CÔNG NGHỆ LÊN MEN NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ CAO

1. Tổng quan về lên men

1.1. Vi sinh vật trong lên men
Thuật ngữ “lên men” được mượn từ tiếng Latin Fevere có nghĩa là “đun sôi”. Theo Louis Pasteur, quá
trình lên men được định nghĩa là “La vie sans l'air”, tức là sự sống không có không khí, và khoa học
về lên men còn được gọi là zymology hay zymurgy. Tuy nhiên, lên men là một trong những phương
pháp lưu trữ/bảo quản thực phẩm lâu đời nhất trên thế giới có từ thời kỳ đồ đá mới (10.000 năm trước
Công nguyên) [39, 41].

. Prajapati JB, Nair BM. The history of fermented foods. In: Farnworth ER, editor. Fermented
functional foods. Boca Raton, New York, London, Washington DC: CRC Press; 2003. p. 1–25.

Ray RC, Joshi VK. Fermented foods;: past, present and future scenario. In: Ray RC, Montet D, editors.
Microorganisms and fermentation of traditional foods. Boca Raton, Florida: CRC Press; 2014. p. 1–36.

Theo nghĩa sinh hóa, đó là biện pháp trao đổi chất trong đó các hợp chất hữu cơ phức tạp (đặc biệt là
carbohydrate) được phân hủy thành các hợp chất đơn giản hơn mà không có sự tham gia của oxy (tác
nhân oxy hóa ngoại sinh) cùng với việc tạo ra năng lượng (phân tử ATP).
Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men tùy thuộc vào vi sinh vật. Động lực khoa học đằng sau quá
trình lên men bắt đầu bằng việc đặt tên và xác định các vi sinh vật (năm 1665) bởi Leeuwenhoek và
Hooke [15].

Gest H. The discovery of microorganisms by Robert Hooke and Antoni van Leeuwenhoek, Fellows of
The Royal Society. Notes Rec R Soc Lond. 2004;58(2):187–201

Sau đó, Pasteur đã loại bỏ “lý thuyết sinh tự phát” vào năm 1859 bằng thí nghiệm lý tưởng. Tuy
nhiên, hiệu suất của một loại vi khuẩn Lactococcus lactis trong sữa lên men đã được Sir Joseph Lister
tìm ra vào năm 1877 [44].

Saito Y, Ishii Y, Hayashi H, Imao Y, Akashi T, Yoshikawa K, Noguchi Y, Soeda S, Yoshida M, Niwa M,
Hosoda J, Shimomura K. Cloning of genes coding for L - sorbose and L - sorbosone dehydrogenases
from Gluconobacter oxydans and microbial production of 2-keto-L-gulonate, a precursor of L -
Ascorbic acid, in a recombinant G. oxydans strain. Appl Environ Microbiol. 2017;63:454

Nói chung, các vi khuẩn ở dạng tế bào hoặc nhóm tế bào riêng biệt, thường là vi khuẩn, đôi khi là
nấm, tảo hoặc tế bào có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, đều tham gia vào quá trình lên men. Một
số thông số liên quan đến quá trình lên men, chẳng hạn như nồng độ tế bào vi sinh vật và các thành
phần của chúng (enzyme) và các điều kiện như pH, nhiệt độ và môi trường lên men (hiếu khí/kỵ khí).
Nói chung, quá trình lên men của vi sinh vật được chia thành bốn loại, (i) tạo ra sinh khối (tế bào);
(ii) sản xuất các chất chuyển hóa; (iii) tổng hợp enzyme, vitamin và protein; và (iv) chuyển
hóa/chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm có giá trị [56].

Thakur SA, Nemade SN, Sharanappa A. Solid state fermentation of overheated soybean meal (Waste)
for production of Protease using Aspergillusoryzae. Int J Res Sci Eng Tech. 2015;50:228–35.

Các vi sinh vật công nghiệp được chia thành bốn loại chính dựa trên phương thức sử dụng năng lượng của
chúng [59]:
. Kampen WH. Nutritional requirements in fermentation processes. In: Vogel HC, Todaro CM, editors.
Fermentation and biochemical engineering handbook: principles, process design and equipment. 3rd ed.
Westwood: Elsevier; 2014. p. 37–57

1. Sinh vật quang tự dưỡng: nguồn năng lượng ánh sáng, CO2 là nguồn carbon (C); thực vật bậc cao, hầu
hết các loài tảo nhân chuẩn, một số vi khuẩn quang hợp
2. Quang dị dưỡng: nguồn năng lượng ánh sáng, nguồn C hữu cơ; vi khuẩn quang hợp không S tím, một
số ít tảo nhân chuẩn.
3. Sinh vật hóa tự dưỡng : nguồn năng lượng hóa học, nguồn CO2 là nguồn C (khử các hợp chất vô cơ
làm nguồn năng lượng); chỉ bao gồm vi khuẩn
4. Sinh vật hóa dị dưỡng: nguồn năng lượng hóa học, nguồn C hữu cơ; đa dạng nhất là nấm (fungi), vi
khuẩn, một số loài tảo
1.2. Môi trường lên men
Nhiều vi khuẩn hóa dị dưỡng có thể phát triển tốt trong điều kiện không được tối ưu hóa. Điều kiện môi
trường thuận lợi hơn, chẳng hạn như nhiệt độ. Nhưng lý do chính là môi trường phát triển phù hợp hơn,
cung cấp lượng chất dinh dưỡng dồi dào dễ tiếp cận. Đây là lúc mà sự phát triển thích hợp của môi trường
lên men trở nên quan trọng. Lên men công nghiệp thường là một nỗ lực thương mại và các điều kiện sản
xuất và tăng trưởng tối ưu cuối cùng sẽ hỗ trợ tính khả thi về mặt kinh tế của quy trình. Ngay cả khi
không có áp lực kinh tế, môi trường tăng trưởng được phát triển cẩn thận có thể mang lại lợi ích cho nhà
nghiên cứu chuyên nghiên cứu về một vi sinh vật hoặc phân tử cụ thể.
Môi trường lên men có thể thô hoặc tinh chế, phức tạp hoặc đơn giản, đắt tiền hoặc rẻ tiền. Bất kể quá
trình nào, các thành phần cơ bản của các phân tử sinh học bao gồm C, nitơ (N), oxy (O), hydro (H), phốt
pho (P) và lưu huỳnh (S). Các vi sinh vật hóa dưỡng phải thu được những nguyên tố này, cộng với các
đồng yếu tố quan trọng như khoáng chất vi lượng, từ môi trường xung quanh chúng. Oxy phần lớn được
tiếp cận từ khí quyển hoặc thông qua việc bổ sung oxy tinh khiết vào môi trường tăng trưởng. Các yếu tố
còn lại được cung cấp bởi môi trường tăng trưởng. Thành phần hóa học chính xác của tế bào thay đổi tùy
theo loài và có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy.

