DIAGN. LAB.

, 1978, XIV, nr 5

JERZY MARUCHIN, JANUSZ OLESINSKI

ZASTOSOWANIE SPEKTROFOTOFLUORYMETRII
DO OZNACZEŃ KATECHOLAMIN W MOCZU

Ż Zakładu Biochemii, Centrum Medycznego

Kształcenia Podyplomowego w Warszawie

Przedstawiono fluorymetryczną metodę oznaczania noradrenaliny

i adrenaliny jako trójhydroksyindolowych fluoroforów, izolowanych
2 moczu na kolumnach z Amberlitem CG 50. Opisano technikę pomia-
rów intensywności fluorescencji dwóch fluoroforów. Przedstawiono. spo-
sób wyznaczania i obliczania współczynników: m, Na, l, da i wzory na
obliczenie siężeń obu amin katecholowych.

Istnieje obszerna literatura dotycząca metod oznaczania amin katecho-

lowych w moczu (1,3,5, 7,8,9,10). Technika pomiarowa została bardzo
udoskonalona w ostatnim dziesięcioleciu. Celem tej pracy jest omówienie
metody izolowania amin katecholowych z moczu przy pomocy chroma-
tografii kolumnowej z żywicą Amberlit CG 50, oraz techniki pomia-
rów fluorescencji przy użyciu spektrofotofluorymetru Aminco-Bowman,
w dwóch różnych długościach fali, ale w jednym pH moczu. Podano też
spcsób obliczenia stężeń noradrenaliny i adrenaliny w jednej próbce mo-
czu, na podstawie pomiaru intensywności fluorescencji fluoroforów, po-
wstałych z utleniania obu katecholamin.
Przedstawioną tu metodę można bezpośrednio zastosować do innych
typów spektrofotofluorymetrów.

METODY

Utlenianie amin katecholowych do trójhydroksyindolu — reakcja THI.

Izolacja adrenaliny i noradrenaliny z moczu w jednym pH polega na
adsorpcji na kolumnie wypełnionej żywicą jonowymienną Amberlit CG 50,
100-—200 mesh w buforze fosforanowym 0.5 M o pH 6.5. Elucję z ko-
lumny przeprowadza się roztworem H;BO; i utlenia się zawarte w elua-
tach aminy katecholowe do THI (6).
Reakcja utleniania amin katecholowych składa się z następujących
etapów:
utleniacz reduktor
Adrenalina К, Fe (CN) adrenochrom kwas askorbinowy
. > noradrenochrom >
Noradrenalina ZNSO4 NaOH

+ Musredace adrenolutyna
noradrenolutyna

Otrzymany eluat utleniany jest zelazicyjankiem potasu w obecnosci ka-

talizatora siarczanu cynku. Stężenie utleniacza jest 1 000 razy większe od
288 J. Maruchin, J. Olesiński Nr 5

stężenia katecholamin (jakość utleniacza kontroluje się obserwując

zmianę zabarwienia próbek badanych z bezbarwnej na żółtą). Proces
utleniania trwa 3 minuty, w badanej próbie równocześnie powstaje adre-
nochrom i noradrenochrom.
Reakcję utleniania należy prowadzić aż do powstania fluoroforów,
w tym celu dodaje się reduktor — zasadowy roztwór kwasu askorbinowe-
go w stosunku 2:1 do stężenia utleniacza (jakość reduktora sprawdza się
w ten sposób, że po dodaniu do utleniacza obserwuje się w ciągu dwóch
sekund odbarwienie żółtej próbki). W warunkach reakcji z noradreno-
chromu i adrenochromu kondensują się dwa fluorofory: adrenolutyna
1 noradrenolutyna, które stabilizują się w ciągu 15 minut. Powstałe
związki wykazują dwa maksima emisji fluorescencji w dwóch różnych
długościach fali 495 nm dla noradrenolutyny i 520 nm dla adrenolutyny.
Pomiaru fluorescencji należy dokonywać zawsze w ściśle określonym cza-
sie od rozpoczęcia reakcji THI (nie dłuższym niż 20 minut).
W pomieszczeniu, w którym przeprowadza się badanie należy utrzymać
stałą temperaturę i jednakowe oświetlenie stołu laboratoryjnego, unikając
bezpośredniego działania promieni słonecznych, ponieważ mogą pojawiać
się niespecyficzne fluoryzujące produkty, które powodują wzrost emisji
fluorescencji próby wzorcowej.
Moi a
tę.

