in vitro własne-
go mRNA. Obie funkcje uważa się przy tym za wzajemnie
powiązane [43]. Co więcej, ludzka ST okazała się hamować
translację mRNA p53 i c-myc, sugerując zaangażowanie en-
zymu nie tylko w regulację translacji własnego mRNA, ale
także w regulację szeregu genów komórkowych [43]. Tak
więc białko syntazy tymidylanowej może mieć wpływ na
różne, jeszcze nie zidentyfikowane, aspekty metabolizmu
komórki, a wysoki poziom syntezy tego enzymu powiąza-
no nawet z aktywnością podobną do onkogennej [44].
TAUTOMERIA PIERŚCIENIA PIRYMIDYNOWEGO
U PODSTAW MECHANIZMU
SWOISTOŚCI SUBSTRATOWEJ
Porównując zależność od pH związanej z mechanizmem
reakcji inaktywacji syntazy tymidylanowej przez analo-
gi dUMP, FdUMP i 4-tio-FdUMP, uzyskaliśmy dowody
uzależnienia silnego wiązania w centrum aktywnym od
obecności grupy N(3)-H [32]. Była to pierwsza wskazówka,
dotycząca molekularnego mechanizmu rozróżnienia mię-
dzy pirymidynami przez centrum aktywne ST. Otóż, że w
fizjologicznych warunkach pH dUMP występuje głównie
w formie tautomerycznej, posiadającej grupy niezdysocjo-
waną N(3)-H i C(4)=O, podczas gdy dCMP występuje w
tych warunkach głównie w formie, posiadającej N(3) i C(4)-
-NH2. Mechanizm rozpznania tej różnicy został opisany w
kilka lat później w wyniku badań krystalograficznych [45].
Polega on na tworzeniu przez wspomniane grupy wiązań
wodorowych z zachowaną w ewolucji resztą asparaginową
(Ryc. 3) centrum aktywnego. Rozróżnianie przez centrum
pomiędzy dUMP i dCMP następuje dlatego, że w przypad-
ku dUMP grupy N(3)-H i O4 pełnią funkcje odpowiednio
donora i akceptora protonu, których to funkcji nie mogą
pełnić grupy N(3) i N4H2, obecne w dCMP. W zgodzie z
takim mechanizmem, mutacja wspomnianej asparaginy do
277

