‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.

‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫פעילות אנזימתית ‪ :‬קינטיקה של מיכאליס‪-‬מנטן‬

‫מטרות המעבדה‪:‬‬
‫‪ .1‬בדיקת קצב הריאקציה כתלות בזמן‪.‬‬
‫‪ .2‬בדיקת קצב הריאקציה כתלות בריכוזי סובסטרט‪.‬‬
‫א‪ .‬מדידת קבוע מיכאליס‪-‬מנטן (‪ )Km‬של האנזים לסובסטרט נתון‪:‬‬
‫ב‪ .‬קביעת סוג העיכוב ע"י הפוספט ומדידת קבוע העיכוב (‪)Ki‬‬
‫‪ .3‬בדיקת השפעת פוספט על פעילות האנזים‬
‫אנזימים –רקע תיאורטי‪.‬‬

‫אנזימים הם חלבונים המזרזים ריאקציות ע"י הורדת אנרגיית השפעול הדרושה להגעה למצב מעבר‪.‬‬
‫מולקולת האנזים הינה בעלת מבנה תלת מימדי‪ ,‬בעל איזור מסוים המהווה אתר פעיל‪/‬קטליטי בו נוצר‬
‫קומפלקס ‪. ES‬האנזימים ספציפים לגבי הסובסטרטים עליהם הם פועלים‪.‬‬
‫פעילות אנזים נקבעת ע"י מספר גורמים כגון‪ :‬טמפ'‪ , pH ,‬ריכוז סובסטרט‪ ,‬ריכוזו בתמיסה‪ ,‬מידת‬
‫אפיניות לסובסטרט‪ ,‬ונוכחות מעכב תחרותי‪/‬לא תחרותי‪.‬‬

‫פעילות ספציפית של אנזים‪ -‬הינה מספר מולקולות סובסטרט ההופכות לתוצר ביחידת זמן ע"י מולקולה‬
‫אחת של אנזים‪.‬‬

‫)‪Specific activity= µmole/ (min*mg protein‬‬

‫כאשר לאנזים נקשר מעכב תחרותי‪ -‬המעכב מתחרה עם הסובסטרט על האתר הפעיל של האנזים‪ ,‬דבר‬
‫שמביא לעיכוב התגובה‪ .‬כאשר המעכב הוא תחרותי ערך ה‪ Km -‬יעלה‪ ,‬ואילו ‪ Vmax‬ישאר קבוע‪.‬‬
‫כאשר לאנזים נקשר מעכב לא תחרותי‪ -‬המעכב אינו מתחרה עם הסובסטרט על האתר הפעיל‪ ,‬אלא נקשר‬
‫לאתר אלוסטרי‪ ,‬גורם להפרעה בקישור האנזים לסובסטרט‪ ,‬דבר הגורם לירידה בערך ‪ Vmax‬ואינו‬
‫משפיע על ה‪. Km -‬‬

‫חלק ‪ :1‬בניית עקומת כיול‬

‫מטרת הניסוי‪ :‬הכנת עקומת כיול לכמות התוצר ‪pNP‬‬

‫אורך הגל בו בליעת ‪ pNP‬היא מכסימלית מתקיימת ב‪420nm-‬‬

‫תוצאות הניסוי חלק א'‪:‬‬

‫‪O.D.‬‬ ‫‪NaOH 0.1 N‬‬ ‫‪H2O‬‬ ‫‪pNP‬‬ ‫‪pNP 0.5 mM‬‬ ‫מס‬
‫‪420nm‬‬ ‫)‪(ml‬‬ ‫)‪(ml‬‬ ‫‪μmol‬‬ ‫)‪(ml‬‬ ‫מבחנה‬
‫‪0‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0.186‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0.9‬‬ ‫‪0.05‬‬ ‫‪0.1‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪0.315‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0.8‬‬ ‫‪0.1‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.654‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0.6‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪1.001‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪0.3‬‬ ‫‪0.6‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪1.342‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪0.8‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪1.611‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪7‬‬

‫‪1‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫דוגמא לחישוב ‪ pNP‬ב‪( μmol‬עבור מבחנה ‪:)3‬‬

‫ריכוז ‪pNP C = 0.5 mM‬‬
‫‪V = 0.2 ml‬‬ ‫נפח ‪pNP‬‬
‫‪n = C * V = 0.5 * 0.2 = 0.1 μmol‬‬

