ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRƯỜNG HÓA VÀ KHOA HỌC SỰ SỐNG

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT SINH HỌC

Đề tài: Sản xuất enzyme Pectinase ứng dụng trong thực phẩm

Sinh viên thực hiện: Vũ Hồng Tuấn

Mã số sinh viên: 20201079

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Thành

Lớp: 739184

Mã học phần: BF4727

Hà Nội, tháng 7 năm 2024

 Lời nói đầu

Việt Nam là nước công nghiệp đang phát triển, đi đôi với xu hướng hội nhập nền kinh
tế quốc tế thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày càng phát triển. Kéo theo đó,
ngành công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm cũng từng bước được đầu tư, cải tiến nhằm
cung cấp các sản phẩm có nguồn gốc sinh học, an toàn đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng.

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống đã trở lên phổ biến, được nhiều người ưa
chuộng vì có tính an toàn, thân thiện, cũng như mang lại lợi ích khá lớn trong ngành sản xuất
thực phẩm.

Nguồn enzyme có thể thu nhận từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó, nguồn
enzyme từ vi sinh vật được nghiên cứu thu nhận rất nhiều vì tính đa dạng, phong phú, mang
lại lợi ích kinh tế và được ứng dụng rộng rãi.

Để hiểu hơn về nguồn enzyme thu nhận từ vi sinh vật, em thực hiện đề tài: “Quy
trình sản xuất chế phẩm enzyme pectinase”.

Vì thời gian hoàn thành không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn chế nên không
tránh khỏi những sai sót, em mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô để đồ án
chuyên ngành của em được hoàn thiện hơn.
 Phần 1: Tổng Quan

1. Đặt vấn đề

Ngày nay, chất lượng cuộc sống được nâng cao, nhu cầu ăn uống trong ngày cũng
được quan tâm nhiều hơn. Không chỉ ăn uống ngon mà còn phải đảm bảo đủ dinh dưỡng
cung cấp cho cơ thể.

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, thảm thực vật vô cùng phong phú. Vì vậy, các
loại cây ăn quả vô cùng đa dạng và phong phú, là nước xuất khẩu nông sản lớn. Các loại quả
xuất khẩu từ Việt Nam qua các nước khác như: chuối, táo ... Nhưng với sản lượng lớn do thu
hoạch đồng loạt nên vấn đề đặt ra là cần phải xử lý để giải quyết tình trạng ứ đọng, đồng thời
đảm bảo giá trị kinh tế, chất lượng dinh dưỡng trong sản phẩm và đảm bảo cung cấp thường
xuyên. Chính vì vậy các loại trái cây cần được chế biến thành các dạng sản phẩm khác nhau
để đa dạng hóa sản phẩm, tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau phục vụ nhu cầu người tiêu dùng
đang ngày càng cấp thiết.

Tuy nhiên, với một hàm lượng pectin khá cao trong thịt quả là nguyên nhân gây cản
trở cho một số công đoạn chế biến đạt hiệu quả thấp do: Sự có mặt của pectin tạo cho nước
quả có độ nhớt cao là nguyên nhân chính gây khó khăn cho quá trình sản xuất bột chuối (sản
phẩm chế biến từ chuối), pectin hoà tan có thể tạo các cấu tử bền khiến cho bột quả không tan
hoàn toàn khi được pha thành nước. Hay trong quá trình trích ly dịch táo để sản xuất rượu thì
các pectin hoà tan được giải phóng vào trong dịch quả, kết hợp với acid hữu cơ và đường tạo
gel gây khó khăn cho quá trình lọc, hàm lượng pectin trong táo sẽ gây đục cho sản phẩm
cider tạo thành ... Những yếu tố trên khiến cho quá trình sản xuất trở nên khó khăn, chi phí
sản xuất lớn, giảm lượng thu hồi, tất cả những yếu tố đó đã làm cho giá thành sản phẩm còn
cao nhưng chất lượng chưa đáp ứng yêu cầu, chưa được thị trường tiêu thụ chấp nhận.

