6/10/2024

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

Chương 9: Phương pháp tách sắc ký

c. Thời gian lưu tr và thời gian lưu hiệu chỉnh t’r
9.2. Những đại lượng cơ bản của phương pháp tách sắc ký
Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic
a. Hệ số phân bố KD và sự di chuyển các chất phân tích đạt giá trị cực đại.
As  Am chiều dài cột (cm) L L
trA = = = (1+k’A)
 A s vận tốc của A (cm/s) UA U
KD 
 A m tm =
L
là thời gian cấu tử không lưu giữ trên cột, còn gọi là thời gian chết.
U
[A]m: Nồng độ chất A trong pha động trA = tm (1 + k’A )
[A]s: Nồng độ chất A trong pha tĩnh
Thời gian lưu hiệu chỉnh: t’rA = trA - tm

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

47 50

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

b. Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất tan và KD

Số mmol A trong pha động

f=
Tổng số mmol A trong toàn cột

f: tỷ lệ thời gian trong pha động

 A m .Vm
f=
 A m .Vm +  A s .Vs
Vm, Vs: thể tích của pha động và pha tĩnh tương ứng.
Chia cả tử số và mẫu số cho [A]m.Vm

1 1
f= =
Vs 1 + k'
1 + KD.
Vm
Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

48 51

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

' V d. Thể tích lưu VR và thể tích lưu hiệu chỉnh V’R
(k = K D s , gọi là thừa số dung tích)
Vm
1 VRA = tRA.F
Vận tốc UA = U.f = U. (cm/s) VRA là thể tích lưu
1+k '
F là tốc độ chảy của pha động, ml/s
(k '  0 nên f  1 và U A  U) Vm = tm .F
Vm là thể tích trống của cột (bất kỳ thể tích nào trong cột mà
Nhận xét: Khi KD hoặc k' càng lớn thì thời gian chất tan ở pha không bị pha tĩnh chiếm sẽ bị pha động chiếm).
động càng ít, nói cách khác là chất tan di chuyển càng chậm. V’RA = VRA - Vm = tm (1+k’A ).F – Vm = Vm .k’A
= Vm . KDA . Vs /Vm = KDA .Vs
Vg = V’RA/VS = KDA
Vg là thể tích lưu riêng hay thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử
(thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích trong 1 đơn vị
thể tích hay trọng lượng của pha tĩnh)
V’RA = VRA – Vm = (tRA – tm)F = t’RA.F
Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

49 52

1
 6/10/2024

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

e. Hệ số tách α
9.3. Sự giãn rộng vùng mẫu, phương trình van Deemter
K k a. Lý thuyết đĩa
α= DA = A'
K DB k B' Đĩa lý thuyết và cách xác định số đĩa lý thuyết bằng TN
Vs Gọi n là số đĩa lý thuyết, σ là độ lệch chuẩn (đại lượng đặc trưng cho độ rộng
Mặt khác: t'RA =t m .K DA . của pic): T Đ
Vm σ n
V n
t'RB =t m .K DB . s Mặt khác, thời gian lưu tR ~ n nên:
Vm tR n t n +1
 hay n  ( R ) 2
t' V  n 
K DA = RA . m
t m Vs Thông thường chiều ngang W được đo bằng thực nghiệm và W = 4σ

t' V
K DB = RB . m 2 2
 t 
2
t m Vs  t  t 
n   R   16.  R   5,54.  R 
K DA t'RA k'A  W / 4  W
   W1/2 
 α= = =
K DB t'RB k'B
Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

53 56

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

g. Pic sắc ký (sắc đồ) Chiều cao đĩa lý thuyết H

Diện tích nằm dưới đường cong của A biểu thị tích phân L
H= (cm)
v2
n
Diện tích =  A dv = mmol A Gọi neff là số đĩa lý thuyết hiệu dụng:
2 2 2
v1
t2  t -t   t'   t .k' 
n eff =16  R m  =16.  R  =16.  m 
Diện tích =  Sdt.mmol=R
t1
A .mmolA  W  W  W 
2
tR t2 k'2  k' 
(S tín hiệu của detetor như hàm số của thời gian) tm =  n eff =16. R2 . =n.  
1+k' W 1+k' 2  k'+1 
RA: tín hiệu ứng với chất phân tích A (số của giấy đồ thị đối
với mỗi mmol của A). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng:
L
H eff =
n eff

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

54 57

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

b. Độ phân giải R
2  t RB -t RA 
R=
WA +WB

tRB – tRA = ΔtR (ΔZ) là sự chênh lệch về thời gian lưu (cũng có thể dùng
thể tích lưu ΔVR = VRB – VRA)

½(W A + W B) là tổng bán chiều rộng pic đo bằng giây hoặc ml

tR ~ n  tR
  ~ n hay R ~ n
W ( ) ~ n  W

Nhận xét: Phương pháp tăng độ phân giải sẽ đơn giản là dùng
W: độ rộng đáy pic cột dài hơn.
W 1/2: độ rộng đáy pic đo ở nửa độ cao

