完整指南

色谱百科
 章1
中压和高压液相制备 基础原理
色谱技术的类型 5
纯化工艺流程 5
吸附色谱法：中压制备色谱与高压制备色谱 6
色谱系统 8
色谱 10
正相与反相 14
固定相 15
流动相 20
吸附色谱法中常见固定相和流动相的概述 26

章2
耗材和样品加载
快速和制备型HPLC中的耗材 29
低压色谱柱和高压色谱柱的处理 31
自填充空的低压色谱柱和玻璃柱 32
快速型和制备型液相色谱中样品的加载 35

章3
检测方法
快速型和制备型高效液相色谱中的检测方法 39
紫外检测器 39
蒸发光散射检测器 42
质谱检测器 44
示差折光检测器 44
荧光检测器 45
兼容 UV 和 ELS 检测器 46

2
章4
方法的开发
中压和高压制备中的方法开发 49
确定纯化分离的方向(中压或高压制备) 49
分析样品溶解度 49
筛选合适的分离条件 (流动相以及固定相) 50
升级到快速液相色谱或制备型HPLC 54
提高分离度 58

章5
应用
广泛的应用 69
蛋白质/肽 69
维生素 73
天然产品/提取物 79
脂肪 83
碳水化合物 87
小分子药物 89

References 92
注意 94

3
中压和高压液相制备
中压和高压液相制备 基础原理

基础原理
章1

4
 中压和高压液相制备 基础原理

色谱技术的类型

色谱法是将样品（例如有机合成混合物或生物粗提物）分离成单一组分的最强大方法之一。分离
过程基于组分在两相之间的分配系数，这两相为：具有大表面的固定相和洗脱通过固定相的流动
相。

色谱法分为两种：液相色谱法或气相色谱法，其差异与流动相的物理状态有关。在气相色谱中，
流动相是将样品输送通过固定相的气体，而在液相色谱中，流动相是溶剂。化合物与固定相（=分
离模式）的相互作用力受极性，大小或特定结合亲和力的差异支配。分离方式决定了液相色谱的类
型：

液相色谱类型 决定分离方式的因素

吸附色谱法
极性
（正相和反相）

亲和色谱法 特定结合亲和力

凝胶色谱法 分子大小

离子交换色谱法 电荷

表1：液相色谱的类型

纯化工艺流程

吸附色谱法是药物，化学药品，香料和其他药物典型的分离和纯化工艺流程的主要部分。首先，化
合物是从植物，细菌或其他活生物体化学合成或提取的。蒸发将物料浓缩，以简化下游加工。如果
样品是新样品并且不熟悉，则通常通过薄层色谱（TLC）或分析型高压液相色谱（HPLC）方法进行
最佳分离条件的筛选。一旦找到合适的条件，则将会把工艺放大升级至制备色谱。在制备步骤中，
目标化合物通过中压制备色谱，高压制备色谱或两者的结合进行大量纯化。如果将这些技术一起
使用，则中压制备色谱可用于预纯化步骤，而高压制备色谱则用以实现最终的高纯度样品。在成功
分离化合物之后，通过蒸发或冷冻干燥进行第二浓缩步骤。此时，该化合物已准备好通过其他技术
（包括熔点分析，分析型HPLC，酶促测定和其他技术）对其纯度和功能进行分析。下图显示了完整
的工艺流程：

5
中压和高压液相制备 基础原理

提取/合成
蒸发
分析色谱法

TLC 分析型
(正向)(NP) HPLC(反向)

浓缩样品体积

制备色谱法
为随后的制备色谱
步骤筛选最佳条件
中压制备 高压制备高
预纯化 纯度纯化
分离目标化合物

浓缩样品体积 蒸发/冻干 验证纯度/功能

图形1：纯化工艺流程

吸附色谱法：中压制备色谱与高压制备色谱

吸附色谱法是色谱法的第一种形式，它是100多年前由俄罗斯-意大利植物学家Mikhail Tsvet发现
的，他使用吸附色谱法分离植物中的色素。从那时起，它已迅速发展成为所有合成或提取实验室中
使用的主要技术。

在吸附色谱中，分离取决于样品组分与固定相和流动相的相互作用系数。具有不同化学性质（极
性）的化合物对固定相和流动相显示出不同的亲和力或粘合强度。亲和力受两个分子特性（吸附
和解吸）的影响。吸附是指某种组分粘附到固定相的能力。解吸或溶解度描述了混合物中的一种成
分在流动相中的溶解程度。各个样品组分在固定相中洗脱通过的速度取决于其吸附/解吸性能，如
下图所示

吸附 解吸
图形2：吸附与解吸

6
 中压和高压液相制备 基础原理

吸附色谱可以是制备型或分析型。 分析色谱法通常用较少量的样品进行，以对混合物中组分的存
在比例或相对比例进行定量，通过TLC或色谱柱（分析型HPLC）完成。区别在于固定相的类型：在
TLC 中固定相涂覆在玻璃或铝板上，而在色谱柱中固定相则填充在柱容器中。

制备色谱的主要目的是分离或纯化混合物的成分，以用于下游应用。在这里，目标是纯化收集大量
的目标化合物。制备色谱法可以是重力色谱法（低压），快速色谱法（中压）或制备型 HPLC （高
压），这些不同的色谱类型由流动相流过固定相产生的不同压力去区分。重力进料色谱法，也称为
开放式柱色谱法，仅使用重力将物质推过色谱柱，这非常耗时。现代色谱系统使用泵（中压制备纯
化和高压制备纯化），可以提高速度，并使分离过程更高效。下表总结了传统方法和现代方法的优
缺点：