Rycina 3. Reszta asparaginowa centrum aktywnego syntazy tymidylanowej jako
element molekularnego mechanizmu swoistości substratowej; prezentowane jest
centrum aktywne ludzkiej syntazy tymidylanowej (na podstawie struktury kry-
stalicznej, PDB 1I00) w kompleksie z dUMP i analogiem kofaktora, z zaznaczo-
nymi na żółto wiązaniami wodorowymi między Asn i N(3)-H oraz O4 dUMP.
asparaginianu, który może tworzyć wiązania wodorowe z
N(3) i N4H2, spowodowała zmianę selektywności ST w stro-
nę katalizy metylacji dCMP [46]. Rolę taką asparaginian peł-
ni także w rozpoznawaniu dCMP przez centrum aktywnym
hydroksymetylazy dezoksycytydylanowej [47].
ZNACZENIE DYSOCJACJI GRUPY
FOSFORANOWEJ W WIĄZANIU dUMP/
ANALOGÓW W CENTRUM AKTYWNYM
W celu poznania znaczenia dysocjacji grupy 5’-fosfora-
nowej nukleotydowego substratu, produktu i inhibitora
dla wiązania w centrum aktywnym ST, przeprowadzono
porównawcze badania wpływu pH na oddziaływania z ST
dUMP, dTMP i FdUMP oraz trzech serii nowych pochod-
nych, będących analogami tych nukleotydów, posiadają-
cych zmodyfikowaną resztę 5’-fosforanową. Zmodyfiko-
wane grupy obejmowały tiofosforan, ditiofosforan, H-fos-
fonian i S-tiosiarczan. Wyniki pozwoliły na znalezienie ko-
relacji między oddziaływaniem z enzymem i wartościami
pKa, opisującymi dysocjację poszczególnych modyfikacji
reszty fosforanowej. Dysocjacja wtórnej grupy hydroksylo-
wej reszty fosforanowej okazała się być warunkiem ogra-
niczającym wiązanie dUMP i jego pochodnych, wskazując
na dianionową formę tej reszty jako preferowaną przez cen-
trum aktywne enzymu [48].
MECHANIZM DZIAŁANIA N4-HYDROKSY-dCMP
JAKO INHIBITORA REAKCJI KATALIZOWANEJ
PRZEZ SYNTAZĘ TYMIDYLANOWĄ
N4-hydroksy-dCMP (N4-OH-dCMP) jest wyjątkowym
analogiem substratu, podstawionym w pozycji innej niż na
węglu C(5), a mimo to powodującym silne hamowanie ST z
różnych źródeł [por. 15]. Ma ono charakter współzawodni-
czy w stosunku do dUMP, a ponadto zależy od mTHF oraz
od czasu (ang. slow-binding inhibition [27]), a więc oparte na
mechanizmie reakcji katalizowanej przez enzym. Towa-
rzyszy mu powstawanie trójcząsteczkowego kompleksu
278
enzymu z inhibitorem i mTHF [30,31,49-51]. Podobnie do
najlepiej poznanego inhibitora tej reakcji, 5-fluoro-dUMP
(FdUMP), N4-OH-dCMP, inkubowany z mTHF i enzymem,
tworzył trójcząsteczkowy kompleks [50]. Jednak, gdy sub-
strat dUMP zastąpiliśmy w mieszaninie reakcyjnej znaczo-
nym [5-3H]-N4-OH-dCMP, nie miało miejsca uwolnienie
trytu z węgla C(5) [30]. Sugerowało to zahamowanie reakcji
na etapie wcześniejszym niż w przypadku FdUMP, którego
aktywność inhibitorowa wynika z obecności atomu fluoru,
zastępującego atom wodoru i niezdolnego do dysocjacji
(Ryc. 1). Zbieżność obserwowanych cech hamowania przez
N4-OH-dCMP, ze znanymi od dawna cechami hamowania
przez FdUMP (poznaniu mechanizmu działania tego in-
hibitora zawdzięczamy dużą część posiadanej wiedzy na
temat mechanizmu reakcji katalizowanej przez ST [3]), su-
gerowała tworzenie przez N4-OH-dCMP podobnie powią-
zanego kompleksu z mTHF (Ryc. 1), z którego z nieznanych
powodów nie uwalniał się z obecny na atomie węgla C(5)
proton [30]. Nasze późniejsze badania krystalograficzne
[52], z zastosowaniem białka mysiej rekombinowanej ST
(mST), dowiodły, że w krysztale (PDB 4EZ8) uzyskanym
w obecności enzymu, N4-OH-dCMP i mTHF powstał kom-
pleks trójcząsteczkowy, w którym centrum aktywne białka
zawierało cząsteczkę inhibitora związanego kowalencyj-
nie oraz cząsteczkę związanego niekowalencyjnie 7,8-di-
hydrofolianu (DHF), zamiast oczekiwanego mTHF. Obraz
ten można interpretować jako wynik katalizowanej przez
enzym poronnej reakcji, polegającej na przeniesieniu gru-
py jednowęglowej na miejsce nieznane dotychczas oraz na
równoległym utlenieniu THF do DHF. Tym bardziej, że
pierścień pirymidynowy inhibitora wskazywał hybrydyza-
cję sp3 atomów C(5) i C(6), sugerując redukcję węgla C(5), z
którego najwyraźniej nie został uwolniony proton (zgodnie
z wcześniejszymi obserwacjami). Centrum aktywne było
zamknięte, z katalityczną resztą Cys189 związaną kowalen-
cyjnie z węglem C(6) inhibitora (ciągłość gęstości elektrono-
wej i odległość 1,87 Å). Zgodnie z tą interpretacją, N4-OH-
-dCMP pozostawał związany z enzymem w warunkach
denaturującej elektroforezy (SDS). Sprawdziliśmy także, że
mST, krystalizująca w obecności FdUMP i mTHF, tworzy
strukturę kompleksu trójcząsteczkowego (powiązanego
zgodnymi ze schematem prezentowanym przez rycinę 1)
analogiczną do wcześniej opisanych (struktura przygoto-
wywana jest do zdeponowania w PDB).
W roztworze równowaga między rotamerami (Ryc. 4)
wokół wiązania C(4)-N4 w N4-OH-dCMP jest przesunięta w
stronę formy syn, w stosunku do N(3) pirymidyny, jednak
mimo tego aktywną formą tego inhibitora wydawał się tyl-
ko rzadki (<5%) izomer anty-imino [30]. Taką też formę in-
hibitora znajdowaliśmy we wszystkich strukturach krysta-
licznych kompleksów z ST [52], co wskazuje na jej stabiliza-
cję w centrum aktywnym. Podkreślić należy, że izomer ten
może być przez centrum aktywne enzymu rozpoznawany
jako analog dUMP, ponieważ grupy N(3)-H i C(4)=N- mogą
tworzyć wiązania wodorowe z resztą Asn. W kontekście
mechanizmu inhibicji, warto zwrócić uwagę na położenie
podstawnika N4-OH we wspomnianej strukturze mTS-
N4-OH-dCMP-DHF w odległości wiązania wodorowego
od reszt Glu81, Tyr129, Leu186, His190 i Trp103 (Ryc. 5).
W świetle naszych wcześniejszych badań [30], podstawnik
ten pełni kluczową rolę modyfikacji przebiegu hamowanej
www.postepybiochemii.pl