Heldal M, Norland S, Fagerbakke KM, et al. The elemental composition of bacteria: a signature of growth
conditions? Mar Pollut Bull. 1996;33(1-6):3–9. https://doi.org/10.1016/s0025-326x(97)00007-6.

Nguyên tố Chức năng Nguồn

C Nguồn năng lượng, cấu trúc phân tử Đường, tinh bột
H Cấu trúc phân tử, hô hấp, sản xuất ATP Nước, proton từ môi trường axit
O Phân tử hữu cơ Không khí
N Protein, nucleic axit Nấm men, peptone, muối amoni, axit amin
P Phospho lipids, nucleic acids Phosphates
S Amino acids, coenzymes Sulfates
Na Cofactor, cation NaCl, Na2HPO4
Mg Cofactor, cation MgSO4, MgCl2
Ca Cofactor, cation CaCl2
K Cofactor, intracellular cation K2HPO4, KH2PO4
 Fe Cytochromes, cofactor FeSO4, FeCl3

Mục tiêu chính khi phát triển môi trường lên men là cung cấp cho vi sinh vật tất cả các yếu tố cần thiết, ở
mức cân bằng thích hợp và ở dạng dễ tiếp cận, để tăng trưởng, hoạt động và sản xuất tối ưu. Do có rất
nhiều nguồn và sự kết hợp nên một cách tiếp cận hợp lý để thiết kế, phát triển và tối ưu hóa môi trường
lên men là rất quan trọng. Đầu vào chính của môi trường lên men bao gồm nguồn C và N, kim loại vi
lượng và các đồng yếu tố, cũng như các hợp chất dành riêng cho quy trình khác như chất chống tạo bọt.
Tối ưu hóa các thành phần môi trường, chú ý đến quy mô sản xuất cuối cùng và thị trường mục tiêu, là
một bước bổ sung để phát triển các quy trình lên men hiệu quả cao, có tiềm năng mở rộng và tiết kiệm
kinh tế.
1.3. Thiết bị lên men
Lên men được biết đến là một quá trình trong đó vi sinh vật phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ
khí và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong một thùng kín gọi là thiết bị lên men. Với mục đích này,
cần phải cung cấp các vi sinh vật phù hợp cho nhà sản xuất để luôn tạo ra lượng sản phẩm mục tiêu cao
nhất. Sau đó, cần phải thực hiện các hoạt động như phát triển chủng, bảo quản, chuẩn bị cấy, tối ưu hóa
môi trường và áp dụng quy trình lên men chính xác. Các thông số quan trọng như hiệu quả sản xuất, năng
suất và tính kinh tế sản xuất đều được tính đến. Loại và số lượng sản phẩm do vi sinh vật tạo ra thay đổi
tùy theo giai đoạn phát triển của vi sinh vật.
Giai đoạn mà vi sinh vật tạo ra sản phẩm và hình thức phát triển là rất quan trọng đối với sự thành công
của quá trình lên men. Với mục đích này, hai phương pháp, lên men lỏng (lên men chìm; SmF) và lên
men nuôi cấy rắn (SSF), được sử dụng rộng rãi. Mặc dù sử dụng phương pháp lên men nuôi cấy rắn, hầu
hết quá trình lên men đều được thực hiện trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí trong môi trường lỏng.
Kiểu sản xuất này được gọi là lên men ở trạng thái lỏng (SmF). Hầu hết các quá trình lên men được thực
hiện trong điều kiện vô trùng, có sục khí và khuấy trộn, trong khi một số quá trình lên men, chẳng hạn
như sản xuất bia và rượu, được thực hiện không có điều kiện vô trùng, sục khí và khuấy trộn. Quá trình
lên men được thiết kế theo các quy trình như huyền phù tế bào, tạo màng trên vật liệu, bẫy trong ma trận.
Các quy trình cơ bản cần thiết cho quá trình lên men ở trạng thái lỏng trong thiết bị lên men như sau:
1. Lựa chọn vi sinh vật thích hợp cho sản phẩm mục tiêu
2. Xác định và chuẩn bị môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật
3. Chuẩn bị và bảo quản giống gốc và tiền nuôi cấy
4. Khử trùng môi trường và thiết bị lên men
5. Cấy thiết bị lên men
6. Sản xuất các sản phẩm vi sinh
7. Giám sát quá trình lên men
8. Thu hoạch sản phẩm
9. Tinh chế sản phẩm và các bước hoàn thiện
10. Làm sạch thiết bị lên men
Một thiết bị lên men lý tưởng trong phòng thí nghiệm khi được mở rộng lên hàng trăm nghìn lít trong một
nhà máy lên men không thể mang lại hiệu suất và năng suất sản xuất tương tự. Hệ thống lên men 100.000
lít chuyển đổi bột ngô thành ethanol không thể cho ra kết quả giống hệt như thiết bị lên men thủy tinh đặt
trên bàn thí nghiệm có thể tích 2 lít.
Quá trình phát triển quy trình lên men thường bắt đầu ở quy mô phòng thí nghiệm (lab scale) với các thiết
bị lên men sinh học để bàn (1–50 L) hoặc thậm chí là bình lắc (100–1000 mL) và tế bào vi sinh vật (vài
mL). Sau khi việc tối ưu hóa đã chứng minh là khả thi thì quy trình quy mô xưởng (pilot scale) (50–
10.000 L) sẽ được thiết kế và triển khai để thiết lập các điều kiện vận hành tối ưu. Chỉ sau đó, sau khi
nghiên cứu thành công ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô xưởng, quy trình xử lý sinh học mới được
triển khai ở quy mô nhà máy (plant scale) (> 10.000 L) cho sản xuất thương mại. Vì vậy, bước thiết lập
một quy trình sinh học từ quy mô nhỏ đến quy mô lớn được gọi là mở rộng quy mô. Mục tiêu của việc
mở rộng quy mô là chuyển các điều kiện tối ưu thu được trong thiết bị lên men sinh học quy mô nhỏ sang
thiết bị lên men sinh học quy mô lớn. Các nghiên cứu mở rộng quy mô là không thể thiếu cho sự phát
triển của bất kỳ quá trình lên men nào, do đó có thể thiết lập tiêu chí thích hợp để thay đổi quy mô mà
không làm tổn hại đến đặc trưng động học của vi sinh vật và do đó làm hỏng hiệu suất của quy trình. Tuy
nhiên, hoạt động động học của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường xác định như nồng
độ chất dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, v.v.
Vi sinh vật nhạy cảm hơn với các biến đổi môi trường này ở quy mô lớn. Do đó, các thử nghiệm quy mô
nhỏ có xu hướng dự đoán quá cao hiệu suất của quy trình ở quy mô lớn hơn trừ khi sự không nhất quán
trong việc mở rộng quy mô được loại bỏ. Đây là nơi kỹ thuật mở rộng quy mô trở nên quan trọng. Với
mục đích này, các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh học phải được kiểm soát. Điều này
được thực hiện bằng cách xem xét các yếu tố vật lý, sinh hóa và xử lý sinh học. Các yếu tố vật lý bao gồm
điều kiện khối lượng và truyền nhiệt, điều kiện trộn (khuấy), mức tiêu thụ điện năng, pH, nhiệt độ, oxy
hòa tan, v.v. Các yếu tố sinh hóa chủ yếu là các thành phần môi trường và nồng độ của chúng cùng với
các đặc tính hóa lý của chúng. Cuối cùng, các yếu tố của quy trình bao gồm điều kiện tiền nuôi cấy, chất
lượng khử trùng và tỷ lệ nuôi cấy cũng quyết định mức độ thực hiện mở rộng quy mô thành công [1].

