บทปฏิบตั ิการที่ 1

เทคนิคพื้นฐานทางจุลชีววิทยา
อ.อภิญญา จันทรวัฒนะ

1. บทนํา
ในการเรียนวิชาทางจุลชีววิทยาสิ่งที่ขาดไมได คือ บทปฏิบัติการที่มีไวเพื่อใหไดรูหลักการและฝกหัด
เทคนิคพื้นฐานในการทําปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาอยางถูกวิธี เพราะงานทางจุลชีววิทยาตองการความสะอาด
และปลอดภัยเปนอยางสูง ดังนั้น การฝกเทคนิคพื้นฐาน เชน การแยกเชื้อบริสุทธิ์ (isolation of pure culture) และ
การถายเชื้อ (culture transfer) นอกจากจะฝกใหสามารถแยกเชื้อและถายเชื้อเปนแลว ยังมีวัตถุประสงคเพื่อให
รูจักการหลีกเลี่ยงไมใหเกิดการปนเปอน (contamination) ของเชื้ออื่นที่ไมตองการจากสภาพแวดลอมที่กําลังทํา
การทดลอง การทําปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาจึงมีจําเปนที่ตองใชอุปกรณหรือเครื่องมือบางอยางที่จําเพาะ เพื่อใช
ในการฆาเชื้อและการเลี้ยงเชื้อ ดังนั้นจึงตองทราบถึงหลักปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา และวิธีการใชงานเครื่องมือ
พื้นฐานทางจุลชีววิทยาอยางถูกตองและเครงครัด เพื่อความปลอดภัยของตัวเองและผูอื่น

2. เทคนิคที่ใชในการแยกเชื้อบริสุทธิ์

2.1 Spread-Plate Technique

ในแหลงธรรมชาตินั้นปกติเชือ้ แบคทีเรียจะเติบโตอยูรวมกันหลายๆสายพันธุ เพื่อการคัดแยกและ
จําแนกชนิดของแบคทีเรียแตละสายพันธุจ ะตองมีขั้นตอนการทําใหเชื้อบริสุทธิ์ (pure culture) โดยเทคนิคทีท่ ํา
ไดงายคือ spread plate technique ซึ่งเทคนิคนี้แบคทีเรียที่ถูกทําใหเจือจางใหมีจํานวนประมาณ 100-200 เซลล
หรือนอยกวาจะถูกนําไปวางตําแหนงตรงกลางของจานเพาะเชื้อ (petri dish/plate) แลวทําการเกลี่ยใหเชื้อ
กระจายทั่วดวยแทงแกวรูปตัว L หลังจากบมที่อุณหภูมิที่เหมาะสมและมีระยะเวลาเพียงพอ จะปรากฏโคโลนี
(colony) ของเชื้อแบคทีเรียขึน้ โดยแตละโคโลนีจะมีจํานวนแบคทีเรียอยูจํานวนมาก และแตละโคโลนีจะถือวา
มาจากแบคทีเรียสายพันธุเดียว ดังนั้นจะทําใหเกิดการแยกจุลินทรียอ อกมาเปนเชือ้ บริสุทธิ์ขึ้น เมื่อมองดวยตา
เปลาแบคทีเรียแตละสายพันธุโคโลนีจะมีลักษณะแตกตางกันดังแสดงในภาพที่ 1-1 นอกจากนั้นยังสามารถทํา
ใหเชื้อมีความบริสุทธิ์มากขึ้นโดยการนําโคโลนีที่ตองการไปเพาะเลีย้ งในจานเพาะเชือ้ ที่มีอาหารใหมดวย
เทคนิคที่เรียกวา Streak-Plate Technique

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 1

ภาพที่ 1-1 ลักษณะโคโลนีของแบคทีเรียทีเ่ จริญบนอาหารแข็งและคํา (Key word) ที่ใชในการอธิบายลักษณะ
โคโลนี
ที่มา: Prescott (2002)

