‫& ‪ Beijing Solarbio Science‬؛ شركة‪ Solarbio (D8930‬تم شراء ملح البوتاسيوم د ‪-‬لوسيفيرين من‬

‫يبلغ وقت امتصاص الدواء ‪ 15-10‬دقيقة‪ ،‬وال يمكن الكشف عن النشاط اإلشعاعي وبقاء ‪).‬بكين‪ ،‬الصين ‪Technology Limited،‬‬
‫الخلية‪ .‬قبل المالحظة‪ ،‬تم حقن ‪ 15‬مجم‪/‬مل من محلول البوتاسيوم لوسيفيرين في كل فأر داخل الصفاق بتركيز ‪ 10‬مجم‪/‬جم من كتلة‬
‫الجسم‪ .‬بعد ‪ 5‬دقائق‪ ،‬تم حقن الفئران بـ ‪ %1‬بنتوباربيتال صوديوم (‪ 50‬مجم‪/‬كجم) داخل الصفاق وفًقا لوزن الجسم‪ ،‬وتم مالحظة نمو‬
‫‪ Bruker‬؛ شركة‪ In-Vivo Xtreme (Xtreme BUX00081‬الورم من خالل التصوير الحيوي باستخدام نظام‬
‫‪).‬بيليريكا‪ ،‬ماساتشوستس‪ ،‬الواليات المتحدة األمريكية ‪Corporation،‬‬

‫اختبار التدفق الخلوي‬

‫‪ BD‬؛‪ (BD FACS Aria II‬تم إجراء تحليل خارج الجسم الحي لمجموعات مختلفة من الخاليا التائية باستخدام مقياس التدفق الخلوي‬
‫لدراسة الخاليا المناعية في الطحال واللمف‪ ،‬تم حصاد األنسجة ‪).‬سان خوسيه‪ ،‬كاليفورنيا‪ ،‬الواليات المتحدة األمريكية ‪Biosciences،‬‬
‫سان دييغو‪ BioLegend، ،‬الكتالوج‪100326 :‬؛( ‪ CD3-cy5.5‬من الفئران في مجموعات مختلفة وتم صبغها بأجسام مضادة لـ‬
‫( ‪ CD4-PE‬ومضادات ‪ BioLegend)،‬الكتالوج‪100712 :‬؛( ‪ CD8a-APC‬ومضادات ‪)،‬كاليفورنيا‪ ،‬الواليات المتحدة األمريكية‬
‫وفًقا لبروتوكوالت الشركة المصنعة‪ .‬باختصار‪ ،‬تم قطع األنسجة إلى قطع صغيرة ووضعها في )‪ BioLegend‬الكتالوج‪100408 :‬؛‬
‫متجانس زجاجي يحتوي على محلول ملحي فوسفاتي منظم (درجة الحموضة ‪ )7.4‬مع ‪ %2‬من مصل الجنين البقري المعطل بالحرارة‪.‬‬
‫ثم تم تحضير معلق خلية واحدة بالضغط اللطيف باستخدام المتجانس دون إضافة إنزيمات هضمية‪ .‬أخيًر ا‪ ،‬تم صبغ الخاليا بأجسام مضادة‬
‫لتحديد الخاليا ‪ُ Anti-CD45-FITC‬م وسومة بالفلورسنت بعد إزالة خاليا الدم الحمراء باستخدام ُم حلل خاليا الدم الحمراء‪ .‬تم استخدام‬
‫‪ CD3+CD4−CD8+‬والخاليا التائية المساعدة هي )‪ (CTLs‬التائية‪ .‬بناًء على هذه المجموعات‪ ،‬كانت الخاليا التائية السامة‬
‫‪ anti-CD45-‬على التوالي‪ .‬لتحليل الخاليا التائية القاتلة الطبيعية‪ ،‬تم صبغ الخاليا في اللمف بأجسام مضادة ‪CD3+CD4+CD8−‬و‬
‫‪anti-49b-‬و ‪ BioLegend)،‬الكتالوج‪100326 :‬؛( ‪anti-CD3-cy5.5‬و ‪ BioLegend)،‬الكتالوج‪103108 :‬؛( ‪FITC‬‬
‫كانت جميع الكواشف وأجهزة ‪ CD45+CD3−CD49b+.‬وفًقا للبروتوكوالت القياسية مثل )‪ BioLegend‬الكتالوج‪103516 :‬؛( ‪APC‬‬
‫تم تحضير معلق خلوي واحد من العقد الليمفاوية ‪ Biolegend (BD Biosciences).‬قياس التدفق الخلوي المستخدمة من‬
‫باستخدام نفس البروتوكول المستخدم في أنسجة الطحال‪ .‬تم تخفيف جميع األجسام المضادة المستخدمة في تجاربنا بمقدار ‪ 200‬ضعف‪ .‬تم‬
‫لمخططات التلوين المختلفة في الملف اإلضافي ‪ : 1‬البيانات األصلية ‪ ،1‬الملف اإلضافي ‪ FACS‬تقديم جميع استراتيجيات البوابة وبيانات‬
‫‪ : 2.‬البيانات األصلية ‪2‬‬

