Trong HPLC, việc phản ứng dẫn xuất thường được yêu cầu để giải quyết vấn đề phát

hiện
hoặc trong một số trường hợp khó khăn về phân tách. Đầu dò UV và fluorimetric rất phổ
biến trong phân tích HPLC hoặc TLC. Tuy nhiên, các chất phân tích cần chứa một nhóm
chromophore hoặc fluorophore để có thể được phát hiện. Do đó, hầu hết các phản ứng
dẫn xuất bao gồm việc tổng hợp các dẫn xuất có màu sắc, hấp thụ UV hoặc phát quang để
tăng cường khả năng phát hiện của chất phân tích. Việc dẫn xuất trước hoặc sau cột có
thể được thực hiện trước hoặc sau quá trình phân tách. Trong trường hợp đầu tiên, các
chất phân tách được dẫn xuất trước khi tiêm vào cột và lượng dư của chất dẫn xuất và các
sản phẩm phụ có thể dễ dàng loại bỏ. Đối với việc dẫn xuất sau cột, chất dẫn xuất được
thêm vào pha di động sau cột. Phản ứng được thực hiện trong một bình phản ứng được
đặt giữa cột và máy dò. Thiết kế của bình phản ứng phụ thuộc vào thời gian phản ứng nên
phải ngắn để tránh làm mờ đỉnh. Trong trường hợp sau, lượng dư của chất dẫn xuất và
các sản phẩm phụ tiềm năng không thể được loại bỏ khỏi hỗn hợp và vì vậy không nên
gây trở ngại cho việc phát hiện chất phân tích.
Tạo dẫn xuất là quá trình biến đổi hóa học một hợp chất để tạo ra hợp chất mới có các
đặc tính phù hợp để phân tích bằng GC và HPLC
Cấu trúc hóa học của hợp chất được giữ nguyên và chỉ biến đổi nhóm chức đặc trưng
của hợp chất phản ứng thành dẫn xuất có sai lệch tính chất lý hóa nhằm làm cho chúng
có thể được phát hiện và phân tích
Việc tạo dẫn xuất là cần thiết trong GC, HPLC, Quang phổ nhìn thấy tia cực tím, v.v
Ba trong số những nhóm chức năng quan trọng nhất trong quá trình dẫn xuất cho HPLC
là chromophores, fluorophores và tâm hoạt động khử và oxy hóa
Một số loại dẫn xuất
Phản ứng alkyl
Sự hình thành các dẫn xuất alkyl hóa được áp dụng để thay thế hydro hoạt
động từ chất phân tích bằng nhóm alkyl (R). Việc thay thế có thể được thực hiện
trong các chức năng như OH, COOH, SH, NH hoặc CONH. Ví dụ, tạo dẫn xuất
với alkyl bromua hoặc iodua chuỗi ngắn có nhiều ứng dụng phân tích cho các
hợp chất như steroid, axit amin, catecholamine, sulfonamid, phenol, barbiturat,
axit hữu cơ và mono- và oligosacarit [5].