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

55 58

2
 6/10/2024

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

b. Độ phân giải R c. Lý thuyết động học

R=1: Hai cấu tử A và B tách khỏi nhau đạt 95% H = H1 + H2 + H3

R=1,5: Hai cấu tử A và B tách khỏi nhau đạt 99,8% - H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho độ đồng
Giá trị R=1,5 thì gọi là độ phân giải đường nền. đều cả hạt nhồi, đường kính hạt nhồi, khả năng nạp cột.
K D ,2  K D ,1 H1 =2λ.d p
Nếu tính theo hệ số phân bố thì R ~ , trong đó KD,2 > KD,1
K D ,2 λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt nó có giá trị bằng 1,5
dp là đường kính hạt nhồi (cm)
Như vậy, R phụ thuộc vào độ chênh lệch tương đối giữa hai hệ số
phân bố. - H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc.
H2 = B/U
B = 2γ.Dm là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất tan
trong pha động và hệ số đường đi của nó.
H2 = 2γ.Dm /U

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

59 62

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

- H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng.
H3 = (Cs + Cm).U
Trong đó:
+ k.d 2f
Cs =
Ds
k: hệ số
Ds: hệ số khuếch tán của chất tan trong pha tĩnh (cm2s-1)
df : chiều dày pha tĩnh (cm)

β.d 2p
+ Cm =
Dm
β: hệ số thực nghiệm, có giá trị từ 0,5 – 1
Dm: hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động (cm2s-1)

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

60 63

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

Thí dụ 1:
Hai chất tan A và B được tách bằng sắc ký với các thông số sau: Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là:
chiều dài cột L= 3.2m, tRA = 280s, tRB = 300s, wA = 15s, wB = 14s, tm =  K.d 2f
2γ.D m d 2
10s. Tính: H = 2λd p + + +β. p  .U
U  D m 
1.Tính số đĩa lý thuyết, chiều cao đĩa lý thuyết  Ds
2.Tính số đĩa lý thuyết hiệu dụng, chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng Vậy, chiều cao tương đương của đĩa lý thuyết phụ thuộc
3.Tính độ phân giải R của phép tách sắc ký vận tốc dòng của pha động U được mô tả bằng phương
4.Tính độ phân giải nếu thay cột có chiều dài là 400cm. trình van Deemter.
B
H=A+ +C.U
U
A=H1
B=2.γ.Dm
C=Cs +C m

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

61 64

3
 6/10/2024

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

9.4. Phân tích bằng phương pháp tách sắc ký

b. Phân tích định lượng
Dựa vào đại lượng diện tích (S) hoặc chiều (H) cao pic sắc
ký:
H = k.Cxb hoặc S = k.Cxb
Trong đó:
k là hằng số của điều kiện thực nghiệm;
b- hằng số bản chất, 0 <b  1.
- Phương pháp ngoại chuẩn: đường chuẩn, thêm chuẩn, …
- Phương pháp nội chuẩn:
+ Để định lượng một cấu tử X cần phải chọn một chất chuẩn S
sao cho: pic của X và S tách rời nhau và gần nhau.
+ Tiến hành pha các hỗn hợp có tỷ lệ về lượng X và S biết trước

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

65 68

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

Xét cực tiểu của chiều cao đĩa lý thuyết: 9.4. Phân tích bằng phương pháp tách sắc ký
B b. Phân tích định lượng
H  A  C.U
U - Phương pháp nội chuẩn:
B B + Chạy sắc ký đo diện tích các pic, lập tỷ số diện tích tương ứng,
H ' (theoU )    C  0  U opt 
U2 C rồi lập đường chuẩn tương đối.
 H min  A  2 BC
Thí dụ 2: Một phép sắc ký sử dụng cột dài 36m, chạy đơn chất chuẩn ở
3 TN như sau:
TN U (cm/s) tR (s) W (s)
1 10 300 20
2 20 250 16
3 30 150 10
+ Sc/Ss và W c/W s tương ứng là tỷ lệ diện tích và tỷ lệ về lượng
Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết, chiều cao đĩa lý thuyết cho cột của cặp cấu tử cần xác định X và chuẩn nội S.
khi vận hành ở vận tốc tối ưu đó.
Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

66 69

Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH Bộ môn Hóa phân tích – Viện KTHH

9.4. Phân tích bằng phương pháp tách sắc ký
a. Phân tích định tính
Dựa vào đại lượng đặc trưng thời gian lưu giữ tRi của các
chất. tRi đặc trưng cho mỗi chất tan Xi trong một hệ pha xác
định.
Nguyên tắc:
- Chạy sắc ký và ghi sắc đồ của bộ mẫu chuẩn, xác định thời
gian lưu tRi của từng chất chuẩn.
- Sau đó chạy sắc ký của mẫu phân tích và xác định thời
gian lưu của từng pic sắc ký trong sắc ký đồ của mẫu phân
tích.
- So sánh thời gian lưu của các pic sắc ký có trong bộ mẫu
chuẩn với sắc ký đồ của mẫu phân tích. Nếu có bộ thư viện
chất chuẩn thì càng dễ dàng.
9.4. Phân tích bằng phương pháp tách sắc ký
c. Phân tích bán định lượng
Coi tổng diện tích của tất cả các pic sắc ký của các chất có
trong mẫu là 100 %:
Stot = S1 + S2 + …+ Sn = 100 %
Từ đó tính được % của các chất có trong mẫu phân tích.
Ưu điểm: nhanh và không cần có dãy mẫu chuẩn.
Hạn chế:
- Trong mẫu có những chất mà detector không phát hiện được.
- Đã coi giới hạn phát hiện LOD của các chất là như nhau.

Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017 Nguyễn Xuân Trường Phương pháp tách chiết 04/2017

67 70