2.2 Pour Plate Technique

เทคนิคการเพาะเชื้อแบบ pour-plate technique ก็เปนอีกวิธีการหนึ่งที่ใชในการแยกเชื้อใหบริสุทธิ์ได
เชนกัน โดยตัวอยางเริ่มตนจะถูกเจือจางใหมีความเขมขนหลายๆ ระดับดวยเทคนิค serial dilution เพื่อทําใหเชื้อ
ถูกเจือจางมากพอที่จะทําใหเกิดโคโลนีเดี่ยวๆ บนจานเพาะเชื้อ โดยนําตัวอยางที่มคี วามเขมขนทีเ่ หมาะสมเติม
ลงในจานเพาะเชื้อเปลาที่ผานการฆาเชื้อแลว แลวทําการเทอาหารวุนลง (Agar Medium) ไปในจานเพาะเชื้อ
(โดยอุณหภูมขิ องอาหารเพาะเชื้อประมาณ 48-50 องศาเซลเซียส ซึ่งจะไมทําใหเชือ้ แบคทีเรียและยีสตตายได)
ผสมอาหารและเชื้อใหเขากันและใหเกิดการกระจายอยางสม่ําเสมอดวยการหมุนจานเพาะเชื้อ เมือ่ วุนเกิดการ
แข็งตัว เซลลจลุ ินทรียจะถูกตรึงใหอยูด านในของอาหาร และจะเกิดโคโลนีเดี่ยวๆ ของเชื้อขึ้นมา

2.3 Streak-Plate Technique

การแยกเชื้ อ ให บ ริ สุ ท ธิ์ เ ป น เทคนิ ค พื้ น ฐานทางจุ ล ชี ว วิ ท ยาที่ มี ค วามสํ า คั ญ อย า งมาก เนื่ อ งจาก
สิ่งแวดลอมตางๆ เชน น้ํา อากาศ พื้นหองเรียน หรือแมแตรางกายของคนก็มีเชื้อจุลินทรียอยูหลายชนิดที่อาจ
ปนเปอนในหลอดเพาะเชื้อได หลักการของการแยกเชื้อใหบริสุทธิ์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ (culture medium) คือ
จะตองแยกเชื้อใหไดโคโลนีเดี่ยวๆ (single colony) จํานวนมาก จากนั้นจึงนําเชื้อที่เปนโคโลนีเดี่ยวไปศึกษา
รูปรางลักษณะ และคุณสมบัติตางๆ เพื่อใหทราบวาเปนเชื้อชนิดใด เทคนิคที่นิยมใชในการแยกเชื้อบริสุทธิ์คือ
วิธี cross streak plate ซึ่งทําไดโดยใชหวงเขี่ยเชื้อ (loop) แตะตัวอยางหรือสิ่งสงตรวจแลวลากหรือขีด (streak)
ลงบนจานเพาะเชื้อที่มีอาหารแข็ง (agar plate) อยูใหไดแนวระนาบติดตอกัน 4-5 เสน หลังจากเสร็จในระนาบ
แรกซึ่งมีเชื้อจุลินทรียอยูหนาแนนที่สุด ใหนําหวงเขี่ยเชื้อมาเผาไฟใหลวดที่ปลายรอนแดงเพื่อฆาเชื้อที่ติดให
หมด จากนั้นจึงขีดเชื้อจากสวนของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพียงหนึ่งครั้งแลวลากเปนระนาบที่สอง 4-5
521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 2
เสนติดกันโดยรอยขีดของเชื้อจะไมทับกับระนาบแรกอีก หลังจากนั้นก็ทําเชนเดียวกันกับระนาบที่สองจนครบ
ทั่วทั้งจานเพาะเชื้อซึ่งมีประมาณสี่ระนาบ (ภาพที่ 1-2) เมื่อไดเชื้อบริสุทธิ์แลวจะมีการศึกษาเชื้อตอไปในดาน
ตางๆ ซึ่งจะตองมีการถายเชื้อจากอาหารเดิมไปยังอาหารใหม หรือมีการเพาะเชื้อลงในอาหารเพื่อการทดสอบ
และการวิเคราะหตางๆ ดังนั้นการเรียนรูเทคนิคที่ถูกตองในการถายเชื้อจึงมีความสําคัญเปนอยางยิ่งซึ่งตองอาศัย
หลักการของ aseptic technique เพื่อปองกันการปนเปอนของเชื้อชนิดอื่นซึ่งจะทําใหผลการทดลองผิดพลาดได
อุปกรณพื้นฐานที่ใชในการถายเชื้อคือ หวงเขี่ยเชื้อ เข็มเขี่ยเชื้อ (needle) และตะเกียงอัลกอฮอลสําหรับใชฆาเชื้อ
โดยการเผา (incineration) การถายเชื้อจุลินทรียพวกแบคทีเรียและยีสตจะใชหวงเขี่ยเชื้อเปนสวนใหญ มีบางครั้ง
ที่ใชเข็มเขียเชื้อปลายตรง สวนเชื้อราที่เปนเสนสาย (filamentous fungi) มักจะใชเข็มเขี่ยปลายงอ