Asadi A, Zinatizadeh AA, van Loosdrecht M. Effects of operational models (batch, continuous and CFID
modes) on the performance of a single A2O airlift bioreactor for treatment of milk processing
wastewater. Chem Eng Res Des. 2017;125:471–82.

1.4. Điều kiện của quá tình lên men

Sản xuất rượu là một trong những lĩnh vực đầu tiên sử dụng quá trình lên men. Vào thời điểm đó, thuật
ngữ lên men có liên quan đến việc chuyển đổi đường thành rượu và carbon dioxide. Sau đó, từ này có liên
quan đến vi sinh vật do Pasteur chứng minh vai trò của nấm men và trong những thập kỷ tiếp theo trở nên
liên quan nhiều hơn đến enzyme [39].

Potter NN. La ciencia de los alimentos. Westport: AVI Publishing Company Inc.; 1973.

Thuật ngữ lên men gắn liền với quá trình trao đổi chất trong đó cơ chất hữu cơ trải qua những thay đổi
hóa học do hoạt động của các enzyme do vi sinh vật tiết ra [33].

. Naik SN, Goud VV, Rout PK, Dalai AK. Production of first and second generation biofuels: a
comprehensive review. Renew Sust Energ Rev. 2010;14:578–97.
https://doi.org/10.1016/j.rser.2009.10.003
Ngày nay, các sản phẩm lên men được sử dụng rộng rãi trong các quy trình đa dạng, như trong chuyển đổi
sinh khối sang nhiên liệu sinh học như ethanol, hydro sinh học và butanol, phụ gia thực phẩm và chất bổ
sung, dinh dưỡng, enzyme công nghiệp, dược phẩm và hóa chất, cũng như để xử lý chất thải công nghiệp.
Sự thành công của quá trình lên men phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện vận hành. Không giống như hầu hết
các quá trình hóa học, trong đó nồng độ, nhiệt độ và áp suất được kiểm soát cơ bản để đảm bảo hiệu quả
và/hoặc tốc độ phản ứng nhất định, trong các hệ thống sinh học, vi sinh vật là một phần của quá trình. Vì
vi sinh vật là những sinh vật sống nên mỗi cá thể có thể phản ứng theo một cách riêng với một điều kiện
nhất định. Tuy nhiên, hành vi của một tập hợp vi sinh vật có thể được dự đoán với độ chính xác nhất định.
Mặc dù vậy, vì chúng là những sinh vật sống nên điều kiện vận hành khắc nghiệt không chỉ dẫn đến quá
trình kém hiệu quả mà còn dẫn đến chết sinh khối và thất bại trong quy trình. Ngoài ra, không giống như
các quá trình sinh học khác (chẳng hạn như các quá trình được áp dụng trong xử lý nước thải), trong đó
mục tiêu là phân hủy sinh học đơn giản các dư lượng hóa chất, nói chung mục tiêu của quá trình lên men
là sinh tổng hợp các sản phẩm có giá trị gia tăng. Do đó, các yêu cầu vận hành bị hạn chế hơn và có thể
liên quan đến các cân nhắc ngoài hoạt động như tiền xử lý cơ chất, khử trùng, chuẩn bị môi trường và
tách các hợp chất ức chế.
2. Tổng quan về công nghệ lên men
2.1. Khái niệm công nghệ lên men
Công nghệ lên men là việc sử dụng các sinh vật để sản xuất thực phẩm, dược phẩm và đồ uống có cồn
trên cơ sở công nghiệp quy mô lớn. Nguyên tắc cơ bản của công nghệ lên men công nghiệp là sinh vật
được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, bằng cách cung cấp nguyên liệu đáp ứng tất cả các yêu cầu cần
thiết như carbon, nitơ, muối, nguyên tố vi lượng và vitamin. Các sản phẩm cuối cùng được hình thành do
quá trình trao đổi chất trong suốt vòng đời của chúng được giải phóng vào môi trường, được chiết xuất để
con người sử dụng và có giá trị thương mại cao. Các sản phẩm chính của công nghệ lên men được sản
xuất kinh tế trên cơ sở công nghiệp quy mô lớn là rượu vang, bia, rượu táo, giấm, ethanol, pho mát,
hormone, kháng sinh, protein hoàn chỉnh, enzym và các sản phẩm hữu ích khác.
2.2. Phương pháp lên men
Quá trình lên men được thực hiện trong một thùng chứa gọi là thiết bị lên men hoặc lò phản ứng sinh học.
Thiết kế và tính chất của thiết bị lên men khác nhau tùy thuộc vào loại lên men được thực hiện. Tất cả các
thiết bị lên men đều cần có phương tiện để đo một số thông số lên men như nhiệt độ, áp suất, pH, thời
gian lên men đã trôi qua, mức chất lỏng, khối lượng, v.v.
Các loại thiết bị lên men khác nhau là:
(1) Thiết bị lên men không khí tái chế ngoại—để sản xuất sinh khối vi khuẩn, với metanol làm cơ chất
(2) Thiết bị lên men không khí tái chế nội—để sản xuất nấm men với dầu làm cơ chất.
(3) Thiết bị lên men tháp hình ống — Được sử dụng để sản xuất bia, rượu, giấm, v.v.
(4) Máy lên men Nathan—dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống.
(5) Máy lên men khuấy—dùng để sản xuất kháng sinh.
2.3. Phân loại quá trình lên men
Lên men theo mẻ
Kiểu lên men trong đó có sự thay đổi về môi trường nuôi cấy, số lượng vi sinh vật và lượng sản phẩm
được tạo ra (tức là chất chuyển hóa hoặc protein mục tiêu). Trong quá trình lên men theo đợt, người ta
thấy được sáu giai đoạn phát triển của vi sinh vật.
(a) Pha trễ:
Ngay sau khi tiêm chủng, số lượng tế bào vi sinh vật không tăng lên trong một thời gian và giai đoạn này
được gọi là pha trễ. Điều này là để các sinh vật thích nghi với môi trường mới mà chúng được cấy vào.
(b) Giai đoạn tăng tốc:
Khoảng thời gian mà các tế bào bắt đầu tăng số lượng được gọi là giai đoạn tăng tốc.
(c) Pha log:
Đây là khoảng thời gian số lượng tế bào tăng đều đặn.
(d) Giai đoạn giảm tốc:
Khoảng thời gian mà mức tăng trưởng ổn định giảm xuống.
(e) Pha ổn định:
Khoảng thời gian không có sự thay đổi về số lượng tế bào vi sinh vật là pha tĩnh. Giai đoạn này đạt được
do sự cạn kiệt nguồn carbon hoặc sự tích tụ của các sản phẩm cuối cùng.
(f) Giai đoạn chết:
Giai đoạn mà số lượng tế bào giảm đều đặn là giai đoạn chết. Điều này là do tế bào chết do ngừng hoạt
động trao đổi chất và cạn kiệt nguồn năng lượng. Tùy thuộc vào yêu cầu của sản phẩm, các giai đoạn phát
triển khác nhau của tế bào sẽ được duy trì. Đối với khối lượng vi sinh vật, giai đoạn log được ưu tiên. Để
sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp tức là kháng sinh, pha tĩnh được ưu tiên hơn.
Lên men gián đoạn
Trong kiểu lên men này, môi trường nuôi cấy mới chuẩn bị được bổ sung đều đặn mà không loại bỏ dịch
nuôi cấy. Điều này làm tăng khối lượng nuôi cấy lên men. Kiểu lên men này được sử dụng để sản xuất
protein từ vi sinh vật tái tổ hợp.
Lên men liên tục
Trong kiểu lên men này, các sản phẩm được loại bỏ liên tục cùng với các tế bào và được bổ sung bằng tế
bào và môi trường nuôi cấy tươi. Điều này dẫn đến thể tích ổn định hoặc không đổi của chất lên men.
Kiểu lên men này được sử dụng để sản xuất protein đơn bào (S.S.P), kháng sinh và dung môi hữu cơ.
3. Công nghệ lên men sản xuất cồn từ nguyên liệu tinh bột
3.1. Công nghệ truyền thống

