‫به نام خدا‬

‫شماره گروه‪...‬‬ ‫استاد ‪ :‬دكتر آيت اللهي‬ ‫جزوه ي جلسه اول درس اصول و مباني آزمايشات مولكولي‬

‫سيدمحرمي‬

‫ارزيابي آزمايشات مولكولي‬

‫‪Real me PCR‬‬
‫در شروع كار بايد گفت كه موردي كه در ارتباط با ‪ Real me PCR‬مطرح هست كه بتوانيم هم زمان تعداد نسخه هاي يك ژن را‬
‫بررسي كنيم‪.‬‬

‫اما در ارتباط با ‪ Real me PCR‬ما از يك سري مواد ‪ Fluorogenic‬يا به اصﻼح ساده تر فلوئوروژنيك هست استفاده مي شود‪ .‬اما‬
‫در شروع فرايند يادگيري اين ماده ابتدا بايد پايه ان را بشناسيم و بعد به سراغ كارايي ان خواهيم رفت‪.‬‬

‫نحوه استفاده از مواد ‪Fluorogenic‬‬

‫ما يك اصﻼحي داريم در اين زمينه تحت عنوان ‪ Intercala ng Dyes‬يا همان رنگ هاي تداخلي يا به اصﻼح رنگ هايي كه تداخل‬
‫ايجاد مي كنند‪.‬‬

‫اما در اولين بار از ماده ‪ Ethidium Bromide‬يا اتيديوم برومايد استفاده كردند مشاهده كردند كه اگر ما ‪ dsDNA‬داشته باشيم ‪،‬‬
‫اگر ‪ Double strand DNA‬داشته باشيم اتيديوم برومايد‪ 25‬برابر درخشان تر مي شود‪ .‬و همين شدكه دانشمندان به اين فكر بيفتند‬
‫كه اتيديوم برومايد ماده خوبي جهت تشخيص ‪ Double strand DNA‬مي باشد‪.‬‬

‫اما در ادامه مشاهده شد كه ماده اي به نام ‪ SYBR Green‬كه خيلي حساس تر مي باشد و مادامي كه به ‪Double Strand DNA‬‬
‫متصل مي شود ‪ 200‬برابر درخشان تر مي شود و بنابراين مبناي ‪ Real me PCR‬بر اساس ‪ SYBR Green‬طراحي شد‪.‬‬

‫اما يك شكل شماتيك كه نشان مي دهد ما يك ‪ Double Strand DNA‬داريم و مي خواهيم روي ان ‪ PCR‬انجام بدهيم و ‪Primer‬‬
‫وارد واكنش ‪ PCR‬مي شود دناتوره شده اتفاق مي افتد و در نهايت دو رشته از هم جدا خواهد شد و اين ‪ Intercala ng Dyes‬ها يا‬
‫همان رنگ هاي تداخلي در داخل محلول ما وجود دارند و زماني كه دناتوره شدن اتفاق افتاد اما به خاط اينكه اين دو رشته از هم جدا‬
‫هستند رنگي توليد نخواهد شد و ‪ Intercala ng‬به رشته هاي جدا شده نخواهد چسبيد در مرحله بعد ‪ Primer‬ها متصل مي شوند‬
‫و فرايند جفت شدن و ‪ Annealing‬اتفاق مي افته و در نهايت ‪ Taq‬پليمراز خواهد چسبيد و ‪ Extension‬رخ خواهد داد همين كه دو‬
‫رشته اي شدن اتفاق افتاد ‪ Intercala ng Dyes‬يا به اختصار ‪ ID‬ها به ان متصل خواهند شد و مرتب اين روند تكرار خواهد شد‪ .‬و‬
‫به مرور زمان تعداد اين دو رشته اي هاي ما زياد تر خواهد شد ‪ID‬هاي ما يا همان ‪ Intercala ng Dyes‬ها بيشتر مي چسبند‪ .‬در‬
‫نتيجه نوراني تر خواهند شد بر اساس رنگ ساتع شده مقدار ‪ DNA‬بررسي مي شود‪.‬‬

‫‪1‬‬
‫سيدمحرمي‬ ‫معرفي ‪SYBR Green‬‬

‫اين ماده ‪ SYBR Green‬از كمپاني هاي مختلفي گرفته شده است حاﻻ بسته به غلظت هاي مختلف و اينكه چطور بخواهيم از اين ماده‬
‫در واكنش ها استفاده كنيم اما غلظت رايج ) ‪ (10.000X‬مي باشد ‪ ،‬و بايد به غلظت ) ‪ (./1X‬ان را برسانيم يا يك قسمت از ‪ 10‬قسمت‬
‫را برداريم و رقيق سازي شود كه بر اساس نوع كمپاني ها اين نحوه و دستور العمل متفاوت خواهد بود‪.‬‬

