UYGULAMA 6

İZOELEKTRİK
NOKTANIN TAYİNİ

Dr.Öğr.Üyesi Evin KOCATÜRK

1 İzoelektrik Noktanın Tayini

2 Uygulamalar

Uygulamalar
3
45 Araç ve gereçler
Cam/plastik malzemeler

6 Preanalitik cihazlar

7 Uygulamalar

89
 İZOELEKTRİK NOKTANIN TAYİNİ

Uygulamanın amacı, izoelektrik nokta (pI) kavramının öğrenilmesi ve konunun serum

proteinlerinin izoelektrik noktalarını belirleyerek konunun pekiştirilmesidir.

Amino asitlerin amin grupları H+ iyonu alabilir, karboksil grupları ise H+ iyonu verebilir.
Genel olarak amino asitler formülde yüksüz olarak gösterilirler, ancak yukarıda bahsedilen H+
iyonu alışverişi tek bir molekül üzerinde gerçekleşirse o molekül artı veya eksi yük taşıyabilir.
Aslında bütün amino asitler çözeltilerde negatif yüklü anyon, pozitif yüklü katyon veya bu
şekillerin karışımı şeklinde bulunurlar. Amino asitlerin hangi yük durumunun baskın
olacağını ortamın pH’sı belirler. Bir amino asidin taşıdığı (+) ve (-) yüklerin eşit olduğu
haline dipolar iyon, bu pH değerine de izoelektrik nokta denir. İzoelektrik nokta, pI ile
gösterilir ve bu nokta her amino asit için spesifiktir.

Amino asitler, kendisi için karakteristik olan izoelektrik nokta değerine eşit pH ortamında net
elektrik yükü taşımadığından, elektriksel alanda hareketsiz kalır. Ayrıca bu noktada
çözünürlükleri de düşüktür.

Amino asitler izoelektrik pH’nın üzerindeki pH değerlerinde ortama H+ iyonu vererek (-)
yüklenerek elektriksel alanda anoda göç ederler ve anyon olarak adlandırılırlar. Tersine
izoelektrik pH’nın altındaki pH değerlerinde ise ortamdan H+ iyonu alarak (+) yüklenirler,
elektriksel alanda katoda göç ederler ve katyon olarak adlandırılırlar. Amino asitlerin ve
proteinlerin bu özelliklerine amfoterik özellik denir. Yani amino asitler, hem proton donörü
(asit) hem proton akseptörü (baz) olarak davranabilirler. Asit ortamda (+) yüklü olan amino
asit, pH yükseldiğinde önce zwitterion halini (artı ve eksi yüklerin eşit olduğu durum) alır. pI
değeri geçildikten sonra ise amino asit (-) yüklü olur.

90
Bir çözeltide H+ veya OH- iyonlarını bağlayarak ortam pH’sını belirli düzeylerde tutmaya
çalışan, pH değişikliklerine karşı koyan bileşiklere tampon denir. Proteinler de yukarıda
bahsedilen özellikleri nedeniyle organizmada bulunan önemli tampon sistemlerden biridir.

Bir amino asidin ortama H+ iyonu verebilme yeteneği pK değeri ile ifade edilir. pK, amino
asidin iyonize olabilen bir grubunun yarı yarıya ayrıştığı pH değeridir. İyonize olabilen bir
yan zincir içermeyen bir amino asit, titre edildiğinde iki adet pK değeri gözlenir. Bunlardan
birincisi (pKa1) -karboksil grubuna, ikinci değer (pKa2) -amino grubuna aittir ve bu amino
asidin izoelektrik noktası, bu iki pKa değerlerinin ortalaması alınarak hesaplanır.

pI = (pKa1 + pKa2)/2

İyonize olabilen bir yan zinciri olan amino asitler için bir de pKR değeri vardır.
Histidine ait R grubun pK’sı 6’dır. Protein yapısına katılıp peptid bağı yapmış histidinde pK R
değeri biraz daha yüksektir, dolayısıyla nötral pH’ya daha da yaklaşır. Bu nedenle histidin
fizyolojik pH’da önemli bir tamponlama gücüne sahiptir. Histidinin pI değeri de 7.6’dır.

91
 UYGULAMA-6

Amaç: Serum proteinlerinin izoelektrik noktalarının belirlenmesi

Materyal:
- 0.1 M Sodyum asetat çözeltisi
- 0.1 M asetik asit çözeltisi
- 0.01 M asetik asit çözeltisi
- % 5’lik serum
- Etanol
Deneyin yapılışı:

1. Tablodaki gibi deney tüpleri hazırlanır ve iyice karıştırılır.

Çözeltiler 1 2 3 4 5 6 7 8
0.1 M sodyum asetat 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.1 M asetik asit 4.0 2.0 1.0 - - - - -
0.01 M asetik asit - - - 5.0 2.5 1.25 0.6 0.3
Distile su 2.0 4.0 5.0 1.0 3.5 4.75 5.4 5.7
pH 4.1 4.4 4.7 5.1 5.4 5.7 6.0 6.3

2. Her bir tüpe 1 ml %5’lik serum ilave edilir, iyice karıştırılır ve bulanıklık kaydedilir.
3. Her tüpe 5 ml etanol ilave edilir ve karıştırılır.
4. Tüplerin 15., 30. ve 45. dakikadaki bulanıklık durumları gözlenerek kaydedilir.

5. Bulanıklığın en fazla olduğu tüp

belirlenir.

Sonuç: Deney sonucunda en fazla bulanıklığa sahip olan tüpün pH’sı serum proteinlerinin
izoelektrik noktasına eşittir.

Yorum: Bu deneyde serum proteinlerinin izoelektrik noktalarının belirlenmesi amaçlanmış ve

serum proteinlerinin değişik pH’larda nasıl hareket ettikleri gözlemlenmiştir. İzoelektrik
noktada proteinlerin çözünürlüğü çok düşük olduğundan, en fazla bulanıklığa sahip olan
tüpün pH’sı serum proteinlerinin izoelektrik noktası olarak kaydedilmiştir.

92