Hiện nay, cả sản xuất cồn quy mô nhỏ và quy mô công nghiệp đều sử dụng phương pháp gia
nhiệt nguyên liệu. Quy trình sản xuất cồn truyền thống bao gồm các bước: nghiền nguyên liệu,
hồ hóa và dịch hóa bằng enzyme amylase ở nhiệt độ 95 - 105°C trong 60 - 70 phút, làm nguội
dịch cháo xuống 60 - 62°C, đường hóa bằng enzyme glucoamylase, hạ nhiệt độ dịch cháo xuống
28 - 32°C và tiến hành lên men.
Tuy nhiên, quy trình này tồn tại nhiều nhược điểm:

 Tiêu hao nhiều năng lượng: Quá trình dịch hóa tốn nhiều năng lượng, cần nhiều thời
gian và nước giải nhiệt, dẫn đến tăng chi phí đầu tư thiết bị.
 Nguy cơ nhiễm tạp cao: Nhiệt độ cao trong quá trình dịch hóa dễ dẫn đến nhiễm tạp,
làm giảm hiệu quả lên men.
 Nồng độ chất khô thấp: Nồng độ chất khô thấp khiến kích thước thiết bị lớn, tăng chi
phí chưng cất và thu hồi sản phẩm.
 Tổn thất đường và axit amin: Phản ứng Maillard xảy ra trong quá trình gia nhiệt, dẫn
đến tổn thất đường và axit amin.
 Thiết bị phức tạp: Quy trình đòi hỏi hệ thống thiết bị phức tạp bao gồm bộ phận cấp
hơi, làm nguội, khuấy trộn,...

Do những nhược điểm trên, công nghệ sản xuất cồn truyền thống đang dần được thay thế bởi các
công nghệ mới, hiệu quả và tiết kiệm năng lượng hơn.

3.2. Công nghệ đường hóa và lên men đồng thời

Công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (SSF) là một phương pháp mới được áp dụng trong
sản xuất cồn, thay thế cho quy trình truyền thống. Công nghệ này đã được nghiên cứu và ứng
dụng thành công trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như ngô, lúa mạch, sắn,...

Công nghệ này có nhiều ưu điểm như

 Tiết kiệm năng lượng: Quá trình dịch hóa diễn ra ở nhiệt độ thấp hơn so với phương pháp
truyền thống (khoảng 80°C), giúp tiết kiệm năng lượng đáng kể.
 Giảm thiết bị và lượng nước sử dụng: Do quy trình được thực hiện trong một bể duy nhất,
nên SSF giúp giảm bớt thiết bị và lượng nước sử dụng.
 Nâng cao hiệu quả lên men: Đường glucose được giải phóng đồng thời với quá trình lên
men, giúp giảm stress cho nấm men và nâng cao hiệu quả lên men.
 Tăng nồng độ cồn: Quy trình SSF có thể thực hiện ở nồng độ chất khô cao, giúp tăng
nồng độ cồn trong dịch lên men, từ đó giảm chi phí chưng cất và xử lý chất thải.
 Giảm giá thành sản phẩm: Nhờ những ưu điểm trên, công nghệ SSF giúp giảm giá thành
sản phẩm cồn.

SSF được áp dụng rộng rãi trong sản xuất cồn từ ngô tại Mỹ. Hầu hết các quốc gia khác cũng
đang dần áp dụng công nghệ này trong sản xuất cồn. Công nghệ SSF là một phương pháp hiệu
quả, tiết kiệm năng lượng và thân thiện với môi trường trong sản xuất cồn. Với những ưu điểm
vượt trội, SSF được kỳ vọng sẽ thay thế hoàn toàn cho quy trình sản xuất cồn truyền thống trong
tương lai.

3.3. Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt

Các quy trình sản xuất cồn hiện nay còn tồn tại nhiều nhược điểm như tiêu tốn năng lượng, nước
làm nguội, quy trình phức tạp,... Để khắc phục những vấn đề này, quy trình sản xuất cồn tiết
kiệm năng lượng (không gia nhiệt) hay còn gọi là “no-cook”, “cold-cook” hoặc “one-step
fermentation” đã ra đời. Phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng hệ enzym có khả năng thủy phân
tinh bột ở nhiệt độ thấp (30 - 34°C) kết hợp dịch hóa, đường hóa và lên men trong cùng một
công đoạn, thiết bị và nhiệt độ.

Phương pháp này có ưu điểm:

 Tiết kiệm năng lượng do không sử dụng nhiệt.

 Đơn giản hóa quy trình.
 Giảm thời gian sản xuất, lượng nước làm mát.
 Nấm men không chịu áp suất thẩm thấu cao.

