ENZIMOLÓGIAI ELŐADÁSOK VÁZLATA

1. Termodinamikai és reakciókinetikai ismétlés

2. Enzimológiai alapfogalmak, osztályozás, enzimaktivitás, pH,
hőmérséklet hatása
3. Enzimkinetika - Michaelis-Menten egyenlet és linearizált formái
4. Enzimgátlások
a. reverzibilis gátlások kinetikája (kompetitív, non-kompetitív,
unkompetitív, vegyes)
b. irreverzibilis gátlások
5. Alloszterikus szabályozás - kinetika, feedback
6. Egyéb regulációs lehetőségek
7. Izoenzimek, összetett enzimek
8. Néhány enzim hatásmechanizmusa - lizozim, Ser-proteázok, RNáz
9. Enzimreakciók osztályozása és nomenklaturája
10. Enzimek és sztereokémia (királis-prokirális szubsztrátok, in-line
mechanizmus)
 Az enzimológia fizikai-kémiai alapjai - ismétlés

Kémiai folyamatok megvalósulásának lehetősége; termodinamikai

feltételek határozzák meg
∆ G = ∆H - T∆S;
∆G < 0 spontán →, ∆G = 0 egyensúly, ∆G > 0 nem megy (spontán ←)
A termodinamikai feltételeket katalizátorok nem befolyásolják

Termodinamikailag lehetséges kémiai folyamatok tényleges

megvalósulása; reakciókinetikai feltételelek határozzák meg

v = kcAacBbcDd…..cNn, A…N molekularitás, a….n rendűség, k

sebességi állandó Arrhenius görbe

Arrhenius egyenlet: k = A e-E/RT; 3,5

E = -2.3 R tg α, aktiválási energia; lg k 2,5

A katalizátorok csökkentik az aktiválási 1,5

energiát, ezzel gyorsítják a reakciót 0,5

0
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025
1/T
 ENZIMOLÓGIAI ALAPFOGALMAK I.

Enzimek: biokatalizátorok, fehérje természetűek (kivéve: ribozim)

Fogalmak: szubsztrát: az enzim által átalakított molekula
kofaktor: az enzim működéséhez szükséges, nem
fehérje természetű molekula
holoenzim: apoenzim (fehérje) + kofaktor
↑ Ó Ô
működő enzim koenzim prosztetikus csoport
specifitás: fajlagosság, az enzim csak egyes molekulá(k)ra
hat
izoenzim: azonos fajban található, azonos funkciójú, eltérő
szerkezetű és tulajdonságú enzimek
Enzimek osztályozása: a katalizált reakció szerint történik, osztályok,
alosztályok, al-alosztályok, individuális enzimek - valamennyinek
adott sorszáma van - enzim katalógus (E.C.) szám
Név: szubsztrát neve + katalizált reakció neve + -áz végződés
pl. tejsav dehidrogenáz
 ENZIMOLÓGIAI ALAPFOGALMAK II.

Enzimek osztályai: 1. Oxidoreduktázok (dehidrogenáz, oxigenáz stb.)

2. Transzferázok (transzamináz, transzketoláz stb.)
3. Hidrolázok (proteáz, lipáz, amiláz, nukleáz stb.)
4. Liázok (nem hidrolitikus bontó enzimek)
5. Izomerázok (mutáz, racemáz stb.)
6. Ligázok, szintetázok