Trong số các biện pháp kỹ thuật đang được sử dụng nhằm tăng chất lượng sản phẩm
từ trái cây thì phương pháp sử dụng enzyme được coi là một hướng rất có triển vọng của
công nghệ sinh học ứng dụng vào sản xuất nước quả, rượu vang và nước uống không cồn. Sử
dụng enzyme sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, trích ly được các chất màu, tanin và
những chất hoà tan khác một cách triệt để hơn. Bên cạnh đó, việc sử dụng enzyme đặc hiệu
cho quá trình loại bỏ pectin và các chất gây đục khác trong dịch quả sẽ góp phần giải quyết
được hiện tượng đục, nâng cao chất lượng và tính ổn định của sản phẩm. Mặt khác, phương
pháp này có ưu điểm vượt trội so với phương pháp lên men tự nhiên, phương pháp đánh nhớt
cơ học như thời gian lên men ngắn và có thể điều chỉnh được dựa vào điều chỉnh liều lượng
enzyme, giảm thiểu những tổn thương cơ học do tác dụng thiết bị đánh nhớt gây ra, giảm
thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trường từ nước thải chế biến, quy trình đơn giản dễ sử dụng

Từ các lý do trên cho thấy việc nghiên cứu ứng dụng enzyme pectinase vào quy trình
sản xuất rất có ý nghĩa thực tế, nó góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm, đa dạng hóa và
phát triển các sản phẩm từ trái cây. Xuất phát từ thực tiễn đó, em lựa chọn đề tài: “Quy trình
sản xuất chế phẩm enzyme pectinase”.

2. Enzyme Pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân cơ chất pectin, với sản phẩm tạo
thành là galacturonic acid, galactose, arabinose, methanol… Đây là một nhóm ezyme được
ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease. Enzyme Pectinase được sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp chế biến thực phẩm, lên men cotton, tách rời các sợi thực vật, xử lý nước thải,
lọc dầu thực vật, lên men trà và cà phê, tẩy trắng giấy ... Trong lĩnh vực chế biến trái cây,
pectinase được sử dụng nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất
lượng và có tác dụng làm trong dịch quả.
Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme này được dùng không giới hạn
trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Mặc dù pectinase có mặt nhiều
ở thực vật và vi sinh vật, nhưng trong sản xuất công nghiệp người ta thường dùng các loại
nấm mốc như: Aspergillus, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizopus stolonifer, ...
Trong số các loài nấm mốc thì Aspergillus luôn là lựa chọn hàng đầu với khả năng phát triển
nhanh trên nhiều loại cơ chất khác nhau, đặc biệt là trên các phế liệu nông nghiệp giàu pectin.
Mặt khác, hàng năm ngành công nghệ chế biến thực phẩm thải ra một lượng lớn các
loại phế phụ liệu giàu pectin như cùi, vỏ các loại củ quả, lợi dụng nguồn phế liệu này để ứng
dụng trong việc sản xuất pectinase ở quy mô công nghiệp đồng thời giảm thiểu lượng xác bã
thực vật thải ra gây ô nhiễm môi trường
3. Đặc điểm của enzyme pectinase
Có kích thước trung bình hay phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa. PME thu nhận từ
những nguồn khác nhau có điểm đẳng điện (pI) không gíng nhau. Điểm đẳng điện thay đổi từ
3,1 đối với một số enzyme được sinh tổng hợp từ nấm mốc đến giá trị pI là 11. Hầu hết
pectinase chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, một vài trường hợp có pI mang
tính acid.
Enzyme từ vi sinh vâth: tất cả các enzyme vi sinh vật không phải là protein kiềm.
Pectinase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid. Hoạt động
của pectinase sinh ra bởi Aspergillus niger đật tối đa ở pH 4,5, 40oC. Các Pectinase acid và
kiềm có thể đề methyl hóa có chất pectin theo cùng một kiểu. Pectinase kiềm làm hình thành
các pectin được đề ester hóa và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo ra
pectin bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium.