开放式柱色谱法 中压/高压纯化分离法

优点 优点
仪器，维护和耗材的费用低 处理快速
• 高分辨率
• 高流速
缺点 • 高度自动化
非常耗时 低溶剂消耗
• 低分辨率 • 高分辨率
• 低流速
溶剂消耗比较大 高灵活性
• 低分辨率 • 兼容高性能耗材和检测器

低灵活性 高重现性
• 与高性能耗材和检测器不兼容 • 条件稳定

低重现性 无需通风橱
• 不能调整流速或者压力

缺点
需要通风橱
仪器，维护和耗材的费用高

表2：开放式色谱柱对比中压和高压制备色谱

7
中压和高压液相制备 基础原理

第一种被推广的加压制备色谱法是在七十年代末提出的中压色谱法（Flash色谱法）。除此之外，
还尝试增加分析型HPLC系统的尺寸，从而使其也可用于制备纯化的工作（制备型HPLC）。如今，
这两种技术都经常使用，但用于不同的目的：中压色谱法主要用作预纯化步骤，以较高的分离度纯
化大量样品，而制备型HPLC的目标是在一定条件下达到最高分离度（纯度）但是装载能力较低。
因此，两种技术的不同之处在于固定相所用的材料（不同的粒径），色谱柱的尺寸（内径（ID）和长
度）以及流动相的流速，可以参考下表：

中压制备系统 高压制备系统

填料粒径 15 - 63 μm 5 - 15 μm

色谱柱内径 12 - 115 mm 10 -70 mm

流速 15 - 250 mL/min 5 - 100 mL/min

装载量 < 300 g < 10 g

最大压力 50 bar 300 bar

表3：中压和高压制备系统的不同点

色谱系统

完整的色谱系统包括流动相容器，使流动相通过系统的泵，用于样品加载的样品注入单元，填充
有固定相的中压/高压色谱柱（实际发生分离的位置），一个与计算机相连用于测量洗脱液组成变
化的检测器，以及一个馏分收集器，用来收集具有不同组成的所有馏分。所有组件将在下面更详
细地描述。

流动相容器
容器需要足够大，以保持足够的流动相，用来保证固定相不会干掉。对于梯度洗脱，溶剂需要分开
储存在不同容器内，并且都与系统连接

泵
泵必须保持足够高的流速，以抵消由填充在高压或中压色谱柱中的固定相产生的背压。

注射单元
注射单元对于将样品可靠，均匀地输送到仪器内至关重要。样品加载应在没有将空气引入色谱柱
的情况下进行，并且应以最直接的方式进行。

8
 中压和高压液相制备 基础原理

中压/高压色谱柱
中压和高压色谱柱是发生分离的实际位置。它充满了固定相，其硬件应该足够坚固，以抵抗流动相
流过它所产生的压力。

检测器
当分离的组分带从色谱柱上洗脱下来时，需要检测器来对其可视化。 检测器根据匹配样品成分的
信号指示何时切换样品收集容器。由于样品成分的特性差异很大，因此开发了几种类型的检测器（
见色谱百科 卷1）

馏分收集器和废液
当流动相离开检测器时，可以将其收集起来或丢弃。如果流动相包含一个分离的组分带，并带有进
一步处理和评估所需的组分，则需要收集。

计算机
检测器连接到计算机，该计算机是记录生成色谱图所需的电信号的系统组件。 色谱图用于鉴定和
定量样品成分的浓度，并进行正确的收集。

系统连接
所有系统组件都与高压管，阀门和配件相连，以形成一个连续的结构，流动相，样品和由此产生的
分离的组分带可以流过该结构。

典型的液相色谱仪设置如下图所示：

注射阀门

废液切换阀门

色谱柱

流动相容器

检测器 馏分收集器 废液

计算机工作站

图形3：液相色谱系统的设置

9
中压和高压液相制备 基础原理

色谱

色谱分离的结果通过色谱图可视化。 检测到的信号称为峰。 每个峰代表检测器对不同化合物的

响应。 所有检测器信号的整个记录称为色谱图。

色谱图的几个可测量参数对于数据分析和纯化分离的质量控制很重要：

• t0: 色谱柱的死体积时间，表示溶剂以给定流速流经填料色谱柱所需的时间
• tR: 保留时间，是指从样品注入到出现最大峰值之间的时间
• w: 峰的基宽，在两个曲率切线之间测量
• a: 峰的前半宽度的值
• b: 峰的后半宽度的值
• b0.5: 半高处的峰宽

x轴以分钟为单位测量时间，而浓度值绘制在y轴上。

tR

h/2

b 0.5

t0 h/2
a b h10%

0 1 2 3 4 5 6
Time (min)

图形4：色谱图

理想的色谱峰具有尖锐的对称形状，如高斯峰，在平坦的基线上宽度较窄。 获得良好的峰形对于
有效地将目标化合物与混合物中的其他组分分离是必不可少的。 但是，窄宽度是只适用于分析色
谱图的典型代表，不适用于制备色谱，因为较高的样品上样量通常会导致峰展宽。

