實驗 5、螢光光譜儀檢測水溶液中奎寧含量

ㄧ、目的
藉本實驗以了解螢光光譜分析法(Fluorescence Spectroscopy)的原理，並可學習
操作螢光光譜分析儀的方法，最後並利用此方法定量分析溶液中奎寧之含量，並探
討 Cl－及Br－抑制螢光強度的效果。

二、原理
當一分子吸收一輻射光(hν)被激發而躍遷至高能階時，若激發態電子是以放光
的形式回到基態時，會放出波長比激發光的波長更長或相同的光，最常見的兩種是
螢光(fluorescence)與磷光(phosphorescence)。

上圖顯示電子從基態(S0)吸收輻射光耀遷至激發態(S１)，再以各種形式釋放能量
回到基態的過程。在激發態的電子會經由振動去活化 (vibrational deactivation)的步驟
很快地(約10-8秒)都回到S１的最低震動能階。此時電子可能藉由非輻射的內部轉換
(internal conversion)以放熱方式回到基態，也可能以放出螢光的方式回到So的不同能
階上(通常選擇life time較短者進行)，所以螢光的波長多比激發輻射光更長或相同，
吸收的輻射波長沒有變化即再放出的螢光稱為共振螢光(resonance fluorescence)。
在去活化的過程，電子也可能經由系統間轉換(intersystem crossing)先到達三重
態T１(triplet state)，再以放出磷光的形式回到So的不同振動能階，磷光的 life time 可
能由10－４秒至數秒鐘，而螢光則小於10－５秒。目前，螢光在分析化學上的應用遠比
磷光重要。
通常飽和分子和只含一個雙鍵的分子沒有螢光特性，而至少有一個芳香環或有
很多共輒雙鍵的分子則具有波長在可見光或紫外光區的螢光質。而苯環上若有取代
基如 –NH 2、–OH、–OCH3、–NHCH3等推電子基則會增加螢光強度：而苯環上有取
代基是 –NO2 和 –COOH 等拉電子基則會減弱或抑制螢光的放射。此外，溶液中存
在某些離子或分子也會抑制螢光強度(quenching) 例如Cl－或Br－即會因 heavy-atom
effect 而抑制溶液中奎寧(quinine) 之螢光強度。
螢光強度(F)和螢光物質的濃度(C)之間的關係如下：
F=K'Po (l -10-εbc)
對於稀釋溶液，若 2.303 εbc < 0.05 則上式可簡化為:
F=2.3K'Poεbc
其中，F: 螢光強度
K': 比例常數,與量子化效率(guantum efficiency) 有關
Po: 入射光強度
ε: 莫耳吸收條數
b: 光徑長
c: 濃度
 故在低濃度時，螢光強度(F)與分析物之濃度(C)之間有很好的線性關係。
螢光光譜可分為激光光譜及放光光譜，其基本量取差異如下：

激光光譜之測量是將λ‘固定測取不同λ對λ'強度之影響而放光光譜之測取是因定入
射光源，λ，測取各種波長放光強度。

三、實驗設備與儀器
螢光光譜分析儀 (Fluorescence Spectrophotometer)：SEEMADZU RF-1501
吸量管、體積瓶、燒杯、安全吸球、玻棒、滴管、量筒、石英試液槽

四、實驗樣品
1. 藥品 :
(1) 濃硫酸 (比重96%, 比重=1.84)
(2) 奎寧 (Quinine)
(3) KBr
 2. 溶液配備 :
(1) 稀硫酸 (0.05M) 1升
(2) 稀鹽酸(0.05M ) 1升
(3) Quinine 標準溶液 :
a. 10 ppm 儲備溶液 : 精秤 0.001 g quinine, 置於100 mL定量瓶內，
加 0.05 M 硫酸至刻度線，使溶解並混合均勻。
b. 利用(a)之溶液加 0.05 M 硫酸配製濃度各為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ppm 之
標準溶液 10mL 於定量瓶中。
(4) 0.1 M KBr溶液：取已知重量的KBr加入100 mL的定量瓶中，再以0.05 M 硫酸
溶解並稀釋至刻度線。
(5) Unknown Sample：由助教配製一濃度在 0.2~1 ppm 之間的 Quinine 標準溶液當
作 Unknown 樣品。

五、實驗步驟
**請先跟老師領取Cell

螢光儀器操作步驟

第一部分 : ( 定性分析 )
1. 預熱開機 :

電腦開機→ 開光譜儀 power → 於桌面點選 FL Solution2.1 for F-7000

→光譜儀暖機 10 分鐘

2. 放入 1.0 ppm quinine → 在 Spectrophotometer 按上列圖式 Auto Pre-scan

→ 紀錄 EX & EM 值。

3. 測 Excitation:

在主目錄中，點選右列上方的 Method。
→在 General 介面的 Measurement 中選擇 Wave Length Scan

→在 Instrument 介面的 Scan Mode 中選擇 Excitation →輸入 EM 之數值 (為紀錄之數

值) →確認 EX slit 與 EM slit 為 5 nm →Ex Start/End 設定 200-700 nm→Scan speed 為

1200 nm/min。

按下右列的 Measure →測出 EX 的圖(可按右鍵 Auto Scare 更改 Y 軸的 Scare 使 peak 較

好觀察) →點選 File 的 Save as 存成 FL Wavelength (*.fds)檔。

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4. 測 Emission:

在主目錄中，點選右列上方的 Method 。

→在 General 介面的 Measurement 中選擇 Wave Length Scan

→在 Instrument 介面的 Scan Mode 中選擇 Emission →輸入 EX 之數值(為紀錄之數

值)→確認 EX slit 與 EM slit 為 5 nm →Em Start 設定 200-700 nm

→Scan speed 為 1200 nm/min。

按下右列的 Measure →測出 EM 的圖(可按右鍵 Auto Scare 更改 Y 軸的 Scare 使

peak 較好觀察) →點選 File 的 Save as 存成 FL Wavelength (*.fds)檔。

第二部分 : ( 定量分析 )
在主目錄中，點選右列上方的 Method 。

→在 General 介面的 Measurement 中選擇 Photometry

→在 Quantitation 中→其 Peak Height 選擇為 EM 值(Pre-scan 得值) ± 10 nm，

Calibration 為 1st order，單位 mg/L，Digit after decinal point 設為 3。

→在 Instrument 介面的 Scan Mode 中選擇 Emission →輸入 EX 值(Pre-scan 得值)，

Replicate 設為 3 次。

→在 Method 的 Standard 中設定 5 個 Sample 及 Concentration 濃度 ( 0.2、0.4、0.6、

0.8、1.0)

設定完後將最低濃度 Sample 置入→按下右列的 Measure → 每個濃度須測量 3 次，測完

所有 Sample ( R2 須大於或等於 0.995 上，才可繼續往下做 )

*校正曲線公式請記錄各點的數值，再自行回去做計算即可。

＊如須重新測試某一點濃度，則選視窗上之樣品編號，再按下左下方 Remeasure 即可

重測該樣品濃度。
測量未知物 Sample，左下角按 Sample ，並利用求得之檢量線計算未知物濃度。

→點選左下角 End
第三部分 : ( 重原子對螢光之影響 )
sample 製備 :

1. 取 10 ppm Quinine 0.5 mL + 0.1M KBr 0.5 mL + 0.05M 稀硫酸稀釋至 10 ml。

2. 將配製好的 10 ppm Quinine 0.5 mL + 0.1M KBr 0.5 mL + 0.05M 稀硫酸 Sample

放入。

3. 在主目錄中，點選右列上方的 Method。

→在 General 介面的 Measurement 中選擇 Wave Length Scan→ 點選畫面上方的 Auto

Pre-Scan 紀錄 EM、EX 值 →在 Instrument 介面的 Scan Mode 中選擇 Emission →輸入

EX 為紀錄之數值→Em Start 設定 200-700 nm→Scan speed 為 1200nm/min。

按下右列的 Measure →測出 EM 的圖(可按右鍵 Auto Scare 更改 Y 軸的 Scare 使 peak

較好觀察) →點選 File 的 Save as 存成 FL Wavelength (*.fds) 檔。

4. 改變 sample，將 0.05M H2SO4 改為用 0.05M HCl 稀釋 Quinine 溶液，觀察 HCl 對螢

光強度的影響。

5. 疊圖：按 Data → overlap from files 選取欲疊圖的檔案名→ 觀察趨勢(也可回去用

oringin、excel 等軟體疊圖)。

sample 製備 : 取 10 ppm Quinine 0.5 mL + 0.1M KBr 0.5 mL + 0.05M 稀鹽酸稀釋至 10

ml，測試步驟同上。
螢光關機步驟

選（Utility → Lamp off）做 Close the Lamp→關電腦介面→冷卻 20min（務必等其冷

卻以免損壞儀器）→關 power。

＊＊沒關 Lamp 就關介面者一律死當＊＊

桌面清理完畢確實關機後，將石英 cell 歸還給老師，由老師簽章後即可離開。

六、結果與討論 請參照 i-learning 內容