‫خيلي وقت ها ممكن است ‪ 2X‬استفاده شود و اين ‪ 2X‬در واقع دو برابر هست و بايد حتما رقيق سازي شود‪ .‬و ‪ SYBR Green‬رو معموﻻ‬
‫در ‪ ) -20‬منفي ‪ 20‬درجه( نگهداري مي كنند و موقع استفاده از ان رقيق سازي ابتدا انجام مي شود و سپس اين ماده ‪ SYBR‬را وارد‬
‫واكنش ‪ Real me‬خواهيم كرد‪.‬‬

‫شناسايي انزيم هاي ‪Hot-start‬‬

‫اين انزيم ها در حالت عادي غير فعال هستند‪ .‬مشكلي كه در ‪ Real me PCR‬وجود دارد اين هست كه مادامي كه ما انزيم را اضافه‬
‫مي كنيم اين انزيم ممكن است به صورت غير اختصاصي ‪ Taq‬پلي مراز ما را فعال كند و اين ‪ Taq‬پلي مراز در دما هاي مختلف به صورت‬
‫غير اختصاصي متصل مي شود بنابراين به اين راه حل رسيدند كه اين پلي مراز در ‪ 95‬درجه زماني كه دناتوراسيون كامل اتفاق افتاد‬
‫حاﻻ بياد ‪ Taq‬پلي مراز ما فعال شود در نتيجه ‪ Hot-Start‬از اينجا شروع شد كه بايد حتما به دماي ‪ 95‬درجه برسه و بعد انزيم ‪Hot-‬‬
‫‪ Start‬ما شروع به فعاليت كند اين فرايند از دو طريق انجام مي شود ‪ :1‬استفاده از ‪ Chemical modifica on‬كه در واقع يك تغيير‬
‫در ‪ 95‬دجه در ساختار به وجود بياد كه فعال شود‪ An body binding :2 .‬كه در واقع بيايم انتي بادي هايي به ان متصل كنيم كه‬
‫اين انتي بادي در دماي زير ‪ 95‬درجه اجازه فعاليت نمي دهد اما مادامي كه به ‪ 95‬درجه رسيد انتي بادي از ان جدا شده حاﻻ مي تواند‬
‫شروع به فعاليت كند‪.‬‬

‫اما اگر فعال شدن انتي بادي يا ‪ An body ac va on‬اتفاق بيفتد تقريبا ‪ 3‬دقيقه در ‪ 95‬درجه سانتي گراد اين قدرت كارايي دارد‬
‫و اگر از ‪ Chemical modifica on‬استفاده كنيم اين در ‪ 9‬تا ‪ 15‬دقيقه ) ‪ (9-15‬در ‪ 95‬درجه سانتي گراد كارايي خواهد داشت‪.‬‬

‫‪Hybridiza on Probes‬‬
‫در واقع ‪ Probes‬ها يك رشته از ‪ DNA‬هستند كه به يك ماده فلوئورسانت متصل مي شوند‪ .‬اما كار اين ‪Hybridiza on Probes‬‬
‫ها اين هست كه متصل مي شوند به دو رشته ما وقتي تك رشته شدند و بعد با ‪ Taq‬پلي مراز شروع به كار خواهند كرد‪.‬‬

‫اما اين ‪ Hybridiza on Probes‬ها انواع و اقسامي دارند‪:‬‬

‫‪ : Cleavage Based Assay .1‬اين ها پروب هاي هيبريدايزي هستند كه در حين ‪ Assay‬شدن و حين كار كردن اين ها قطعه قطعه‬
‫مي شوند‪ .‬مثل ‪ TaqMan Probes‬كه بسيار پر كابرد هستند‪ LNA Probes – MGB Taqman Probes -‬ها اين ها همگي مثال‬
‫هاي ‪ Cleavage‬هستند در حين كار پروب مي شكند تا بتواند كار كند‪.‬‬

‫‪ : Displaceable Probe Assay .2‬به پروب هايي اشاره دارد كه بلند مي شوند و دوباره مي نشينند به طور كلي مي توان گفت‬
‫قابليت جايگزيني دارند‪ .‬مثال‪.Dual Oligo FRET Probes ،TaqBeacon Probes ،Molecular Beacons :‬‬