PRZYGOTOWANIE SPEKTROFLUORYMETRU DO OZNACZEŃ

Jako światło wzbudzenia stosuje się lampę ksenonowo-rtęciową. In-
tensywność światła wzbudzenia reguluje się zmienną przesłoną. Dobór
odpowiedniej ilości przesłon w komorze pomiarowej, oraz ich wzajemne
ułożenie od szerokości szczeliny na wyjściu światła z monochromatora
wzbudzenia i wejściu na monochromator emisji, daje poprawny sygnał
na fotopowielaczu. Dobór przesłon światła przeprowadza się doświadczal-
nie, zwykle węższe szczeliny występują na drodze Światła wzbudzenia,
a dwukrotnie szersze na drodze światła emisji.
Dla uzyskania optymalnych warunków pomiaru należy odpowiednio
ustawić monochromatory wzbudzenia i emisji, to poprzez wyznaczenie
maksimum widm wzbudzenia i emisji fluorescencji dwóch fluoroforów.
Widma wzbudzenia i emisji fluorescencji fluoroforu adrenolutyny
i noradrenolutyny przedstawione są na ryc. la i lb.
| i
100 ZE 79 ain

„ | 90 }-

80|--
m|-
60 m

50|-- 436nm
40 |—
30|--
20|-
d- |
0 | | nm
400 900
Мг 5. Spektrofotofluorymetria katecholamin 289

100
436nm
90 |- ри 520nm
405nm Pań
80 р

70
60 |

40 |-

JU
10

! | | nm
400 500

b
Ryc. la,b. — Widma fluorescencyjne wzbudzenia i emisji noradrenaliny i adrena-
liny po reakcji trójhydroksyindolowej — THI. a. Widmo wzbudzenia fluoroforu nor-
adrenaliny wykazuje maksima w 360, 405, 436 nm. Widmo emisji fluorescencji
wykazuje maksimum w 495 nm. b. Widmo wzbudzenia fluoroforu adrenaliny wyka-
zuje maksimum w 360, 405 i 436 nm. Widmo emisji fluorescencji posiada maksimum
w 520 nm. Stężenie noradrenaliny lub adrenaliny przed reakcją THI wynosiło 200 ng
w 2,0 cm3 buforu fosforanowego 05 M o pH 6,5. Na podstawie widm wzbudzenia
i emisji ustalono ustawienie monochromatorów do oznaczania stężenia katecholamin
w jednej próbie moczu. Dla noradrenaliny wzbudzenie 405/495 nm emisji, dla adre-
naliny 436/520 nm. Widma wyznaczono na rejestratorze X—Y American Comp.,
sprzężonym z spektrofotofluorymetrem Aminco-Bowman z lampą ksenonowo-rtę-
ciową. ,

POMIAR FLUORESCENCJI

W 10 minucie od momentu rozpoczęcia rekacji THI uruchomić spektro-

fotofluorymetr: zapalić lampę, włączyć fotometr oraz wysokie napięcie
na fotopowielaczu. Po 10 minutach uzyskuje się stabilizację źródła światła
i „ciemnego prądu”. Po zakończeniu reakcji THI odczekać dalsze 15 mi-
nut. dla stabilizacji fluoroforów. W tym czasie wyskalować spektrofoto- | i
i
fluorymetr. Monochromator wzbudzania ustawić na 405 nm, natomiast }