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 中压和高压液相制备 基础原理

只要峰是对称的，就表示样品是均匀地流过固定相。 如果峰形异常，则表示组分流受到干扰，这
可能是由样品，溶剂或包括中压或高压色谱柱的设备引起的。

有两个方法可以确定峰的形状：

• 不对称因子
• 拖尾系数

在基线以上10％（峰高）处测量的不对称因子（As）定义为：

a是峰高的10％时峰的前半部宽度
b是峰高的10％处峰的后半宽度

拖尾因子测量比基线高5％（峰高）的峰宽，并定义为：

a是峰高的5％时峰的前半部宽度
b是峰高的5％处峰的后半宽度

A Tf 或 As等于1表示完美对称的峰。 低于或高于1时，峰形会呈现前延或拖尾：

前延 高斯曲线 拖尾
Tf or A s < 1 Tf or A s = 1 Tf or A s > 1

下面讨论了如何克服这些问题的常见原因和建议。值得一提的是，峰值失真的原因可能有很多种，
此处可能无法全部例举

11
中压和高压液相制备 基础原理

峰拖尾

• 二级相互作用
电离的硅烷醇基团可以与具有胺和其他碱性官能团的化合物相互作用。结果，并非所有分子都
以相同的速度通过色谱柱，这会导致峰拖尾。为了解决这个问题，可以降低流动相的
值以抑制硅烷醇基团的电离。

• 死体积
色谱系统中过多的柱死体积会导致溶质分子扩散，因此会拖尾峰。这将主要影响早期洗脱峰的
峰形。稍后洗脱的化合物将受到填料本身的影响，因为这些较慢的化合物在材料中的保留时间
更长。

• 样品溶剂
如果样品在初始流动相条件下不能完全溶解，则峰可能会拖尾，因为并非所有分子均质地通过
固定相。因此，确保样品始终完全溶解非常重要。峰拖尾也可能是由于样品溶剂的洗脱强度比
流动相高得多。在通过固定相的过程中，强洗脱能力溶剂由于与流动相的扩散作用而降低，这
导致组分的保留时间不同。 为避免此问题，建议使用流动相作为样品溶解溶剂或确保流动相
的洗脱强度与纯化的起始条件匹配。

• 色谱柱过载
当色谱柱超载时，可能会出现峰拖尾，因为流动相中的化合物浓度非常高，而固定相中的浓度
却很低。高浓度峰比低浓度峰更快速地通过色谱柱。最后，该峰将具有锋利的前部和倾斜的尾
部。可通过减少样品量，稀释样品，更换更大的色谱柱来消除该问题。

前沿峰

• 色谱柱过载
色谱柱超载也会导致前沿。原因与拖尾峰相反：如果固定相中的化合物浓度很高，而流动相中
的浓度很低，则会发生前沿峰。在这种情况下，高浓度峰将比低浓度峰在色谱柱中移动的速度
更慢，并且该峰将变形，并带有倾斜的前部和尖锐的尾部。如上所述，可以通过减少样品量，
稀释样品，更换更大的色谱柱或小柱来消除问题。

• 填料床变形
在色谱柱入口处形成空隙或填料床中存在通道会导致前沿峰。如果色谱柱已经使用了很长时间
并且处于其保存期限内，则可能会发生这种情况。但是，如果问题突然发生，则可能与色谱柱
在过高压力下运行有关。在某些情况下可能会发生这种情况，例如出口筛板或管道被溶剂中的
颗粒堵塞。因此，建议始终使用清洁溶剂并过滤样品。

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 中压和高压液相制备 基础原理

峰分裂

除了峰的前后峰外，还会出现另一个异常的峰形，即峰分裂。峰分裂描述了具有肩膀或双胞胎的高
斯峰：

如果发生峰分裂，则重要的是检查分裂是否发生在一个或两个峰上，或者所有峰均受影响。 如果
仅影响一个峰，则很可能是由于化学问题（分离问题）所致。在这种情况下，可以通过优化流动相
条件最终解决问题。另一种解决方案可以选择其他固定相以改善分离效果。

但是通常，所有峰都受到峰分裂的影响，在这种情况下，问题与色谱柱有关：

• 在色谱柱入口处存在空隙或在填料床中形成通道会导致峰分裂。 使用预包装的色谱柱时，无
法纠正这些问题，因此使用新色谱柱是唯一的选择。

• 入口筛板部分堵塞也会导致峰分裂。 进样前过滤样品可防止发生分裂。 固体上样方式的使

用也可以帮助消除问题。

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中压和高压液相制备 基础原理

正相与反相

通常，中压和高压制备型HPLC可在两种条件下进行：正相和反相。这些条件在固定相和移动相的
极性上不同，因此在其应用方面也不同。在正相色谱中，固定相本质上是极性或亲水性的，而流动
相本质上是非极性或疏水的。当各个组分通过色谱柱时，它们的极性基团与固定相的极性基团相
互作用。低极性物质对固定相的亲和力较低，先被洗脱。为了洗脱亲水性组分，需要在流动相中使
用更多极性溶剂。通常，溶剂的极性会在运行过程中增加，以实现组分的最佳分离效果。
UNPOLAR

Carboxylic acids
Amids
Sulfones/Sulfoxides
Alcohols/Amines
Esters/Aldehydes/Ketones
Nitro compounds
POLAR Ethers
Sulfides
Aromatics Organic halgen compounds
Olefins
Alkanes

图5：正相条件

在反相色谱中，两相相反，所以固定相为非极性，而流动相本质上为极性。在这里，疏水分子吸附
到疏水固定相上，而亲水分子则更快地通过色谱柱并先被洗脱。稍后可以通过使用有机非极性溶
剂降低流动相的极性来洗脱疏水性分子。通常，运行过程中溶剂的极性会降低。
POLAR