4. Cơ chế tác dụng

Vách tế bào thực vật có cấu trúc rất phức tạp quyết định kích thước, hình dạng, liên
quan đến sự tăng trưởng và phát triển của tế bào. Thành phần chủ yếu của vách tế bào là các
polysaccharides: cellulose, hemicelluloses và pectin, pectin chiếm khoảng 35% trọng lượng
khô của thành tế bào. Lớp pectin có vai trò là liên kết các tế bào với nhau, do đó khi sản xuất
nước dịch quả hàm lượng pectin cao sẽ làm nước dịch quả bị đục và rất nhớt gây ảnh hưởng
lớn đến quá trình sản xuất. Bổ sung enzyme vào khối thịt quả nghiền làm tăng hiệu suất thu
hồi dịch quả. Thêm vào đó, sự phân hủy một phẩn tế bào bởi enzyme tạo thuận lợi cho việc
tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cải thiện chất lượng cảm quan của dịch quả.
Enzyme Pectinase xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thườnng
tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester
hóa, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đӭng cҥnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành
acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinase thường đượcc họat hóa bởi các ion
Ca2+ và Mg2+ .

5. Nguồn thu nhận (bảng so sánh) để chọn nấm mốc A. Niger

6. Tại sao chọn ???
 Việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme đang rất được
quan tâm. Hiện có hơn 50% tổng lượng enzyme công nghiệp được sản xuất từ nấm men và
nấm mốc.
Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp pectinase chủ yếu là vi sinh vật hiếu khí, tiêu
biểu là các dòng sau:

+ Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam, p.cilrimim,

aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus, a.oryzae, a.wentii,
fusarium moniliforme,…

+ Nấm men: saccharomyces fragilis

+ Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella aerogenes…

Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác
của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác
phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. Người ta thường thu pectinase từ canh
trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc với ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh
trưởng và phát triển nhanh cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn. Trong đó Aspergillus
niger là chủng sinh enzyme pectinase nhiều.

7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất

7.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường.
a. Nguồn carbon.
Nguồn carbon là thành phần đóng vai trò đặc biệt trong sự phát triển của vi sinh vật.
Đối với quá trình sinh tổng hợp Pectinase, nguồn carbon giàu pectin có độ methoxyl hóa cao
và đơn phơn tử như acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác thường
được sử dụng. Các thành phҫn này không chỉ đóng vai trò đơn thuần là nguồn carbon cho sự
phát triển của vi sinh vật, mà còn là một cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp
Pectinase.
b. Nguồn nito.
Nito tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh
học khác của tế bào sinh vật. Môi trường có đủ lượng carbon và nito cần thiết sẽ tích lũy
lượng enzyme lớn nhất. Ngoài ra, do acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme,
acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như quá trình sinh tổng hợp
enzyme. Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng
lượng.
c. Nguồn cơ chất.
Đặc điểm chung của môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme pectinase là sự có
mặt chất cảm ứng.
d. Nguồn khoáng dinh dưỡng.
Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng đến sự sinh trửong và tổng hợp enzyme của
vi sinh vật. Phospho cần để tổng hợp các thành phần quan trọng của tế bào và nhiều
coenzyme. Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác.
Cation Mg2+ có ảnh hưởng dêdn độ bền nhiệt của enzyme. Lưu huỳnh có mặt trong các acid
amin quan trọng như methionine, cysteine, có vai trò tích cực trong việcc kích thích sự hình
thành enzyme. Ngoài ra, calcium, mangan, corban, ... cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp
enzyme.
7.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp sẽ đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển
của nấm mốc và làm giảm hoạt lực của enzyme. Nhiệt độ tốt nhất cho Aspergillus niger phát
triển và lên men là 30-40oC.
7.3 Ảnh hưởng của pH.
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trườnng có dung dịch đệm cao và
hàm ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong khoảng thời
gian nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường ủ có ảnh hưởng không nhỏ đến
sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Khi pH môi trường chuyển dịch về phía
acid hoặc kiềm, sự tako thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme lại
bị kìm hãm. Giá trị pH tối ưu trong quá trình lên men là 4,0
7.4. Thời gian nuôi.
Thời gian lên men ảnh hưởng đáng kể đến khả năng đáng kể đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme và hoạt tính của enzyme. Vi sinh vật cần thời gian để phát triển và sản sinh
enzyme. Nếu thời gian ủ quá dài môi trường sẽ cạn dần dinh dưỡng vi sinh vật phát triển kém
và do đó hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, ngoài ra việc tạo bào tử cũng sẽ làm giảm hoạt tính của
enzyme. Đối với Aspergillus niger quá trình sinh tổng hợp enzyme nhiều nhất thường kết
thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử.

