Chromatography

層析法
Chromatography
 字義：chroma為色素，graphy是記錄或畫圖，即「色彩記錄」。

 來源：1906年，俄國生物學家Tswett最早開始使用此法，他是用
一直立的玻璃圓筒，下有出口，內裝碳酸鈣粉(CaCO3) (固定相)
，於圓筒頂端置入綠色植物抽出液，以石油醚當展開液(移動相)
，則石油醚向下移動時，其所含之色素漸分離展開，形成一層層
的色素帶，因之將其命名為chromatography，以後此類分離法稱
為色層分析法(chromatography)，統稱層析法。

石油醚

CaCO3
Chromatography 移
動
色層層析法 相
固
 定義： 定
相
一種有效的物理分離方法，是根據試樣
混合物中各成分在不互溶的兩相(固定相
與移動相)中的吸附能力、分配係數、或
其他親合作用之差異，使其流速不同，
作為分離的依據。

層析法可以解決一般分離方法，如：蒸
餾、分餾、萃取、再結晶等，不易分離
的混合物之分離分析。

http://faculty.ksu.edu.sa/18856/Chromatographic/_w/column%20chromatography_jpg.jpg
 固定相(Stationary phase)：可為液體或固體，固定在原來的地
方，當移動相帶著試料(混合物)通過它時，二者即開始進行
多次的分配或吸附作用。

 移動相(Mobile phase)：可為液體或氣體，當它通過固定相時，
即與固定相進行多次之分配、吸附作用，而分離物質。

• Analyze
Separate
• Identify
• Purify
Mixture Components
• Quantify
 Uses for Chromatography
Chromatography is used by scientists to:
• Analyze –
examine a mixture, its components, and their relations to one another

• Identify –
determine the identity of a mixture or components based on known
components

• Purify –
separate components in order to isolate one of interest for further study

• Quantify –
determine the amount of the a mixture and/or the components present in the
sample
Types of Chromatography

 依分離原理來分類：

一、吸附層析
二、分配層析
三、離子交換層析
四、分子篩層析
五、其他……
吸附層析法 (Adsorption chromatography)

 是利用同一吸附劑(固定相)對混合物中各種成分吸附能力的
差異，而使各成分達到分離目的的層析方法。

 基本原理:
不同的化合物由於結構性質上的差異，展開劑(移動相)對它們的沖提
能力和在吸附劑(固定相)上的吸附、解吸附性能力也是不同的，因而
在吸附劑上移動的距離也就不會相同，而達到分離的效果。

△、□、○表示三種不同成分。

從Ａ到Ｄ四圖表示，三成分由於各自吸
附能力不同，與填充劑(固定相)的吸附
和去吸附的過程有所差異
吸附層析法 (Adsorption chromatography)

 常用吸附劑: ~ 固定相

 矽膠 (Silica gel)：極性吸附劑
為一多孔性物質，可用通式SiO2．xH2O來表示。顆粒表面具有很多矽
醇基，由於矽醇基能和許多化合物形成氫鍵而具有一定的吸附作用，
所以矽膠吸附作用的強弱與矽醇基的含量多少有關。

 氧化鋁(Aluminum oxide)
 聚醯胺(Polyamide)
 活性炭(Activated carbon)

http://www.psaplants.com/gifs/silica-gel.jpg
吸附層析法 (Adsorption chromatography)

~ 移動相
 溶劑:

 溶劑的選擇

 對極性吸附劑(固定相)而言: 溶劑的極性↑；沖提能力↑
(Like Dissolves Like：相似者相溶)

常用溶劑極性次序：

H2O CHCl3 CCl4

水 ＞ 丙酮 ＞ 乙酸乙酯 ＞ 氯仿 ＞ 苯 ＞ 四氯化碳 ＞ 石油醚

O O
R' O R
C C CH2
H3C H3C
CH3 O
CH3
Illustration of Chromatography
Stationary Phase

Separation

Mobile Phase

Mixture Components

Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase

Blue  
Black  
Red  
Yellow     
吸附層析法 (Adsorption chromatography)

 被分離的物質:

 對極性吸附劑：
 被分離的物質極性↑
 吸附力↑
 沖提能力↓

 應用:

薄層層析(Thin Layer Chromatography, TLC)

管柱層析法(Column Chromatography, CC)

http://faculty.ksu.edu.sa/18856/Chromatographic/_w/column%20chromatography_jpg.jpg
 分配層析 (Partition chromatography)

 利用物質在互不相溶的兩相溶劑(固定相+移動相)中分配係數
不同，而達到分離的一種層析方法。

 分配係數:在一定的溫度下達到平衡後，溶質在兩相中濃度的
比值是一個常數，

用KD表示：

KD＝溶質在固定相中的濃度/溶質在移動相中的濃度。

 Like Dissolves Like: 相似者相溶。

 分配層析 (Partition chromatography)

 基本原理:

 將固定相(若原為液體時)吸著在惰性固體或濾紙上(支持劑、載體或擔
體)，欲被分離的物質(混合物)置於固定相上，以移動相沖提(或展開)，
樣品中的物質就在固定相與移動相之間分配而達到分離。

因此，本法由載體、固定相、移動相、被分離物質四個部分組成。

 以水或親水性溶劑為固定相，與水不相混溶的極性有機溶劑為移動相
的分配層析稱為正相分配層析(normal phase, NP)

 反之，以親脂性有機溶劑為固定相，以水或親水性溶劑為移動相則稱
為反相分配層析(reverse phase, RP) 層析法 固定相 移動相
正相 極性大 極性小
逆相 極性小 極性大
 分配層析 (Partition chromatography)

 應用:

 紙層析 (Paper Chromatography, PC)

 薄層層析 (Thin Layer Chromatography, TLC)
 管柱層析法 (Column Chromatography, CC)
 液相-液相層析法 (Liquid-Liquid Chromatography)
離子交換層析 (Ion exchange chromatography)
 是用離子交換劑(固定相)代替吸附劑的一種層析方法。該方法在工業
上用途很廣，在天然產物有效成分的分離方面，特別對水溶性成分氨
基酸、肽類、生物鹼、有機酸及酚類化合物的分離。
202.196.208.114

混合物帶電荷數越多↑
與固定相的吸附能力↑
溶媒沖提能力↓
愈慢被沖出來

分子篩層析 (Size exclusion chromatography)

混合物分子量↓
 固定相具有孔洞，可使分子量大小 滯留於固定相內時間↑
溶媒沖提能力↓
不一的混合物進入，利用移動相的 愈慢被沖出來
沖提，根據分子量的大小達到分離
的一種層析方法。
http://www.chemistry.adelaide.edu.au/external/soc-rel/content/images/size-exc.png
 薄層色層分析
Thin-Layer Chromatography (TLC)
Technique
 實驗目的

 通過實驗主要是要讓同學學習TLC的原理與操作。
 基本原理 鋁(Aluminum)板

 TLC法 是藉由玻璃板或其
他適當的支持體上，均勻
塗上一層薄層吸附劑(固定
相)後，點上檢品混合液，
然後藉由展開劑(developer)
(移動相)予以分離的過程。

玻璃板

 其分離效果可經由吸附作用、分配作用或兩者合併而達成，可以
用來分離或鑑定小量sample中複雜的無機物、有機物，以及生物
化學物質成分之簡單的方法。
 吸附劑 ~ 固定相

(1) 礬土或氧化鋁
(2) 矽膠 (silical gel)
(3) 矽藻土或纖維素

展開劑 (eluent, mobile phase) ~ 移動相

 分為極性、非極性溶媒：

化合物極性大者，用極性大之溶媒；反之亦然

►利用對吸附劑(固定相)的毛細作用及吸附作用而移動，當展開劑通過固定
相時，即與固定相對混合物中之成分進行多次的分離和吸附作用，而使混合
物中之各成分分離
 藥品和儀器 鋁(Aluminum)板

儀器
 Developing chamber 展開槽
固定相: 矽膠 (屬極性大)
 Capillary tube 毛細管
 TLC plate
 藥品和儀器
O
藥品 O2N
H
N C CH3

 Standard solution A： p-nitroacetanilide

O2N NH2
 Standard solution B： p-nitroaniline

 Sample solution C： 水解實驗之產物 (上次實驗的產物)