Rycina 4. Równowagi syn-anti i amino-imino dla cząsteczki N4-OH-dCMP.
reakcji. Dlatego wyjaśnienie mechanizmu jego ingerencji w
reakcję katalizowaną przez ST, w tym powodów uniemoż-
liwienia uwalniania protonu z węgla C(5) pierścienia piry-
midynowego, może pomóc zrozumieć niejasne dotychczas
elementy mechanizmu reakcji.
AKTYWNOŚĆ SYNTAZY TYMIDYLANOWEJI
W CYKLU KOMÓRKOWYM I LOKALIZACJA
ENZYMU W KOMÓRCE ZWIERZĘCEJ
Aktywność syntazy tymidylanowej jest charakterystycz-
na dla komórek, które opuściły fazę G0 cyklu komórkowe-
go. Wysoką aktywność tego enzymu można znaleźć zwykle
w komórkach proliferujących [53]. W komórkach ssaków
poziom mRNA syntazy tymidylanowej jest bardzo niski w
fazie G0 cyklu komórkowego, natomiast wzrasta 10-20-krot-
nie, gdy komórki przechodzą do fazy S [54,55] i znów obniża
się w trakcie różnicowania [56]. Porównanie rozmaitych
komórek i tkanek pod względem poziomu mRNA synta-
zy tymidylanowej pokazało zmienność, odzwierciedlającą
różnice w prędkości proliferacji [57]. Regulacja poziomu
mRNA syntazy tymidylanowej rozgrywa się prawdopo-
dobnie w większym stopniu na etapie potranskrypcyjnym,
niż na transkrypcyjnym, przy czym prawidłowy przebieg
regulacji wymaga połączonego udziału zarówno promoto-
ra genu syntazy tymidylanowej, jak i intronów [57]. Wyniki
ostatnich badań sugerują, że to proces prawidłowego wyci-
nania intronów, a nie sekwencje w nich zawarte, jest dla tej
regulacji istotny [58].
Próby ustalenia lokalizacji syntazy tymidylanowej da-
wały niespójne wyniki, zależne od stosowanej metody i ro-
dzaju komórek, wskazujące na lokalizację jądrową lub cyto-
plazmatyczną [59]. Ostatnio stwierdzono, że białko enzymu
jest składnikiem kompleksu multienzymatycznego, związa-
nego z maszynerią replikacyjną DNA, obejmującego także
hydroksymetylotransferazę serynową (SHMT) i reduktazę
dihydrofolianową (RDHF) [60], które razem z ST katalizu-
ją cykl biosyntezy tymidylanu. Wszystkie trzy enzymy (w
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
Rycina 5. Położenie podstawnika N4-OH w strukturze mysia ST-N4-OH-dCMP-
DHF (PDB 4EZ8) w stosunku do reszt Glu81, Tyr129, Leu186, His190 i Trp103.
przypadku SHMT izoenzym SHMT1), zlokalizowano w ją-
drze, przy czym ich translokacja do tego przedziału komór-
kowego zależy od modyfikacji potranslacyjnej przez mały
modyfikator podobny do ubikwityny (SUMO, ang. small
ubiquitin-like modifier). Zrąb kompleksu stanowi SHMT [60],
której translokacja do jądra zależy od cyklu komórkowego
i ma miejsce w fazach S i G2/M, jak również w odpowiedzi
na zniszczenie przez UV [60-62]. U myszy jądrowa lokaliza-
cja drogi biosyntezy tymidylanu de novo jest wymagana dla
zminimalizowania błędnego włączania uracylu do DNA
[63].
WPŁYW MODYFIKACJI POTRANSLACYJNYCH NA
WŁAŚCIWOŚCI SYNTAZY TYMIDYLANOWEJ
Wiedza na temat modyfikacji potranslacyjnych ST jest
bardzo uboga. Samsonoff i wsp. [59] udokumentowali moż-
liwość występowania fosforylacji białka szczurzej syntazy
tymidylanowej, brak jednak było informacji na temat ewen-
tualnego wpływu takiej lub innych modyfikacji na właści-
wości enzymu. Z tego samego ośrodka pochodzi informacja
na temat modyfikacji enzymu (także szczurzego), polegają-
cej na obecności na końcu NH2 N-acetylowanej metioniny.
Modyfikacja ta powodowała kilkakrotne obniżenie aktyw-
ności właściwej homogennego elektroforetycznie preparatu
enzymu, w porównaniu z podobnie oczyszczonym prepa-
ratem enzymu rekombinowanego (identycznego w zakre-
sie sekwencji aminokwasów) z nie zablokowanym końcem
NH2 [64].
Wyniki porównawczych badań ST pochodzenia zwie-
rzęcego, gromadzone przez nas od wielu lat, sugerowały
możliwość występowania różnic we właściwościach, nie-
zależnych od sekwencji aminokwasowej, a więc prawdo-
podobnie związanych z modyfikacjami potranslacyjnymi.
W tabeli 1 zestawiono przykłady występowania znacznych
różnic w zakresie niektórych właściwości różnych form en-
zymu o tym samym pochodzeniu gatunkowym (np. prepa-
raty enzymu izolowanego z różnych linii komórek nowo-
279
Tabela 1. Parametery oddziaływania syntazy tymidylanowej z różnych źródeł z dUMP, FdUMP i analogami FdUMP [28,30-35,48,66,71-76]. Ki (S-B) – stała hamowania
powolnego wiązania (ang. slow-binding)

Km (µM) dla Ki (S-B) (nM) dla

Źródło enzymu
dUMP FdUMP 2-tio-FdUMP 4-tio-FdUMP N4-OH-dCMP N4-OH-FdCMP

Mysz
Rak Ehrlicha 1.3 5.5 79 60 50 20
L1210 2.6 1.8 41 102 63 73
L1210 oporne na FdUrd 2.5 12 297 14 184 93
Grasica 4.2 2.6
Rekombinowany enzym myszy
0.98
ekspresja w E. coli)
Szczur
Rak jelita K-12 3.2 120 400
Wątroba regenerująca 3.4 10 64 850 890 50
Rekombinowany enzym hepatomy
3.7 20 790
(ekspresja w E. coli)
Człowiek
Komórki raka jelita grubego HCT-8 2.8 130 140
Komórki białaczki CCRF-CEM 2.3 4 180
Rekombinowany enzym ludzki
5.3
(ekspresja w E. coli)
Tasiemiec
Hymenolepis diminuta 5.4 114 632 910 920 50