RCOOH + PhCH2X → RCOOCH2Ph + HX

Trong đó: X = nhóm halogen
R= alkyl substitution
 Các thuốc thử và điều kiện khác nhau đã được sử dụng trong quá trình tạo dẫn
xuất cho mục đích phân tích. Là thuốc thử RX cho quá trình alkyl hóa, một trong
những chất được sử dụng phổ biến nhất là các alkyl halogenua, đặc biệt là alkyl
iodua và alkyl bromua. Do một số quá trình tạo dẫn xuất có thể chậm và không
hiệu quả tùy thuộc vào chất phân tích và thuốc thử, nên tốc độ phản ứng trở
thành một thông số quan trọng đối với khả năng ứng dụng phân tích. Các hợp
chất với hydro có tính axit cũng có thể được alkyl hóa: bằng cách sử dụng
trimethyl orthoacetate, alkyl-p-tolyltriazenes (R─NH─N═N─ C 6H4 ─CH3 ), và
các đồng phân O-alkyl để hình thành của các chất phân tích có chứa hydro axit,
imino este,…[8].
Ưu điểm: Nhiều loại thuốc thử có sẵn, điều kiện phản ứng có thể thay đổi từ
axit mạnh đến bazo mạnh, một số phản ứng có thể được thực hiện trong các hệ
thống nước.
Nhược điểm: Giới hạn đối với amin và hydroxyl có tính axit, điều kiện thí
nghiệm phức tạp, thuốc thử thường độc hại, tối ưu hóa cho các hợp chất cụ thể
thường cần thiết.
Phản ứng silyl hóa
Silyl hóa là phản ứng hóa học thay thế một nguyên tử hydro phản ứng trong
OH, COOH, SH, NH, CONH, POH, SOH, hoặc carbonyl có thể enolisable bằng
một nhóm silyl, thường gặp nhất là với trimethylsilyl (TMS). Một số lượng lớn
các phương pháp phân tích liên quan đến quá trình silyl hóa áp dụng cho rượu
bao gồm carbohydrate, phenol, amin, stero, v.v. Mục đích của quá trình silyl hóa
trong sắc ký chủ yếu là để giảm tính phân cực của chất phân tích, tăng tính ổn
định và cải thiện hoạt động của LC. Sự khác biệt về khối phổ của các hợp chất
silyl hóa so với chất phân tích ban đầu cũng có thể là một lợi thế cho khả năng
phát hiện. Tuy nhiên, khối phổ của nhiều hợp chất silyl hóa có thể không có sẵn
trong các thư viện khối phổ thông thường. Ngoài ra, các hợp chất silyl hóa cộng
với lượng dư thừa thường gặp của thuốc thử silyl hóa có thể làm giảm chất lượng
của một số loại pha tĩnh như pha tĩnh của cột loại Carbowax (polyethylene
glycol), do đó việc tách chúng không thể thực hiện được trên các cột như vậy .
 Silyl hóa có thể được thực hiện trên các chất phân tích cụ thể hoặc trực tiếp
trên các mẫu phức tạp như nguyên liệu thực vật. Tác nhân silyl hóa và dung môi
có thể đóng vai trò kép của chất chiết xuất và chất phản ứng silyl hóa .
Ưu điểm: ứng dụng rộng rãi, nhiều loại thuốc thử có sẵn, dễ dàng ổn định
nhiệt.
Nhược điểm: nhạy cảm với độ ẩm, phải sử dụng dung môi thích hợp.
Phản ứng acyl hóa
Một nhóm acyl được đưa vào một hợp chết hữu cơ. Trong trường hợp axit
cacboxylic, phản ứng bao gồm việc đưa nhóm acyl và mất nhóm hydroxyl
R’OCOCOR’ + HOR → R’OCOR + HOCOR’
Trong đó: R : nhóm alkyl
R’ : nhóm alkyl thay thế khác
Sự tạo thành dẫn xuất acyl được áp dụng để thay thế hydro hoạt động từ chất
phân tích ở các chức năng như -OH, -SH, -NH, -CONH,... có thể được chuyển
đổi thành este, thioeste và amit tương ứng thông qua quá trình acyl hóa .
Quá trình acyl hóa cũng được sử dụng để giảm độ phân cực và cải thiện hoạt
động của chất phân tích trong cột sắc ký. Nó có thể tạo ra độ bay hơi tốt hơn của
chất phân tích, mặc dù không được công nhận như đối với quá trình silyl hóa
hoặc metyl hóa. Chỉ tạo dẫn xuất với các nhóm acetyl hoặc với các nhóm acyl
flo hóa (không nặng hơn heptafluorobutyryl) mới cải thiện tính bay hơi, trong
khi các nhóm acyl nặng hơn khác không phù hợp cho mục đích này. Mặt khác,
việc cải thiện khả năng phát hiện là một mục đích rất phổ biến cho quá trình acyl
hóa. Các thuốc thử acyl hóa phổ biến là acyl halogenua như clorua hoặc bromua,
là những hợp chất phản ứng thích hợp cho quá trình acyl hóa. Phản ứng của acyl
clorua với một amin diễn ra như sau:

Vì khả năng phản ứng của amit thấp hơn so với amin nên hydro thứ hai trong
amin khó thay thế hơn. Ngoài ra, trở ngại không gian có thể ảnh hưởng tiêu cực
đến phản ứng. Việc tạo ra một axit mạnh như HCl là một bất lợi trong phản ứng
với acyl halogenua và thông thường axit phải được loại bỏ bằng cách thêm các
hợp chất cơ bản như Na2CO3 hoặc MgCO3 hoặc sử dụng pyridin làm môi
trường phản ứng. Khả năng phản ứng cao của acyl halogenua được sử dụng để
acyl hóa các hợp chất với hydro ít phản ứng hơn. Một số carbonyl xyanua phản
ứng tương tự với acyl clorua
Ưu điểm: ổn định thủy phân, dễ bay hơi đối với các chất như cacbohydrat
hoặc axit amin, hỗ trợ phân tách sắc ký mà có thể không thực hiện được với các
chất không phù hợp với chất phân tích GC, phản ứng với rượu, thiol và amin có
thể được sử dụng để kích hoạt -COOH cho quá trình este hóa
Nhược điểm: dụng cụ thí ngiệm phức tạp, các sản phẩm phản ứng thường phải
được loại bỏ trước khi phân tích, phản ứng phải được thược hiện trong hệ thống
không có nước, thuốc thử nhạy cảm với độ ẩm, thuốc thử nguy hiểm và có mùi.
1.7.4 Dẫn xuất Chiral
Các hợp chất có cấu trúc phản chiếu với nhau nhưng không thể chồng lên
nhau được gọi là Chirality. Chirality thường được gây ra bởi sự tồn tại trong
phân tử của ít nhất một nguyên tử Carbon tứ diện và được thay thế bằng các
nhóm khác nhau. Tuy nhiên, chiral có thể được tạo ra bằng nguyên tử chiral phốt
pho hoặc lưu huỳnh. Không chỉ các chiral trung tâm (chẳng hạn như carbon bất
đối xứng) tạo ra các chất đối kháng, mà một trục chiral hoặc một mặt phẳng
chiral có thể dẫn đến các chất đồng phân đối ảnh .
Độ chirality trong một đồng phân đối quang được chỉ định bằng cách sử dụng
các ký hiệu R và S dựa trên các quy tắc cụ thể. Để gán ký hiệu R hoặc S cho
Carbon bất đối, các nhóm thế được sắp xếp theo trình tự a > b > c > d. Đối với
bốn nguyên tử được gắn trực tiếp vào carbon bất đối xứng, số nguyên tử cao hơn
sẽ xếp thấp hơn .
Có một hoặc nhiều Carbon bất đối xứng có thể có mặt trong một phân tử. Như
trong trường hợp của Carbohydrate, các đồng phân lập thể được tạo ra bởi nhiều
hơn một Carbon bất đối xứng có thể là hình ảnh phản chiếu đồng phân đối ảnh
hoặc có
thể có các cách sắp xếp không gian khác nhau là đồng phân đối quang. Các loại
phân tử này được thể hiện dưới dạng sơ đồ dưới đây:

Hợp chất (S,S)- và (R,R)- là đồng phân đối ảnh, trong khi hợp chất (S,R)- là
đồng phân đối quang của cả (S,S)- và (R,R)-.
Việc tách các chất đối quang bằng sắc ký khí có thể được thực hiện bằng cách
sử dụng các cột sắc ký có pha tĩnh bất đối xứng.Việc tạo dẫn xuất của các chất
đồng phân đối ảnh với thuốc thử không đối kháng tạo ra các phân tử là chất đồng
phân đối ảnh. Dẫn xuất Chiral có thể cải thiện quá trình tách sắc ký khỏi các
phân tử khác, nhưng các hợp chất tạo dẫn xuất của các đồng phân đối ảnh còn lại
không thể tách được ngoại trừ trên các pha tĩnh bất đối. Đôi khi, có thể thu được
sự phân tách tốt hơn ngay cả giữa các đồng phân đối ảnh (trên cột sắc ký bất đối)
sau khi tạo dẫn xuất.
Các đồng phân không đối quang có thể được phân tách trên các cột sắc ký với
các pha tĩnh không đối xứng. Vì vậy, một quy trình thay thế đối với việc tách các
chất đồng phân đối quang là sử dụng quá trình tạo dẫn xuất chiral. Kiểu tạo dẫn
xuất này tạo ra các đồng phân không đối quang có thể được tách ra trên các pha
tĩnh không đối kháng .
Sự phân tách sau khi tạo dẫn xuất bằng thuốc thử đồng phân đối quang tinh khiết dựa trên
sự hình thành các đồng phân không đối quang và có thể được phân tách trên các pha tĩnh
thông thường.
Một số loại dẫn xuất đặc biệt của HPLC
+Đối với đầu dò UV
Có nhiều loại thuốc thử cho phép đưa vào nhóm hấp thụ tia UV cao. Các thuốc thử này
thường là các hợp chất thơm liên hợp cao cũng chứa một nhóm phản ứng cao với nhóm
chức của chất phân tích. Nhóm sắc đoàn phải có hệ số hấp thụ mol cao. Đối với việc phát
hiện ở mức độ vết (phạm vi nanogam thấp), hệ số hấp thụ mol thường bằng hoặc lớn hơn
10.000 l / mol / cm. Hơn nữa, trong trường hợp oligome, các nhóm mang màu có thể
cung cấp các hệ số hấp thụ mol tương tự cho các dẫn xuất oligome. Do đó, thu được các
yếu tố đáp ứng mol không đổi, cho phép xác định tỷ lệ mol của tất cả các oligomer mà
không cần tất cả các hợp chất làm tiêu chuẩn. Bước sóng hấp thụ cực đại được chọn để
tối đa hóa độ nhạy và hạn chế nhiễu nền.
Một số loại thuốc thử được sử dụng