‫‪ pNP‬עקומת כיול ל‬

‫‪8.1‬‬
‫‪6.1‬‬
‫‪3700.0 + x 87740208501362.3 = )x(f‬‬
‫‪4.1 = ²R‬‬
‫‪460812393268899.0‬‬
‫‪O.D. 420nm‬‬

‫‪2.1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪8.0‬‬
‫‪6.0‬‬
‫‪4.0‬‬
‫‪2.0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0 50.0‬‬ ‫‪1.0 51.0‬‬ ‫‪2.0 52.0‬‬ ‫‪3.0 53.0‬‬ ‫‪4.0 54.0‬‬ ‫‪5.0‬‬
‫‪pNP μmol‬‬

‫מסקנות‪:‬‬
‫מצאנו שיש קשר לנארי בין הבליעה לריכוז ה ‪.pNP‬‬
‫בעזרת עקומת הכיול אפשר לחשב את ריכוז התוצר ‪. pNP‬‬

‫חלק ‪ :2‬קצב הריאקציה כתלות בזמן בשני ריכוזי הסובסטרט השונים‬

‫מטרת הניסוי‪ :‬השפעת הזמן על פעילות האנזים‪.‬‬

‫תוצאות‪:‬‬

‫)‪n (µ mole‬‬ ‫‪O.D. 420 nm‬‬

‫( ‪ )pNPP 20mM‬מבחנה‬ ‫מבחנה ‪A (pNPP 0.2‬‬ ‫מבחנה ‪B ( pNPP‬‬ ‫מבחנה ‪A (pNPP 0.2‬‬ ‫זמן‬
‫‪B‬‬ ‫‪mM‬‬ ‫)‪20mM‬‬ ‫‪mM‬‬ ‫(דקות)‬
‫‪0.0257‬‬ ‫‪0.0134‬‬ ‫‪0.091‬‬ ‫‪0.051‬‬ ‫‪0‬‬
‫‪0.0707‬‬ ‫‪0.0538‬‬ ‫‪0.238‬‬ ‫‪0.183‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0.1694‬‬ ‫‪0.0879‬‬ ‫‪0.56‬‬ ‫‪0.294‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪0.2855‬‬ ‫‪0.1305‬‬ ‫‪0.939‬‬ ‫‪0.433‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪0.3946‬‬ ‫‪0.1669‬‬ ‫‪1.295‬‬ ‫‪0.552‬‬ ‫‪20‬‬

‫‪2‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫דוגמא לחישוב מיקרומול (לפי מבחנה ‪ A‬בזמן של ‪) 5min‬‬

‫‪y = O.D =0.294‬‬

‫‪y = 3.2631x + 0.0073‬‬
‫‪x= (y-0.0073)/3.2631=0.0879 µ mole‬‬

‫‪3‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫מסקנות‪:‬‬
‫‪.1‬בחלק זה של הניסוי לקחנו שתי סדרות ‪ A‬ו‪ B-‬בהן ריכוז הסובסטרט היה שונה בזמנים שונים‬
‫אך שאר התנאים זהים ‪ .‬במבחנה ‪ B‬בה ריכוז הסובסטרט היה גבוה יותר התקבלה בליעה גבוהה‬
‫יותר דבר המורה על פעילות אנזימתית גדולה יותר וקצב הריאקציה מהיר יותר‪.‬‬
‫‪.2‬מהגרפים ניתן לראות כי קצב הריאקציה תחילה עולה (שיפוע חד) לאחר מכן (אחרי כ‪10-‬‬
‫דק') שיפוע הגרף מתחיל להתמתן כלומר קצב פעילות האנזים יורדת הדבר נובע מכך שהאנזים‬
‫הגיע לנק' רוויון וקצב הפעילות שלו נהיה קבוע ככל שהזמן עובר‪.‬‬
‫*ע"פ הוראת המדריכה בהמשך הניסוי נשתמש ב‪ 5-‬דק' כזמן אופטמלי לקצב פעילות מירבי של‬
‫האנזים‪.‬‬
‫‪. 3‬בזמן אפס ניתן להבחין בפעילות אנזימתית אשר לא היתה אמורה להתרחש‪ .‬הדבר יכול לנבוע‬
‫מכך שהוספנו נתרן הידרוקסיד לאחר כמה שניות כך שהאנזים כבר הספיק להגיב‪.‬‬