Enzimaktivitás: az időegység alatt átalakított szubsztrát vagy keletkező

termék mennyisége (célszerű az utóbbit mérni !)
egységei: 1 Unit (U) = µmol/perc; 1 katal (kat) = 1 mól/sec (nagyon
nagy, a µkat, nkat nagyságrend használatos), utóbbi az SI egység.
Specifikus enzimaktivitás: az egységnyi tömegű fehérjére számított
enzimaktivitás, egységei: µmol/perc/mg fehérje, katal/kg fehérje
Molekuláris aktivitás (átviteli szám): optimális feltételek között 1 mól
enzimre vonatkoztatott keletkezett termék móljainak száma, egységei:
mól/mól fehérje; katal/mól enzim
 KÜLÖNBÖZŐ TÉNYEZŐK HATÁSA AZ ENZIMEK
AKTIVITÁSÁRA
Hőmérséklet hatása:
a hőmérséklet emelése egy darabig növeli a reakciósebességet, nő az
aktivált állapotú molekulák aránya; adott hőmérséklet felett a sebesség
meredeken csökken - enzimfehérje denaturálódik (nem haranggörbe !)
pH hatása: befolyásolja az aktivitáshoz szükséges ionizálható
csoportok disszociációját; elősegítheti gátlások azonosítását (pl. KI pH
függése, a pH hatása a szubsztrát ill. inhibitor kötések
összehasonlítására). A KM és Vmax azonos pH függése a kötő és
katalitikus hely egybeesésére utal.
Széles pH-optimum esetén a nem ionizálható csoportok fontosak. A
legtöbb enzim pH-optimuma 7-8 közötti, pepszin 1.5, argináz 9.7.
v optimum (37oC) v optimum

aktiválási
energia denaturáció
csökken

t pH
 ENZIMKINETIKA I.
k1 k2
Michaelis-Menten kinetika: E + S ES E+P
k-1

Egyszubsztrátos reakcióra dolgozták ki, feltétele a gyors egyensúly (rapid equilibrium)

továbbá a kezdeti sebesség (vo) mérése, amikor még a termék nem alakul szubsztráttá.

Vo = k2 [ES] [E][S] k-1 Ks [ES]

Ks = ——— = —— ; ebből [E] = —————
[ES] k1 [S]

Ks [ES]
[ET] = [E] + [ES] és ebből [ET] = ———— + [ES] ET = összes enzim
[S]

vo [ES] [ES] 1 Vm[S]

—— = —— = ————————— = —————— vo = ————
Vm [ET] Ks[ES] Ks Ks + [S]
———— + [ES] —— + 1
[S] [S] Klasszikus Michaelis-
egyenlet
 ENZIMKINETIKA II.

A klasszikus Michaelis-kinetika megvalósulási feltételei:

1. Stabil [ES]; 2. Ks disszociációs állandó legyen, vagyis k-1>>>k2;
3. [S] nem változik; 4. [EP] nem alakul ki; 5. k-2 = 0 ( E + P → ES);
6. A reakció egyszubsztrátos; 7. koncentrációkkal számolhatunk
aktivitások helyett

Stacionárius feltétel (steady-state) esetén Briggs-Haldane által

módosított Michaelis-Menten egyenlet, ekkor k2 ≈ k-1
d[ES]
kezdeti sebesség (P még nincs) : ——— = 0
dt
ekkor az enzim-szubsztrát komplex koncentrációja időben állandó
k1 [E] [S] = (k-1 + k2) [ES]
(k-1 + k2) [ES]
[E] = ——————— ; vo = k2 [ES]
k1 [S]
 ENZIMKINETIKA III.

(k-1 + k2) [ES] (k-1+k2+k1[ES]) [ES]

[ET] = [E] + [ES] = —————— + [ES] = —————————
k1 [S] k1 [S]

k1 [S] [ET]
[ES] = ————— ; Vmax = k2 [ET] (maximális reakciósebesség)
k-1+k2+k1[S]

k2k1 [S] [ET] k2 [S] [ET] Vmax [S] Michaelis

vo = —————— = —————— = ———— egyenlet
k-1+k2+k1[S] k-1+k2 KM + [S]
——— + [S]
k-1 + k2 k1
——— = KM KM = Ks : csak ha k-1>>>k 2 !!
k1 Ha k2>>>k-1 KM = Kk = k2/k1
Michaelis állandó van Slyke-féle kinetikus állandó
 ENZIMKINETIKA IV. A KM és a Vmax meghatározása
Michaelis-hiperbola
Michaelis-hiperbola A hiperbolából a KM és Vmax pontosan nem
8
87
határozható meg, ezért linearizálják a görbét.
76
65
v o vo

