‫דו"ח מעבדה מספר ‪ – 3‬שיטות להפרדת חלבונים‬

‫מטרות המעבדה‪-‬‬

‫לימוד שיטת כרומוטוגרפיה‪ -‬הפרדת חלבונים בשיטה המבוססת על הבדלים במטען באמצעות‬
‫מחליף אניונים‪.‬‬

‫חלק א' – הפרדה על פי מטען‪ -‬כרומוטוגרפיה באמצעות מחליף יונים‬

‫מבוא‪-‬‬
‫כרומטוגרפיה באמצעות מחליפי יונים היא טכניקה נפוצה להפרדת חלבונים על בסיס‬
‫ההבדלים במטען החשמלי שלהם‪ .‬טכניקה זו מנצלת את האינטראקציות בין יונים‬
‫בתמיסה לבין המצע הכרומטוגרפי הנושא קבוצות טעונות חשמלית‪ .‬כאשר הקולונה‬
‫מכילה מחליפי אניונים היא טעונה במטען חיובי‪ ,‬יונים שליליים נקשרים אליה‪ ,‬וכאשר‬
‫היא נושאת מחליפי קטיונים‪ ,‬היא טעונה במטען שלילי ויונים חיוביים נקשרים אליה‪.‬‬
‫מידת הקישור למחליף היונים תלויה בריכוז היונים בתמיסה וב‪ pH-‬שלה‪ .‬במעבדה זו‪,‬‬
‫בוצעה הפרדה של שני חלבונים‪ :‬אלבומין מסרום עגל(‪)Bovine Serum Albumin, BSA‬‬
‫ופראוקסידאז מחזר (‪ ,)Horseradish Peroxidase, HRP‬באמצעות מחליף אניונים מסוג‬
‫‪ ,DEAE-Cellulose‬שקושר חלבונים בעלי מטען שלילי‪ .‬הנקודה האיזואלקטרית (‪ )pI‬של‬
‫החלבונים‪,‬היא ה‪ pH -‬שבו המטען הכללי של החלבון הוא נייטרלי‪ .‬ב‪ pH-‬נמוך מה‪pI-‬‬
‫החלבון יהיה בעל מטען חיובי‪ ,‬וב‪ pH-‬גבוה מה‪ pI-‬החלבון יהיה בעל מטען שלילי‪.‬‬
‫ב‪ pH=7.4-‬לחלבון ‪ BSA‬יש מטען שלילי‪ 5.1( pH ) ≤ pI ≤5.5( pH ),1‬בעוד שלחלבון ‪ HRP‬יש‬
‫מטען חיובי‪ 2‬חלש ) ‪ .8.7 ( pH ) ≤ pI ≤ 9.0( pH‬בתנאים אלו‪ ,‬חלבון ‪ BSA‬ייקשר בחוזקה‬
‫למחליף האניונים‪ ,‬בעוד שחלבון ‪ HRP‬ייקשר בעוצמה פחותה‪ .‬שחרור החלבונים ממחליף‬
‫¿¿‪ )Cl−‬המתחרים עם‬
‫האניונים יעשה באמצעות שימוש ב )‪ NaCl(aq‬המכיל יוני כלוריד ( )‪(aq‬‬

‫הקבוצות השליליות של החלבונים על אתרי הקישור במחליף האניונים בקולונה‪ ,‬נקשרים‬

‫במקומם וגורמים לשחרור החלבונים‪.‬‬
‫המדידה הכמותית של החלבונים בפרקציות נעשית באמצעות ספקטרופוטומטר בשני‬
‫אורכי גל‪ 280nm :‬ו‪ 403 nm-‬וכיול המכשיר ע"י דגימה המכילה בופר פוספט‪ .‬אורך גל של‬
‫‪ 280nm‬נבחר לניתוח כמות החלבון הכללית בפרקציה מכיוון שבו הבליעה האופטית של‬
‫חלבונים היא מקסימלית בשל נוכחות חומצות אמינו ארומטיות ‪ .‬באורך גל של ‪,403 nm‬‬
‫הבליעה האופטית של ‪ ,heme‬קופקטור של האנזים ‪ ,HRP‬מגיעה לשיאה‪ .‬מדידה זו‬
‫מאפשרת לנו לקבוע את כמות ה‪ heme-‬בפרקציה בצורה מדויקת ובכך מתאפשרת מדידה‬
‫של כמות החלבון ‪ HRP‬בפרקציה‪ .‬כדי להבטיח דיוק ואמינות במדידת ריכוזי החלבונים‪,‬‬
‫חשוב לבצע כיול של הספקטרופוטומטר בעזרת סטנדרטים ידועים‪.‬‬