(取少許，約筆尖大小，以1 ml乙醇溶解) CH CH OH
3 2

 展開液：ethyl acetate (移動相) >> ethyl acetate: hexane 1:1

乙酸乙酯 乙酸乙酯 己烷

C CH2
H3C
O
CH3
 實驗步驟-1
 取2片TLC plate

 於距底部1 cm處，以鉛筆輕
畫一baseline，並標示出3點
 上部具頂端0.5 cm處，畫一
solvent front
0.5 cm

0.5 cm

x x x x x x
1 cm

1 cm
 樣品施點 (Spotting) Capillary tube 毛細管

手有油汙，不要碰觸到TLC
 Do not get greasy fingerprints on the plate
 Use pencil only 只能使用鉛筆於TLC

 Spot on baseline
點於基準線
 Avoid edges
避免TLC的邊緣翹起，會干擾移動向的展開
 ** 施點Standard A、B時，瓶內的毛細管不要共用，以
實驗步驟-2 免汙染而影響實驗的結果。
**請看清楚Standard A、B的名稱。

 如右圖所示，以毛細管分別
取standard solution A, B and
sample solution C點於plate上
(spot 之直徑約0.1 cm)

 以吹風機(or 嘴巴吹氣)吹乾
spot ( why?)

 A：p-nitroacetanilide
 B：p-nitroaniline
 C：水解實驗之產物 (上次實驗的產物) x x x x x x
(取少許，約筆尖大小，以1 ml乙醇溶解) 1 cm

A A+C C B B+C C
 樣品溶於乙醇，而我們後續使用
的展開溶媒(移動相)為乙酸乙酯
注意事項
極性: 乙醇 > 乙酸乙酯

sample可重複點(loading)於同一位置上，但須先等前
一次之溶媒乾了以後(可用吹風機吹乾or用嘴吹氣吹乾)
，再將sample點上。點的面積也盡可能達到最小點

Tailing
拖尾

影響判讀
 實驗步驟-3 ** 容器不要用水洗，不然會影響實驗結果。
** 容器若是太髒，則用乙酸乙酯清洗。

 於展開槽(須乾燥)中加入約5 ml乙酸乙酯，注意高度不可高
於baseline
** 展開槽中的展開液要低於基準線，如此才不致
於在未展開檢品時，檢品已被展開液溶解。

 將TLC plate垂直置入展開槽

 讓展開液向上展開

展開槽

baseline

乙酸乙酯
層析圖的展開
 實驗步驟-4 ** 展開時，需蓋上展開槽之蓋子，以達飽
和蒸氣壓且勿移動展開槽。

 待展開至離上端solvent front時，則停止

 於UV lamp下觀察，並以鉛筆圈出spot

 計算standard A, B及sample之Rf值

solvent front
Retention Factor, Rf value

化合物移動的距離
Rf＝ 展開液移動的距離

Rf＝0.3~0.4解析度最佳
Retention Factor, Rf value
 Rf值的再現性，注意事項：

1.使用相同吸附劑
2.薄層的厚度要一樣
3.展開溶劑之品質要恆定
4.展開槽的飽和
5.浸入展開溶劑之深度要相等
6.試料的量要儘可能相等
7.溫度影響
8.同一片TLC plate上比較容易有Rf值的再現性
 檢測
http://faculty.ksu.edu.sa/18856/Chromatographic/Thin%20layer%20chromatog
raphy.jpg

1.有色化合物：用肉眼即可觀察 http://www.labsource.com/ProdImg/14/14320.jpg

2.無色化合物： TLC之用途
a.濃硫酸：加熱，使有機成分焦化
 成分檢查(定性)
b.碘蒸氣
 判斷兩化合物是
c.紫外燈：短波(254 nm) 、長波(360 nm) 否極性相同
 定量
 Homework
 若一未知物質(X) 與一已知標準物(Y) ，在TLC片上其
Rf值相同，我們可以說X與Y是同一物質嗎？爲什麼？

 何謂Tailing？如何避免？
點名

 拿完成之兩TLC plates & 計算出其Rf值

 點完名將原水解產物置於原處，下次實驗時再繼續操作

值日生
 5/7- 藥妝第16組、第17組、第18組

生科第19組(第1組)、第20組(第2組) 、第21組(第3組)