* Fluorymetryczna metoda polega na wykorzystaniu wybranego zakresu zależ-

ności liniowej między stężeniem poszukiwanego związku a emisją fluorescencji
o stałej intensywności. Fluorymetria jest oparta na pomiarach względnej intesyw-
ności emisji światła, wypromieniowanego przez substancję znajdującą się w stanie
wzbudzenia. Tylko niewielka część emitowanego światła dochodzi do fotopowielacza.
Światło rozchodzi się we wszystkich kierunkach oraz ulega osłabieniu na drodze od
próbki badanej przez monochromator do fotopowielacza. Im mniej światła dochodzi
do fotopowielacza, tym więcej pojawia się niekorzystnych zjawisk, które powstają
przez wzmacnianie sygnału na fotometrze, są to tzw. szumy własne urządzeń elek-
tronicznych oraz utrata liniowości wskazań fotometru.
Pomiary fluorescencji są wartościami względnymi, uzyskanymi na podstawie po-
równania do znanych wzorców. Metoda porównawcza wymaga kalibracji i standa-
ryzacji wskazań spektrofotofluorymetru. Do tego celu stosuje się roztwór siarczanu
chininy w 0.1 N H»50O4. Roztwór ten nie ulega fotooksydacji, nie wykazuje zjawiska
samotłumienia emisji światła i w zakresie stężeń od 0.001 do 10.0 ug na cm* emituje
fluorescencję liniowo. Standaryzacja spektrofotofluorymetrów z lampą ksenonowo-
-rtęciową jest przeprowadzana przy wzbudzeniach od 260 do 450 nm, oraz emisji od
410 do 580 nm (4, 5).
290 J. Maruchin, J. Olesiński Nr 5

monochromator emisji na 495 nm (dotyczy noradrenaliny). Przed przy-

stąpieniem do pomiaru intensywności fluorescencji skontrolować usta-
wienie lampy wzbudzenia przy użyciu wzorcowego roztworu siarczanu
chininy w 0.1 N H,SO, (1.0 ug/cm*). Obracając śruby na cokole lampy
doprowadzić do najwyższego wychylenia wskazówki mikrofotometru
(maksymalna emisja światła, świadcząca o optymalnej czułości aparatu) *.
Następnie przy otwartym fotopowielaczu ustawić zero na mikrofotome-
trze względem wody destylowanej. Wyskalować mikrofotometr roztwo-
rem wzorcowym noradrenaliny w stężeniu 100 ug/cm'”, regulując stopień
wzmocnienia i dobierając odpowiednie szczeliny, tak, aby wskazania przy-

Tabela I. Przygotowanie standardów wewnętrznych amin katecholowych w moczu

Objętość roztworu Ilość Objętość Stężenie

Niumer | wzorcowego o stęże- dodanych roztworu katecholamin
probówiki | niu 2 wg/cm? katecholamin (cm3) a (ug/100 cm’)
dodana do próbki (ug) |

0 — — 20,0 x
I 0,125 0,25 20,0 x + 5,0
II 0,25 | 0,50 20,0 x + 10,0
III 0,50 1,00 20,0 х + 20,0
ТУ 0,75 1,50 20,0 x + 30,0
У 1,0 2,00 20,0 x + 40,0
VI 1,25 2,50 20,0 x -+ 50,0

a Zebrać 24 godzinny mocz z 15,0 cm HCI 6 N, przesączyć około 50 cm moczu

i odpipetować 35,0 cm3 przesączu, dodać 95,0 cm? roztworu EDTA 0,5%, doprowadzić
pH tego roztworu do 6,5 przy pomocy 0,5 N NaOH.
x Stężenie adrenaliny i noradrenaliny w 100 cm* badanego moczu.

Tabela II. Wyniki pomiarów intensywności fluorescencji roztworów moczu

z różnymi stężeniami standardów wewnętrznych noradrenaliny

Względna intensywność fluorescencji w układach: I 405/495 nm a

II 436/520 nm — a
Numer Próh | | Różnica |
pro- badana i Prébka kontrolna .--.... - . =. - Те. | Ie
bówki | | | ee 1—2
LŚ la—2a
| EEE. | |
|
1 | la 2 2a 3 3a | 4 4a
| | | | | i
0 12,8 7,2 4,3 2,05 8,77 5,15 — —
I 19,8 10,4 4.05 2,05 15,75 8,35 6,98 3,20
II 24.8 14,6 3,92 2,65 20,88 11,99 12,11 6,80
III 38,2 21,6 3,95 1,93 34,25 19,67 25,48 14,52
IV 49,3 27,5 4,26 2,00 45,04 25,5 36,27 20,35
У 66,5 37,5 4,65 2,75 41,85 34,75 53,08 29,60
VI 18,2 442 4,55 2,23 13.65 41,97 64,88 36,87