3.4. Công nghệ lên men sản xuất cồn nồng độ chất khô cao

Theo Thomas và cộng sự (1993), VHG (Very High Gravity) là thuật ngữ chỉ dịch lên men có
nồng độ chất khô từ 27g/100g (tương đương 300g/L) trở lên. Quá trình lên men VHG cho phép
đạt được nồng độ cồn sau lên men trên 15% v/v. Tuy nhiên, VHG cũng tiềm ẩn những ảnh
hưởng tiêu cực đến nấm men, enzym và quá trình lên men do áp suất thẩm thấu và nồng độ cồn
cao, đặc biệt ở điều kiện nhiệt độ lên men thông thường. Mặc dù vậy, VHG vẫn được đánh giá
cao bởi những lợi thế về sản lượng, năng suất thiết bị, tiết kiệm năng lượng và giảm chi phí xử lý
chất thải. Do vậy, VHG đang là một hướng nghiên cứu được nhiều quan tâm trong ngành sản
xuất cồn.

Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp sản xuất bia và ethanol sinh học đã tập trung hơn
vào việc thực hiện các biện pháp cắt giảm chi phí để duy trì năng suất trong thời kỳ suy thoái
kinh tế. Một biện pháp như vậy là việc áp dụng công nghệ lên men trọng lượng rất cao (VHG)
mới nổi nhờ khả năng tăng cường năng suất quy trình và giảm thiểu hiệu quả của nó. Công nghệ
này nhằm mục đích giảm nhu cầu về nước trong quy trình và do đó giảm chi phí chưng cất và chi
phí xử lý liên quan, bao gồm một phần lớn chi phí năng lượng tổng thể, do đó, chiếm khoảng
30% tổng chi phí sản xuất [2] ; Nhờ đó, VHG đạt được năng suất cao hơn nhờ nồng độ etanol
cao hơn mà không cần đầu tư thêm/cơ sở hạ tầng lớn. Trong thực tế, nồng độ etanol tăng lên ở
cuối quá trình lên men có thể được thực hiện bằng cách lên men môi trường chứa đường vượt
quá 250 g/l để đạt được hơn 15% (v/v) etanol so với 10–12. % (v/v), thường thấy ở hầu hết các
nhà máy chưng cất trên toàn thế giới. Những lợi ích tiềm tàng của công nghệ lên men VHG so
với các phương pháp truyền thống bao gồm tiết kiệm nước đáng kể, sản lượng rượu cao hơn và
giảm lao động cũng như nhu cầu năng lượng, chi phí vốn ít hơn và cũng giảm thiểu ô nhiễm vi
khuẩn.

Khái niệm lên men ethanol nồng độ chất khô cao (High Gravity) đã được đề xuất vào những năm
1980 và được áp dụng thành công sau đó, cho phép tăng mạnh nồng độ ethanol từ mức 7–8%
(v/v) trước đó [3]. Khái niệm này còn được mở rộng hơn nữa cho công nghệ lên men nồng độ
chất khô rất cao (VHG) trên cơ sở tiến bộ nghiên cứu về sinh lý nấm men mang lại những hiểu
biết mới về khả năng dung nạp ethanol của nấm men. Nghiên cứu đã tiết lộ rằng nhiều chủng
Saccharomyces cerevisiae có thể chịu được nồng độ ethanol cao hơn nhiều so với những gì đã
biết trước đây mà không cần bất kỳ điều kiện hoặc biến đổi di truyền nào [13, 78]. Trong trường
hợp sử dụng tinh bột làm chất nền, công nghệ VHG được định nghĩa là “sự chuẩn bị và lên men
cho đến khi hoàn thành quá trình nghiền có chứa 27 g chất rắn hòa tan trở lên trên 100 g dịch”
[76].

Tuy nhiên, tế bào nấm men phải chịu áp lực thẩm thấu cao ở giai đoạn lên men ban đầu khi mức
đường trong môi trường tăng lên trên giới hạn chịu đựng thông thường của chúng (>30% w/v).
Do đó, quá trình lên men chậm thường được quan sát thấy và cuối cùng hiệu suất sản xuất
ethanol giảm xuống [49]. Áp suất thẩm thấu cao, hoạt độ nước thấp (aw) và tác động độc hại của
nồng độ ethanol cao hơn là những yếu tố chính [32, 69], cùng với các yếu tố căng thẳng khác,
chịu trách nhiệm ức chế sự phát triển của nấm men và giảm hiệu suất lên men dưới nồng độ cơ
chất cao.

Mặc dù một số loại nấm men chịu được áp lực thẩm thấu như Saccharomyces rouxii có thể phát
triển tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao nhưng mức sản xuất ethanol của chúng tương
đối thấp. Người ta đã quan sát thấy rằng sự gia tăng áp suất thẩm thấu dẫn đến sự tích tụ ethanol
nội bào tăng lên [49] trong các tế bào nấm men, do đó, gây ra tác động bất lợi lên các enzyme
nội bào liên quan đến sản xuất ethanol. Do đó, khả năng lên men và khả năng tồn tại của nấm
men bị tổn hại nghiêm trọng trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao. Ngoài trọng lượng ban đầu
cao của môi trường, các tế bào nấm men tiếp tục chịu đựng nồng độ ethanol cao vào cuối quá
trình lên men ở chế độ theo mẻ. Để giảm hoặc loại bỏ các tác động tiêu cực do trọng lực cũng
như nồng độ ethanol tăng lên, các nghiên cứu đang được thực hiện để tìm hiểu cơ chế nấm men
thích ứng với các điều kiện khắc nghiệt, tập trung chủ yếu vào khả năng bài tiết và dung nạp
ethanol trong những điều kiện như vậy.

4. Công nghệ lên men VHG trong sản xuất bia

Ngành công nghiệp sản xuất bia đã chứng kiến sự tiết kiệm chi phí đáng kể nhờ sử dụng công
nghệ này. Bởi vì trong quá trình sản xuất bia VHG, dịch lên men chứa 160 g chất rắn hòa tan
trên mỗi kg gam trở lên được phép lên men, tiếp theo là quá trình trưởng thành và sau đó được
pha loãng với nước carbonated đến nồng độ cồn quy định, công suất của nhà máy bia có thể
được cải thiện lên 50% mà không cần đầu tư thêm [29]. Quá trình lên men VHG không chỉ là
một quá trình tối ưu hóa kinh tế mà còn hỗ trợ quá trình sản xuất bia có độ ổn định Xavour được
cải thiện và kết tủa sương mù lạnh tốt hơn so với phương pháp truyền thống, qua đó khoảng 12°P
dịch nha được lên men để sản xuất bia có 5% (v/v) etanol.

