KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA TRONG GEL AGAROSE

Mục tiêu:
Sau khi thực hành xong bài này, sinh viên có khả năng:
1. Thực hiện được kỹ thuật điện di DNA trong gel agarose theo đúng quy trình hướng
dẫn.
2. Nhuộm và đọc được kết quả điện đi DNA.
Nội dung:
1. Mục đích
Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng
và hàm lượng DNA. Nguyên tắc của kỹ thuật dựa vào đặc tính cấu trúc của
axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu
tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
2. Thiết bị, hóa chất
2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), khay điện di, bể điện di, lược
tạo
giếng điện di, giá thăng bằng nhờ giọt nước đổ bản gel.
- Cân điện tử.
- Bình chịu nhiệt để đun agarose.
- Lò vi sóng.
- Ống eppendorp loại 2 ml.
- Micropipet 0.5-10µl.
- Đầu col 0.5-10µl.
- Giấy parafilm dùng cho phòng thí nghiệm.
- Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm bản gel.
- Máy lắc.
- Bể nhuộm gel.
- Máy soi và chụp ảnh gel.
2.2. Hóa chất và cách pha hóa chất.
- Agarose.
- Dung dịch đệm TAE 1X: Dung dịch TAE 1X được pha từ TAE 50X stock
bao gồm:
+ 242 gam Tris base (FW = 121)
+ 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng)
+ 100 ml EDTA (pH = 8)

1
 + Bổ sung nước cất lên thể tích 1 lít.
Khi pha 1X sẽ cần 1 ml dung dịch 50X stock + 9 ml nước cất.
- Thuốc nhuộm chạy điện di (Loading dye).
- Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide (EtBr) hoặc 3x Ultra GelRed.
3. Quy trình điện di
3.1. Đổ gel
- Chuẩn bị gel agrose 1%: Pha 1,0 gam agarose trong 100 ml TAE 1X, đun sôi
bằng lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn.
Lưu ý: Khi đun bằng bình chịu nhiệt có nắp, không được đậy nắp kín hoặc
đun bằng cốc thủy tinh chỉ nên đổ khoảng 2/3 thể tích cốc nhằm tránh tràn
khi sôi. Đun sôi để nguội đến 55-60oC (khi có thể dùng tay cầm được bình đựng
agarose là được) mới tiến hành đổ bản gel.
- Lắp khay điện di vào giá thăng bằng.
- Đặt lược vào khe trên khay điện di. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm
của bể điện di. Tiến hành lấy thăng bằng mặt phẳng ngang của khay điện di bằng giọt
nước trên giá.
- Đổ bản gel: Bản gel agarose có kích thước dài 15 cm, rộng 10 cm và cao 0,4
cm. Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa được 10μl mẫu. Do vậy mỗi bản gel
cần đổ khoảng 60 ml. Gel agarose đã pha, đun tan đều trong lò vi sóng và để nhiệt độ
xuống tới 55-600C, đổ gel từ từ, liên tục vào khay điện di để tránh tạo bọt. Để yên khay
điện di cho tới khi gel động lại (khoảng 30-45 phút).
- Đổ một phần dung dịch đệm TAE 1X phủ bản gel, nhấc lược khỏi bản gel.
- Nhấc khay điện di đặt vào bể điện di sao cho đầu bản gel có giếng điện di ở
phía cực âm.
- Đổ dung dịch đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi ngập bản gel.
3.2 Chạy điện di
- Tra mẫu DNA vào giếng:
+ Dùng micropipet hút 8 μl từng mẫu DNA đã tách chiết trộn với 2μl Loading
dye trên giấy parafilm, dùng micropipet hút và bơm để trộn đều mẫu DNA với
Loading dye. Lưu ý: Mỗi mẫu dùng 1 đầu col riêng để trộn, hút và bơm.
+ Bơm cẩn thận 10μl hỗn hợp mẫu đã trộn vào giếng điện di theo thứ tự đã
định sẵn.
+ Khi tra mẫu vào giếng, tỳ 2 khuỷu tay lên mặt bàn làm điểm tựa, đưa
micropipet sao cho đầu col thẳng đứng vào sâu trong miệng giếng khoảng 2mm rồi
bơm từ từ mẫu vào trong giếng. Cần lưu ý thao tác này nếu không cẩn thận sẽ làm
tràn mẫu ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng.
- Đậy nắp bể điện di đảm bảo đúng chiều của cực âm, cực dương.

2
 - Bật nguồn máy điện di, cắm dây dẫn của nắm bể điện di vào máy điện di, lưu
ý cắm đúng cực âm (dây mà đen) và cực dương (dây màu đỏ).
- Cài đặt thời gian và hiệu điện thế cho phù hợp.
- Nhấn phím Run để chạy điện di. Kiểm tra: điện trường được thiết lập nếu
thấy bọt khí xuất hiện trong dung dịch đệm từ dây dẫn của 2 cực âm và dương trong
bể điện di.
3.3. Kết thúc quá trình điện di
- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của Loading
dye trên bản gel để dừng quá trình điện di.
- Tắt công tắc nguồn máy điện di. Tháo dây dẫn khỏi máy điện đi. Tháo nắp bể
điện di.
- Lấy cẩn thận bản gel ngâm vào bể nhuộm đã có sẵn Ethidium bromide (EtBr).
Nhuộm bản gel trong khoảng 10-15 phút, trong quá trình nhuộm, thỉnh thoảng lắc nhẹ
bể nhuộm. Rửa bản gel bằng nước sạch trước khi đưa bản gel lên máy soi và chụp ảnh
gel.
- Soi bản gel bằng máy soi và chụp ảnh gel. Nếu có DNA, sẽ xuất vạch huỳnh
quang màu đỏ cam trên hình ảnh của bản gel.
- Chụp ảnh bản gel và lưu kết quả.