Izveštaj vežbe:

Određivanje izoelektrične tačke aminokiselina

Studenti: Marijana Radulović, 2019/0042 i Natalija Panić 2019/0052

1
Teorijski uvod
Aminokiseline su amfoterni molekuli koji sadrže dve funkcionalne grupe, karboksilnu i amino,
vezane za hiralni Catom. U neutralnoj sredini, oko pH = 7, karboksilna grupa je disosovana
(COO-), a amino grupa je protonovana (NH3+). Zbog toga, molekul aminokiseline sa
nejonizabilnom bočnom grupom ima pozitivan i negativan pol i naziva se cviter (zwitter) jon.

Sve aminokiseline osim glicina, pored ove dve funkcionalne grupe sadrže i bočne grupe (R) i
prema njihovim karakteristikama se dele u sledeće grupe: nepolarne, polarne i naelektrisane.

pH vrednost na kojoj aminokiselina postoji u obliku cviter jona zove se izoelektrična tačka (pI):

p Ka1+ p Ka2
pI =
2

Za aminokiseline sa nejonizabilnom bočnom grupom, K a1 i Ka2 su konstante disocijacije COOH

i -NH3+ grupe, redom. Sedam od 20 osnovnih aminokiselina ima jonizabilnu bočnu grupu
(Tabela 1: Arg, Asp, Cys, Glu, His, Lys, Tyr). Konstante disocijacije i izoelektrična tačka se
eksperimentalno određuju titracijom.

❖ Disocijacija aminokiseline cistein

Disocijacija cisteina je predstavljena na Slici 1. Cviter jon je označen sa Cys 0. pKa vrednosti za
disocijaciju karboksilne, amino i bočne grupe date su u tabeli 1.

Cys0

Slika br. 1: Disocijacija cisteina

Ka1 odgovara disocijaciji karboksilne grupe, Ka2 disocijaciji bočne -SH grupe, a Ka3 se osnosi na
amino grupu.

2
 Tabela br.1: pKa vrednosti -COOH, -NH3+ i bočnih grupa (R) osnovnih aminokiselina.

Budući da je koncentracija cviter jona određena vrednostima konstanti Ka 1 i Ka2, za računanje

teorijske vrednosti izoelektrične tačke koristimo ove konstante.

p K a 1 + p K a 2 1 , 7+8 , 3
pI = = =5
2 2

Materijali i metode

Reagensi:
0,2 M HCl; 0,2 M NaOH; rastvor cisteina

Pribor:
pH-metar
automatske pipete od 500 µL
Čaše od 50 mL

❖ Postupak

Pripremljeni su rastvori aminokiselina i standardizovan je pH-metar. U dve čaše od 50 mL,

odmereno je po 30 mL rastvora cisteina. Nakon određivanja pH rastvora aminokiseline, titrovan
je jedan rastvor aminokiseline sa 0,2 M HCl do pH≈ 2. Posle ispiranja pH elektrode u
destilovanoj vodi, titrovano je drugih 30 ml aminokiseline sa 0,2 M NaOH do pH≈ 12. Tabelarno
je prikazana zavisnost pH rastvora od dodate zapremine HCl i NaOH, a zatim i grafički prikazana

3
zavisnost pH rastvora od dodate zapremine HCl, odnosno NaOH: pH = f(Vbaze/kiseline). Sa grafika su
procenjene pKa vrednosti i upoređene su sa tabličnim vrednostima.