8. Các phương pháp nuôi cấy

 Quá trình nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận Pectinase có thể được thực hiện
bằng hai phương pháp lên men khác nhau: lên men rắn (SSF) và lên men chìm (SmF).
Các nghiên cứu trước đã cho thấy enzyme thu được từ phương pháp SSF có hoạt tính
cao hơn so với phương pháp SmF khi nuôi cấy trên cùng loại vi sinh vật và cơ chất lên men,
hoạt tính trong phương pháp SSF cao hơn 2,3 lần so với SmF.

8.1.Phương pháp lên men chìm (SmF)

Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng dịch thể. Chủng vi sinh vật cấy vào môi
trường được phân tán khắp mọi điểm và xung quanh bề mặt tế bào đượcc tiếp xúc với dịch
dinh dưỡng. Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp oxy
bằng cách sục khí liên tục. Do hệ thống khuấy trộn tốt nên toàn bộ môi trường nuôi cấy là
một hệ thống nhất.
a. Ưu điểm
- Cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận lợi.
- Ít tốn kém mặt bằng, tiết kiệm diện tích sản xuất.
- Dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình sản xuất.
b. Nhược điểm
- Đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị.
- Cần phải khuấy và sục khí liên tục.
- Đòi hỏi trang bị kỹ thuật cao, dễ nhiễm trùng toàn bộ.
- Dễ hỏng cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn.
- Phế liệu phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi trường.
8.2 Phương pháp lên men bề mặt SSF
Phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên
bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thường, môi trường dạng rắn với nguyên liệu chính là bột
cám mì, bã củ cải, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác (amonium sulfate,
amonium chloride, amonium phosphate).

a. Ưu điểm
- Môi trường nuôi cấy đơn giản.
- Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường rắn hoặc bổ sung
thêm một số chất dinh dưỡng.
- Sản phẩm thu nhận có nồng độ cao, dễ dang tinh sạch.
- Sử dụng kết hợp các cơ chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, bào tử hoặc tế
bào.
 - Độ ẩm thấp và mật độ nấm mốc lớn nên hạn chế được sự lây nhiễm của nhiều
loại vi sinh vật khác.
- Lượng tạp chất sinh ra thấp hơn trong SmF.
- Enzyme ít nhạy cảm với các chất ức chế dị hóa hoặc cảm ứng.
- Trong điều kiện thiết bị đơn giản, không có thiết bị phản ứng sinh học, việc lên
men SSF là phương thức hiệu quả, dễ thực hiện, có tính khả thi cao.
- Việc cung cấp oxi cho vi sinh vật thuận tiện hơn, do hàm lượng oxi trong
không khí cao hơn nhiều so với hàm lượng oxi hòa tan trong dịch lên men,
diện tích tiếp xúc của vi sinh vật với không khí trong môi trường rắn cũng cao
hơn sự tiếp xúc của vi sinh vật với bọt khí trong môi trường lỏng.
- Có thể tạo được sản phẩm ở dạng rắn.
- Chi phí năng lượng thấp hơn.
- Vận hành quy trình lên men cũng đơn giản hơn, không đòi hỏi trình độ
chuyên môn cao.
b. Nhược điểm
- Các vi sinh vật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào cản về độ
ẩm môi trường.
- Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, oxi tự do, CO2 khó theo dõi và
khống chế hơn. Vì thế việc duy trì chế độ lên men tối ưu trong suốt thời gian
lên men là khó thực hiên.
- Sự đảo trộn khó, dẫn đến việc lên men khó được đồng nhất.
- Trong nhiều trường hợp, việc thu sản phẩm khó khăn hơn so với lên men
trong môi trường lỏng.

9. Lựa chọn phương pháp lên men.

- Trong phương pháp lên men bề mặt có 2 loại môi trường nuôi cấy , đó là môi trường
bán rắn và môi trường lỏng. Ở môi trường lỏng thì vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt dung
dịch lỏng nơi phân cắt giữa pha lỏng và pha khí. Khi đó các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành
những ván phủ kín bề mặt dung dịch lỏng. Enzyme sẽ được tổng hợp trong tế bào và thoát
khỏi tế bào vào trong dung dịch nuôi cấy. Do đó việc thu nhận enzyme thô trong dịch nuôi
cấy cũng rất đơn giản. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt lực
của enzyme thu nhận được không cao bằng nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Một mặt
phương pháp này vi sinh vật phát triển chủ yếu trên bề mặt nên hệ số sử dụng môi trường
nuôi cấy không cao. Vì vậy phương pháp này ít được dùng.