Aliphatics
Organic halogen compounds
Ketones
UNPOLAR
Ethers/aldehydes
Amines
Alcohol/phenols
Carboxylic acids

图6：反相条件

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 中压和高压液相制备 基础原理

固定相

固定相需要保留目标化合物，但既不能太强也不能太弱。在没有吸附的情况下，化合物与流动
相一起流过色谱柱，可能无法与混合物中的杂质或其他化合物分离。如果化合物对固定相的粘
性太大，则洗脱将花费太多时间和溶剂。

吸附主要受固定相极性的影响，但其他参数也有影响。这些参数将在下面更详细地讨论。

正相固定相

裸（=未键合）二氧化硅是色谱法中使用最广泛的固定相。它是二氧化硅的一种多孔形式，由
交替排列的硅和氧原子的不规则三维结构组成。
HO
HO O Si
O
O Si O Si
O
HO
Si O
Si O Si O Si
O O O O
HO Si O Si
HO

图7：硅胶分子结构

二氧化硅材料是多孔材料，其中硅烷醇基团分布在填充材料的整个表面（包括孔）上。
HO
HO
HO

HO
HO

HO
HO SiO2

图8：二氧化硅极性表面

二氧化硅呈弱酸性，在2至8的pH范围内稳定。其堆积密度约为0.4至0.8 g/cm3 。

未结合的二氧化硅被认为是具有高样品容量和强机械抗性的经济高效的固定相。这种包装材料是
分离高极性和中极性化合物的理想选择，主要用于中压应用。

其他二氧化硅相（称为键合相）也可用于正相应用。它们具有较低的极性，因此在极性化合物在二
氧化硅上的保留力太强的情况下是很好的选择。

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中压和高压液相制备 基础原理

HO HO HO
HO HO HO
H2N H2N H 2N
O O O

Si Si Si Si Si Si
O O O O O O

氨基 二醇基
图9：氨基和二醇键合二氧化硅的表面

氧化铝是另一种极性相反的相，可以代替未结合的二氧化硅使用。它具有铝和氧原子的网络。 这
种填充材料的活性点是 Al3+ 中心和连接的 O2 - 原子。氧化铝通常是碱性的，但也可以中性或酸
性形式获得。氧化铝凝胶的粒径类似于硅胶。密度约为0.9g/cm3 。对于中性氧化铝，洗脱顺序与
硅胶非常相似
OO
OH OH OH OH

AI AI AI AI AI

O O O O O O

图10：氧化铝结构

氧化铝提供了比二氧化硅优越的pH稳定性（pH 2-12），并且其中性形式经常用于酸敏感化合物，
无法用二氧化硅纯化。尽管铝的载样能力低于二氧化硅，但氧化铝在某些应用中仍具有独特的分
离性能。

反相固定相

反相二氧化硅由非极性有机基团组成，例如通过稳定的Si-O-Si-C-键与硅胶的硅烷醇基键合的
十八烷基（C18），辛基（C8）或丁基（C4）烷基链键。

Si Si Si Si Si Si Si Si Si
O O O O O O O O O

C4 C8 C18

图11：C4，C8和C18键合的二氧化硅

16
 中压和高压液相制备 基础原理

通常，具有长烷基链的C18用于小于2000g/mol的化合物，而C8和C4对于具有较高摩尔质量（最
高10000g/mol）的分子会提供更好的结果。

除正相外，氨基和二醇相还可用于反相应用。由于它们的极性介于非极性和极性之间，因此使氨
基和二醇相成为色谱中的全能色谱柱。在非极性化合物在C18上的保留太强的情况下，它们是理想
的相。

反相色谱中要记住的重要参数是碳负载和封端。如下所述，这些参数在保留方面起着重要作用。

封端

在官能化之后（例如，具有C18链），二氧化硅仍然具有未反应的硅烷醇基（二氧化硅表面上
的游离-OH基）。

非极性封端用于限制游离酸性硅烷醇与碱性化合物的相互作用。较小的疏水物（例如三甲基甲硅
烷基）适合于C18基团之间的紧密空间，并与活性硅烷醇反应，因此使二氧化硅成为非酸性和非
极性二氧化硅。这样可以最大程度地减少碱性化合物与表面的非特异性结合，并改善色谱峰的形
状。

另一方面，极性封端用于在100％的水环境中稳定C18烷基链。由于溶解度的原因，许多极性化合
物更喜欢高度水性的流动相，并且只有在最低浓度的有机改性剂的情况下才能保留。标准C18显示
由于这些条件导致的相塌陷和较差的分辨率。C18的极性封端可以在高水环境中实现相稳定并更
好地保留极性化合物。

O Si O Si O Si
O Si O Si Unpolar O Si Polar
O Si O Si O Si
O Si O Si Unpolar O Si Polar
O Si O Si O Si