‫חלק ‪ :3‬פעילות האנזים כנגד ריכוז הסובסטרט ‪:‬גרף מיכאליס מנטן‬

‫מטרת הניסוי‪ :‬תלות הפעילות האנזימתית בריכוז הסובסטרט‬

‫(הטבלה והגרפים יוצגו לאחר החישובים)‪.‬‬

‫ריכוז סובסטרט‬
‫‪O.D. 420 nm‬‬ ‫סטוק (‪)ml‬‬
‫ציטרט בופר‬ ‫ציטרט‬ ‫‪H 2O‬‬ ‫ריכוז סובסטרט‬ ‫מס'‬
‫‪Pi +‬‬ ‫‪Pi -‬‬ ‫‪Pi+‬‬ ‫בופר‬ ‫אנזים‬ ‫)‪(ml‬‬ ‫‪50mM‬‬ ‫‪5mM‬‬ ‫‪0.5mM‬‬ ‫סופי ‪Mm‬‬ ‫מבחנה‬
‫‪0.008‬‬ ‫‪0.001‬‬ ‫‪0.5ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0.035‬‬ ‫‪0.234‬‬ ‫‪ml 0.5‬‬ ‫‪ml 0.5‬‬ ‫‪ml 0.1‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪0.1‬‬
‫‪0.077‬‬ ‫‪0.295‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.114‬‬ ‫‪0.431‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪0.3‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.1‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.178‬‬ ‫‪0.501‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪0.201‬‬ ‫‪0.532‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.204‬‬ ‫‪0.549‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.298‬‬ ‫‪0.564‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.5 ml‬‬ ‫‪0.1 ml‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.4‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪8‬‬

‫דוגמא לחישוב נפח ה‪ pNPP-‬במ"ל (מבחנה ‪:)2‬‬

‫‪C1 = 0.5 mM‬‬
‫? = ‪V1‬‬
‫‪-‬ריכוז סופי‪C2 = 0.1 mM‬‬
‫‪-‬נפח סופי‪V2 = 1 ml‬‬
‫‪C1 * V1 = C2 * V2‬‬
‫‪V1 = C2 * V2 / C1 = 0.1 * 1 / 0.5 = 0.2 ml‬‬

‫‪4‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫כמות‬ ‫כמות‬ ‫מס'‬

‫תוצר‬ ‫תוצר‬ ‫מבחנה‬
‫מהירות תגובה(‬ ‫‪pNP‬‬ ‫‪O.D.‬‬ ‫מהירות תגובה(‬ ‫‪pNP‬‬ ‫‪O.D.‬‬ ‫]‪Final [S‬‬
‫‪)μmol/min‬‬ ‫)‪(μmol‬‬ ‫‪420nm‬‬ ‫‪)μmol/min‬‬ ‫)‪(μmol‬‬ ‫‪420nm‬‬ ‫‪mM‬‬
‫‪0.000‬‬ ‫‪0.000‬‬ ‫‪0.008‬‬ ‫‪0.000‬‬ ‫‪0.001‬‬ ‫‪0.010‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0.002‬‬ ‫‪0.008‬‬ ‫‪0.035‬‬ ‫‪0.014‬‬ ‫‪0.069‬‬ ‫‪0.234‬‬ ‫‪0.1‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪0.004‬‬ ‫‪0.021‬‬ ‫‪0.077‬‬ ‫‪0.018‬‬ ‫‪0.088‬‬ ‫‪0.295‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.007‬‬ ‫‪0.033‬‬ ‫‪0.114‬‬ ‫‪0.026‬‬ ‫‪0.130‬‬ ‫‪0.431‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.010‬‬ ‫‪0.052‬‬ ‫‪0.178‬‬ ‫‪0.030‬‬ ‫‪0.151‬‬ ‫‪0.501‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪0.012‬‬ ‫‪0.059‬‬ ‫‪0.201‬‬ ‫‪0.032‬‬ ‫‪0.161‬‬ ‫‪0.532‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪0.017‬‬ ‫‪0.085‬‬ ‫‪0.284‬‬ ‫‪0.033‬‬ ‫‪0.166‬‬ ‫‪0.549‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪0.018‬‬ ‫‪0.089‬‬ ‫‪0.298‬‬ ‫‪0.034‬‬ ‫‪0.171‬‬ ‫‪0.564‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪8‬‬

‫דוגמא לחישוב תוצר ‪: pNP‬‬

‫השתמשנו בנוסחא אשר מצאנו בחלק ה‪ 1-‬מהעקומת כיול‪.‬‬
‫מבחנה מספר ‪:2‬‬

‫‪y=3. 2631 x+0 . 0073‬‬

‫‪y=O . D‬‬
‫‪O .D−0 . 0073 0. 234−0 . 0073‬‬
‫=‪x‬‬ ‫=‬ ‫‪=0. 069 μ mol‬‬
‫‪3 .2631‬‬ ‫‪3. 2631‬‬
‫דוגמא לחישוב מהירות תגובה‪:‬‬