‫תוצאות‪-‬‬
‫‪1‬‬
‫‪/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2288568‬‬
‫‪2‬‬
‫‪/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8220500‬‬
 ‫טבלה מספר ‪ -1‬תוצאות הבליעה באורכי גל ‪ nm280‬ו‪ nm403‬כנגד ריכוזים שונים של חומר‬
‫שטיפה‪:‬‬

‫יחס ב‪ )%(-‬בין‬ ‫‪O.D at 403 nm‬‬ ‫‪O.D at 280‬‬ ‫חומר השטיפה‬ ‫מס' מבחנה‬
‫‪Heme- O.D‬‬ ‫‪nm‬‬
‫‪-‬ל‪ O.D‬של החלבון‬
‫הכללי‬
‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫בלאנק‬
‫‪90.6%‬‬ ‫‪1.869‬‬ ‫‪2.061‬‬ ‫ללא שטיפה‬ ‫‪1‬‬
‫‪94.6%‬‬ ‫‪1.999‬‬ ‫‪2.112‬‬ ‫‪mL3‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪37.2%‬‬ ‫‪0.209‬‬ ‫‪0.561‬‬ ‫בופר פוספט‬ ‫‪3‬‬
‫‪19.5%‬‬ ‫‪0.018‬‬ ‫‪0.092‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪-‬‬ ‫‪0.078‬‬ ‫‪-0.001‬‬ ‫‪ mL3‬בופר פוספט‬ ‫‪5‬‬
‫‪50%‬‬ ‫‪0.001‬‬ ‫‪0.002‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪1000%‬‬ ‫‪0.010‬‬ ‫‪0.001‬‬ ‫)‪mM 50 NaCl(aq‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪49.0%‬‬ ‫‪0.05‬‬ ‫‪0.102‬‬ ‫‪ mL3‬בופר פוספט‬ ‫‪8‬‬
‫‪2.17%‬‬ ‫‪0.045‬‬ ‫‪2.068‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪110.1%‬‬ ‫)‪NaCl(aq‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪0.109‬‬ ‫‪0.099‬‬
‫‪mM 150‬‬
‫‪148.1%‬‬ ‫‪0.1007‬‬ ‫‪0.068‬‬ ‫‪ mL3‬בופר פוספט‬ ‫‪11‬‬
‫‪42.8%‬‬ ‫‪0.009‬‬ ‫‪0.021‬‬ ‫‪+‬‬ ‫‪12‬‬
‫‪-‬‬ ‫)‪NaCl(aq‬‬ ‫‪13‬‬
‫‪0.033‬‬ ‫‪-0.001‬‬
‫‪mM 300‬‬

‫חישוב יחס ב(‪ )%‬בין הבליעה האופטית של ‪ heme‬לבין הבליעה של החלבון הכללי בכל דגימה‪-‬‬

‫‪O. D at 403 nm‬‬

‫¿=‪×100‬‬
‫‪O . D at 280 nm‬‬

‫עבור דגימה מס' ‪ 2‬נקבל ‪:‬‬

‫‪1.869‬‬
‫‪×100=90.6 %‬‬
‫‪2.061‬‬

‫גרף מספר ‪ – 1‬קריאת ‪ O.D‬של קולונת ‪ DEAE-cellulse‬עבור אורכי גל ‪- nm280‬ו ‪nm 403‬‬
 ‫מול בליעה באורך גל ‪ nm280‬באורך גל ‪ O.D‬בליעה אופטית‬
‫‪nm403‬‬
‫‪2.5‬‬

‫‪2‬‬
‫‪ O.D‬צפיפות אופטית‬

‫‪1.5‬‬

‫‪1‬‬

‫‪0.5‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪11‬‬ ‫‪12‬‬ ‫‪13‬‬ ‫‪14‬‬
‫מספר דגימה‬