Objaśnienie: Rubryki oznaczone literą „a” dotyczą pomiarów fluorescencji w ukła-

dzie II 436/520 nm.
Rubryka 4, 4a — skorygowane względne intensywności fluorescencji
standardów wewnętrznych (pomniejszone o względną intensywność
fluorescencji próbki zerowej „0”).
Ip — względna intensywność fluorescencji siarczanu chininy w stę-
żeniu 1,0 ug/cm3 w 0,1 n HeSO, = 15, mierzona w I 405/495 nm.
Ip; — jak wyżej = 4, mierzona w II 436/520 nm.
Nr 9 Spektrofotofluorymetria katecholamin 291

rządu mieściły się w skali, np. 90 podziałek, przy najmniejszym stopniu

wzmocnienia. Zachowując te same warunki: wzmocnienia sprawdzić in-
tensywność fluorescencji wzorcowego roztworu chininy (zwykle 15 po-
działek na skali fotometru). Wg tej wartości ustawiano wskaźnik mikro-
fotometru podczas pomiarów wszystkich pozostałych roztworów. Pomiar
fluorescencji fluoroforów rozpoczynać od próbki o najmniejszym steze-
niu, stosując maksymalne wzmocnienie mikrofotometru. Należy pamiętać
o tłumieniu gwałtownych wychyleń wskazówki totometru. Intensywność
fluorescencji badanej próbki zapisywać jako wartość środkową pomiędzy
maksymalnym odchyleniem wskazówki fotometru w prawo i w lewo.
Następnie wykonywać pomiary próbek o coraz wyższych stężeniach nor-
adrenaliny obniżając w miarę potrzeby zakres wzmocnienia.

WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKÓW DLA OBLICZENIA STEZENIA

NORADRENALINY I ADRENALINY W MOCZU

Do próbek moczu dodać sześć wzorcowych roztworów noradrenaliny

lub adrenaliny o różnym stężeniu (standard wewnętrzny) wg schematu
roboczego przedstawionego w tabeli I.
Mocze z dodatkiem standardu wewnętrznego noradrenaliny (oraz mocz
bez dodatku) nanieść na siedem kolumn propylenowych, wypełnionych
zbuforowaną żywicą Amberlit CG 50 o pH 6,5 (wysokość kolumny 4,0 cm,
średnica 0,6 cm). Ustalić szybkość wycieku z kolumny na około 10 kro-
pel/min. Gdy warstwa płynu nad żywicą zmniejszy się do około 1 mm
przemyć kolumnę 10 ml wody. Zabieg powtórzyć, wycieki odrzucić.
Zaadsorbowaną na kolumnie noradrenalinę eluować 2/3 M kwasem bor-
nym w objętości 7,5 сп’. Szybkość wycieku eluatu 10 kropel/min. Ze-
brane eluaty uzupełnić wodą bidestylówaną do objętości 8,0 cm”. Do 14
probówek, oznaczonych jako próbki badane (0, I, II, III, IV, V, VI) i prób-
ki kontrolne (Ky, K,, K2, K;, Ky, Ks, Ke) rozlaé eluaty z siedmiu kolumn
(po 2,0 ml). Do każdej probówki z próbką badaną lub kontrolną dodać
następujące odczynniki: bufor fosforanowy 05 М РН 6,5 1,0 cm, 0,25%
roztwór siarczanu cynku 0,1 ml, 0,25%e roztwór żelazicyjanku potasu
0,1 cm? a następnie po 3 minutach dodać po 0,5 em? zasadowego roztworu
kwasu askorbinowego (20/0 kwas askorbinowy tr 5 N NaOH w stosunku
1:9).
Uwaga! W probówkach kontrolnych zasadowy roztwór kwasu askorbi-
nowego dodać przed dodaniem roztworu żelazicyjanku potasu. W ten
sposób hamuje się w próbie kontrolnej reakcję THI. Po przeprowadzeniu
reakcji THI w próbkach badanych wykonać pomiar intensywności fluo-
rescencji przy ustawieniu monochromatorow I — 405/495 nm, oraz przy
IJ ustawieniu 436/520 nm. Wyniki takich pomiarów, dla roztworów stan-
dardów wewnętrznych noradrenaliny, przedstawiono w tabeli IL.
Wykorzystując wartości I,, podane w tabeli II, uzyskane z monochro-
matorów 405/495 nm obliczono dane, z których sporządzono tabelę III,
dla wyznaczenia współczynnika n, dla noradrenaliny.
Podstawiając do wzoru sumy wartości podane pod tabelą III, obliczono
współczynnik n,, z którego wynika, że wzrost stężenia noradrenaliny
o 1,0 ug w 100 cm* moczu powoduje wzrost intensywności fluorescencji
o 1,2961 podziałki mikrofotometru, przy ustawieniu monochromatora I —
405/495 nm.
292 J. Maruchin, J. Olesiński Мг 5