无封顶 无极性封端 极性封端

图12：不同类型的封端

17
中压和高压液相制备 基础原理

碳含量

碳载量是指烃与硅胶的共价连接。它取决于键合官能团的相对表面覆盖率和链长。较高的碳含量
通常会导致更好的分离度，但也会延长运行时间。

O Si O Si
O Si
O Si O Si
O Si
O Si O Si

图13：高碳含量和低碳含量的硅胶

粒径

粒径是任何固定相最重要的特性之一。色谱柱或色谱柱中较小的二氧化硅粒径对应于较高的总表
面积。较高的表面积增加了分离中可能的吸附和解吸步骤的数量，因此提高了柱效。

粒度越小，最终产品的分离度和纯度越好。 尽管切换到较小的硅胶颗粒相对容易，但是要考虑因
此带来的背压影响这一限制因素。

将粒径减小一半会使压力值增加3-4倍，如下图所示：
10 µm 20 µm 40 µm 80 µm
Pressure: 23 bar Pressure: 6 bar Pressure: 2 bar Pressure: 0.5 bar

Time (mins) Time (mins) Time (mins) Time (mins)

图14：粒径对背压的影响

对于中压色谱，标准粒径范围为40-60 µm，但对于更复杂的样品，通常使用20-30 µm。 对于制

备型HPLC，粒径范围为5-15 µm，可实现最高纯度分离。

18
 中压和高压液相制备 基础原理

填料形状

硅胶颗粒的形状可以是球形或不规则形状。与不规则颗粒相比，球形颗粒有助于通过色谱柱的流
动更均匀，最终导致更尖锐的峰。由于球形颗粒可以更密集，更均匀地填充在色谱柱中，因此可
以实现更高的分离度。球形颗粒的生产非常复杂，因此这种材料的成本比不规则颗粒的成本高得
多。

通常，球形颗粒可用于复杂的应用，不规则颗粒足以用于基本应用。
规则填料 不规则填料

均质流动 不规则流动

图15：通过球形和不规则二氧化硅颗粒的样品流

孔径大小

二氧化硅颗粒可以具有一定范围的孔径。中压色谱和制备型HPLC中使用的标准孔径约为60至
100 Å。这些孔尺寸非常适合大小不超过5 kDa的小分子，因为这些孔很容易接近，相互作用的
表面很大并且分辨率很高。根据经验，为了易于进入孔，孔的大小应至少为分子直径的三倍。
对于较大的分子，尤其是大于5 kDa的肽或蛋白质，应使用200至300 Å的较大孔径的硅胶来实
现最佳分离。通常，吸附色谱法可用于最大大小为100 kDa的肽。需要使用尺寸排阻色谱法来
分离大于100 kDa的任何分子。

小孔径 大孔径

图16：孔径差异

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中压和高压液相制备 基础原理

表面积

通常，二氧化硅颗粒具有很高的表面积，这是良好分辨率所必需的。它们的比表面积等于其内
外表面积之和，因此受粒度和孔径的影响。但是，由于内部孔隙结构中包含超过99%的表面
积，因此孔径起着最重要的作用。 通常，孔径越小，表面积越大，分离效果越好。但是，这
仅适用于易于扩散到孔中的分子，因此化合物尺寸与孔尺寸之比对于满足此规则至关重要。

用于纯化小分子（> 5 kDa）的二氧化硅的典型表面积约为500-600平方米/克，而键合二氧化硅
的表面积为200-300平方米/克。 对于氧化铝，表面积要低得多，约为150平方米/克。

流动相

流动相的最重要特征是其溶解样品的能力以及将目标化合物穿过固定相的速度都不太快也不太
慢。 速度取决于溶剂的强度及其从固定相的活性部位置换或洗脱底物的能力。从这个意义上说，
溶剂被描述为弱溶剂或强溶剂，通常在分过程中将两者结合使用。

除溶剂强度外，还有其他因素会影响溶剂对特定分离问题的适用性。这些属性包括偶极子参数，
质子供体参数和质子受体参数，它们都对分离产生影响。

正相色谱中的溶剂

在正相色谱法中，使用的溶剂是非极性或疏水性的。弱溶剂和强溶剂的典型溶剂组合为己烷/
乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇。二氯甲烷/甲醇比己烷/乙酸乙酯具有更高的极性，因此它更适合
于分离极性更大的化合物。下表概述了正相色谱法中其他常见的溶剂，指出了它们的极性和其
他特性。 极性更大的溶剂具有更高的溶剂强度。

20
 中压和高压液相制备 基础原理

溶剂 极性 E° 偶极参数 质子受体参数 质子供体参数

正戊烷 0.00 0 0 0

正己烷 0.00 0 0 0

石油醚 0.01 0 0 0

环己烷 0.04 0 0 0

二甲苯 0.26 0 0.5 0

异丙醚 0.28 0.5 0.5 0

甲苯 0.29 0 0.5 0

乙醚 0.38 2 2 0

氯仿 0.40 3 0.5 3

二氯甲烷 0.42 5.5 0.5 0

四氢呋喃 0.45 4 3 0

丙酮 0.56 5 2.5 0

二氧六环 0.56 4 3 0

乙酸乙酯 0.58 3 2 0

表4：正相色谱中的溶剂

在反向色谱中的溶剂

在反相色谱中，流动相具有极性，因此水成为最弱的溶剂。溶剂强度值随极性的降低而增大。
反相色谱中常用的流动相是水和另一种与水混溶的溶剂（例如甲醇、乙腈或乙醇）混合物。