Nicień
Trichinella spiralis 3.1 80 960 510 6.7
Rekombinowany enzym T. spiralis 20.1
Caenorhabditis elegans 1.0 1.0
Rekombinowany enzym
2.7 2.1
C. elegans (ekspresja w E. coli)

tworowych o tym samym pochodzeniu gatunkowym), a w
niektórych przypadkach także udokumentowanej identycz-
ności sekwencji aminokwasów. W tym kontekście, wśród
danych zestawionych w tabeli 1 zwracają uwagę różnice
w oddziaływaniu z inhibitorami powoli wiązanymi i/lub
dUMP syntaz tymidylanowych mysich (enzymy komórek
L1210 macierzystych i opornych na FdUrd oraz enzym re-
kombinowany „dziki” nie różnią się sekwencją aminokwa-
sów; najprawdopodobniej dotyczy to też enzymu z grasicy)
oraz nicienia pasożytniczego T. spiralis (enzym ze źródła
naturalnego także nie różni się sekwencją aminokwasów
od enzymu rekombinowanego). Warto też wspomnieć o
różnicach, w obrębie każdej z tych dwóch par enzymów,
w zakresie reaktywności w stosunku do przeciwciał mo-
noklonalnych skierowanych przeciwko rekombinowanej
szczurzej syntazie tymidylanowej, spośród których pewne
reagowały krzyżowo z enzymem T. spiralis, ale nie rekom-
binowanym oraz z rekombinowanym enzymem L1210, ale
nie z tym izolowanym z komórek L1210 [65].
wrażliwość w stosunku do inhibitora okazała się nie wy-
nikać z różnicy w sekwencji aminokwasów [66], natomiast
porównanie właściwości preparatów enzymu otrzymanych
z każdej z dwu linii komórek L1210, oczyszczonych w obec-
ności i pod nieobecność inhibitorów fosfataz, wskazało na
uzależnienie tej wrażliwości od fosforylacji białka [66].
Dalsze badania fosforylacji ST pokazały, że białko enzy-
mu może ulegać fosforylacji nie tylko jako białko endogen-
nie obecne w komórkach ssaczych, ale także jako białko re-
kombinowane (odpowiadające enzymowi człowieka, szczu-
ra, myszy lub nicienia pasożytniczego Trichinella spiralis)
produkowane w komórkach bakteryjnych. Ufosforylowane
formy enzymu cechowała przynajmniej 3-krotnie niższa (w
porównaniu z formami nieufosforylowanymi) aktywność
cząsteczkowa (liczba obrotów) oraz wyżej wspomniane
aktywności niekatalityczne. Porównawcze analizy 31PNMR
dowiodły, że w czterech badanych rekombinowanych biał-
kach ST fosforylacja dotyczy reszt histydynowych [67].

Możliwość wpływu fosforylacji na właściwości ST po-
kazała analiza oczyszczonych niemal do homogenności
preparatów enzymu, wyizolowanych w obecności inhibi-
torów fosfataz z komórek białaczki mysiej L1210 opornych
na 5-fluorodezoksyurydynę, której ST jest hamowana sła-
biej, w porównaniu z enzymem z komórek macierzystych,
przez 5-fluorodezoksyurydylan (5-FdUMP, aktywna forma
5-FdUrd), co jest elementem mechanizmu oporności. Różna
Wyniki naszych badań sugerują jednak zależność od fos-
forylacji nie tylko aktywności katalitycznej, ale także wspo-
mnianych już wyżej zdolności białka syntazy tymidylanowej
do wiązania mRNA i hamowania translacji. Badania te doty-
czyły enzymu rekombinowanego, wyprodukowanego w ko-
mórkach bakteryjnych i rozdzielonego na formy nieufosfory-
lowaną i ufosforylowaną, przy czym modyfikacja tej ostatniej
okazała się dotyczyć tylko reszty/reszt histydynowej/histy-