‫‪O.D at 280 nm‬‬ ‫‪O.D at 403 nm‬‬

‫דיון ומסקנות‪-‬‬

‫בניסוי זה הופרדו החלבונים ‪ BSA‬ו‪ HRP-‬באמצעות מחליף אניונים ‪ DEAE cellulose.‬הפרדת‬

‫החלבונים התבצעה על ידי גרדיאנט עולה של בופר נתרן‪-‬פוספט בטווח ריכוזים של ‪ mM 50‬עד‬
‫‪ mM 300‬וב‪ .- pH=7.4‬בתערובת החלבונים נכחו ‪ 10‬מ"ג‪/‬מ"ל של ‪ HRP‬ו‪ 8-‬מ"ג‪/‬מ"ל של ‪BSA‬‬
‫ובמהלך תהליך ההפרדה טופטפה ל‪ 13-‬מבחנות לאחר מעבר דרך הקולונה‪ .‬תוצאות הניסוי הראו‬
‫כי החלבון ‪ HRP‬השתחרר מהקולונה בריכוזים נמוכים יותר של בופר נתרן‪-‬פוספט (‪ )mM 50‬מה‬
‫שמעיד על קישור חלש יותר לקולונה בהשוואה לחלבון ה‪ . BSA -‬לעומתו חלבון ‪ BSA‬השתחרר‬
‫בריכוזים גבוהים יותר של בופר פוספט נתרן (‪ )mM 300‬מה שמצביע על קישור חזק יותר‬
‫לקולונה‪ .‬תופעה זו הינה קשר ישיר לתכונות החלבונים ב‪ pH‬בו בוצע הניסוי‪ .‬ב ‪ =pH 7.4‬לחלבון‬
‫‪ BSA‬יש מטען שלילי‪ 5.1( pH ) ≤ pI ≤5.5( pH ),3‬בעוד שלחלבון ‪ HRP‬יש מטען חיובי‪ 4‬חלש‬
‫) ‪ .8.7 ( pH ) ≤ pI ≤ 9.0( pH‬לכן‪ ,‬שני החלבונים נמצאים באינטרקציות שונות למחליף אניונים ‪DEAE‬‬
‫‪ .cellulose‬ההפרדה בניסוי התבצעה ע"י הבופר פוספט נתרן‪ .‬ככל שריכוז הבופר עלה‪ ,‬התחרות‬
‫בין יוני ¿¿‪ Cl−‬לחלבונים הקשורים לאתרים הטעונים חיובית בקולונה גברה‪ .‬בתחילת הניסוי‪,‬‬
‫בריכוזים נמוכים של הבופר(‪ )mM 50‬חלבון ה‪ HRP -‬השתחרר בשל הקישור החלש יותר שלו‬
‫לקולונה‪ .‬בריכוזים גבוהים של הבופר (‪ )mM 300‬חלבון ה‪ BSA -‬השתחרר מהקולונה בשל תחרות‬
‫חזקה יותר של יוני הכלור‪.‬ניתוח ערכי הבליעה בספקטרופוטומטר הראה כי הבליעה באורך גל‬
‫‪ nm403‬הייתה גבוהה בתחילת הניסוי‪ ,‬מה שמעיד על נוכחות ‪ HRP‬הידוע בבליעתו החזקה באורך‬