Tabela III Obliczone wartości dla wyznaczenia współczynnika n

| dla noradrenaliny

ah У X x'y
Numer | stężenie
probówki noradrenaliny Ir 405/495 nm
|... |. _(wg/100 cm?) ma SEE
I 5,0 6,98 25,0 34,90
II 10,0 12,11 100,0 121,10
III 20,0 25,48 400,0 509,60
IV 30,0 36,27 900,0 1088,10
V 40,0 53,08 1600 0 2083,20
УТ 50,0 64,88 2500.0 3244,00

Suma wartości potrzebnych do obliczeń według wzoru poniżej:

хх = 155,0 Ży F 197,8 >). = 5525,0
Уху = 7080,9 (Xx)? = 24025,0
Wzór na obliczenie współczynników m, na, oraz a, az:

sg * Ży
—х.у — oes na

п, (я
a(x)"
n

mapę 55978 |
m= 8. 7080,9 — 5109,983 __1971,6007
5050 2425.0 5525,0 —- 4004,1666 1520,8334 1.2960
6
wo e * 5 men R

W identyczny sposób obliczono współczynnik n, dla noradrenaliny, wy-

korzystując wyniki z tabeli II (dane z części 2 — 436/520 nm). Wartość
współczynnika n, wynosi 0,7462 co oznacza, że przy wzroście stężenia
noradrenaliny o 1,0 ug na 100 cem* moczu przy ustawieniu monochroma-
torów II — 436/520 nm, intensywność fluorescencji wzrasta o 0,7462 po-
działki mikrofotometru.
W identyczny sposób wyznaczono współczynnik a, i a, dla adrenaliny,
stosując do obliczeń ten sam wzór matematyczny. Uzyskano wyniki: a, =
— 1,1465; а, = 1,4698. ,
Mając wyznaczone współczynniki n,, n, oraz a, i a, można przystąpić
do oznaczenia stężenia noradrenaliny i adrenaliny w jednej próbce moczu.

WYNIKI

W tabeli IV przedstawiono dane, obrazujące odzysk amin katecholo-

wych, dodanych do moczu i oznaczonych wg procedury wyżej opisanej.
Odzysk adrenaliny wynosi 113,40/0 a noradrenaliny 98,2%/. Zawyżone
wyniki dla adrenaliny powstają przy wspólnym oznaczaniu dwóch fluoro-
torów w jednym pH 6,5. Obliczony współczynnik korelacji dla adrenaliny
i noradrenaliny w mieszaninie roztworów wzorców wynosi 0,9848 dla nor-
adrenaliny i 0,9994 dla adrenaliny, co dowodzi wysokiej powtarzalności
metody (11).
Nr 5 Spektrofotofluorymetria katecholamin 293