Nhiều công ty sản xuất bia trên khắp thế giới, đặc biệt là ở Canada, đang áp dụng công nghệ này
và khai thác những lợi thế của nó. Tuy nhiên, khi mật độ dịch nha tăng lên, các tế bào nấm men
phải đối mặt với các điều kiện căng thẳng bao gồm hạn chế chất dinh dưỡng, đặc biệt là nitơ
amin tự do (FAN) và oxy hòa tan [14]. Ngoài ra, những lo ngại như thời gian lên men dài hơn,
độ ổn định bọt kém hơn, đặc tính Xavour khác nhau và khả năng sử dụng hoa bia kém so với lên
men thông thường [43] cần phải được giải quyết trước khi nhận ra toàn bộ tiềm năng của công
nghệ. Hơn nữa, sự kết hợp của việc sản xuất bia VHG với các phương pháp hiện đại khác, chẳng
hạn như sử dụng các thiết bị lên men hình trụ cao, cũng làm tăng áp suất thủy tĩnh, mức độ
carbon dioxide và giảm mức độ oxy. Nhiều tác giả đã đề xuất nhiều phương pháp khác nhau để
khắc phục những nhược điểm này như nhiệt độ lên men cao hơn, bổ sung dinh dưỡng [14, 15,
24, 54], chủng nấm men đột biến [9], sục khí hiệu quả hơn so với ủ bia thông thường [15, 18],
cao hơn tốc độ ném [25, 45, 70] và men cố định [46, 47, 51, 66, 83].
4.1. Ảnh hưởng của dinh dưỡng bổ sung

Nguồn nito

Casey và cộng sự. [15] đã chứng minh hiệu quả của việc bổ sung chất dinh dưỡng trong quá
trình sản xuất bia VHG bằng cách thêm nguồn nitơ, ergosterol và axit oleic vào dịch hèm
chất rắn hòa tan 31%, qua đó sản xuất bia có chứa ethanol lên đến 16,2% (v/v). Dragone và
cộng sự. [24] đã chứng minh thành công sự cải thiện năng suất ethanol của dịch nha 20°P ở
15°C, trong điều kiện nhà máy thí điểm, bao gồm chất bổ sung dinh dưỡng, cụ thể là chiết
xuất men 0,8% (w/v), ergosterol 24 mg/l và 0,24% (v/v) Tween 80. Debourg [18] đã minh
họa rằng việc sử dụng quá trình oxy hóa trước của nấm men trước khi ủ và kiểm soát tốc độ ủ
là những điều kiện tiên quyết cần thiết để đạt được hiệu suất lên men VHG nhất quán và có
thể dự đoán được.

Trong quá trình sản xuất bia VHG, việc bổ sung nitơ amin (ví dụ: axit amin, chiết xuất nấm
men, urê, muối amoni) đã được chứng minh là cải thiện sự phát triển và lên men của nấm
men (Puligundla et al., 2011). Trong sản xuất bia VHG (20 ° P), việc bổ sung dịch hèm với
1,0% gluten lúa mì thủy phân (hỗn hợp axit amin và peptide) đã cho thấy sự cải thiện đáng
kể về sự phát triển và lên men của nấm men, đặc biệt là tích lũy sinh khối nấm men, sản xuất
và sử dụng ethanol tỷ lệ nitơ amin tự do được cải thiện lần lượt là 4,6%, 15,2% và 41,2%
(Zhao, Lu, Chu, Yang, & Meng, 2017).

Việc bổ sung axit amin đã được chứng minh là cải thiện hiệu suất lên men và khả năng chống
stress của nấm men Lager (Saccharomyces pastorianus) trong quá trình lên men VHG (Lei,
Feng, Peng, & Xu, 2019). Trong nghiên cứu đó, độc tính của ethanol (10%, v/v) được chứng
minh là nguyên nhân chính làm giảm khả năng sống sót của tế bào, sự phát triển của nấm
men và khả năng lên men của dịch nha so với trọng lượng dịch đường cao (24 ° P)

Lysine và histidine là các axit amin quan trọng đối với nấm men trong điều kiện trọng lực
bình thường cũng như điều kiện VHG. Vai trò của lysine và histidine trong việc điều hòa nitơ
trong điều kiện VHG đã được Lei et al làm sáng tỏ thêm. (2013). Họ đã chỉ ra rằng việc bổ
sung lysine, histidine và hỗn hợp của chúng đã làm tăng sự phát triển của nấm men, lên men
dịch đường, hình thành các chất dễ bay hơi hương vị và sản lượng ethanol.

Tiềm năng của dịch thủy phân protein từ bột quả óc chó, được điều chế bằng cách sử dụng
các enzyme phân giải protein thương mại Neutrase ®, Protamex ® và Flavorzyme ®
có/không xử lý bằng siêu âm, để cải thiện hiệu suất lên men của men bia trong quá trình sản
xuất bia VHG (24 °P) đã được chứng minh (Li và cộng sự, 2019).

Trong quá trình sản xuất bia VHG, việc hạn chế nitơ dẫn đến quá trình lên men bị kẹt hoặc
chậm do khả năng tồn tại của nấm men giảm. Mặt khác, trong quá trình lên men, nấm men
bia không thể đồng hóa các protein ngoại bào và peptide chuỗi dài vì hầu hết các loại nấm
men không tiết ra hoạt tính protease axit vào môi trường xung quanh. Trong một nghiên cứu,
khả năng sử dụng nitơ không có sẵn từ dịch nha VHG (20 ° P và 24 ° P) bằng cách thêm các
protease thương mại (Neutrase, Flavorzyme và Protamex) khi bắt đầu quá trình lên men đã
được nghiên cứu (Lei, Zhao, & Zhao, 2013 ). Kết quả cho thấy việc bổ sung protease làm
tăng đáng kể hàm lượng FAA dịch nha và do đó số lượng tế bào nấm men huyền phù trong
các giai đoạn lên men sau này. Việc bổ sung Flavorzyme cho thấy hiệu suất lên men tốt nhất
trong số các protease đã được thử nghiệm về khả năng lên men dịch nha được cải thiện đáng
kể, sản lượng ethanol cao hơn và sự hình thành các chất dễ bay hơi có hương vị. Ngoài ra,
các protease của không làm thay đổi độ ổn định bọt của bia thành phẩm so với đối chứng ở
từng trọng lượng tương ứng.

Nguồn C

Chất hỗ trợ sản xuất bia là những nguyên liệu không phải lúa mạch mạch nha mang lại nguồn
carbohydrate và protein bổ sung cho dịch nha (Goode & Arendt, 2006). Các loại ngũ cốc
khác nhau bao gồm lúa mì, lúa mạch, lúa miến ngô, gạo và yến mạch thường được sử dụng
(ở các dạng khác nhau: ngũ cốc nguyên hạt, bột kiều mạch, dạng mảnh, ép đùn nấu chín, bột
mì/tinh bột, xi-rô và ngũ cốc mạch nha) làm phụ gia pha chế. Việc áp dụng các vật liệu phụ
trợ dạng lỏng đã được đề xuất để giảm đáng kể chi phí sản xuất và tăng sản lượng sản xuất
trong quá trình sản xuất bia VHG. Ngoài ra, chúng còn góp phần tạo nên đặc tính của sản
phẩm (Goode & Arendt, 2006).