‫גל זה עקב קבוצת ה ‪ . -heme‬הבליעה באורך גל ‪ nm 280‬היתה גבוה בהתאמה לשיא שנראה‬
‫בקריאה זו‪ ,‬לאור העובדה שחלבון ה‪ BSA -‬נושא שיירי טירוזין וטריפטופאן (כפי שצוין במבוא)‪.‬‬
‫בדגימה ‪ 9‬כאשר ריכוז הבופר היה ‪ mM300‬ראינו קריאה גבוהה באורך גל זה‪ ,‬מה שמעיד על כך‬
‫שחלבון ‪ BSA‬הוא החלבון הדומיננטי שנפלט מהקולונה בריכוזים גבוהים יותר של בופר‪ .‬אחוז‬
‫‪3‬‬
‫‪/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2288568‬‬
‫‪4‬‬
‫‪/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8220500‬‬
 ‫ה‪ heme-‬בבליעה אופטית באורך גל ‪ 403‬ננומטר ביחס לבליעה באורך גל ‪ 280‬ננומטר יכול לספק‬
‫מידע נוסף על הרכב החלבונים בכל דגימה ‪ .‬ככל שהאחוז גבוהה יותר‪ ,‬נסיק שיותר חלבון ‪HRP‬‬
‫נוקה מסך החלבונים בכל דגימה‪ .‬בדגימות ‪-1,2‬אחוז ה ‪ heme‬בבליעה היה גבוה יותר‪ ,‬מה שמעיד‬
‫על כך ש‪ HRP-‬החלבון המכיל את קבוצת ה‪ heme-‬הוא החלבון הדומיננטי שנפלט מהקולונה‪.‬‬
‫בדגימה ‪, 9‬עבור הקריאה באורך גל‪ nm 280‬בנקודה בה חלבון ה‪ BSA‬השתחרר מהקולונה‪ ,‬גם‬
‫חלבון ה‪ HRP‬אינו קשור לקולונה ועל כן ראינו אחוז יחסי נמוך מאוד בין חלבון ה‪ heme‬ל ‪.-BSA‬‬
‫שיטת ההפרדה באמצעות מחליף אניונים ‪ DEAE cellulose‬בשילוב עם גרדיאנט עולה של בופר‬
‫נתרן‪-‬פוספט הוכחה כיעילה להפרדת החלבונים ‪ BSA‬ו ‪ HRP.‬תוצאות הניסוי מאשרות כי השיטה‬
‫מאפשרת הפרדה על פי עוצמת הקשירה לקולונה‪ ,‬בהתאם למטען החלבונים ב ‪ pH‬מסויים‪.‬‬
‫המסקנות שהוצגו לעיל תאמו את הצפי המדעי ומראות כי ניתן להשתמש בשיטה זו להפרדת‬
‫חלבונים אחרים בעלי ערכי ‪ pI‬שונים‪ ,‬תוך התאמת תנאי הניסוי כדי לשפר את היעילות והדיוק‬
‫של ההפרדה‪.‬‬