280 www.postepybiochemii.pl
dynowych. Z tych dwóch form tylko ufosforylowana posiada-
ła wspomniane aktywności niekatalityczne, dysponując jedno-
cześnie znacząco obniżoną aktywnością katalityczną [67].
Co ciekawe, ST okazała się być substratem dla obu pod-
jednostek katalitycznych ludzkiej kinazy białkowej CK2, ale
nie dla holoenzymu α2β2. Przy tym reakcje fosforylacji przez
CK2α and CK2α’ białka ST, podobnie jak kalmoduliny czy
BID, były silnie hamowane w obecności podjednostki regu-
latorowej CK2β. Zastosowanie MALDI-TOF MS pozwoliło
zidentyfikować Ser124 jako miejsce fosforylacji. Modyfikacja
nie zmieniała wartości Km, natomiast obniżała wartość Vmax
katalizowanej przez ST reakcji [68]. Zastosowanie mode-
lowania molekularnego pozwoliło ocenić mechanizm tego
wpływu [69].
Zademonstrowano ponadto, że endogenne białka ST w
grasicy cielęcej i komórkach L1210 ulegają nitracji in vivo.
Natomiast chemiczna nitracja rekombinowanych białek ST
człowieka, myszy i C. elegans istotnie wpływa na potencjał
katalityczny, obniżając aktywność cząsteczkową [70].
PIŚMIENNICTWO
1. Santi DV, Danenberg PV (1984) Folates in pyrimidine nucleotide bio-
synthesis, W: Blakley R L, Benkovic S J (red) Folates and pterins t 1,
Chemistry and biochemistry of folates. Wiley, New York, str. 345-398
2. Rode W (1986) Biosynteza tymidylanu: rola biologiczna i regulacja w
komórkach zwierzęcych. Postepy Biochem 32: 401-420
3. Carreras CW, Santi DV (1995) The catalytic mechanism and structure
of thymidylate synthase. Annu Rev Biochem 64: 721-762
4. Stroud RM, Finer-Moore JS (2003) Conformational dynamics along an
enzymatic reaction pathway: Thymidylate synthase, “the movie”. Bio-
chemistry 42: 239-247
5. Islam Z, Strutzenberg TS, Gurevic I, Kohen A (2014) Concerted versus
step-wise mechanism in thymidylate synthase. J Am Chem Soc 136:
9850-9853
6. Singh P, Abeysinghe T, Kohen A (2015) Linking protein motion to en-
zyme catalysis. Molecules 20: 1192-1209
7. Wang Z, Kohen A (2010) Thymidylate synthase catalyzed H-transfers:
two chapters in one tale. J Am Chem Soc 132: 9820-9825
8. Agrawal N, Hong B, Mihai C, Kohen A (2004) Vibrationally enhanced
hydrogen tunneling in the E. coli thymidylate synthase catalyzed reac-
tion. Biochemistry 43: 1998–2006
9. Kanaan N, Ferrer S, Marti S, Garcia-Viloca M, Kohen A, Moliner V
(2011) Temperature dependence of the kinetic isotope effects in thy-
midylate synthase. A theoretical study. J Am Chem Soc 133: 6692-6702
10. Hong B, Maley F, Kohen A (2007) Role of Y94 in proton and hydride
transfers catalyzed by thymidylate synthase. Biochemistry 46: 14188-
14197
11. Wang Z, Ferrer S, Moliner V, Kohen A (2013) QM/MM Calculations
Suggest a Novel Intermediate Following the Proton Abstraction Cata-
lyzed by Thymidylate Synthase. Biochemistry 52: 2348-2358
12. Kanaan N, Martı S, Moliner V, Kohen A (2007) A quantum mecha-
nics/molecular mechanics study of the catalytic mechanism of the
thymidylate synthase. Biochemistry 46: 3704-3713
13. Wang Z, Sapienza PJ, Abeysinghe T, Luzum C, Lee AL, Finer-Moore
JS, Stroud RM, Kohen A (2013) Mg2+ binds to the surface of thymidy-
late synthase and affects hydride transfer at the interior active site. J
Am Chem Soc 135: 7583-7592
14. Finer-Moore JS, Santi DV, Stroud RM (2003) Lessons and conclusions
from dissecting the mechanism of a bisubstrate enzyme: Thymidylate
synthase mutagenesis, function, and structure. Biochemistry 42: 248-
256
15. Rode W, Leś A (1996) Molecular mechanism of thymidylate syntha-
se-catalyzed reaction and interaction of the enzyme with 2- and/or
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
4-substituted analogues of dUMP and 5-fluoro-dUMP. Acta Biochim
Polon 43: 133-142
16. Koehn EM, Fleischmann T, Conrad JA, Palfey BA, Lesley SA, Ma-
thews II, Kohen A (2009) An unusual mechanism of thymidylate bio-
synthesis in organisms containing the thyX gene. Nature 458: 919-923
17. Becker HF, Djaout K, Lamarre I, Ulmer JE, Schaming D, Balland V,
Liebl U, Myllykallio H, Vos MH (2014) Substrate interaction dynamics
and oxygen control in the active site of thymidylate synthase ThyX.
Biochem J 459: 37-45
18. Shallom S, Zhang K, Jiang L, Rathod PK (1999) Essential protein-pro-
tein interactions between Plasmodium falciparum thymidylate synthase
and dihydrofolate reductase domains. J Biol Chem 274: 37781-37786
19. Liang P-H, Anderson KS (1998) Substrate channeling and domain-do-
main interactions in bifunctional thymidylate synthase-dihydrofolate
reductase. Biochemistry 37: 12195-12205
20. Hardy LW, Finer-Moore JS, Montfort WR, Jones MO, Santi DV, Stroud
RM (1987) Atomic Structure of Thymidylate Synthase: Target for Ra-
tional Drug Design. Science 235: 448-455