- Chính vì những lý do trên nên em chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi
trường bán rắn.
 Phần 2: Quy trình sản xuất
1. Quy trình sản xuất
2. Thuyết minh quy trình.

2.1 Nguyên liệu

Môi trường nuôi cấy: Là môi trường bán rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì,
cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường bán rắn thường
dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm
ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzyme. Có thể bổ sung
những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được
hàm lượng pectinase cao. Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường
thoáng khí tốt, giúp cho sự phát triển của nấm.

 Bột cám
- Chức năng: Là nguồn cung cấp dinh dưỡng chính để vi sinh vật sinh trưởng và phát triển.

- Cách tiến hành: Bột cám gạo được nghiền nát đạt kích thước cần thiết sau đó được
định lượng vào thiết bị phối trộn.
 Trấu
- Chúc năng: Bổ sung trấu với mục đích tạo độ tơi xốp và tránh nguyên liệu bị kết dính.
- Cách tiến hành: Trấu được đưa đi làm sạch, sau đó được chuyển đi định lượng và xả
xuống thiết bị trộn.
 Bã táo
- Chức năng: Là cơ chất cảm ứng tạo tổng hoepj enzyme pectin methylesterase. Bã táo
là nguồn cơ chất rất thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme Pectinase hoạt
tính thô thu được là 4,83 U/g.
- Cách tiến hành: Bã táo được nghiền đạt kích thước cần thiết sau đó được định lượng
vào thiết bị phối trộn.

2.2 Phối trộn

Môi trường nuôi cấy bề mặt của vi sinh vật tạo enzyme pectinase gồm có 62% là bột
cám. 25% trấu, nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng tổng hợp enzyme tương ứng là 5% cám mì
và 5% bã táo, bổ sung amonium sulfate và amonium chloride 1%, amonium phosphate 2%.
Nước làm ẩm, phục vụ trực tiếp cho thanh trùng, đảm bảo chế độ làm ẩm cho quá trình nuôi
cấy, độ ẩm tối ưu là 55% pH = 5,0. Nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát triển gây
tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh.

2.3 Thanh trùng

- Mục đích: Làm cho môi trường được tinh khiết về phương diện vi sinh vật.
- Cách tiến hành: Thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121 oC trong vòng 30p.

2.4 Làm nguội

- Làm nguội gần đến nhiệt độ nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thích hợp về mặt nhiệt độ
cho vi sinh vật phát triển. Đây cũng là giai đoạn kiểm tra và loại bỏ những thành phần nhão
hoặc khô so với yêu cầu.
- Cách tiến hành: Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội đến nhiệt độ khoảng
33- 34 oC. Yêu cầu thời gian thực hiện quá trình này phải ngắn để tránh bị nhiễm vi sinh vật
tạp.

2.5 Nhân giống sản xuất

- Sử dụng Aspergillus niger niger để nuôi cấy có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao.
Nấm được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh nhiễm tạp, được nhân theo
phương pháp bề mặt và cũng trên môi trường bán rắn để giống quen với điều kiện sản xuất.
Khi nhân giống thường để cho nấm mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu
theo phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín. Tỉ lệ nhân
giống vào khoảng 0,2 – 2%.
- Giống trong ống nghiệm được giữ ở trạng thái hoạt động bằng cách cấy chuyền mỗi
tháng một lần trong các môi trường thạch Czapek. (Thành phần môi trường)
- Mục đích:
+ Kích hoạt giống gốc và cho giống vi sinh vật làm quen với môi trường lên men sẽ sản
xuất trên quy mô công nghiệp.
+ Tạo đủ lượng giống để sản xuất trên quy mô công nghiệp.

 Cách tiến hành:

- Nhân giống trên máy lắc.
- Môi trường trong giai đoạn này cũng là môi trường được nuôi trong bình tam giác 1
lit và được đặt trên máy lắc.
- Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 10% chuyển qua phòng
nhân giống để nhân giống sản xuất. Quá trình nhân giống sản xuất cũng được thực hiện trên
khay và được thực hiện trong phòng nhân giống.