‫חלק ב' ‪-‬הפרדה על פי גודל ‪-‬אלקטרופורזה דנטורטיבית (‪)SDS-PAGE‬‬

‫מטרות המעבדה‪-‬‬
 ‫ביצוע אלקטרופורזה דנטורטיבית של הפרקציות המכילות ‪ HRP‬ו‪. BSA‬‬

‫מבוא‪-‬‬

‫הפרדת חלבונים לפי גודל היא טכניקה ביוכימית שמטרתה להפריד חלבונים בתערובת על פי‬
‫גודלם המולקולרי‪ .‬אלקטרופורזה ‪5‬הינה שיטת הפרדה שמבוססת על נדידה של חלבונים טעונים‬
‫בשדה חשמלי על גבי משטח ג'ל ‪ .‬ההפרדה היא על פי הגודל או המטען‪ .‬באלקטרופורזה מונחת‬
‫התערובת (מומסת בנוזל או נוזלית בעצמה) על גבי משטח העשוי ג'ל הנקרא פוליאקריל אמיד‪.‬‬
‫זרם חשמלי מועבר דרך הג'ל‪ ,‬כך שצידו האחד טעון חיובית והשני ‪ -‬שלילית‪ .‬המולקולות‬
‫בתערובת‪ ,‬אשר טעונות חשמלית‪ ,‬נודדות לעבר קצהו האחד של הג'ל‪ ,‬כתוצאה מהכוח החשמלי‬
‫הפועל עליהן‪ .‬המולקולות בתערובת אינן נודדות בקצב זהה‪ .‬מולקולות כבדות יותר נודדות‬
‫באיטיות‪ ,‬ואילו מולקולות קלות נודדות במהירות ומגיעות רחוק יותר בג'ל‪ .‬לפני הרצת התערובת‬
‫בג'ל מוסיפים לה בדרך‪-‬כלל דטרגנט הנקרא ‪( SDS‬סודיום דודציל סולפט)‪ .‬מערבבים את החלבון‬
‫עם ה‪ mercaptoethanol ,SDS -2 -‬וחימום לדנטורציה‪ .‬תפקיד המרקפטואתנול הוא חיזור קשרי‬
‫‪ S-S‬בחלבון ופתיחת השרשראות כך שיסייעו להפרדה עפ"י גודל בלבד‪ .‬תפקיד ה ‪ SDS -‬הוא‬
‫לעשות דנטורציה לחלבונים‪ ,‬להיקשר אליהם ביחס קבוע ולהעניק להם מטען שלילי שמגביר את‬
‫יכולת הנדידה של החלבונים בשדה החשמלי‪ .‬יחס מסה‪-‬מטען מושווה בין החלבונים ולכן הם‬
‫נעים עפ" י המסה המולארית בלבד‪ .‬בנוסף‪ SDS ,‬גורם לשבירת קשרים בחלבון ולהרס המבנה‬
‫השניוני והשלישוני שלו כך שהחלבונים הופכים ללינאריים (קוויים)‪ .‬ישנן ‪ 2‬שיטות‬
‫באלקטרופורזה דנטורטיבית‪ -‬ג'ל נטיבי לעומת ג'ל דנטורטיבי‪ .‬שתיהן מבוססות על נדידת‬
‫חלבונים טעונים דרך ג'ל פוליאקרילמיד‪ ,‬אך נבדלות בגישתן להפרדה‪ .‬ג'ל נטיבי מאפשר שמירה‬
‫על מבנה החלבון הטבעי ומפריד על סמך מטען‪ ,‬גודל וצורה‪ .‬יתרונו בשמירה על המבנה‪ ,‬אך קשיים‬
‫בהפרדת חלבונים בעלי מטען או גודל דומה‪ .‬ג'ל דנטורטיבי גורם לפירוק מבנה החלבון באמצעות‬
‫‪ SDS‬ומאפשר הפרדה יעילה יותר על סמך גודל שרשרת חומצות האמינו בלבד‪ ,‬אידיאלי לקביעת‬
‫משקל מולקולרי וזיהוי חלבונים ספציפיים‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬פירוק המבנה עלול לפגוע בפעילותם של‬
‫חלק מהחלבונים‪ .‬בניסוי נבצע אלקטרופורזה דנטורטיבית של הפרקציות המכילות פראוקסידז‬
‫‪ HRP‬במשקל מולקולרי של ‪ 6Kda44‬ואלבומין מסרום עגל ‪ BSA‬במשקל מולקולרי של‬
‫‪7‬‬
‫‪.kDa66.4‬‬

‫תוצאות‪:‬‬
‫תמונה מספר ‪ -1‬תוצאות נדידת החלבונים באלקטרופורזה דנטורטיבית כפי שהתקבל בניסוי‪:‬‬

‫)‪Ladder (kDa‬‬
‫זוג ‪2‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪https://www.thermofisher.com/il/en/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis/‬‬
‫זוג ‪3‬‬
‫שלנו‬
‫‪protein-gels/specialized-protein-gels/2d-gel-electrophoresis.html‬‬
‫‪https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-the-molecular-weight-mw- 6‬‬
‫‪of-horseradish-peroxidase-HRP‬‬
‫‪Mi‬‬
‫‪https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-the-molecular-weight-mw-‬‬ ‫‪7‬‬

‫‪x‬‬ ‫‪of-Bovine-Serum-Albumin-BSA‬‬
 ~180

~130
6 ‫זוג‬ 5 ‫זוג‬ 4 ‫זוג‬ 1 ‫זוג‬
~95

~70 Mi
x

BSA
~53

~43

HRP
~33

~25

-‫) בניסוי לספרות‬Mw( ‫ השוואה בין משקל מולקולרי‬-2 '‫טבלה מס‬

)Kda( ‫ספרות‬ )Kda( ‫ניסוי‬ ‫חומר‬
8
66.4 ~67 BSA
9
44 ~44 HRP
66.4 ~67 Mix
44 ~44