21. Perry KM, Pookanjanatavip M, Zhao J, Santi DV, Stroud RM (1992)
Reversible dissociation and unfolding of the dimeric protein thymidy-
late synthase. Protein Sci 1: 796-800
22. Voeller DM, Zajac-Kaye M, Fisher RJ, Allegra CJ (2002) The identifica-
tion of thymidylate synthase peptide domains located in the interface
region that bind thymidylate synthase mRNA. Biochem Biophys Res
Commun 297: 24-31
23. Genovese F, Ferrari S, Guaitoli G, Caselli M, Costi MP, Ponterini G
(2010) Dimer-monomer equilibrium of human thymidylate synthase
monitored by fluorescence resonance energy transfer. Protein Sci 19:
1023–1030
24. Anderson AC, O’Neil RH, DeLano WL, Stroud R.M (1999) The struc-
tural mechanism for half-the-sites reactivity in an enzyme, thymidyla-
te synthase, involves a relay of changes between subunits. Biochemi-
stry 38: 13829-13836
25. Saxl RL, Changchien LM, Hardy LW, Maley F (2001) Parameters af-
fecting the restoration of activity to inactive mutants of thymidylate
synthase via subunit exchange: further evidence that thymidylate syn-
thase is a half-of-the-sites activity enzyme. Biochemistry 40: 5275-5282
26. Świniarska M, Leś A, RodeW, Cieśla J, Millán-Pacheco C, Blake IO, Pa-
stor N (2010) Segmental motions of rat thymidylate synthase leading
to half-the-sites behaviour. Biopolymers 93: 549-559
27. Morrison JF (1982) The slow-binding and slow, tight-binding inhibi-
tion of enzyme-catalysed reactions. Trends Biochem Sci 7: 102-105
28. Rode W, Cieśla J, Zieliński Z, Kędzierska B (1986) Purification and
properties of mouse thymus thymidylate synthase. Comparison of the
enzyme from mammalian normal and tumour tissues. Int J Biochem
18: 361-368
29. Rode W, Kulikowski T, Kędzierska B, Shugar D (1987) Studies on the
interaction with thymidylate synthase of analogues of 2’-deoxyuridi-
ne-5’-phosphate and 5-fluoro-2’-deoxyuridine-5’-phosphate with mo-
dified phosphate groups. Biochem Pharmacol 36: 203-210
30. Rode W, Zieliński Z, Dzik JM, Kulikowski T, Bretner M, Kierdaszuk
B, Cieśla J, Shugar D (1990) Mechanism of inhibition of mammalian
tumor and other thymidylate synthases by N4-hydroxy-dCMP, N4-
-hydroxy-5-fluoro-dCMP, and related analogues. Biochemistry 29:
10835-10842
31. Rode W, Dąbrowska M, Zielinski Z, Gołos B, Wranicz M, Felczak K,
Kulikowski T (2000) Trichinella spiralis and Trichinella pseudospiralis: de-
velopmental patterns of enzymes involved in thymidylate biosynthe-
sis and pyrimidine salvage. Parasitology 120: 593-600
32. Dzik JM, Kulikowski T, Zieliński Z, Cieśla J, Rode W, Shugar D (1987)
Interaction of 5-fluoro-4-thio-2’-deoxyuridine 5’-phosphate with
mammalian tumour thymidylate synthase: role of the pyrimidine
N(3)-H dissociation. Biochem Biophys Res Commun 149: 1200-1207
33. Dzik JM, Zieliński Z, Cieśla J, Bretner M, Kulikowski T, Shugar D,
Bertino JR, Rode W (1993) Interaction of 2-thio-5-fluoro-dUMP and
4-thio-5-fluoro-dUMP with mammalian normal and tumour, and
helminthic, thymidylate synthases: influence of C(4)-substituents on
281
 specificity for enzyme inactivation. Biochem Biophys Res Commun
195: 1301-1308
34. Dąbrowska M, Zieliński Z, Wranicz M, Michalski R, Pawełczak K,
Rode W (1996) Trichinella spiralis thymidylate synthase: developmen-
tal pattern, isolation, molecular properties, and inhibition by substrate
and cofactor analogues. Biochem Biophys Res Commun 228: 440-445
35. Wińska P, Gołos B, Cieśla J, Zieliński Z, Frączyk T, Wałajtys-Rode E,
Rode W (2005) Developmental arrest in C. elegans dauer larvae leaves
high expression of enzymes involved in thymidylate biosynthesis,
similar to that found in Trichinella muscle larvae. Parasitology 131:
247-254
36. Berger FG, Berger SH (2006) Thymidylate synthase as a chemothera-
peutic drug target: Where are we after fifty years? Cancer Biol Therapy
5: 1238-1241
37. Jarmuła A (2010) Antifolate Inhibitors of Thymidylate Synthase as An-
ticancer Drugs. Mini-Rev Med Chem 10: 1211-1222
38. Avallone A, Di Gennaro E, Silvestro L, Iaffaioli VR, Budillon A (2014)
Targeting thymidylate synthase in colorectal cancer: critical re-evalu-
ation and emerging therapeutic role of raltitrexed. Expert Opin Drug
Saf 13: 113-129
39. Rose MG, Farrell MP, Schmitz JC (2002) Thymidylate synthase: a criti-
cal target for cancer chemotherapy. Clin Colorectal Cancer 1: 220-229
40. Shoichet BK, Stroud RM, Santi DV, Kuntz ID, Perry KM (1993) Struc-
ture-based discovery of inhibitors of thymidylate synthase. Science
259: 1445-1450
41. Stout TJ, Tondi D, Rinaldi M, Barlocco D, Pecorari P, Santi DV, Kuntz
ID, Stroud RM, Shoichet BK, Costi MP (1999) Structure-based design
of inhibitors specific for bacterial thymidylate synthase. Biochemistry
38: 1607-1617
42. Costi MP, Gelain A, Barlocco D, Ghelli S, Soragni F, Reniero F, Ros-