ภาพที่ 1-2 การแยกเชื้อดวยวิธี cross streak plate

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 3

3. วัตถุประสงค
1. เพื่อใหนักศึกษาเทคนิคพื้นฐานเกี่ยวกับทางจุลชีววิทยาไดแก การถายเชื้อที่ถูกตองดวยเทคนิคปลอด
เชื้อ (aseptic technique) การทํา serial dilution, Spread plate, Pour plate และ Streak plate
2. เพื่อใหนักศึกษาเรียนรูและเขาใจเกี่ยวกับขอควรระวังและความปลอดภัยในการการปฏิบัติงาน

4. วิธีการทดลอง

4.1 การเพาะเชื้อแบบ Spread Plate

การเจือจางแบบ 10 serial dilutions

1. ปเปต 1 ml ซัสเพนชันของเชื้อตั้งตน (100) มาใสหลอดที่มีน้ําเกลือ (0.9 % NaCl) ที่ฆาเชื้อแลว
ปริมาตร 9 ml ดวยเทคนิคปลอดเชื้อ เขยาใหเขากัน จะไดเปนซัสเพนชันของเชื้อที่ 10-1
2. ปเปตซัสเพนชันของเชื้อที่ได (10-1) 1 ml ใสหลอดที่มีน้ําเกลือ (0.9 % NaCl) ที่ฆาเชื้อแลว ปริมาตร 9
ml ดวยเทคนิคปลอดเชื้อ เขยาใหเขากัน จะไดเปนซัสเพนชันของเชื้อที่ 10-2
3. ปเปตซัสเพนชันของเชื้อที่ได (10-2) 1 ml ใสหลอดที่มีน้ําเกลือ (0.9 % NaCl) ที่ฆาเชื้อแลว ปริมาตร 9
ml ดวยเทคนิคปลอดเชื้อ เขยาใหเขากัน จะไดเปนซัสเพนชันของเชื้อที่ 10-3
4. นําไปทดลองตอในขั้นตอไป : การเพาะเชื้อแบบ Spread Plate และ Pour Plate

ภาพที่ 1-3 ขั้นตอนการทํา serial dilution

ที่มา: Prescott (2002)

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 4

 ขั้นตอนการ Spread plate
1. ระบุชื่อ-กุล นักศึกษา วันทีท่ ําการทดลองที่ดานลางของจานเพาะเชื้อ
2. ปเปตตัวอยางปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร ลงที่ตําแหนงตรงกลางจานเพาะเชื้อ
3. จุมแทงแกวรูปตัวแอล (spreader) ในแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 95 แลวเอียง spreader ที่ขอบของบีก
เกอรเพื่อแยกแอลกอฮอลสวนเกินออก
4. นําแทงแกวเกลี่ย spreader ที่ผานการจุมแอลกอฮอลไปเผาไฟจนแอลกอฮอลไหมหมด และปลอยให
spreader เย็น
5. นํา spreader เกลี่ยเชื้อใหทวั่ จานจานเพาะเชื้อ และระมัดระวังไมใหมือสัมผัสกับขอบดานในของจาน
เพาะเชื้อ
6. จุม spreader ในแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 95 และกําจัดแอลกอฮอลสวนเกินโดยใหแทงแกวสัมผัส
กับของบีกเกอร นําเผาไฟจนแอลกอฮอลไหมหมด ปลอยใหเย็น และนําไปเกลี่ยเชื้อแบคทีเรียจานในจานเพาะ
เชื้อที่เหลือ โดยขั้นตอนการ Spread plate แสดงไวในภาพที่ 1-4
7. กลับจานเพาะเชื้อใหดานที่มีอาหารเพาะเชื้ออยูด านบน แลวนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
นาน 24-48 ชั่วโมง
8. สังเกตลักษณะของโคโลนีที่ปรากฏ

ภาพที่ 1-4 ขั้นตอนเพาะเชื้อดวยเทคนิค spread plate technique

ที่มา: Prescott (2002)