‫‪ :Probes incorporated directly into the primers .3‬اين ها يك سري از پروب هايي هستند كه به طور مستقيم با پرايمر‬
‫جايگزين مي شوند‪ ،‬مثال‪Scorpions – Amplifluor :‬‬

‫‪2‬‬
‫سيدمحرمي‬ ‫خصوصيات ‪TaqMan Probes‬‬

‫ما يك خاصيت فيزيكي داريم تحت عنوان ‪ (Fluorescence resonance energy transport ) FRET‬از اين خاصيت در فيزيك‬
‫استفاده شده حاﻻ تصور كنيم ما يك ‪ Taqman probes‬داريم و اين پروب يك سر ‪ 5‬پريم دارد و همچنين يك سر ‪ 3‬پريم‪ .‬سر ‪5‬‬
‫پريم ما به ماده اي متصل است كه به ان ‪ Reporter‬مي گويند و سر ‪ 3‬پريم ما به ماده اي وصل است كه به ان ‪ Quencher‬مي گويند‬
‫اين ‪ reporter‬در حالت معمول بايد نور ساتع كند اما ‪ Quencher‬اين نور را خاموش مي كند و اجازه فعاليت به ‪ reporter‬را نمي‬
‫دهد اما مادامي كه اين ها در كنار هم هستند در واقع هيچ گونه سيگنالي را نشان نخواهند داد تا اينكه بشكنه پروب و اين ‪quencher‬‬
‫از ‪ reporter‬جدا شود و با جدا شدن قدرت خاموش كنندگي نخواهد داشت و ‪ reporter‬شروع به ساتع كردن نور خواهد كرد‪.‬‬

‫در ‪ Taqman probe‬حاﻻ دو رشته داريم و پرايمر پروب ‪ Taqman‬ما هستند و حاﻻ دناتوراسيون اتفاق مي افتد و دو رشته از هم‬
‫جدا مي شود در مرحله بعد پروب و پرايمر مي نشيند خاصيت ‪ Taq‬پلي مرازي در ‪ Taqman‬پلي مراز ها خاصيت اگزونوكلئازي هست‬
‫يعني تا پرايمر نشست پروب هم متصل مي شود و اين ‪ Taq‬پلي مراز شروع به ساختن رشته هاي جديد خواهد كرد و تا اينكه مي رسه‬
‫به پروب ولي چون خاصيت اگزونوكلئازي دارد اين پروب را مي شكند تا شكست ‪ reporter‬از ‪ quencher‬جدا مي شود و نور ساتع‬
‫مي شود و فلورسانس خاصيت ‪ Detec on‬و تشخيصي پيدا خواهد كرد‪ .‬و هر چقدر اين روند تكرار شود ميزان ساتع شدن نور بيشتر‬
‫خواهد بود چون به همان نسبت در هر سيكل تعداد رشته ها افزايش مي يابد‪.‬‬

‫نقاط قوت ‪TaqMan Probes‬‬

‫‪ .1‬ميزان استفاده از ان زياد است‪.‬‬

‫‪ .2‬طراحي ان راحت تر است و فقط كافيه پرايمر و پروب ان را سفارش بديم و توليد ميشه با يك دستگاه خوب به راحتي جواب مي‬
‫گيريم‪.‬‬

‫‪ : Fluorescence is target specific .3‬فلورسانس به يك هدف خاص مي چسبد مثال مي خواهيم ترانسلوكاسيون ‪ 15:17‬را مي‬
‫خواهيم بررسي كنيم و اين قطعات كه بهم مي چسبند قطعات بزرگي هستند دقيقا محل شكستن هم ‪ 15‬و هم ‪ 17‬را پيدا مي كنيم و‬
‫از هر كدوم ‪ 10‬تا باز اخري را انتخاب مي كنيم و يك ‪ sequence‬خاصي داره براي اين محل يك پروب طراحي مي كنيم يك طرف و‬
‫به ‪ reporter‬وصل مي كنيم طرف ديگر را به ‪ quencher‬وصل مي كنيم و اين ها اساسا ‪ Target base‬هستند چون در اثر در كنار‬
‫هم قرار گرفتن اين ها ما محصولي خاص خواهيم داشت‪.‬‬