Rezultati i diskusija

Tabela br.2: Zavisnost pH vrednosti od zapremine dodate HCL

V(HCl) pH V(HCl) pH V(HCl) pH V(HCl) pH

[ml] [ml] [ml] [ml]
0 5,75 0,8 2,89 2,1 2,34 4,4 1,93
0,05 4,36 0,85 2,86 2,2 2,32 4,6 1,91
0,1 4,02 0,9 2,83 2,3 2,29 4,8 1,88
0,15 3,8 0,95 2,8 2,4 2,27 5 1,86
0,2 3,66 1 2,77 2,5 2,25 5,2 1,84
0,25 3,53 1,05 2,73 2,6 2,22 5,4 1,81
0,3 3,45 1,1 2,71 2,7 2,2 5,6 1,79
0,35 3,37 1,2 2,64 2,8 2,18 5,8 1,77
0,4 3,3 1,3 2,6 2,9 2,16 6 1,75
0,45 3,23 1,4 2,54 3 2,16 6,2 1,73
0,5 3,18 1,5 2,52 3,2 2,11 6,4 1,71
0,55 3,11 1,6 2,49 3,4 2,07 6,6 1,69
0,6 3,07 1,7 2,46 3,6 2,04 6,8 1,69
0,65 3,02 1,8 2,42 3,8 2,01 7 1,66
0,7 2,98 1,9 2,39 4 1,99 7,2 1,64
0,75 2,94 2 2,37 4,2 1,96 7,4 1,64

V(NaOH) pH V(NaOH) pH V(NaOH) pH V(NaOH) pH

4
 [ml] [ml] [ml] [ml]
0,05 5,83 1,25 7,47 4,05 8,27 11,05 9,56
0,1 6,16 1,35 7,51 4,25 8,31 11,45 9,64
0,15 6,34 1,45 7,56 4,45 8,35 11,85 9,76
0,2 6,49 1,55 7,58 4,65 8,39 12,25 9,88
0,25 6,6 1,65 7,64 5,05 8,46 12,65 10
0,3 6,69 1,75 7,68 5,45 8,51 13,05 10,1
0,35 6,71 1,85 7,72 5,85 8,57 13,45 10,23
0,4 6,79 1,95 7,74 6,25 8,62 13,85 10,31
0,45 6,87 2,05 7,78 6,65 8,73 14,25 10,44
0,5 6,93 2,15 7,8 7,05 8,78 14,65 10,53
0,55 6,99 2,25 7,82 7,45 8,87 15,05 10,64
0,6 7,03 2,45 7,88 7,85 8,93 15,45 10,73
0,65 7,08 2,65 7,95 8,25 9,01 15,85 10,83
0,7 7,12 2,85 7,99 8,65 9,08 16,25 10,89
0,75 7,16 3,05 8,04 9,05 9,14 16,65 10,98
0,85 7,24 3,25 8,1 9,45 9,2 17,05 11,05
0,95 7,31 3,45 8,14 9,85 9,28 17,45 11,12
1,05 7,37 3,65 8,18 10,25 9,37 17,95 11,16
1,15 7,43 3,85 8,23 10,65 9,47 18,45 11,26
Tabela br.3: Zavisnost pH vrednosti od zapremine dodate NaOH

Slika br. 1: Grafički prikaz zavisnosti pH vrednosti od zapremine dodate kiseline odnosno baze

5
Posmatrajući titracionu krivu možemo proceniti pKa vrednosti odgovarajućih grupa, tako sa krive
dobijamo:

pKa1=2,06

pKa2=8,24

pKa3=9,86

Procenjena vrednost izoelektrične tačke:

p K a 1 + p K a 2 2 , 06+ 8 ,24
pI = = =5 ,15
2 2

Vrednosti dobijene eksperimentalno pokazuju dobro slaganje sa tabličnim vrednostima, mada

vrednost pKa amino grupe pokazje malo veće odstupanje od ostalih. Pri računaju izoelektrične
tačke ova vrednost ne figuriše tako da se eksperimentalno dobijena vrednost veoma dobro slaže
sa tabličnom.

Literatura:

1. Praktikum iz biofizičke hemije( A. Popović-Bijelić, M. Mojović, Beograd: Univerzitet u

Beogradu, Fakultet za fizičku hemiju, 2017)

2. Dinamička biohemija(Lj. Topisirović, Đ. Fira, J. Lozo, Beograd, 2010),.