2.6 Gieo giống

- Mục đích: Phân bố giống đều trên môi trường nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thuận lợi
cho giống phát triển tốt.
- Cách tiến hành: Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ 33 – 34 oC ta tiến hành
gieo giống, tỷ lệ gieo giống là 16,5% v/w.

2.7 Nuôi cấy

- Đây là giai đoạn quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình, giai đoạn này cần được giám
sát chặt chẽ. Những thay đổi của các thông số sinh lý trong giai đoạn này sẽ ảnh hưởng trực
tiếp đến năng suất và chất lượng enzyme thành phần.
- Cách tiến hành: Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được
chuyển canh trường qua cân định lượng và được đưa và khay, khay chuyển vào phòng nuôi
cấy được đặt trong phòng nuôi cấy và tiến hành nuôi. Thời gian nuôi cấy nấm mốc 96 giờ.
+ Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá.
Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió. Nhiệt độ thích hợp với
đa số mốc là 30-320C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào
tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp Enzyme.

+ Quá trình nuôi cấy nấm mốc được chia thành 3 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Trong giai đoạn
này có những thay đổi sau:

- Nhiệt độ tăng chậm.

- Bào tử nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
- Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
- Khối môi trường còn rời rạc.
- Enzyme mới bắt đầu hình thành. Không cần thông khí nhiều, chỉ cần làm
thoáng khoảng 2 -3 thể tích không khí/ thể tích phòng/ giờ.
- Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được
để nhiệt độ cao hơn 30 oC vì thời kì này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.

 Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18 giờ tiếp theo. Giai đoạn này có những thay đổi sau:

- Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 400 - 450C. Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới
60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho mốc thở và đuổi CO2 ra khởi môi
trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần
giữ ở 28 - 300 C và độ ầm trong phòng khoảng 90%.
- Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có
thể quan sát bằng mắt thường. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp nơi
trong các hạt môi trường, trong lòng môi trường, làm môi trường kết bánh lại khá chặt, độ ẩm
môi trường giảm dần. Chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các
quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường xung quanh 80 –
90kcal/giờ
- Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 40 – 45 oC. Lượng oxi trong môi
trường giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần không khí mạnh tới 60 thể tích
khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho nấm mốc hô hấp và đuổi CO2 ra khởi môi trường,
đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 -
300 C và độ ầm trong phòng khoảng 90%.
- Các loại Enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được hình thành
nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng.

 Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20 giờ. Giai đoạn này có những biến đổi:
- Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại.
Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí không quá 20 – 25 thể tích
không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở 300 C.

- Lúc này nhiệt độ khối môi trường sẽ giảm dần kéo theo cường độ hô hấp giảm một
cách rõ rệt. Màu sắc của nấm sợi bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trưng. Trong giai đoạn
này bào tử được hình thành nhiều và làm giảm hoạt lực của enzyme. Do đó cần dừng quá
trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này.

- Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại
điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa. Enzyme vẫn được hình thành ở giai đoạn này.
- Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ, đựng
trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm.Sản phẩm này là chế phẩm enzyme thô.
- Đối với Aspergillus niger quá trình sinh tổng hợp enzyme nhiều nhất thường kết thúc
khi nấm bắt đầu sinh bào tử.

Sự phát triển của nấm sợi khi nuôi cấy bề mặt

2.8 Thu nhận enzyme

- Enzyme ngoại bào (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy
ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch.
 -
Enzyme ngoại bào