‫‪ :Mul plexing .4‬يك پنل مي گذاريم واسه ترانسلوكاسيون هايي كه در ‪ AML‬استفاده مي شود هر ترانسلوكاسيون مي چسبد و‬
‫تشخيص داده مي شود‪ .‬ولي تشخيص اينكه به عنوان مثال كدام ترانسلوكاسيون ‪ 8:21‬هست يا كدوم ‪ 6:9‬بايد بر اساس طول موج‬
‫‪ reporter‬باشه و دستگاه ‪ real me‬كانال هاي مختلفي دارد و هر كانال طول موج خاصي رو ‪ detect‬مي كند‪.‬‬

‫‪3‬‬
‫سيدمحرمي‬ ‫معايب ‪TaqMan Probe‬‬

‫‪ .1‬هزينه باﻻيي جهت راه اندازي ان بايد اختصاص داد‪.‬‬

‫‪ .2‬و بايد كامﻼ در اين زمينه با صبر و حوصله بود چون بايد ميزان ان را مدام كم و زياد كرد‪.‬‬

‫مشخصه هاي داشتن يك ‪ PCR‬خوب و درست‬

‫‪ .1‬نبايد چند تا محصول توليد شود بايد حتما يك محصول توليد شود چون پروب ما واسه يك قسمت طراحي شده است‪.‬‬

‫‪ Efficiency .2‬ما بايد ‪ 100‬درصد باشه ‪ 100+/-%10‬يعني از ‪ 90‬تا ‪ 110‬درصد كارايي داشته باشيم‪.‬‬

‫‪ : Good Intra – and Inter- Experimental Reproducibility .3‬ما يك نمونه اي داريم ما اين رو به پنج تا ازمايشگاه ديگه‬
‫هم مي دهيم تا ان را برايمان انجام دهند تا مشاهده كنيم كه تكرار پذيري ان نمونه بين اين چند تا ازمايشگاه چگونه است اين هست‬
‫معناي ‪. Inter-Experimental‬‬

‫‪ : Intra- Experimental‬در ازمايشگاه خودمون يك نمونه را ‪ 5‬بار پشت سر هم بدهيم و جواب بگيريم و مقايسه كنيم‪.‬‬

‫‪ :Sensi vity over a broad dynamic range .4‬در ‪ PCR‬ما با ‪ Dynamic range‬وسيعي رو به رو هستيم و براي اين ‪copy‬‬
‫‪ number‬ها كه توليد مي شوند حتما ميزان حساسيت ان هم سنجيده شود‪.‬‬

‫ويژگي هاي يك پرايمر خوب‬

‫نكته‪ :‬اگر ما بخواهيم از ‪ SYBER Green‬به عنوان پروب استفاده كنيم پرايمر ما چه ويژگي هايي خواهد داشت‪ :‬و اين سوال انحرافي‬
‫هست چون اين مورد اصﻼ پروب نياز ندارد و ما فقط براي ان از پرايمر استفاده مي كنيم‪.‬‬

‫‪ .1‬بين ‪ 15-30 bp‬بايد طول داشته باشد‪.‬‬

‫‪ .2‬از نظر تئوري اين دو پرايمر بيش از ‪ 2‬درجه سانتي گراد با هم اختﻼف نداشته باشند‪.‬‬

‫‪ .3‬واسه دماي ‪ Annealing‬پرايمر ها سعي كنيد از دماي بين ‪ 60-55‬استفاده شود‪.‬‬

‫‪ TaqMan Primers .4‬ها بايد معموﻻ يك دماي حداقل ‪ 60‬درجه سانتي گراد داشته باشند‪.‬‬

‫‪ .5‬محتواي ‪ G-C‬بين ‪ 60-40‬درصد باشد اگر ‪ Target sequence‬نياز هست بين ‪ 80-20‬درصد محتواي ‪ G-C‬هم مناسب است‪.‬‬

‫‪ .6‬ولي معموﻻ همين ‪ 50‬درصد ‪ G-C‬داشته باشد مناسب است خيلي زياد ‪ G-C‬استفاده نشود‪ .‬چون بعد دو رشته به سختي از هم جدا‬
‫مي شوند‪.‬‬

‫‪ .7‬در انتهاي ناحيه ‪ 3‬پريم ‪ G-C ،‬كﻼمپ كم داشته باشيم علتش اين هست كه ايجاد ‪ Folding‬مي كند‪.‬‬

‫‪ .8‬سعي كنيد يون منيزيم را تا حد امكان جوري بررسي كنيد و داخل محلول بريزيد كه ‪ Taq‬پلي مراز را از بين نبرد و خراب نكند و به‬
‫اندازه استفاده شود‪.‬‬

‫‪4‬‬