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中压和高压液相制备 基础原理

溶剂 极性 E° 偶极参数 质子受体参数 质子供体参数

乙腈 0.65 8 2.5 0

丙醇 0.71 2.5 4 4

乙醇 0.88 4 5 5

甲醇 0.95 5 7.5 7.5

水 Large Large Large Large

表5：反相色谱的溶剂

混溶性

混溶性是描述两种物质混合在一起的程度，或者描述它们在任何浓度下相互形成均相溶液的程
度。流动相通常是由可混溶的混合溶剂组成。下面是各种溶剂之间的混溶表。

正戊烷
正己烷
石油醚
环己烷
二甲苯
二异丙基醚
甲苯
乙醚
氯仿
二氯甲烷
四氢呋喃
丙酮
二氧己环
乙酸乙酯
乙腈
正丙醇
乙醇
甲醇
水

图17：溶剂混溶性

紫外吸收和沸点

当用紫外检测器时，溶剂不应吸收检测器所使用波长的紫外线，以避免干扰，使样品能正确的
识别收集。低沸点溶剂有利于蒸发光散射检测（ELSD），因为它们可以在较低温度下工作，
这有利于化合物的稳定性。此外，低沸点使后运行浓缩步骤蒸发时更容易和更快。

22
 中压和高压液相制备 基础原理

溶剂 紫外截止波长 沸点 °C

正己烷 210 69

环己烷 210 81

乙醇 210 78

甲醇 210 64

二氯甲烷 245 40

乙酸乙酯 260 78

丙酮 330 56

乙腈 200 81

甲苯 285 111

二丙醚 220 90

氯仿 245 62

水 190 100

丙醇 210 82

四氢呋喃 220 66

二氯甲烷 230 84

N,N-二甲基甲酰胺 270 153

二甲亚砜 265 189

苯 280 80

表6：溶剂的紫外截止波长和沸点

毒性

制备色谱中毒性最大的部分涉及流动相中的有机溶剂。通常，正相溶剂中，特别是是正己烷和
二氯甲烷（DCM），比反相溶剂毒性更大。从常用的反相溶剂来看，乙腈的毒性最大，其次
是甲醇，然后是乙醇。用户可以尝试通过尽量减少流动相中有机溶剂的量来降低其纯化过程的
毒性水平。这可以通过使用缩短长度、内径和颗粒大小的柱子来实现。或者，可以用毒性较小
的溶剂代替毒性大的流动相，例如异丙醇和DMSO或水。对于等度分析，可行的选择是使用流
动相回收器，以最大程度地减少危险废物。

23
中压和高压液相制备 基础原理

粘度

粘度描述了流体的流动阻力。低粘度的溶剂较不粘稠，可最大程度地降低色谱柱的背压，因此
备受青睐。当使用特定比例的水和高粘度有机溶剂的混合物时，粘度尤其重要。比较普通的正
相溶剂时，乙酸乙酯和二氯甲烷的粘度比正己烷大，从反相色谱中使用最频繁的溶剂来看，乙
醇是最粘稠的，其次是甲醇，然后是乙腈（请参见下图）。

[cP] at 20 °C

3 3
viscosity

n-propanol
2 2

ethanol
1 1
water

methanol
acetonitrile

0 20 40 60 80 100 % [w/w] organic

图18：不同水混物的粘度

溶剂改性剂

流动相的pH对离子化合物的保留时间及其峰形有很大的影响。中性化合物不受pH值的影响。
由于离子化合物可溶于水，并且与可电离的硅烷有发生不可逆相互作用的风险，因此pH控制
主要发生在反相应用中。在调整溶剂的pH值之前，重要的是要知道二氧化硅骨架Si-O-Si在pH
值为8.0时会水解，而氧化铝在pH值为2-13时是稳定的。溶剂改性剂的浓度通常为1%或更少，
并在高于或低于其pK值的最多1个单位下有效缓冲。

酸性和碱性化合物可能在中性pH下形成偶联物，导致峰形变差甚至双峰。如果是酸性分析物，pH
会降低，因此该化合物不会电离。通常，在反相应用下，离子抑制的分析物比离子化的分析物具有
更好的保留能力。对于碱性化合物，离子抑制形式可能处于不适合固定相的高pH值条件下。但是，
大多数碱基都是在低pH值条件下进行纯化的，在这条件下显示出良好的分离效果。

24
 中压和高压液相制备 基础原理

影响酸性和碱性化合物保留的另一个问题是在中等pH值条件下硅烷表面上硅烷醇的潜在电离作
用。通常，这些硅烷醇会去质子化并带负电荷。这可以导致带正电荷的碱性离子的保留增加，从而
导致离子交换相互作用（一种次级相互作用）。结果往往是峰拖尾，这是由于与反相色谱柱不同的
相互作用所致。可以通过在硅烷醇未离子化的低pH值下工作或在流动相中加入竞争性的胺（例如
氢氧化铵）来避免这种影响。由此，硅烷醇在流动相中吸引了胺添加剂，从而中和了它们。

有几种不同的pH调节剂，适用于溶剂的pH控制。但是，考虑用于该应用的检测器的类型很重要。
紫外线检测器需要使用低紫外线截止波长的添加剂，对于ELSD检测器，需要一定的挥发性才能获
得准确的结果。下表显示了最常见的流动相改性剂。