+Đối với đầu dò huỳnh quang

Phát quang xảy ra khi một phân tử hấp thụ một photon, thường là trong vùng UV, làm
thay đổi trạng thái của phân tử thành trạng thái kích thích; việc trở lại trạng thái cơ bản
được thực hiện bằng cách phát ra một photon khác ở bước sóng cao hơn trong khoảng thị
trường. Lợi ích chính của việc phát hiện phát quang là độ nhạy đáng kể cao hơn so với
các phương pháp dựa trên phát hiện UV. Phát hiện phát quang đặc biệt hữu ích cho phân
tích dấu vết. Ngoài ra, các phân tử phát quang không phổ biến nên có thể được xác định
lựa chọn trong một hỗn hợp phức tạp nhờ tính chất phát quang đặc trưng của nó
+Đối với đầu dò MS
+Dẫn Xuất Trước Cột
Dẫn xuất trước cột có nghĩa là chất thử và chất dẫn xuất được gửi đến bình phản ứng
thông qua hai hoặc nhiều bơm tiêm riêng lẻ để được pha trộn và thực hiện phản ứng ngay
lập tức, sau đó vào cột sắc ký để phân tách.Cũng có khả năng phản ứng chất DUT với
chất dẫn xuất trước, sau đó feeds các dẫn xuất như mẫu để phân tích sắc ký, trong trường
hợp này phương pháp là dẫn xuất trước cột ngoại tuyến; một số tài liệu đề cập đến việc
chất dẫn xuất có thể được thêm vào pha di động, và sau khi mẫu được cấp, DUT được
phép trải qua dẫn xuất trực tiếp với pha di động (tức là, dẫn xuất trực tuyến).

➤ Không có hạn chế về điều kiện phản ứng

➤ Số lượng chất dẫn xuất có thể được tối thiểu hóa

➤ Cung cấp độ nhạy của chất phân tích tổng thể tốt hơn do nền thấp hơn

➤ Yêu cầu sản phẩm phản ứng ổn định theo thời gian
+Dẫn Xuất Sau Cột
Dẫn xuất sau cột đề cập đến việc tách riêng chất thử, sau đó pha trộn dung dịch từ cột với
chất dẫn xuất trên tuyến để tạo ra một dẫn xuất có thể phát hiện, sau đó đưa vào bộ phát
hiện. Tùy theo loại dẫn xuất tạo ra, nó có thể được phân loại thành dẫn xuất UV-visible,
dẫn xuất phát quang, dẫn xuất Raman, và dẫn xuất điện hóa và phản ứng quang hóa.

➤ Chất dẫn xuất được thêm vào dung dịch tựa ra đang chảy

➤ Sản phẩm không ổn định có thể được phân tích ngay lập tức

➤ Phản ứng phải nhanh chóng và tương thích với chất pha

➤ Dòng không ngừng của dòng chất dẫn xuất yêu cầu lượng lớn chất dẫn xuất.