54
3
Linearizálási módszerek:
4
2
31 1. Kettős reciprok (Lineweaver-Burk)
20
1 0 2 4 6 8 10
0 [S]
1 KM + [S] KM 1 1
 =  =  *  + 
0 2 4 6 8 10
[S]
vo Vmax [S] Vmax [S] Vmax
2. Eadie-Hofstee
vo KM KM
voKM + vo[S] = Vmax[S] vo = -  + Vmax tg α = 
tg α = - KM [S] Vmax
3. Hanes
[S] KM [S]
 =  +  tg α = 1/Vmax
vo Vmax Vmax
 ENZIMKINETIKA V.
Kettős reciprok ábrázolás Eadie-Hofstee plot Hanes-féle ábrázolás
Lineáris (Kettős reciprok ábrázolás)
4,5 6
6 4
5
3,5
5
3 4
4

[S]/v o
2,5
3
1/v o

vo
3 2
1,5 2
2
1 1
1 0,5
0 0 0
-4 -2 0 2 4 6 0 1 2 3 4 5 6 7 -4 -2 0 2 4 6

1/[S] vo /[S] [S]

Több szubsztrát kötődésekor:

a. nem befolyásolják egymást - egyidejű kötődés
nS + E ESn E+ nP vo = Vmax [S]n / KM + [S]n
k2 Hill-egyenlet; ha vo=Vmax/2, [S]=KM1/n
- egymás utáni kötődés esetén: E + S ES ES + S ES2
ES2 E+2P azonos vagy eltérő szubsztrát esetén is ugyanaz
Vmax [S]2
vo = 
Ks2 + Ks [S] + [S]2
 ENZIMKINETIKA VI.

Több szubsztrát kötődése esetén

b. befolyásolják egymást
I. S1 gátolja S2 kötődését - látszólagos szubsztrátfelesleg-gátlás
II. S1 segíti S2 kötődését - látszólagos szubsztrátfelesleg-aktiválás

c. Allosztéria
Centrumonként csak egy szubsztrát kötődik, de ez befolyásolja a
másik centrumhoz kötődést n értéke tört szám, nH Hill-koefficiens
Ha nH = n, kölcsönhatásra utal fontos szabályozási lehetőség
[P]
A reakció időbeli lefolyásának egyensúly
vizsgálata reverzibilis reakciók
esetén: stacionárius
pre-stacionárius - µsec pre s.s
stacionárius - msec-sec.
t
 FEHÉRJE-LIGAND KAPCSOLATOK I.

Az enzim-szubsztrát/inhibitor kötődés analógiájára történnek, pl.

antigén-antitest, receptor-ligandum (pl. hormon)

Ábrázolások: Lineweaver-Burk KLOTZ-egyenlet

Eadie-Hofstee SCATCHARD-összefüggés

n Ka [S] ν = kötött ligandok relatív száma (0-1)

ν =  n =egy molekulán kötődő ligandok száma
[S] Ka +1 Ka = 1/Ks

ν + ν Ka[S] / [S] = n Ka

ν [S] ν n ν n ν
 +  =   =  -  = n Ka - ν Ka
Ks [S] [S] Ks [S] Ks Ks
 FEHÉRJE-LIGAND KAPCSOLATOK II.
7

6 nKa Feltételek:
1. n = 1 (egy kötőhely)
5

4
2. telítettség pontos meghatározása
/[S]

tg α = -Ka
3

2 3. kis szórások
1 n 4. több kötőhelynél: függetlenek
0
0 1 2 3 4 és egyenértékűek legyenek
ν

7
6 K1+K2
Két független kötőhely esetén:
5 r = összes receptoron kötött ligand
4
A = nem kötött ligand
r/A

3
2 K1, K2 = kötési folyamatok Ka értékei
1
K1 K2
0
0 1 2 3 4 R+B RB + B RB2
r