Dễ tách

Không cần phá vỡ thành tế bào

Không lẫn chung với các thành phần nội bào, nếu
có chỉ là một vài enzyme ngoại bào khác
2.9 Trích ly
Bền vững hơn
- Mục đích: Trích ly giúp Pectinase
Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn
có thể liên kết và khuếch tán ra
ngoài dung môi ở mức tối đa, giảm mất hoạt tính của enzyme. Vi lọc dùng để loại bỏ vi
khuẩn, xác vi sinh vật và các tạp chất trong dung dịch enzyme.
- Sử dụng dung dịch đệm citrate (pH = 3,6) với tỷ lệ dung dịch đệm : cơ chất 2:1 v/w.
Nhiệt độ trích ly 35 oC, thời gian 50p. Sau khi trích ly sử dụng vi lọc 0,2 micromet để lọc và
thu được chế phẩm enzyme thô.
- Để chiết rút enzyme từ môi trường bán rắn dùng nước, các dung dịch muối trung tính,
các dung môi hữu cơ (cồn, axeton). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục
đích này có kết quả tốt và dể được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch
tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa
các tạp chất không tan. Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. Để tránh tạp
nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có
màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10
– 120C.
- Phương pháp tách chiết và làm sach enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là
phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton). Các
dung môi hữu cơ này làm giãm hằng có điện môi của môi trường. như ta đã biết, lực hút tĩnh
điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện mới. Vì vậy các enzyme, các chất protein cũng như các chất
có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan
của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, lực hút ion của
dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh mất họat tính của enzyme tất cả phải
được làm lạnh xuống 3 – 5 oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và lắng
xuống dưới cần trích ly ngay.

2.9 Kết tủa

- Kết tủa bằng muối (kết tủa bằng cách thay đổi lực ion) là một trong các cách thức phổ
biến nhất để tách protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính
lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, ... Phương pháp kết tủa bằng muối
dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối (tính
theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định để loại bỏ một phần protein tạp của dung dịch
enzyme. Hiệu quả kết tủa protein của các anion và cation muối khác nhau thì khác nhau.
- Trong số các loại muối được sử dụng, muối (NH4)2SO4 là tốt nhất. Vì muối
(NH4)2SO4 có độ hòa tan cao, rẻ tiền, đồng thời muối (NH4)2SO4 có độ ion hóa cao. Thêm
vào đó, kết tủa thu được bằng phương pháp này ổn định, ít bị biến tính nhưng phải tiến hành
quá trình loại muối. Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt enzyme
sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nước quanh phân tử.
Khi thêm muối amonium sulfate vào với nồng độ cao, các phân tử muối sẽ phân ly thành các
ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại
với nhau và kết tủa xuống.

 Nguyên tắc

Enzyme hòa tan trong dung dịch dựa vào sự cân bằng giữa lực tĩnh điện và tương tác
kỵ nước. Sự kết tủa enzyme xảy ra khi ta thêm muối trung tính vào dung dịch với nồng độ
thích hợp. Khi đó, enzyme kết tủa thuận nghịch và có thể thu lại dung dịch enzyme bằng cách
tách (ly tâm) và hòa tan lại kết tủa. Ngoài ra, trong một số trường hợp, khi bổ sung muối còn
có tác dụng làm bền enzyme, chống lại sự biến tính và phân hủy hoặc nhiễm vi sinh vật

 Tác nhân kết tủa

Để kết tủa enzyme có thể sử dụng nhiều loại muối khác nhau. Trong thực tế,
ammonium sulfate được dùng phổ biến nhất vì muối này có độ hòa tan cao trong nước, đạt
được lực ion cao và giá thành rẻ. Tỷ trọng của dung dịch bão hoà khoảng 1.235 g/mL, thuận
lợi cho quá trình ly tâm để tách kết tủa.

 Các yếu tố ảnh hưởng

- Nồng độ muối:ở nồng độ thấp, sự có mặt của muối làm bền nhóm mang điện trong
phân tử enzyme và làm tăng tính tan của enzyme. Khi nồng độ muối tăng thì độ tan của
protein cũng tăng. Nếu tiếp tục tăng nồng độ muối thì độ tan của enzyme sẽ giảm và enzyme
bắt đầu kết tủa vì khi thêm muối vào dung dịch, một số phân tử nước sẽ solvat phân tử muối
- Tính chất ion: sự ảnh hưởng của muối đến quá trình kết tủa được xác định qua tính
chất của các ion, trong đó điện tích ion là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Hiệu quả ảnh hưởng
của các ion âm giảm dần theo trật tự sau: phosphate, sulphate, acetate, chloride… Những ion
dương hóa trị một có ảnh hưởng mạnh hơn ion dương hóa trị hai. Hiệu quả ảnh hưởng xếp
theo thứ tự giảm dần của các ion dương như sau: NH4+ , K+ , Na+.
- Thành phần, nồng độ dịch protein, nhiệt độ quá trình cũng có ảnh hưởng đến sự kết
tủa protein. Nhiệt độ càng cao thì tính tan của protein càng giảm.