‫‪μ mol 0. 069‬‬

‫=‪v‬‬ ‫=‬ ‫‪=0 . 014‬‬
‫‪min‬‬ ‫‪5‬‬

‫הכוונה היא ל‪ 5-‬דק'‪( .‬ע"פ חלק קודם של הניסוי)‬ ‫‪‬‬

‫‪5‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫חלק ‪ :4‬פעילות האנזים כנגד ריכוז הסובסטרט עם ובלי מעכב גרף ‪Lineweaver-‬‬
‫‪Burk‬‬

‫מטרת הניסוי‪ :‬פעילות האנזים כנגד ריכוז הסובסטרט והמעכב התחרותי‬

‫]‪1/[S‬‬
‫‪1/V Pi+‬‬ ‫‪1/V Pi-‬‬ ‫)‪(1/mM‬‬
‫‪589.01‬‬ ‫‪71.97‬‬ ‫‪10‬‬
‫‪234.08‬‬ ‫‪56.71‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪152.91‬‬ ‫‪38.51‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪95.58‬‬ ‫‪33.05‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪84.23‬‬ ‫‪31.09‬‬ ‫‪0.5‬‬
‫‪58.96‬‬ ‫‪30.12‬‬ ‫‪0.1‬‬
‫‪56.12‬‬ ‫‪29.31‬‬ ‫‪0.05‬‬

‫חישוב הנתונים לקבלת ‪ Km‬ו‪: V max -‬‬

‫‪1‬‬ ‫‪km‬‬ ‫‪1‬‬
‫=‬ ‫‪+‬‬
‫‪v 0 V max [ s ] V max‬‬

‫בהעדר פוספט‪:‬‬

‫כאשר ‪y=0 : 1/[s] =-1/Km‬‬

‫‪Y=4.4515x+29.677=0‬‬

‫‪X= -29.677/4.4515 = -6.667‬‬

‫‪Km/1-=6.667-‬‬

‫‪6‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫‪Km = 0.149mM‬‬

‫כאשר ‪x=0 : 1/Vmax = 1/V0‬‬

‫‪Vmax = Y=29.677/1‬‬

‫‪Vmax= 0.0337 µmole/min=1/29.677‬‬

‫בנוכחות פוספט‪:‬‬

‫‪Y=51.217x+45.1=0‬‬

‫‪X= -45.1/51.217= -0.880‬‬

‫‪Km/1-=0.880-‬‬

‫‪Km= 1.136mM‬‬

‫‪Vmax=Y=45.1 Vmax=0.022 µmole/min /1‬‬

‫‪Pi+‬‬ ‫‪Pi-‬‬
‫כמות‬ ‫מס'‬
‫תוצר‬ ‫כמות‬ ‫מבחנה‬
‫‪pNP‬‬ ‫תוצר‬ ‫‪Final‬‬
‫פעילות‬ ‫מהירות תגובה(‬ ‫‪(μmol‬‬ ‫‪O.D.‬‬ ‫פעילות ספציפית‬ ‫מהירות תגובה(‬ ‫‪pNP‬‬ ‫‪O.D.‬‬ ‫]‪[S‬‬
‫ספיציפית‪V‬‬ ‫‪)μmol/min‬‬ ‫)‬ ‫‪420nm‬‬ ‫)‪µmole/(min*mg‬‬ ‫‪)μmol/min‬‬ ‫)‪(μmol‬‬ ‫‪420nm‬‬ ‫‪mM‬‬
‫‪0.000‬‬ ‫‪0.000‬‬ ‫‪0.000‬‬ ‫‪0.008‬‬ ‫‪0.00‬‬ ‫‪0.000‬‬ ‫‪0.000‬‬ ‫‪0.01‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪1‬‬
‫‪0.012‬‬ ‫‪0.001‬‬ ‫‪0.004‬‬ ‫‪0.035‬‬ ‫‪0.08‬‬ ‫‪0.005‬‬ ‫‪0.023‬‬ ‫‪0.234‬‬ ‫‪0.1‬‬ ‫‪2‬‬
‫‪0.051‬‬ ‫‪0.003‬‬ ‫‪0.015‬‬ ‫‪0.077‬‬ ‫‪0.20‬‬ ‫‪0.012‬‬ ‫‪0.059‬‬ ‫‪0.295‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪3‬‬
‫‪0.190‬‬ ‫‪0.011‬‬ ‫‪0.057‬‬ ‫‪0.114‬‬ ‫‪0.72‬‬ ‫‪0.043‬‬ ‫‪0.216‬‬ ‫‪0.431‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪4‬‬
‫‪0.593‬‬ ‫‪0.036‬‬ ‫‪0.178‬‬ ‫‪0.178‬‬ ‫‪1.67‬‬ ‫‪0.100‬‬ ‫‪0.501‬‬ ‫‪0.501‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪5‬‬
‫‪1.340‬‬ ‫‪0.080‬‬ ‫‪0.402‬‬ ‫‪0.201‬‬ ‫‪3.55‬‬ ‫‪0.213‬‬ ‫‪1.064‬‬ ‫‪0.532‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪6‬‬
‫‪9.467‬‬ ‫‪0.568‬‬ ‫‪2.840‬‬ ‫‪0.284‬‬ ‫‪18.30‬‬ ‫‪1.098‬‬ ‫‪5.490‬‬ ‫‪0.549‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪7‬‬
‫‪11.28‬‬ ‫‪8‬‬
‫‪19.867‬‬ ‫‪1.192‬‬ ‫‪5.960‬‬ ‫‪0.298‬‬ ‫‪37.60‬‬ ‫‪2.256‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0.564‬‬ ‫‪20‬‬

