Professional Documents
Culture Documents
דוח ביוכימיה 3 גמור
דוח ביוכימיה 3 גמור
מטרות המעבדה-
לימוד שיטת כרומוטוגרפיה -הפרדת חלבונים בשיטה המבוססת על הבדלים במטען באמצעות
מחליף אניונים.
תוצאות-
1
/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2288568
2
/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8220500
טבלה מספר -1תוצאות הבליעה באורכי גל nm280ו nm403כנגד ריכוזים שונים של חומר
שטיפה:
יחס ב )%(-בין O.D at 403 nm O.D at 280 חומר השטיפה מס' מבחנה
Heme- O.D nm
-ל O.Dשל החלבון
הכללי
0 0 0 0 בלאנק
90.6% 1.869 2.061 ללא שטיפה 1
94.6% 1.999 2.112 mL3 2
37.2% 0.209 0.561 בופר פוספט 3
19.5% 0.018 0.092 4
- 0.078 -0.001 mL3בופר פוספט 5
50% 0.001 0.002 + 6
1000% 0.010 0.001 )mM 50 NaCl(aq 7
49.0% 0.05 0.102 mL3בופר פוספט 8
2.17% 0.045 2.068 + 9
110.1% )NaCl(aq 10
0.109 0.099
mM 150
148.1% 0.1007 0.068 mL3בופר פוספט 11
42.8% 0.009 0.021 + 12
- )NaCl(aq 13
0.033 -0.001
mM 300
חישוב יחס ב( )%בין הבליעה האופטית של hemeלבין הבליעה של החלבון הכללי בכל דגימה-
1.869
×100=90.6 %
2.061
גרף מספר – 1קריאת O.Dשל קולונת DEAE-cellulseעבור אורכי גל - nm280ו nm 403
מול בליעה באורך גל nm280באורך גל O.Dבליעה אופטית
nm403
2.5
2
O.Dצפיפות אופטית
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
מספר דגימה
דיון ומסקנות-
מטרות המעבדה-
ביצוע אלקטרופורזה דנטורטיבית של הפרקציות המכילות HRPו. BSA
מבוא-
הפרדת חלבונים לפי גודל היא טכניקה ביוכימית שמטרתה להפריד חלבונים בתערובת על פי
גודלם המולקולרי .אלקטרופורזה 5הינה שיטת הפרדה שמבוססת על נדידה של חלבונים טעונים
בשדה חשמלי על גבי משטח ג'ל .ההפרדה היא על פי הגודל או המטען .באלקטרופורזה מונחת
התערובת (מומסת בנוזל או נוזלית בעצמה) על גבי משטח העשוי ג'ל הנקרא פוליאקריל אמיד.
זרם חשמלי מועבר דרך הג'ל ,כך שצידו האחד טעון חיובית והשני -שלילית .המולקולות
בתערובת ,אשר טעונות חשמלית ,נודדות לעבר קצהו האחד של הג'ל ,כתוצאה מהכוח החשמלי
הפועל עליהן .המולקולות בתערובת אינן נודדות בקצב זהה .מולקולות כבדות יותר נודדות
באיטיות ,ואילו מולקולות קלות נודדות במהירות ומגיעות רחוק יותר בג'ל .לפני הרצת התערובת
בג'ל מוסיפים לה בדרך-כלל דטרגנט הנקרא ( SDSסודיום דודציל סולפט) .מערבבים את החלבון
עם ה mercaptoethanol ,SDS -2 -וחימום לדנטורציה .תפקיד המרקפטואתנול הוא חיזור קשרי
S-Sבחלבון ופתיחת השרשראות כך שיסייעו להפרדה עפ"י גודל בלבד .תפקיד ה SDS -הוא
לעשות דנטורציה לחלבונים ,להיקשר אליהם ביחס קבוע ולהעניק להם מטען שלילי שמגביר את
יכולת הנדידה של החלבונים בשדה החשמלי .יחס מסה-מטען מושווה בין החלבונים ולכן הם
נעים עפ" י המסה המולארית בלבד .בנוסף SDS ,גורם לשבירת קשרים בחלבון ולהרס המבנה
השניוני והשלישוני שלו כך שהחלבונים הופכים ללינאריים (קוויים) .ישנן 2שיטות
באלקטרופורזה דנטורטיבית -ג'ל נטיבי לעומת ג'ל דנטורטיבי .שתיהן מבוססות על נדידת
חלבונים טעונים דרך ג'ל פוליאקרילמיד ,אך נבדלות בגישתן להפרדה .ג'ל נטיבי מאפשר שמירה
על מבנה החלבון הטבעי ומפריד על סמך מטען ,גודל וצורה .יתרונו בשמירה על המבנה ,אך קשיים
בהפרדת חלבונים בעלי מטען או גודל דומה .ג'ל דנטורטיבי גורם לפירוק מבנה החלבון באמצעות
SDSומאפשר הפרדה יעילה יותר על סמך גודל שרשרת חומצות האמינו בלבד ,אידיאלי לקביעת
משקל מולקולרי וזיהוי חלבונים ספציפיים .יחד עם זאת ,פירוק המבנה עלול לפגוע בפעילותם של
חלק מהחלבונים .בניסוי נבצע אלקטרופורזה דנטורטיבית של הפרקציות המכילות פראוקסידז
HRPבמשקל מולקולרי של 6Kda44ואלבומין מסרום עגל BSAבמשקל מולקולרי של
7
.kDa66.4
תוצאות:
תמונה מספר -1תוצאות נדידת החלבונים באלקטרופורזה דנטורטיבית כפי שהתקבל בניסוי:
)Ladder (kDa
זוג 2 5
https://www.thermofisher.com/il/en/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis/
זוג 3
שלנו
protein-gels/specialized-protein-gels/2d-gel-electrophoresis.html
https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-the-molecular-weight-mw- 6
of-horseradish-peroxidase-HRP
Mi
https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-the-molecular-weight-mw- 7
x of-Bovine-Serum-Albumin-BSA
~180
~130
6 זוג 5 זוג 4 זוג 1 זוג
~95
~70 Mi
x
BSA
~53
~43
HRP
~33
~25