4.2. Sự hình thành các hương vị đặc trưng

Thành phần hương vị của bia có thể được chia thành bốn nhóm chính, đó là các thành phần
hương vị chính (chính), hương vị thứ cấp, hương vị thứ ba và hương vị nền. Ethanol, carbon
dioxide và đắng hoa bia (isohumulones) thuộc nhóm chính và việc loại bỏ chúng sẽ dẫn đến
sự thay đổi mạnh mẽ về hương vị của sản phẩm (Kosiv, Kharandiuk, Polyuzhyn, Palianytsia,
& Berezovska, 2017). Nồng độ của các hợp chất hương vị cơ bản thường vượt quá hai lần
ngưỡng nhạy cảm. Các hợp chất hương vị bia quan trọng như ethyl caprylate, isoamyl
acetate, ethyl acetate và rượu amyl thuộc nhóm thứ cấp; và nồng độ của chúng cao hơn
ngưỡng nhạy cảm 1,2 lần. Các thành phần hương liệu có nồng độ 0,1 –0,5 dưới ngưỡng nhạy
cảm thuộc nhóm bậc ba (ví dụ: phenylethyl acetate và acetoin). Các chất có nồng độ dưới
ngưỡng nhạy cảm trên 10 lần thuộc về thành phần nền (có hàng trăm thành phần khác nhau
thuộc nhóm này) và tạo nên mùi vị nền của bia. Tất cả các thành phần hương vị chịu trách
nhiệm về chất lượng cảm quan của sản phẩm và chúng hoạt động cùng nhau.

Sự hình thành mức độ tăng ethyl axetat và giảm mức độ rượu bậc cao đã được báo cáo [22,
63, 70] ở dịch lên men có nồng độ cao hơn. Bia được ủ ở VHG chứa hàm lượng diacetyl và
pentanedione cao hơn; hàm lượng dimethyl sulfide và acetaldehyde thấp hơn.

4.3. Cố định nấm men

Trong quá trình sản xuất bia VHG, sự hiện diện của các loại đường như glucose, maltose và
sucrose ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình keo tụ của nấm men. Tuy nhiên, nồng độ nitơ cao
hơn trong quá trình sản xuất bia VHG đã được chứng minh là cải thiện khả năng keo tụ của
các chủng nấm men.
Việc bao gói nấm men trong gel bảo vệ tế bào khỏi áp lực thẩm thấu trong điều kiện trọng
lực cao, dẫn đến tăng tốc độ lên men trong dịch nha có trọng lượng rất cao (VHG). Phương
pháp này nâng cao hiệu quả lên men so với tế bào nấm men tự do.

5. Công nghệ lên men VHG trong sản xuất ethanol

Quá trình lên men ethanol VHG đã được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường chứa
đường đơn giản (glucose, sucrose, v.v.) cũng như carbohydrate phức tạp (tinh bột, dextrin,
v.v.). Môi trường chứa glucose có hơn 300 g/l chất rắn hòa tan, cùng với các chất dinh dưỡng
khác như nitơ amin tự do, chiết xuất nấm men, sterol, v.v., thường được sử dụng cho quá
trình lên men VHG để nghiên cứu sản xuất ethanol. Quá trình lên men nhanh và nồng độ
ethanol cao có tầm quan trọng lớn trong ngành công nghiệp ethanol. Tối ưu hóa quy trình,
loại bỏ hoàn toàn các tổn thất đã biết về cơ chất hoặc ethanol cũng như hiện tượng chảy
đường, xảy ra khi áp lực lên men tăng do axit hữu cơ, ion và các sản phẩm cuối cùng có tính
ức chế khác, đã được đề xuất để đạt được hơn 90% hiệu suất ethanol theo lý thuyết [30].
Ngoài ra, nghiên cứu đã được tiến hành về sinh lý nấm men để hiểu quá trình gây ra mức độ
ức chế cao do ethanol gây ra đối với khả năng lên men và khả năng tồn tại của nấm men.

5.1. Cơ chất

Giá thành cơ chất lên men ảnh hưởng đáng kể đến tính kinh tế của việc sản xuất ethanol.
Trong công nghệ lên men VHG, ngoài việc giảm chi phí đầu tư, vận hành và giảm nhu cầu
năng lượng, việc sử dụng nguyên liệu hiệu quả về mặt chi phí còn có thể giảm chi phí và cải
thiện tính kinh tế của quá trình sản xuất ethanol. Một loạt các chất nền, cả vật liệu đường hóa
và tinh bột, đã được sử dụng để sản xuất etanol VHG. Gần đây, chất nền giá rẻ, cụ thể là
váng sữa phô mai có hàm lượng lactose cao, đã được sử dụng thành công mà không cần bổ
sung bất kỳ chất bổ sung nào cho quá trình lên men ethanol VHG bằng cách sử dụng
Kluyveromyces marxianus cố định [44].

Sắn là chất nền rẻ tiền và rất thích hợp cho quá trình lên men ethanol trong điều kiện VHG.
Cây sắn có thể được trồng và thu hoạch quanh năm, củ sắn là nguồn cung cấp tinh bột chất
lượng cao rất dồi dào. Sắn nghiền VHG (30-40% w/v chất khô) được chế biến bằng phương
pháp hóa lỏng tinh bột và sau đó là đường hóa, dẫn đến nồng độ đường khử tổng số lần lượt
là 29,0%, 96 31,64% và 37,15% w/v trong 30%, 35% và 40% nghiền tương ứng. Sau 72 giờ
lên men, nồng độ ethanol cuối cùng là 101,8 và 94,6 g/L thu được ở tỷ lệ nghiền 30% và
35%, tương ứng là 98 [36]. Nguyễn và cộng sự. [51] đã phát triển quy trình SSF để sản xuất
ethanol từ 99 loại bột sắn trong điều kiện VHG. Sau 72 giờ lên men, nồng độ etanol 100 đạt
được là 17,2% v/v tương ứng với 86,1% hiệu suất etanol lý thuyết, trong khi đó ở quy mô thí
điểm 101 nồng độ etanol là 16,5% v/v tương ứng với 83,6% hiệu suất lý thuyết.