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 5

 4.2 การเพาะเชื้อแบบ Pour Plate
1. เตรียมจานเพาะเชื้อ (เปลา) เขียนชื่อ-สกุล วันที่ทําการทดลองที่ดานลางของจานเพาะเชื้อ
2. เตรียมหลอดอาหาร NA ปริมาตร 15 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว
3. เตรียมปเปตขนาด 1 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว
4. ปเปตซัสเพนชันของเชื้อที่อัตราการเจือจาง 10-1 ปริมาตร 1.0 ml ปลอยลงในจานเพาะเชื้อดวยเทคนิค
ปลอดเชื้อ
5. เทอาหารจากหลอดอาหาร NA 15 ml ลงในจานเพาะเชื้อที่มีเชื้ออยูแลว
6. หมุนจานเพาะเชื้อเพื่อใหเชื้อและอาหารผสมเขากันดี รอจนอาหารกลายเปนวุนแข็งดีแลวจึงคว่ําจาน
เพาะเชื้อ แลวนําไปบมที่ 3737oC 24-48 ชั่วโมง ทําซ้ําโดยใชซัสเพนชันของเชื้อที่ 10-2 แทน โดยขั้นตอนการ
pour plate แสดงไวในภาพที่ 1-5

ภาพที่ 1-5 ขั้นตอนการเพาะเชื้อดวยเทคนิค pour plate

ที่มา: Prescott (2002)

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 6

 4.3 การทําใหเชื้อบริสุทธิ์ดวยเทคนิค Streak plate
1. ระบุชื่อ-กุล นักศึกษา วันทีท่ ําการทดลองที่ดานลางของจานเพาะเชื้อทีม่ ีอาหารเลี้ยงอยู
2. ใชลูบเขี่ยเชือ้ (Loop) เขี่ยเอาเชื้อออกจากหลอดที่มีเชือ้ ดวยเทคนิคปลอดเชื้อ (Aseptic technique) ดัง
แสดงในภาพที่ 1-6

ภาพที่ 1-6 การถายเชื้อดวยเทคนิคปลอดเชื้อ

ที่มา: Prescott (2002)
3. แลวทําการ Streak เชื้อที่อยูปลาย loop ลงบนจานเพาะเชื้อที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไดเตรียมไวแลว ดวย
ความระมัดระวัง ซึ่งมีขั้นตอนดังนี้

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 7

 3.1 เปดฝาจานเพาะเชื้อใหมชี องวางเพียงพอที่จะสอด loop เขาไปไดงาย ดังแสดงในภาพที่ 1-7 (ก) แลว
สอด Loop ที่มีเชื้อแบคทีเรียอยูทําการ streak ที่พื้นที่หมายเลข 1 โดยในระหวางการ streak จะตองไมทําใหผิว
ของอาหารแตก
3.2 เมื่อ streak ที่บริเวณพืน้ ทีห่ มายเลข 1 แลวใหนํา Loop ออกมาฆาเชื้อโดยการเผาไฟ หลังจากนัน้ ทํา
ให loop เย็นลงโดยการแตะที่ขอบของอาหารเลี้ยงเชื้อใกลๆ กับบริเวณหมายเลข 1
3.3 หมุนจานเพาะเชื้อใหอยูใ นตําแหนงที่เหมาะสมสําหรับการ streak บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 2 แลวทํา
การ cross streak โดยจุดเริ่มตนจะอยูที่บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 1 แลวทําการ Streak ที่บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 2 ดัง
ภาพที่ 1-7 (ข)
3.4 เมื่อ streak ที่บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 2 แลวใหนํา Loop ออกมาฆาเชื้อโดยการเผาไฟ หลังจากนัน้ ทํา
ให loop เย็นลงโดยการแตะที่ขอบของอาหารเลี้ยงเชื้อใกลๆ กับบริเวณหมายเลข 2
3.5 หมุนจานเพาะเชื้อใหอยูใ นตําแหนงที่เหมาะสมสําหรับการ streak บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 3 แลวทํา
การ cross streak โดยจุดเริ่มตนจะอยูที่บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 2 แลวทําการ Streak ที่บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 3 ดัง
ภาพที่ 1-7 (ข) ถาหากจําเปนสามารถทําการ streak ที่บริเวณพืน้ ที่หมายเลข 4 ได
3.6 กลับจานเพาะเชื้อแลวนําไปบมในตูบม เชื้อควบคุมอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24-48 ชั่วโมง
แลวสังเกตการเจริญของเชื้อ

(ก) (ข)

(ค) (ง)
ภาพที่ 1-7 ขั้นตอนการทําเชือ้ บริสุทธิ์ดวยเทคนิค Streak plate
ที่มา: Prescott (2002)

521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory 8