Bài 5 – ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIỂU KHI

1. Mục tiêu
Sau khi học và thực hành xong bài này, sinh viên có khả năng
- Hiểu được và áp dụng được các lý thuyết đã học vào trong quá trình kiểm tra chỉ tiêu Tổng số
vi sinh vật hiểu khi
- Thực hiện được thao tác kiểm tra Tổng số vi sinh vật hiều khi, chuẩn bị được môi trường,
mẫu vật cần kiểm.
2. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.1. Nguyên liệu
- Chà bông heo (1 hộp 200 gr)
- Thịt hộp (1 hộp)
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Dia petri
- Đên côn
- Que cây
- Kính hiển vi
- Ông dong, ống nghiệm
- Tủ cấy
2.3. Hóa chất
- Plate count agar (PCA)
3. Thực hiện thí nghiệm
3.1. Chuẩn bị môi trường
- Cân môi trường nuôi cấy (PCA agar) và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác định trong
bình cầu (hoặc bình tam giác). Dùng bông gòn bịt kín miệng bình.
- Đun nóng môi trường để hòa tan hoàn toàn các thành phần môi trường trong nước.
- Rửa sạch các đĩa petri, ống nghiệm và pipette.
- Thanh trùng dụng cụ, môi trường, dụng cụ thủy tỉnh, bình chứa mẫu pha loãng.
3.2. Chuẩn bị mẫu
- Cân 10 g mẫu từ các nguồn nguyên liệu (chà bông heo và thịt hộp).
- Cho mẫu đã cân vào bình cầu đựng 90 ml nước cất.
- Pha loãng mẫu: Dang 1 mi mẫu pha loãng lầu 1. Sang ông nghiệm chứa sự nước cất, ta được
đúng địch pha loãng lần 2. tiếp tục như vậy, ta sẽ được dung dịch pha loãng lần 3, lần 4, lần 5
3.3 thì nghiệm xác định Tổng số vị khuẩn hiểu khí

Trang số…..
Vì khuẩn hiểu khí là nhóm vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc
trong điều kiện có sự hiện diện của O2. Tổng số vi khuẩn hiểu khí hiện điện trong mẫu chỉ thị
mức độ vệ sinh của thực phẩm, hay mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản thực
phẩm, thời hạn bảo quản của sản phẩm, nguy cơ hư hỏng. Thường sử dụng phương pháp đếm
đĩa (Total plate count) để xác định chỉ tiêu này.
Nguyên tắc: Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường PCA tư một lượng mẫu xác định
trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tê bảo duy nhất
Dùng pipet vô trùng lấy 1 mủ mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa petri Rót vào mẫu khoảng
15 mL PCA. Nghiêng đĩa và lắc nhẹ xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, sao cho mẫu hòa đều
vào môi trường. Để yên, chờ môi trường đông lại, lật úp đĩa và đặt vào từ ẩm ở 30°C
Trong 48-72h
Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng và quy ra
lượng vi sinh tổng số trong 1 ml (hay 1 g) mẫu.

N= ∑
C
¿¿
Trong đó:
N: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu (CFU:
colony forming units);
C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong
khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc /đĩa);
ni : số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ I,
d i: hệ số pha loãng tương ứng:
v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
Giá trị trung bình nồng độ pha loãng và tổng lượng vi sinh có trong 1ml chà bông
Trong đó ta chọn ra những đĩa có độ pha loãng khác nhau có thể đếm được từ 25-250
khuẩn lạc, hệ số loãng của 3 hình bên dưới hình 1 là 10^0 , hình 2 là 10^-2,hình 3 là 10^-4

Hình 1 hình 2 hình 3

Trong 3 hình với 3 hệ số pha loãng khác nhau ta có thể đếm số khuẩn lạc trên từng đĩa như sau
Hình 1 có số lượng vượt quá 300 khuẩn lạc nên không đếm được
Hình 2 ta đếm được khoảng 240-250 khuẩn lạc
Hình 3 thì ta đếm được khoảng 50-60 khuẩn lạc
Với số liệu trên ta có thể tính tống sô khuẩn lạc trong 1ml dung dịch mẫu như sau với trung
bình hệ số phá loãng 10 là 245 và 10 55 đưa vào công thức

Trang số…..
Ta có
245+55
N= −2 −4 = 14851.5 (CFU/mL)
(2∗1∗10 + 2∗1∗10 )
Tương tự như vậy với mẫu thịt hộp
Ta cũng có 3 hình với hệ số pha loãng khác nhau
Hình 1 có hế số pha loãng 10 là , hình 2 có hế số pha loãng 10 là và hình 3 là 10

Ta lại thực hiện đếm khuẩn lạc của 3 đĩa trong hình trên và biết được
Hình 1 ta đếm đước khoảng 30-34 khuẩn lạc trên đĩa
Hình 2 không đếm được
Hình 3 đếm được khoảng từ 200-300 khuẩn lạc
Với số liệu đó ta có thể tính được trung bình pha loãng của 10 là 250 và 10 là 32, áp dụng vào
công thức
Ta có:
250+ 32
N= 2 4 = 13960.4 (CFU/mL)
(2∗1∗10 +2∗1∗10 )
4. Báo cáo kết quả
Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường theo thời gian?

