Họ và tên: Lê Đình Minh

MSSV: 20201184

Mã lớp: 739266

BÀI 5: PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ĐƯỜNG/OLIGOSACCHARIT BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG (TLC)
I. NGUYÊN TẮC
 Phương pháp sắc ký bản mỏng là phương pháp tách các chất dựa trên sự
khác nhau về ái lực của chất cần phân tích giữa pha tĩnh và pha động.
 Pha tĩnh: lớp silicagen( SiO2.xH2O)
o Pha động: hệ dung môi(n-propanol:nitromethan:H2O= 7:1:2)
 Khi chạy sắc ký, sau một thời gian, chất có ái lực cao hơn với pha tĩnh sẽ bị
giữ lại trên pha tĩnh lâu hơn, nên chuyển động châm hơn, quãng đường dịch
chuyển ngắn hơn.
 Phương pháp sắc ký bản mỏng thường dùng để tách hợp chất phân cực , có
khả năng tạo liên kết cầu H
 Hệ số dịch chuyển Rf
+ Rf=a/b a:quãng đường dịch chuyển của chất cần phân tích
b: quãng đường dịch chuyển của dung môi
+ Rf càng lớn thì ái lực của chất phân tích với pha tĩnh càng nhỏ và ngược
lại.
(trong điều kiện xác định , Rf là 1 hằng số đặc trưng cho chất cần phân tích ,thông
thường là khi thực hiện trên cùng 1 bản sắc ký )
 Phản ứng hiện màu
(C6H12O6)n → 6nC + 6nH2O
Giải thích: H2SO4 5% pha trong cồn : có 95% là cồn, cồn phân cực và dễ bay hơi
hơn nước , nên khi sấy sẽ nhanh hơn. Sau khi sấy, còn H2SO4 oxi hóa đường
thành màu đen.
II. TIẾN HÀNH
 Mẫu phân tích: hỗn hợp đường
1. Chuẩn bị
  Bản sắc ký bản mỏng (Meck, Silicagel 20x20cm) theo kích thước 4x10cm
(PTN chuẩn bị)
 Hệ dung môi: hỗn hợp n-butanol: axit acetic : nước = 45 : 20 : 35 (PTN
pha)
2. Tiến hành
Chấm mẫu
 Đi găng tay, cố gắng hạn chế chạm vào mặt phủ silica gel, chỉ cầm nhẹ hoặc
dùng nhíp kẹp ở một góc. Lấy bản sắc ký bản mỏng, dùng bút chì kẻ đường
chấm mẫu (xem hình trên), đánh dấu vị trí và tên mẫu.

 Lấy 10 µl mẫu bằng ống mao quản thuỷ tinh hoặc đầu côn 10ul
 Chấm mẫu vào vị trí qui định, đường kính vết loang không vượt quá 2 mm.
Chạy sắc kí
 Đặt bản sắc kí đã chấm mẫu vào bình sắc ký có chứa dung môi hữu cơ đã bão
hoà hơi dung môi, mép dưới bản sắc kí được nhúng vào dung môi sao cho
đường chấm mẫu không ngâm ngập trong dung môi, mặt chấm mẫu hướng
xuống phía dưới.
 Quá trình chạy được kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của bản
sắc kí 1cm
 Lấy bản sắc kí ra, dùng bút chì đánh dấu vị trí của vệt dung môi
 Sấy khô bản sắc kí
Phát hiện mẫu
 Phun đều dung dịch H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối lên bản sắc kí (hoặc nhúng
nhanh bản sắc kí vào khay đựng dung dịch hiện màu trên)
 Sấy khô bản sắc ký ở 1100C trong 5 phút (hoặc hơ bản mỏng trên bếp điện),
xuất hiện dần các vết màu.
III. XỬ LÝ SỐ LIỆU

Nhận xét: Kết quả đo cho thấy có sự chênh lệnh rất nhỏ giữa chiều cao tương ứng
của a trong mẫu H so với 2 mẫu, điều này có thể được giải thích do thao tác chấm
mẫu H thấp hơn một chút

Mẫu số 1 (Glucose) Mẫu số 2 (Raffinose)

Mẫu hỗn hợp số 3

a (cm) 3,85 2,55 3,8 2,5

b (cm) 8,15 8,15 8,15 8,15

Rf (a/b) 0.472 0.313 0.466 0.307

Nhận xét: Dựa vào kết quả tính toán ta thấy Rf(Glucose) >Rf(Ranfinose) chứng tỏ
ái lực của Glucose với pha tĩnh nhỏ hơn Ranfinose so với pha tĩnh.
 Rafinose là chất phân cực hơn.
IV. CHÚ Ý
1.Chuẩn bị sắc ký
 Chú ý đi găng tay , giữ sạch bản mỏng để tránh các hợp chất hữu cơ , tạp
chất trên tay dính vào bản sắc ký.
 Không làm tróc bản TLC
2.Mẫu
 Lượng mẫu vừa đủ (0,1-2 ug) tùy loại mẫu
 Chọn dung môi pha mẫu càng ít phân cực càng tốt
 Kẻ đường chấm mẫu bằng bút chì, không kẻ bằng bút bi vì mực bút bi là
hợp chất hữu cơ, khi ngâm vào dung môi trong quá trình chạy sắc kỹ sẽ gây
nhiễu
 Dùng mao quản chấm mẫu. Chú ý chấm nhiều lần , chỗ nào khô chấm tiếp .
chấm sao cho đường kính vết loang không quá 2mm, phải theo thứ tự
3. Chạy sắc ký
 Đặt bản sắc ký vào bình sắc kí sao cho mép dưới bản sắc ký được nhúng vào
dung môi nhưng không ngập trong dung môi, tránh các mẫu bị lẫn vào nhau
gây nhiễu
 Dung môi hữu cơ trong bình sắc kí phải được bão hòa hơi dung môi, tránh
bay hơi. Dung môi phải tinh khiết, không màu hoặc màu rât nhạt
 Quá trình chạy sắc ký kết thúc khi vệt chạy của dung môi cách mép trên tờ
sắc kí 0.5-1cm
 Trong quá trình sắc kí, buồng sắc kí phải kín
4. Hiện màu
 Phun đều H2SO4 5% trong cồn tuyệt đối vào các bản sắc kí
 Sấy kĩ , cẩn thận tránh làm cháy bản sắc kí

V. CÁC BIỆN PHÁP CẢI THIỆN

 Khi mẫu bị trùng, có thể do lượng mẫu quá nhiều, ta chấm lại mẫu cho vừa
đủ.
  Khi mẫu bị mờ có thể do nồng độ dung dịch thấp, ta cần chấm nhiều lần
(giữa các lần cần sấy khô rồi chấm lại lượng nhỏ, tránh làm tăng diện tích bề
mặt của mẫu).
 Nếu lượng mẫu ít mà vẫn bị trùng, ta cần thay đổi dung môi cho kém phân
cực hơn.
 Khi mẫu trùng nhau, ta có thể sấy khô rồi quay ngược cho chạy sắc ký tiếp.

VI. CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN MÀU ĐỐI VỚI PHÂN TÍCH ĐƯỜNG
BẰNG TLC
 Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương
pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:
 Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát
được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì
thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
 Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
 Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc ký vào,
hoặc phun lên bản sắc ký.
 Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng lyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn,
chẳng hạn hư khối phổ.