‫דוגמא לחישוב פעילות ספציפית‪:‬‬

‫מבחנה מס' ‪ 2‬בלי מעכב‪:‬‬

‫)‪V=µmole/ (min*mg protein‬‬

‫)‪V=0.023 µmole /(5min*0.06mg)=0.08 µmole/(min*mg‬‬

‫‪7‬‬
 ‫מגישים‪ :‬ליאור בלסר ת‪.‬ז ‪038799391‬‬
‫איריס קליימן ת‪.‬ז ‪308663970‬‬

‫הנוסחא לקבוע עיכוב‪:‬‬

‫)‪Kmi=Km(1+ [I] /Ki‬‬

‫)‪Ki=Km*[I]/(Kmi-Km‬‬

‫ערך משולש‬

‫‪mM10‬‬ ‫‪ 1‬מ"ל‬
‫‪mM5‬‬ ‫‪ 0.5‬מ"ל‬

‫‪Ki=0.150*5/(1.136-0.150)=0.760‬‬

‫מסקנות לחלק שלישי ורביעי‪:‬‬

‫פוספט הינו מעכב תחרותי לאנזים פוספטאז‪ ,‬דבר שהתבטא בעליה בערכו של ‪ Km‬בנוכחות‬ ‫‪‬‬
‫המעכב‪.‬‬

‫ע"פ הגרף בחלק השלישי רואים שתחילה יש עלייה בפעילות האנזים יחד עם פעילות הסובסטרט‬ ‫‪‬‬
‫עד אשר כל האנזים רוויים ואין עלייה בקצב פעילות האנזים זה בא לידי ביטוי בפלטו‪.‬‬

‫בעזרת עקומת ‪ Lineweaver – Burk‬ניתן לחשב את ערכי ‪ Km‬ו‪.Vmax -‬‬ ‫‪‬‬

‫‪ Km‬עולה כאשר מעכב תחרותי נקשר לאתר הפעיל של האנזים (האפיניות‬ ‫‪‬‬
‫לסובסטרט יורדת) בעוד שערך ה‪ Vmax-‬אינו משתנה בהרבה ‪ .‬קיבלנו נקודות‬
‫חיתוך עם ציר ‪ Y‬קרובות על כן ניתן להסיק ש ‪ Pi‬הינו מעכב תחרותי לאנזים‬
‫פוספאטז כי ערך ה ‪ Km‬עלה בנכחותו ואילו ערך ‪ Vmax‬כמעט ולא השתנה‪.‬‬

‫המשמעות המטבולית של עיכוב ע"י פוספט‪ :‬ירידה בפעילות האנזים פוספטאז כלפי‬ ‫‪‬‬
‫‪ . pNPP‬עיכוב פעילות האנזים עשוי לגרום לפגיעה בתפקוד רקמות מרכזיות בגוף‬
‫בהם מצוי האנזים‪ ,‬כגון‪ :‬כבד‪ ,‬הטחול ותאי הדם‪.‬‬

‫‪8‬‬