si T, Ruberto A, Guillou C, Cavazzuti A, Casolari C, Ferrari S (2006)
Antibacterial agent discovery using thymidylate synthase biolibrary
screening. J Med Chem 49: 5958-5968
43. Liu J, Schmitz JC, Lin X, Tai N, Yan W, Farrell M, Bailly M, Chen T,
Chu E (2002) Thymidylate synthase as a translational regulator of cel-
lular gene expression. Biochim Biophys Acta 1587: 174-182
44. Rahman L, Voeller D, Rahman M, Lipkowitz S, Allegra C, Barrett JC,
Kaye FJ, Zajac-Kaye M (2004) Thymidylate synthase as an oncogene:
A novel role for an essential DNA synthesis enzyme. Cancer Cell 5:
341-351
45. Hardy LW, Nalivaika E (1992) Asn (177) in Escherichia-coli thymidylate
synthase is a major determinant of pyrimidine specificity. Proc Natl
Acad Sci USA 89: 9725-9729
46. Liu L, Santi DV (1992) Mutation of asparagine 229 to aspartate in thy-
midylate synthase converts the enzyme to a deoxycytidylate methyla-
se. Biochemistry 31: 5100-5104
47. Graves KL, Butler MM, Hardy LW (1992) Roles of Cys148 and Asp179
in catalysis by deoxycitidylate hydroxymethylase from bacteriophage
T4 examined by site-directed mutagenesis. Biochemistry 31: 10315-
10321
48. Gołos B, Dzik J M., Kazimierczuk Z, Cieśla J, Zieliński Z, Jankowska
J, Kraszewski A, Stawiński J, Rode W, Shugar D (2001) Interaction of
thymidylate synthase with the 5’-thiophosphates, 5’-dithiophospha-
tes, 5’-H-phosphonates and 5’-S-thiosulfates of 2’-deoxyuridine, thy-
midine and 5-fluoro-2’-deoxyuridine. Biol Chem 382: 1439-1445
49. Lorenson MY, Maley GF, Maley F (1967) The purification and proper-
ties of thymidylate synthetase from chick embryo extracts. J Biol Chem
242: 3332-3344
50. Goldstein S, Pogolotti AL, Jr, Garvey EP, Santi, DV (1984) Interaction
of N4-hydroxy-2’-deoxycytidilic acid with thymidylate synthetase. J
Med Chem 27: 1259-1262
51. Felczak K, Miazga A, Poznański J, Bretner M, Kulikowski T, Dzik JM,
Gołos B, Zieliński Z, Cieśla J, Rode W (2000) 5-Substituted N4-hydro-
xy-2’-deoxycytidines and their 5’-monophosphates: synthesis, con-
formation, interaction with tumor thymidylate synthase, and in vitro
antitumor activity. J Med Chem 43: 4647-4656
282
52. Dowierciał A, Jarmuła A, Wilk P, Rypniewski W, Kierdaszuk B, Rode
W (2013) Crystal structures of complexes of mouse thymidylate syn-
thase crystallized with N4-OH-dCMP alone or in the presence of
N5,10-methylenetetrahydrofolate. Pteridines 24: 93-98
53. Pestalozzi BC, McGinn CJ, Kinsella TJ, Drake JC, Glennon MC, Allegra
CJ, Johnston PG (1995) Increased thymidylate synthase protein levels
are principally associated with proliferation but not cell cycle phase in
asynchronous human cancer cells. British J Canc 71: 1151-1157
54. Ayusawa D, Shimizu K, Koyama H, Kaneda S, Takeishi K, Seno T
(1986) Cell-cycle-directed regulation of thymidylate synthase messen-
ger RNA in human diploid fibroblasts stimulated to proliferate. J Mol
Biol 190: 559-567
55. Gribaudo G, Riera L, Rudge TL, Caposio P, Johnson LF, Landolfo S
(2002) Human cytomegalovirus infection induces cellular thymidylate
synthase gene expression in quiescent fibroblasts. J Gen Virol 83: 2983-
2993
56. Horie N, Nozawa R, Takeishi K (1992) Identification of cellular diffe-
rentiation-dependent nuclear factors that bind to a human gene for
thymidylate synthase. Biochem Biophys Res Commun 185: 127-133
57. Lee Y, Shen G, Johnson LF (1999) Complex transcriptional initiation
pattern of the thymidylate synthase promoter in mouse tissues. Arch
Biochem Biophys 372: 389-392
58. Ke Y, Ash J, Johnson, LF (1996) Splicing signals are required for S-pha-
se regulation of the mouse thymidylate synthase gene. Mol Cell Biol
16: 376-383
59. Samsonoff WA, Reston J, McKee M, O’Connor B, Galivan J, Maley GF,
Maley F (1997) Intracellular location of thymidylate synthase and its
state of phosphorylation. J Biol Chem 272: 13281-13285
60. Anderson DD, Woeller CF, Chiang E-P, Shane B, Stover PJ (2012) Se-
rine hydroxymethyltransferase anchors de novo thymidylate synthesis
pathway to nuclear lamina for DNA synthesis. J Biol Chem 287: 7051-
7062
61. Woeller CF, Anderson DD, Szebenyi DM, Stover PJ (2007) Evidence
for small ubiquitin-like modifier-dependent nuclear import of the thy-
midylate biosynthesis pathway. J Biol Chem 282: 17623-17631
62. Fox JT, Shin WK, Caudill MA, Stover PJ (2009) A UV responsive in-
ternal ribosome entry site enhances serine hydroxymethyltransferase
1 expression for DNA damage repair. J Biol Chem 284: 31097-31108
63. Macfarlane A J, Anderson DD, Flodby P, Perry C A, Allen RH, Stabler
SP, Stover PJ (2011) Nuclear localization of de novo thymidylate bio-
synthesis pathway is required to prevent uracil accumulation in DNA.
J Biol Chem 286: 44015-44022