‫انزيم مرتبط المناعي فحص‬

‫‪ BMG LABTECH،‬؛‪ (SpectroNano S/N 601-1175‬المواد الكيميائية واألجهزة الرئيسية‪ :‬تم شراء طيف متعدد االستخدامات‬
‫‪ (PT512)،‬لدى الفئران )‪ (TNF-α‬لعامل نخر الورم ألفا )‪ (ELISA‬ومجموعة اختبار المناعة المرتبطة باإلنزيم ‪)،‬أوفنبرج‪ ،‬ألمانيا‬
‫ومجموعة اختبار المناعة المرتبطة ‪ (PI508)،‬لدى الفئران )‪ (IFN-γ‬ومجموعة اختبار المناعة المرتبطة باإلنزيم إلنترفيرون جاما‬
‫‪ Beyotime‬من شركة )‪ BCA (P0012‬ومجموعة اختبار البروتين ‪ (PI326)،‬لدى الفئران )‪ (IL-6‬باإلنزيم إلنترلوكين ‪6‬‬
‫تم طحن أنسجة الطحال لدى الفئران ‪(Shanghai BiYunTian Biotechnology Co. Ltd., Shanghai China).‬‬
‫تم جمع الدم من مقلة عين ‪ IFN-γ.‬من ثالث مجموعات بعد العالج‪ ،‬ثم تم استخدام اختبار المناعة المرتبطة باإلنزيم لقياس مستويات‬
‫الفئران ونقله إلى أنبوب مضاد للتخثر‪ .‬بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين‪ ،‬تم طرد الدم بسرعة ‪ 1000‬جم لمدة ‪20‬‬
‫‪.‬في المصل ‪ IL-6‬و ‪ TNF-α‬باستخدام العصارة الخلوية (المصل) لقياس مستويات ‪ ELISA‬دقيقة‪ ،‬وتم إجراء اختبار‬

‫معالجة العينات واستخراج الحمض النووي من البراز‬

‫تم جمع عينات البراز في الصباح وتخزينها عند درجة حرارة ‪ 80-‬درجة مئوية حتى استخالص الحمض النووي‪ .‬تم استخراج الحمض‬
‫‪)،‬ألمانيا ‪ QIAamp ® DNA Stool Mini Kit (Qiagen، Hilden،‬النووي الميكروبي من عينات البراز باستخدام مجموعة‬
‫‪S‬من جين ‪ V3–V4 16‬وفًق ا لبروتوكول الشركة المصنعة‪ .‬بعد التحديد الكمي‪ ،‬تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة‬
‫‪-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3).‬العكس‪-CCTACGGGNGGCWGCAG-3، 5 :‬األمام‪ (5 :‬الميكروبي باستخدام بادئات ‪rRNA‬‬
‫بعد الرحالن الكهربائي‪ ،‬تم تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هالم أجار بنسبة ‪ %1.2‬باستخدام مجموعة استخالص الجل‬
‫باستخدام )شنغهاي‪ ،‬الصين( ‪ Genesky Biotechnology, Inc.‬تم تسلسل المكتبات بواسطة ‪QIAquick (Qiagen).‬‬
‫‪ MiSeq Benchtop.‬جهاز تسلسل‬

‫تحليل المعلومات الحيوية‬

‫تم فرز التسلسالت الخام في عينات مختلفة ‪ Genesky Biotechnologies, Inc.‬تم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية بمساعدة‬
‫‪ CUTADAPT‬عن طريق مطابقة الباركود‪ .‬بعد ذلك‪ ،‬تم تقليم تسلسالت البادئات والباركود باستخدام‬
‫وتحليلها باستخدام ] ‪ FLASH [ 34‬تم دمج القراءات المعالجة باستخدام ‪(cutadapt.readthedocs.io/en/stable/#).‬‬
‫إلى ملف ‪ OTU‬لتحويل جدول ‪ MOTHUR‬تم استخدام ‪ (OTU).‬إلنشاء جدول وحدة تصنيف تشغيلية ] ‪ UPARSE [ 51‬خط أنابيب‬
‫عبر جميع عينات السماد من ‪ OTU‬إدخال مناسب لمزيد من تحليل ألفا وبيتا [ ‪ .] 53 ، 52‬تمت مقارنة المستويات النسبية لثراء‬
‫المرجحة لتحليل اإلحداثيات األساسية ‪ UniFrac‬خالل منحنى التخلخل‪ .‬لمقارنة االختالفات بين العينات المختلفة‪ ،‬تم حساب مسافات‬
‫وهي خوارزمية الكتشاف المؤشرات ‪ (LEfSe)،‬وحجم التأثير )‪ (LDA‬تم استخدام تحليل التمييز الخطي ‪(PCoA) [ 54 ، 55 ].‬‬
‫الحيوية عالية األبعاد‪ ،‬لتحديد العوامل المهيمنة المسؤولة عن االختالفات بين ثالث مجموعات [ ‪ .] 56‬وأخيًر ا‪ ،‬تم تصور خريطة حرارية‬
‫‪ R pheatmap.‬لمجتمع البكتيريا باستخدام حزمة‬

‫إحصائيات‬
‫‪ t‬واختبار )‪ (ANOVA‬وتم إجراء تحليل التباين أحادي االتجاه ‪ SPSS 23.0.‬تم إجراء التحليل اإلحصائي باستخدام برنامج‬ ‫للطالب‬
‫ذات داللة إحصائية ‪ p < 0.05‬إلجراء مقارنات بين المجموعات المتعددة‪ .‬وتم اعتبار القيمة‬