Tabela IV. Odzysk adrenaliny i noradrenaliny dodanych do moczu w mieszaninie

wzorców w stosunku 10:1

|
|
o
Dodano "Jem?
(и5/спл?) 3 Znaleziono
(średnia
(ug/cm3)
. z 3 pomiarów)
. 0 /o |
odzysku
Numer | a |
próby |
Noradr. Adren. Noradr. | Adren. | Noradr. Adren.
| |

0 — — 0,0795 0,0017 — —
I 0,0861 0,0075 0,1642 0,0109 98,4 122,6
II 0,1906 0,0123 0,2614 0,0152 — 95,4 109,7
III 0,3095 0.0288 0,3911 0.0328 100,7 107.9

średnio: 98,2 113,4

a—b
0/9 odzysku = ‚ 100

gdzie: a — stężenie próbki wzbogaconej

b — stężenie próbki niewzbogaconej
c — ilość dodanego wzorca

OZNACZANIE NORADRENALINY I ADRENALINY W JEDNEJ PRÓBCE MOCZU

Około 50 cm* moczu ze zbiórki dobowej, zakwaszonej do pH 3,0, sączono

na bibule o porach średniej wielkości. Po przesączeniu pobierano 5,0 cm”
moczu, dodawano 14,0 cm* 0,1%/6 EDTA i doprowadzano do pH 6,5 1 N
NaOH. Otrzymany roztwór w całości nanoszono na kolumnę z Amberli-
tem CG 50. Nie dodawano standardów wewnętrznych. Adsorpcję, prze-
mywanie, elucję przeprowadzano tak, jak to opisano w części metodycz-
nej. Reakcję THI prowadzono w dwóch probówkach (próba właściwa
i odnośnik), do których dodawano eluat i odczynniki jak opisano wyżej.

Tabela V. Intensywność fluorescencji fluoroforów noradrenaliny i adrenaliny

w jednej próbie moczu określane w dwóch długościach fali

Objętość | Noradre- Adrena- Stężenie Stężenie

Roos AO eluatu po nalina lina adrenaliny | noradre-
reakcji THI Ir Те» (ug/100 m1) naliny
р
| 405/495 nm ,436—520 nm (wg/100 ml)

Badana 5,0 cm? pobrano 15,20 5,30 -—- —

2 cm?
z 8,0 cm
Kontrolna 5,0 cm? jak wyżej 3,20 2,50 — —
Różnica 12,00 2,80 — —
0,24 6,25

Pomiar intensywności fluorescencji wykonywano przy ustawieniu mo-

nochromatorów: 405/495 nm dla noradrenaliny i 436/520 nm dla adre-
naliny w obu probówkach. Otrzymane wartości Iy — intensywność
fluorescencji w 495 nm i I » — intensywność fluorescencji w 520 nm
przedstawiono w tabeli V.
 294 J. Maruchin, J. Olesiński Nr 5

stężenia amin katecholowych oblicza się na podstawie układu dwóch

równań z dwiema niewiadomymi, podanych przez Brujensa i Wy-
beng’a (2):

I, 405/495 = ax -|- ny
I", 436/520 = ax + ny
Po rozwiązaniu tych równań uzyskuje się wzory na obliczenie stężeń
adrenaliny (x) i noradrenaliny (y) w jednej próbie moczu.

Г’, 436/520 mJ" Ma .

а,

21. Г, 405/495 — I”, 436/520

У
—_
т.
a2 za rawie Е

а1
eee sw п, ee п.