64. Cieśla J, Weiner KXB, Weiner RS, Reston JT, Maley GF, Maley F (1995)
Isolation and expression of rat thymidylate synthase cDNA: Phylo-
genetic comparison with human and mouse thymidylate synthases.
Biochim Biophys Acta 1261: 233-242
65. Gołos B, Wałajtys-Rode E, Porębska A, Cieśla J, Dąbrowska, Zieliński
Z, Rode W (2002) Thymidylate synthase heterogeneity assessed by
monoclonal M antibodies, W: Milstien S, Kapatos G, Levine RA, Shane
B (red.) Chemistry and biology of pteridines and folates. Kluwer Aca-
demic Publishers, Dodrecht, Boston, London, str. 519-523
66. Cieśla J, Frączyk T, Zieliński Z, Sikora J, Rode W (2006) Altered mouse
leukemia L1210 thymidylate synthase, associated with cell resistance
to 5-fluoro-dUrd, is not mutated but rather reflects posttranslational
modification. Acta Biochim Polon 53: 189-198
67. Frączyk T, Ruman T, Wilk P, Palmowski P, Rogowska-Wrzesinska
A, Cieśla J, Zieliński Z, Nizioł J, Jarmuła A, Maj P, Gołos B, Wińska
P, Ostafil S, Wałajtys-Rode E, Shugar D, Rode W (2015) Properties of
Phosphorylated Thymidylate Synthase. Biochim Biophys Acta - Prot
Proteom, w druku; DOI: 10.1016/j.bbapap.2015.08.007
68. Frączyk T, Kubiński K, Masłyk M, Cieśla J, Hellman U, Shugar D,
Rode W (2010) Phosphorylation of Thymidylate Synthase from Vario-
us Sources by Human Protein Kinase CK2 and its Catalytic Subunits.
Bioorg Chem 38: 124-131
69. Jarmuła A, Frączyk T, Cieplak P, Rode W (2010) Mechanism of influ-
ence of phosphorylation on serine 124 on a decrease of catalytic acti-
vity of human thymidylate synthase. Bioorg Med Chem 18: 3361-3370
www.postepybiochemii.pl
70. Dąbrowska-Maś E, Frączyk T, Ruman T, Radziszewska K Wilk P, Cie-
śla J, Zieliński Z, Jurkiewicz A, Gołos B, Wińska P, Wałajtys-Rode E,
Leś A, Nizioł J, Jarmuła A, Stefanowicz P, Szewczuk Z, Rode W (2012)
Tyrosine nitration affects thymidylate synthase properties. Org Bio-
mol Chem 10: 323-331
71. Bretner M, Kulikowski T, Dzik JM, Balińska M, Rode W, Shugar D
(1993) 2-Thio derivatives of dUrd and 5-fluoro-dUrd and their 5’-mo-
nophosphates: synthesis, interaction with tumor thymidylate syntha-
se, and in vitro antitumor activity. J Med Chem 36: 3611-3617
72. Cieśla J, Gołos B, Dzik JM, Pawełczak K, Kempny M, Makowski M,
Bretner M, Kulikowski T, Machnicka B, Rzeszotarska B, Rode W
(1995) Thymidylate synthases from Hymenolepis diminuta and rege-
nerating rat liver: purificarion, properties, and inhibition by substrate
and cofactor analogues. Biochim Biophys Acta 1249: 127-136
73. Cieśla J, Zieliński Z, Rode W (1997) Comparison of properties of E. co-
li-expressed rat hepatoma and normal rat thymidylate synthases, W:
Pfleiderer W, Rokos H (red.) Chemistry and biology of pteridines and
folates 1997, Blackwell Sci, Berlin, Vienna, Oxford, Edinburgh, Boston,
London, Melbourne,Paris, Tokyo, str. 411-414
74. Cieśla J, Gołos B, Wałajtys-Rode E, Jagielska E, Płucienniczak A, Rode
W (2002) The effect of Arg 209 to Lys mutation in mouse thymidylate
synthase. Acta Biochim Polon 49: 651-658
75. Dąbrowska M, Jagielska E, Cieśla J, Płucienniczak A, Kwiatowski J,
Wranicz M, Boireau P, Rode W (2004) Trichinella spiralis thymidylate
synthase: cDNA cloning and sequencing, and developmental pattern
of mRNA expression. Parasitology 128: 209-221
76. Ziemkowski P, Felczak K, Poznański J, Kulikowski T, Zieliński Z, Cie-
śla J, Rode W (2007) Interactions of 2’-fluoro-substituted dUMP analo-
gues with thymidylate synthase. Biochem Biophys Res Commun 362:
37-43

Thymidylate synthase-catalyzed reaction mechanism

Wojciech Rode, Adam Jarmuła

Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 3 Pasteura St., 02-093Warsaw, Poland

rode@nencki.gov.pl

Key words: posttranslational modifications, N4-hydroxy-dCMP, thymidylate synthase

ABSTRACT
Thymidylate synthase ThyA (EC 2.1.1.45; encoded by the Tyms gene), having been for 60 years a molecular target in chemotherapy, catalyses
the dUMP pyrimidine ring C(5) methylation reaction, encompassing a transfer of one-carbon group (the methylene one, thus at the formal-
dehyde oxidation level) from 6R-N5,10-methylenetetrahydrofolate, coupled with a reduction of this group to the methyl one, with concomitant
generation of 7,8-dihydrofolate and thymidylate. New facts are presented, concerning (i) molecular mechanism of the catalyzed reaction,
including the substrate selectivity mechanism, (ii) mechanism of inhibition by a particular inhibitor, N4-hydroxy-dCMP, (iii) structural pro-
perties of the enzyme, (iv) cellular localization, (v) potential posttranslational modifications of the enzyme protein and their influence on the
catalytic properties and (vi) non-catalytic activities of the enzyme.

Postępy Biochemii 61 (3) 2015 283