:‫דיון בתוצאות ומסקנות‬

‫ מה‬,‫ העמודות ישרות ללא ערבובים‬.‫ בג'ל‬BSA-‫ ו‬HRP ‫התוצאות מציגות הפרדה ברורה בין פסי‬
,BSA-‫ ו‬HRP ‫ משקלם המולקולרי של‬.‫שמצביע על הפרדה יעילה של החלבונים על סמך גודלם‬
‫ תואמים את הערכים המדווחים‬,HRP ‫ עבור‬kDa 44 -‫ ו‬BSA ‫ עבור‬kDa 67 - ‫כפי שנמדדו בניסוי‬
https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-the-molecular-weight-mw- 8
of-Bovine-Serum-Albumin-BSA
https://www.aatbio.com/resources/faq-frequently-asked-questions/What-is-the-molecular-weight-mw- 9
of-horseradish-peroxidase-HRP
 ‫בספרות ‪ kDa 66.4 -‬עבור ‪ BSA‬ו‪ kDa 44 -‬עבור ‪ .HRP‬איכות זו מצביעה על הכנה נכונה של ג'ל‬
‫האלקטרופורזה ועל ביצוע תקין של תהליך ההרצה‪ SDS .‬ו‪ β-mercaptoethanol-‬תרמו להפרדה‬
‫יעילה על ידי דנטורציה של חלבונים‪SDS , .‬תרם בכך שכל חלבון נודד בג'ל על סמך גודלו‬
‫הליניארי של שרשרת חומצות האמינו‪ ,‬ללא קשר למבנהו הטבעי או למטען שלו‪ ,‬כפי שהוסבר‬
‫במבוא‪ β- mercaptoethanol .‬תרם בכך שהוא חומר מחזר הגורם לשבירת קשרי דיסולפיד בין‬
‫קבוצות ציסטאין בחלבונים‪ .‬שבירת קשרי דיסולפיד אלו גורמת לדנטורציה נוספת של חלבונים‬
‫ומבטיחה שכל שרשרת פולי‪-‬פפטיד נודדת בג'ל באופן עצמאי על סמך גודלה‪ .‬חשוב לציין כי‬
‫הסטיות הקלות בין משקלם המולקולרי של חלבונים כפי שנמדד בניסוי ובין הערכים המדווחים‬
‫בספרות אינן משמעותיות אך עשויות לנבוע מגורמים שונים‪ :‬שגיאות מדידה‪ -‬סטייה קלה בנפח‬
‫הדגימות עלולה להשפיע על קביעת ריכוז החלבונים בג'ל וכתוצאה מכך על חישוב המשקל‬
‫המולקולרי‪ .‬שגיאה בקריאת הג'ל‪ -‬קשיים בקריאת פסי החלבונים בג'ל עלולים להוביל להערכה‬
‫שגויה של מרחקם מהחזית וכתוצאה מכך לחישוב לא מדויק של המשקל המולקולרי‪.‬‬
‫אינטראקציות בין חלבונים‪ -‬אינטראקציות בין חלבונים שונים בג'ל עלולות להשפיע על נדידתם‬
‫וכתוצאה מכך על חישוב המשקל המולקולרי‪ .‬למרות כל הגורמים שציינו לעיל‪ ,‬סטייה קלה בין‬
‫תוצאות הניסוי לערכים המדווחים בספרות היא דבר נפוץ ואינו בהכרח מעיד על בעיה בניסוי‪.‬‬
‫בתוצאות‪ ,‬הפסים‪ 10‬של תערובת ה‪ Mix-‬דקים לעומת הפסים של ‪ BSA‬ו‪ .HRP‬פס דק יותר‬
‫בתערובת המיקס מצביע על ריכוז נמוך יותר של חלבונים בהשוואה לפסי ‪ BSA‬ו‪ .HRP-‬גורמים‬
‫אפשריים להבדלים בפסים‪ :‬יחס הדגימות‪ -‬ייתכן שהיחס בין ‪ BSA‬ל‪ HRP-‬במיקס היה שונה‬
‫מהיחס בדגימות הנפרדות וכתוצאה מכך התקבלו פסים בעובי שונה בג'ל‪ .‬אינטרקציות בין‬
‫החלבונים כפי שצוין לעיל‪ .‬דנטורציה לא מלאה‪ -‬ייתכן שלא כל החלבונים במיקס עברו דנטורציה‬
‫באופן מלא‪ ,‬מה שהשפיע על נדידתם בג'ל ועל מראה הפסים‪.‬‬

‫‪ https://meyda.education.gov.il/files/MadaTech/biotechnologia/IMMUNOLOGY_BOOK.pdf 10‬עמ' ‪69‬‬