ag
gdzie: x — stezenie adrenaliny w moczu (ug/100 cm?)
y — Stezenie noradrenaliny w moczu (ug/100 cm»)
I, 405/495 — intensywność fluorescencji przy ustawieniach mono-
chromatorów wzbudzania w 405 i emisji 495 nm
I, 436/520 — intensywność fluorescencji przy ustawieniach mono-
chromatorów wzbudzania w 436 i emisji 520 nm
ai, Nn, — współczynnik obliczeniowy dla adrenaliny i noradre-
naliny przy ustawieniu monochromatora 405/495 nm
Az, M — współczynnik obliczeniowy dla adrenaliny i noradre-
naliny przy ustawieniu monochromatora 436/520 nm
Podstawiając do wzoru wartości a, i a; Oraz ny, N» i Intensywność fluo-
rescencji Iy i I”; obliczono, że stężenie adrenaliny w badanym moczu
wynosi 0,24 ug/100 ml a stężenie noradrenaliny 6,25 ug/100 ml. Uzyskane
-. wartości są iloczynem mnożenia przez współczynniki wydajności procen-
towej, podane na poprzedniej stronie.
Norma zawartości wolnych katecholamin w moczu w naszej pracowni,
ustalona doświadczalnie, wynosiła u ludzi zdrowych dla noradrenaliny
od 0—105 ug/dobę, dla adrenaliny od 0—26 ug/dobę. Opisana metoda
oznaczania amin katecholowych w moczu dotyczy wolnej adrenaliny
i noradrenaliny z ominięciem procesu izolowania ich z połączeń podczas
kwaśnej hydrolizy.

Е. Марухин, Я. Олесиньски

ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРОФОТОФЛУОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

КАТЕХОЛАМИНОВ В МОЧЕ

Резюме

Представлен флуориметрический метод определения порадреналина и адре-

налина, как тригидроксииндоловых Ффторофоров, выделенных из мочи на ко-
лонках с Амберлитом СС 50. Описана техника измерений интенсивности флуо-
ресценции двух фторофоров на колонках с Амберлитом СС 50. Представлен
способ определения и подсчёта коэффициентов п:, п.. а, аз и Формулы для
определения концентрации обоих катехоламинов.
Nr 5 Spektrofotofluorymetria katecholamin 295

J. Maruchin, J. Olesinski

SPECTROFLUOROMETRY IN ASSAY OF URINARY CATECHOLAMINES

summary

A fluorimetric method for determination of noradrenaline and adrenaline as tri-

hydroxyindole fluorophores isolated from urine on Amberlite CG 50 columns is
reported. The technique of measuring the intensity of fluorescence of two fluoro-
phores is described. The methods of determination and calculation of mn, me, ai, ae
and formulas for calculation of concentrations of both catecholamines are presented.

PISMIENNICTWO

1. Barchos J., Erdelyi E., Angwin P.: Simultaneous Determination of Indole and
Catecholamines in Tissues Using a Weak Cation-Exchange Resin. Analytical
Biochemistry 50, 1—17, 1972.
2. Brunjes S., Wybenga D.: Differential fluorometry in catecholamine determina-
tion: a simplified metod of calculation. Clin. Chem. 9, 626, 1963.
3. Crout J.: Determination of catecholamine in urine. Standard Methods of Clinical
Chemistry Vol. 3 New York: Academic Press, 1961.
4. Elevitch F.: Fluorometric Techniques in Clinical Chemistry Little, Brown and
Company Boston USA, 1973.
5. Euler U., Lishajko F.: Improved technique for the fluorometric estimation of
catecholamines. Acta Physiol. Scand. 51, 348, 1961.
6. Jacobs S., Sobel C., Henry R.: Specificity of the trihydroxyindole method for
the determination of urinary catecholamines. J. Clin. Endocrinol. Metab. 21,
305, 1961. |
Januszewicz W., Wocial B.: O znaczeniu adrenaliny i noradrenaliny w moczu
=

metodą fluorymetryczną według modyfikacji Eulera i Floding'a. Endokrynol.

Pol. 9, 71, 1958.
8. Markowska L., Markiewicz L.: Fluorymetryczna metoda jednoczesnego oznacza-
nia adrenaliny, noradrenaliny i serotoniny w mózgu. CIOP — Centralny Instytut
Ochrony Pracy, Zeszyt 79, 1973.
9. Toshiharu N.: Biochemistry of Catecholamines University Park Press, 1973.
10. Underfiend S.: Fluorescence Assay in Biology and Medicine, Vol. II, Academic
Press, 1969, Appendix II.
11. Zgirski A., Gondko R.: Obliczenia biochemiczne. PWN, 1975.

Adres autora: Jerzy Maruchin, Zakład Biochemii CMKP, ul. Marymoncka 99,
01-813 Warszawa.