Trang số…..
Nguyên Nồng độ Thời Môi trường và Hiện tượng
liệu pha loãng gian nhiệt độ

10^0 Ngày 1 PCA và ủ trong tủ Chưa xảy hiện tượng

ấm 30 độ C

10^0 Ngày 2 PCA và ủ trong tủ Bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc
ấm 30 độ C

10^0 Ngày 3 PCA và ủ trong tủ Sô lượng khuẩn lạc tăng thêm

ấm 30 độ C

10^0 Ngày 4 PCA và ủ trong tủ Số lượng vượt quá 300 khuẩn lạc
ấm 30 độ C không thể đếm được

10^-2 Ngày 1 PCA và ủ trong tủ Chưa xuất hiện khuẩn lạc

ấm 30 độ C

Chà bông 10^-2 Ngày 2 PCA và ủ trong tủ Xuát hiện các đốm khuẩn lạc
ấm 30 độ C

10^-2 Ngày 3 PCA và ủ trong tủ Vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh
ấm 30 độ C

10^-2 Ngày 4 PCA và ủ trong tủ Có nhiều đốm khuẩn lạc có thể

ấm 30 độ C đếm khoảng được từ 150-300

10^-4 Ngày 1 PCA và ủ trong tủ Chưa xuất hiện khuẩn lạc

ấm 30 độ C

10^-4 Ngày 2 PCA và ủ trong tủ Vi khuẩn bắt đầu phát triển

ấm 30 độ C

Trang số…..
 10^-4 Ngày 3 PCA và ủ trong tủ Có những đớm khuẩn li ti trên đĩa
ấm 30 độ C

10^-4 Ngày 4 PCA và ủ trong tủ Có thể đếm được trên từ 30-50

ấm 30 độ C khuẩn lạc trên đĩa

10^0 Ngày 1 PCA và ủ trong tủ Vi khuẩn bắt đầu phát triển

ấm 30 độ C

10^0 Ngày 2 PCA và ủ trong tủ xuất hiện khuẩn lạc

ấm 30 độ C

10^0 Ngày 3 PCA và ủ trong tủ Khuẩn lạc phủ kình bề mặt của đĩa
ấm 30 độ C petri

10^0 Ngày 4 PCA và ủ trong tủ Không dếm được số lượng khuẩn

ấm 30 độ C lạc

10^-2 Ngày 1 PCA và ủ trong tủ Không xảy ra hiện tượng

Thị hộp ấm 30 độ C

10^-2 Ngày 2 PCA và ủ trong tủ Vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh
ấm 30 độ C

10^-2 Ngày 3 PCA và ủ trong tủ Có nhiều nhóm khuản lạc xuất

ấm 30 độ C hiện

10^-2 Ngày 4 PCA và ủ trong tủ Có thể đếm được tương tự mẫu chà
ấm 30 độ C bông

10^-4 Ngày 1 PCA và ủ trong tủ Vi khuẩn bắt đầu phát triển

ấm 30 độ C

Trang số…..
 10^-4 Ngày 2 PCA và ủ trong tủ Có những đốm li ti trên đĩa
ấm 30 độ C

10^-4 Ngày 3 PCA và ủ trong tủ Có những nhóm khuẩn lạc trên đĩa
ấm 30 độ C

10^-4 Ngày 4 PCA và ủ trong tủ Có thể đếm được

ấm 30 độ C

Câu 2 xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trên mẫu đã phân tích
Với mẫu chuẩn ta có thể xác định được mẫu này gần như không xuát hiện khuẩn lạc chỉ xuất
hiện khuẩn lạc khi ta đỗ môi trường không đúng cách
Ngày 0 :bất đầu cho vào tủ ử chưa có khuẩn lạc
Ngày 4 vẫn không xuất hiện khuẩn lạc

Với các mẫu của thịt hộp với nồng độ pha loãng khác nhau ta có thể thấy được sự trênh lệch rõ
rõ rãng qua mật độ khuẩn lạc có trên đĩa qua 4 ngày

Mẫu pha loãng 10^0 Mẫu pha loãng 10^-2 Mẫu pha loãng 10^-4
Ngày 0 bất đầu cho vào tủ ử chưa có khuẩn lạc

Trang số…..
Ngày 4 đã có nhiều khuẩn lạc trên đĩa nhiều nhất là mẫu pha loãng 10^0

Tương tự với mẫu thịt hộp cũng có 3 nồng độ pha loãng

Ngày 0 bất đầu đưa vào tủ ủ chưa có hiện tượng

10^0 10^-2 10^-4

Ngày 4 tương tự như mẫu thịt hộp sau 4 ngày lượng xuật hiên trên mặt đĩa với mật độ từ nhiều
đến rất nhiều tùy theo độ pha loãng của mẫu

Trang số…..