5.2. Dịch lên men

5.2.1. Giảm thiểu độ nhớt dịch lên men

Mối lo ngại về độ nhớt cao của hỗn hợp nghiền trong quá trình lên men VHG đã được thảo
luận trước đó [6] và hầu hết các nghiên cứu đều khuyến nghị sử dụng các enzym làm giảm
độ nhớt, chẳng hạn như cellulase, hemiaellulase, xylanase, protease và β-glucanase, trong
quá trình chuẩn bị hỗn hợp nghiền. Một hỗn hợp các enzyme phân hủy thành tế bào, có
nguồn gốc từ Aspergillus aculeatus, được sử dụng để giảm độ nhớt của sắn cho quá trình lên
men ethanol VHG [56]. Phức hợp đa enzyme, hỗn hợp glycosyl hydrolase, làm giảm độ nhớt
của rễ cây nghiền, phoi và bột giấy một cách hiệu quả. Phân tích proteomic cho thấy hỗn hợp
này chứa cellulase tác động nội và ngoại, hemicellulase và pectinase. Tiền xử lý cơ chất sắn
bằng enzyme (endoglucanase, FPase, xylanase, polygalacturonase, β-glucanase và
mannanase) ở 45°C, pH 139 ± 5,0 trong 2 giờ đã làm giảm độ nhớt xuống mức hoạt động
<500 mPa.s, tương đương đến độ nhớt cuối cùng là 3,0–51,3% so với mức ban đầu. VHG
SSF của dịch rễ cây nghiền (32% chất rắn ban đầu) sử dụng quy trình nhiệt thông thường
(hóa lỏng ở nhiệt độ cao) tạo ra ethanol 19,65% v/v, trong khi quy trình chưa nấu chín (VHG
SSF sử dụng amylase phân hủy tinh bột thô ở 32 °C trong 96 h) dẫn tới ethanol 17,54% v/v.
Kết quả chỉ ra rằng hiệu quả của quá trình và tính kinh tế trong sản xuất ethanol sinh học
VHG có thể được cải thiện bằng cách sử dụng hỗn hợp enzyme.

5.2.2. Dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời (SLSF)

Trong những năm gần đây, quy trình SLSF hay quy trình không nấu đã được giới thiệu để
tăng sản lượng ethanol và tiết kiệm năng lượng cũng như chi phí đầu tư [59, 60]. Chu-Ky và
cộng sự. [60] đã phát triển quy trình SLSF tại VHG về gạo tấm để sản xuất ethanol uống
được. Trong nghiên cứu này, hỗn hợp (311,5 g/L chất khô) của bột gạo (RF) và nước máy
được hóa lỏng, đường hóa và lên men đồng thời. Quá trình SLSF được tiến hành bằng cách
bổ sung enzyme thủy phân tinh bột thô có chứa hỗn hợp alpha-amylase và gluco-amylase
(Stargen 002 ở mức 991,8 GAU/kg RF), gluco-amylase (Amigase Mega L ở mức 0,035%
w/w), protease (Fermgen ở 600 SAPU/kg RF), men khô hoạt tính S. cerevisiae (Ethanol đỏ ở
3,5 × 107 173 tế bào/mL), KH2PO4 (4,8 mM) và urê (16,0 mM). Nồng độ ethanol 17,6% v/v
tương ứng với 86,3% sản lượng ethanol lý thuyết đạt được sau 120 giờ. Ở quy mô thí điểm
(25 L), hàm lượng etanol 17,0% v/v tương ứng với 83,2% sản lượng etanol lý thuyết đã đạt
được bằng quy trình SLSF-VHG. Ngoài ra, quy trình này còn tạo ra các loại ngũ cốc khô
được làm từ gạo nhờ chưng cất có hàm lượng protein thô (47,5%) và chất xơ (15,8%) cao.

5.2.3. Giải phóng tinh bột không áp lực

Việc giải phóng tinh bột khỏi chất nền tinh bột (thường bằng cách nấu) và hóa lỏng nó là
những bước tốn nhiều chi phí, ngoài chi phí nguyên liệu thô, trong quy trình sản xuất ethanol
tinh bột. Tuy nhiên, một công trình gần đây đã chỉ ra rằng tiêu thụ năng lượng có thể được
giảm bớt một cách hiệu quả bằng cách thay thế việc truyền nguyên liệu thô bằng xử lý cơ học
bằng các máy nghiền thích hợp, được gọi là giải phóng tinh bột không áp suất [61].

5.3. Dinh dưỡng cho nấm men

Việc bổ sung môi trường lên men VHG với các chất dinh dưỡng thích hợp đã được chứng
minh là có hiệu quả trong việc giảm bớt tác động bất lợi của áp suất thẩm thấu cao lên tế bào
nấm men. Một số báo cáo trước đây cho thấy rằng, ví dụ, việc bổ sung các ion amoni, urê,
chiết xuất nấm men, bột đậu nành, bột hạt có dầu và các chất bổ sung khác sẽ cải thiện khả
năng sống của tế bào, tốc độ tăng trưởng của nấm men và tốc độ sản xuất ethanol trong môi
trường lên men VHG bằng cách tăng nitơ amin tự do và/ hoặc nồng độ axit béo. Chiết xuất
nấm men và men khô đã qua sử dụng được sử dụng làm chất bổ sung nitơ trong sản xuất
ethanol từ nước ép lúa miến ngọt trong điều kiện VHG (~280 g/L tổng lượng đường) [41].
Việc bổ sung nitơ và các nguyên tố vi lượng (Zn2+, Mg2+ và Mn2+) cùng với việc cung cấp
sục khí là cần thiết để nâng cao hiệu quả sản xuất ethanol.

Các chất bổ sung dinh dưỡng như ergosterol, axit oleic và các axit béo khác, dầu thực vật,
sữa bột gầy, chitin, polysaccharides và bổ sung sợi nấm đã được chứng minh là có lợi cho
nấm men lên men [61], và tác dụng thúc đẩy tăng trưởng của chúng đã được xác định rõ.

Tác dụng của chất bảo vệ thẩm thấu bao gồm proline, glycine betaine, glycine, tryptone,
adenine-uracil-cytosine, ammo nium, muối canxi và magiê đã được thử nghiệm trong điều
kiện HG [74]. Năng suất ethanol có thể được tăng cường bằng cách bổ sung cơ chất phản
ứng giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp ethanol ở nấm men là acetaldehyde.

5.4. Cố định nấm men

Trong điều kiện VHG, các chủng kháng etanol là điều kiện tiên quyết để sản xuất etanol hiệu
quả hơn nhằm khắc phục tình trạng lên men bị tắc do nồng độ etanol cao ở cuối quá trình lên
men [24]. Ở dạng keo tụ, các tế bào nấm men có thể được cố định và giữ lại trong các thiết bị
lên men để có mật độ tế bào cao nhằm cải thiện năng suất ethanol [28]. Các khối nấm men có
thể thể hiện khả năng chịu đựng ethanol được cải thiện, do sự thay đổi hình thái do quá trình
keo tụ gây ra ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của màng tế bào nấm men và chuyển hóa nội
bào [27, 29].

Trong điều kiện VHG, S. cerevisiae ban đầu gặp phải áp lực thẩm thấu dẫn đến giai đoạn trễ
kéo dài [73]. Tuy nhiên, so với nấm men không keo tụ, không quan sát thấy giai đoạn trễ đối
với sự phát triển và lên men ethanol của nấm men keo tụ trong điều kiện VHG [24].

6. Ứng dụng của công nghệ lên men nồng đô chất khô cao