改性剂 紫外线截止波长 pKa

三乙胺 267 nm 10.8

三氟乙酸 210 nm 0.3

乙酸 210 nm 4.8

乙酸铵/甲酸铵 200 nm 9.2

甲酸 210 nm 3.8

表7： 吸附色谱中的改性剂

25
中压和高压液相制备 基础原理

吸附色谱法中常见固定相和流动相的概述

固定相 吸附色谱的类型 表面极性

硅胶 正相色谱 极性

C18 反相色谱 非极性

C18 WP 反相色谱 非极性

氨基 正相&反相色谱 中等极性

二醇基 正相&反相色谱 低极性

氧化铝 正相色谱 极性

26
 中压和高压液相制备 基础原理

合适的溶剂系统 保留 备注

高保留的高至中极性化合物
• 正己烷/乙酸乙酯
• 二氯甲烷/甲醇 不保留的非极性化合物
最受欢迎的极性流动相
• 没有水！
强极性化合物的保留能力很
强

• 水/甲醇 高保留的中等至非极性化合物
• 水/乙腈 最受欢迎的非极性流动相
• 水/乙醇 没有保留的强极性化合物

• 水/甲醇 高保留的中等至非极性化
孔径宽（200-250A:非常适合
• 水/乙腈
＞2000Da的蛋白质/肽
• 水/乙醇 没有保留的高极性化合物

请参考C18和硅胶 高保留率的中等极性化合物 碳水化合物和胺类的理想选择

请参考C18和硅胶 高保留率的低极性化合物

强保留的高极性至中等极性化
• 正己烷/乙酸乙酯 合物
提供中性、酸性和碱性类型
• 二氯甲烷/甲醇 不保留的强非极性化合物
保留很强的极强化合物

27
耗材和样品加载
耗材和样品加载

章2

28
 耗材和样品加载

快速和制备型HPLC中的耗材

制备液相色谱的用户在耗材方面有多种选择。耗材的选择非常重要：通过色谱柱从合成混合
物或天然提取物中分离化合物。色谱系统只会使分离过程高效便捷。

用户可以选择：

低压色谱柱（预包装或空） 玻璃柱（空） 高压色谱柱（预装）

与制备型HPLC相比，Flash色谱耗材种类更多。这是因为对于Flash应用，用户可以选择低压色
谱柱（预装或空）或玻璃柱（空）。 在制备型HPLC中，色谱柱总是预先填充的。

选择耗材之前，需要考虑以下几个因素：

• 分离难度
• 纯度要求
• 样品量
• 纯化通量
• 可用仪器

Flash和制备型HPLC耗材具有各自独特的优势。 制备型HPLC色谱柱通常用于在高背压下进
行的高效分离。它们的分离能力因为尺寸规格受到限制，因此不适用于需要大量化合物的应
用。Flash色谱柱用于不需要高效率但样品量高的纯化。通常，将Flash用作预纯化步骤，然后
通过制备型HPLC以达到最高纯度。下表列出了快速HPLC和制备型HPLC的区别。

Flash Prep HPLC

Particle size 15-63 μm 5-15 μm

Column ID 12-115 mm 10-70 mm

Flow rate 15-200 mL/min 5-100 mL/min

Loading capacity < 300 g < 10g

Max pressure 50 bar 300 bar

表1：快速和制备HPLC对比

29
耗材和样品加载

Flash应用中的耗材通常有三个选项：预装的低压色谱柱，空的低压色谱柱或空的玻璃柱。 耗
材的选择取决于应用程序的要求。 下表讨论了优缺点：

优点 缺点

• 高灵活性（可用的材质 • 大多数色谱柱的压力极
预装低压色谱柱（聚丙烯材质 和尺寸范围广泛） 限较低（通常为10-15
外壳，填料通常是二氧化硅） • 专业填充造就的高质量 bar）
• 无投资成本 • 高耗材成本

• 费时的填充和清洁步骤
• 耗材成本低（仅散装二 • 中低水平的分离结果
低压色谱柱空柱管（聚丙烯材 氧化硅） • 填充会产生细小的灰尘
质外壳）
• 无投资成本 颗粒（影响用户安全）
• 不能反复填充

• 耗材成本低（仅散装二
氧化硅）
• 额定压力高（最高 • 高投资成本
50bar） • 费时的填充和清洁步骤
玻璃柱空柱管（玻璃材质外
• 在规格方面具有很高的 • 中低水平的分离结果
壳）
灵活性（g至kg） • 填充会产生细小的灰尘
• 使用寿命长（可以重新 颗粒（影响用户安全）
填充）

表2：Flash应用所需耗材

制备型HPLC色谱柱通常不自动填充。制备型HPLC的主要目标是高分离度，只有在材料完全
填充后才能实现。这是通过浆液填充完成的，以便制备型HPLC色谱柱可将二氧化硅和溶剂（
通常为异丙醇/乙醇）一起输送。 制备型HPLC色谱柱的外壳材料是不锈钢，可以承受较高的
背压

30
 耗材和样品加载

低压色谱柱和高压色谱柱的处理

正确处理低压色谱柱或高压色谱柱非常重要。 它可能对色谱柱的寿命以及所获得结果的质量
产生重大影响。

平衡

Flash和制备型HPLC耗材可通过平衡去除所有残留气体，保证样品和溶剂在分离过程中均匀，
稳定流动。 这有助于避免不必要的分离问题，例如未分离的化合物和低纯度馏分。

色谱柱的平衡时间取决于其尺寸。 通常，用5-10倍柱体积（CV）的起始溶剂冲洗色谱柱来达
到平衡。对于低压色谱柱，平衡过程会由于溶剂吸附在干燥的二氧化硅介质上而产生热量。
产生的热量主要取决于以下参数：