 Phương pháp tiến hành

- Nồng độ muối tối ưu cần sử dụng thay đổi tùy theo từng trường hợp và được xác định
bằng thực nghiệm. Khi thực hiện thí nghiệm, cần tiến hành bổ sung ammonium sulphate
chậm và khuấy đều. Kết tủa có thể tách ra bằng ly tâm hay lọc. Phương pháp lọc chỉ được áp
dụng khi tỷ trọng của protein kết tủa gần bằng với tỷ trọng trong dung dịch.
- Trong một số trường hợp, có thể sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn để tinh sạch
protein. Người ta bổ sung ammonium sulfate vào dịch trích đến nồng độ mà protein mong
muốn không tủa, các kết tủa xuất hiện sẽ được tách bỏ. Sau đó bổ sung muối vào dịch để đạt
đến nồng độ mà protein mong muốn kết tủa. Cuối cùng, tách và thu nhận kết tủa.

 Ứng dụng trong nghiên cứu tinh sạch pectinase

Ammonium sulphate là tác nhân thường gặp nhất trong nghiên cứu tinh sạch enzyme
nói chung và đặc biệt trong tinh sạch enzyme pectinase. Ammonium sulphate có ưu điểm nổi
bật là nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến và ít có khả năng gây biến tích bất thuận nghịch enzyme.
Vì thế, đây thường là tác nhân kết tủa được nhà sản xuất ưu tiên lựa chọn. Nồng độ
ammonium sulphate tối ưu cho tinh sạch enzyme thường nằm trong khoảng từ 60-80% tuỳ
vào từng loại enzyme cụ thể.

2.11 Ly tâm
- Trong quá trình ly tâm tách tủa enzyme ra khỏi hỗn hợp dung môi dung dịch chỉ cần
tốc độ ly tâm thấp để thu cặn nên ta dùng máy ly tâm dạng đĩa để tiến hành thu cặn vì thể tích
chứa của máy ly tâm đĩa cao hơn so với quá trình ly tâm ống nên sử dụng máy ly tâm đĩa là
phù hợp trong quá trình thu cặn. Thể tích thùng của máy ly tâm dạng đĩa lớn phù hợp với quy
mô công nghiệp.
- Để tránh hiện tượng biến tính enzyme thường ly tâm ở 4 oC với vận tốc 6500 vòng/
phút trong 15 phút. Sau đó thu kết tủa.
2.12 Lọc màng
- Mục đích: Loại bỏ muối amoni sulfate và các tạp chất khác.

- Trong hầu hết các trường hợp, enzyme tinh sạch phải được giữ lại trên bề mặt vật liệu
lọc. Vì thế, vật liệu lọc cần phải có kích thước mao quản nhỏ hơn kích thước enzyme.

-
- Mẫu enzyme được hòa tan trong dung dịch đệm citrate pH 4 sau đó được bơm qua hệ
thống màng ở phân đoạn 20kDa và tiến hành quá trình lọc khối lượng phân tử của pectinase
khoảng 43 kDa dó đó phần dịch lọc chứa muối amoni sulfate đã tan trong dịch đệm bã lọc
chứa enzyme ở dạng sệt được thu nhận và chuyển sang giai đoạn sấy tạo thành phẩm.

2.13 Sấy đông khô

- Sấy đông khô sử dụng chân không và kết đông để loại bỏ nước. Sấy đông khô chân
không là một kỹ thuật sấy sản phẩm ưu việt. Trước hết nguyên liệu được đông lạnh đột ngột,
làm nước trong sản phẩm đóng thành thể rắn, rồi qua xử lý chân không thăng hoa thành dạng
hơi rồi ngưng tụ thành nước và thải ra ngoài, sản phẩm trở thành dạng khô. Sấy thăng hoa có
ưu điểm rất lớn so với các phương pháp sấy khác đó là: sản phẩm có chất lượng cao giữ
nguyên được màu sắc, cấu trúc, hoạt tính sinh học. Tiêu hao năng lượng để bay hơi hàm ẩm
thấp.

2.14 Bao gói

Sau khi thu được chế phẩm enzyme dạng bột ta đem đi đóng gói bằng thiết bị bao gói
tự động khối lượng định sẵn thu nhận thành phẩm enzyme kỹ thuật.