‫פרוטוקול מעבדה ‪ - 1‬קינטיקה אנזימטית‬

‫קביעת קצב הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטראט בהעדר מעכב‬

‫הכינו שורת מבחנות המכילות ‪ 900µl‬של תמיסת ‪ (Stock solution 7.5mM) BTC‬בהתאם לריכוזים –‬
‫המופיעים בטבלה מספר ‪ .1‬הטעינו קוואדרופליקאטים של בארות לפי הסדר הבא‪ 50µl :‬מכל ריכוז ‪50µl ,BTC‬‬
‫מים‪ ,‬ו‪ 100µl -‬בופר המכיל ‪ ,DTNB‬לפי טבלה ‪.2‬‬
‫הוסיפו את האנזים (‪ )stock solution concentration: 20 µg/ml‬לבארות מיד לפני הכנסת הפלטה למכשיר‪.‬‬
‫בעזרת המדריך‪ ,‬תקראו ב‪ 12 :OD414-‬מדידות עם ‪ 10‬שניות בין מדידה למדידה (‪ (interval‬בקורא פלטות‪-‬‬
‫‪ .Magellan‬המכשיר מתוכנת מראש למדידות המעבדה‪.‬‬

‫קביעת קצב הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטראט בנוכחות מעכב‬

‫חזרו על הניסוי המתואר לעיל כאשר תערובות הריאקציה מכילות‬

‫‪ 50µl‬של ‪ Galantamine HCl‬בריכוז של ‪ 2.0 µM‬במקום ‪ 50µl‬מים‪.‬‬
‫בעזרת המדריך‪ ,‬תקראו ב‪ 12 :OD414 -‬מדידות עם ‪ 10‬שניות בין מדידה למדידה (‪ (interval‬בקורא פלטות‪-‬‬
‫‪ .Magellan‬המכשיר מתוכנת מראש למדידות המעבדה‪.‬‬

‫טבלה ‪ :1‬מיהול של הסובסטראט [יש למלא את הטבלה במסגרת הדוח המכין למעבדה]‬
‫‪Sample ID‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪8‬‬

‫)‪BTC concentration (μM‬‬ ‫‪250‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪750‬‬ ‫‪1,000‬‬ ‫‪2,500‬‬ ‫‪3,500‬‬ ‫‪5,000‬‬ ‫‪7,500‬‬

‫)‪Volume of 7.5 mM BTC (μl‬‬

‫)‪Volume of Water (μl‬‬

‫טבלה ‪ :2‬תלות מהירות הראקציה של ‪ Butyrylcholine esterase‬בריכוז הסובסטראט‪ ,‬בהעדר מעכב‬

‫‪BTC‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫)‪Vol. (μl‬‬ ‫‪Vol.‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Replicate‬‬ ‫‪Avg.‬‬
‫)‪(μM‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫)‪DTNB(a‬‬ ‫)‪(μl‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪Rate ±‬‬
‫‪BTC‬‬ ‫‪H2O‬‬ ‫)‪(1mM‬‬ ‫‪BChE‬‬ ‫‪std. dev.‬‬
‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪ΔA414/min‬‬ ‫‪Nmol‬‬ ‫‪Nmol‬‬
‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬ ‫‪TNB/min‬‬
‫‪± SD‬‬
‫‪1‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪2‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪3‬‬ ‫‪150‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪4‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪5‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪6‬‬ ‫‪700‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪7‬‬ ‫‪1000‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪8‬‬ ‫‪1500‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪50‬‬

‫‪(a) DTNB in 250 mM K-phosphate buffer pH 8‬‬

 ‫ בנוכחות מעכב‬,‫ בריכוז הסובסטראט‬Butyrylcholine esterase ‫ תלות מהירות הראקציה של‬:3 ‫טבלה‬
BTC Vol. Vol. Vol. (μl) Vol. Replicate Replicate Replicate Replicate Replicate Replicate Replicate Replicate Avg.
(μM) (μl) (μl) DTNB(a) (μl) 1 1 2 2 3 3 4 4 Rate ±
BTC Gal, (1mM) BChE std. dev.
2μM ΔA414/min Nmol ΔA414/min Nmol ΔA414/min Nmol ΔA414/min Nmol Nmol
TNB/min TNB/min TNB/min TNB/min TNB/min
± SD
1 50 50 50 100 50
2 100 50 50 100 50
3 150 50 50 100 50
4 200 50 50 100 50
5 500 50 50 100 50
6 700 50 50 100 50
7 1000 50 50 100 50
8 1500 50 50 100 50

(a) DTNB in 250 mM K-phosphate buffer pH 8

:‫הגדרות‬
.‫ של סובסטרט בדקה‬1 mol ‫ כמות האנזים המפרק‬:‫יחידת אנזים‬
.‫ מספר יחידות האנזים במג' חלבון‬:‫פעילות ספציפית‬
.‫ מספר מולים של הסובסטרט שמפורקים בדקה ע"י מול אחד של אנזים‬:TURNOVER NUMBER
.440 kDa ‫המסה המולקולארית של בוטירילכולין אסטראז היא‬
.13 Units/mg protein ‫הפעילות הספציפית של האנזים המסחרי היא‬