• 溶剂类型
• 流速
• 二氧化硅的量

由于二氧化硅是极性材料，因此与极性较小的溶剂的吸附相比，极性溶剂的吸附更强，并产
生更多的热量。 较高的流速会导致产生更多的热量。 在较小的色谱柱中，由于停留时间相
对较短，热量很容易消失，并且很容易传递到墨盒壁上。 在包含大量二氧化硅的大尺寸色谱
柱中，通过壁的传热较慢，这导致在柱中积聚了更多的热量。大量滞留的热量可能达到很高
的水平，以至于由于相关的压力增加，色谱柱可能会损坏。 热量还会通过吸附和解吸步骤影
响色谱过程，从而降低分离效率。产生的热量还可能导致半挥发性化合物部分或全部蒸发。
为了解决这些问题，建议减少平衡过程中极性溶剂的量。 在平衡过程中降低流速也可能会有
帮助。一旦填充的硅胶床被正确润湿，就可以控制热量的产生，并且可以获得最佳的分离产
率。由于制备型HPLC色谱柱是作为浆液包装的，并且被润湿输送，因此不会观察到平衡过程
中的加热。

储存和清洁

通常，不建议存储正相填料（未粘结的二氧化硅）。 因为与极性溶剂或水痕迹接触时，该极
性填料会失活。而且一旦二氧化硅失活，就不可能重新活化它。由于选择性的改变，失活的二
氧化硅不能提供与以前相同的分离效果。可以使用反相填料（键合的二氧化硅，例如C18，C8
，C4，氨基和二醇）进行多种分离，因为这种疏水性固定相可以用有机溶剂清洗。强保留的
杂质可以被去除，因此色谱柱可以保存更长时间。尽管反相填料的成本比二氧化硅填料高，但
它们可以重复使用，这可以平衡成本差异。一旦湿润，建议不要干燥反相色谱柱。由于固定相
的膨胀和收缩，变干会导致形成通道。色谱柱应用20%的水和80%的有机溶剂（如乙腈，甲醇
或乙醇）湿润保存。有机溶剂的存在可以有效避免细菌/藻类生长。由于低压色谱柱的外壳材
质是聚丙烯，因此无法将其保存在100%的己烷当中，因为这样会造成外壳软化。

31
耗材和样品加载

进一步的建议

• 请勿超过最大压力极限，并避免压力冲击，否则可能导致硅胶床塌陷。
• 切勿将100%的水与标准C18材料一起使用，因为这会导致相塌陷并对分离产生不利影
响。 特殊的防水C18相可用于需要100%水的应用。
• 如果供应商文档中没有另外说明，则将pH范围保持在2-8之间。否则，二氧化硅可能会损
坏。
• 对于制备型HPLC色谱柱，请使用保护柱，以防止杂质不可逆地吸附在色谱柱硅胶上，从
而延长了色谱柱的使用寿命。

自填充空的低压色谱柱和玻璃柱

如果用户决定自己填充色谱柱，那么对他而言，获得均匀的颗粒分布和均匀的填充密度非常重
要。然而，手动填充的耗材柱效通常无法与专业填充的色谱柱相提并论：分离效率和重现性较
低。对于希望以最经济的方式纯化简单混合物的情况，自填充是一种合适的解决方案。由于可
以使用多种预包装的色谱柱，因此用户很少用自填充的方式。 而且，聚丙烯硬件的重复使用
受到限制，它在反复使用时不是很坚固。因此，玻璃柱通常是用户自填充和重复使用的首选。

填充玻璃柱有两种方法：干式和湿法填充。通常，干法填充是使用压缩气体的方法，比较快
速简便，但是填充密度不那么稠密。因此，它仅适用于中大型二氧化硅颗粒（25-200 μm）。
对于较小的颗粒，建议使用二氧化硅和溶剂的混合液，通过泵将其填充到玻璃柱中。

通常，任何填充过程都可以分为三个阶段：

• 准备
• 填充
• 压实

以下是干法填充和湿法填充方法的简短说明。

32
 耗材和样品加载

干法填充玻璃色谱柱

干包装过程所需的材料包括分离色谱柱，填充容器，二氧化硅，氮气瓶和漏斗。在制备步骤
中，必须将色谱柱清洗至干净并完全干燥。垂直夹紧色谱柱，并拧紧填充容器。然后借助
漏斗将二氧化硅松散地引入。用二氧化硅占据填充容器的程度应是色谱柱体积的至少10%
过剩。重要的是，切勿敲击色谱柱或使其振动，这将导致不可避免的颗粒分离并使色谱柱无
用。在最后阶段，将氮气从氮气瓶吹过色谱柱，直到听不到嘶嘶声为止。氮气瓶的主阀必须
关闭，并且压力必须完全降低。 此程序至关重要，因为否则在拆下氮气软管时色谱柱床会分
开。 该柱现在可以进行平衡了。

Silica

Funnel
Filling
vessel
Nitrogen cylinder

Separation
column

Filling Compacting

图1：干法填充玻璃色谱柱

干法填充柱的平衡直接用分离所需的溶剂进行。建议从刚装满的色谱柱中丢弃前100至200 ml
的液体，然后才循环溶剂。该预防步骤可防止已洗掉的硅胶细颗粒进入泵。一旦空气停止从
色谱柱中流出并且检测器的基线稳定，就可以进行分离。

33
耗材和样品加载

湿法填充玻璃色谱柱

该过程所需的材料包括分离玻璃柱，浆料填充容器，二氧化硅，溶剂，漏斗和烧杯。首先，
将色谱柱清洗然后干燥。将硅胶悬浮在溶剂中。典型比例为1 g二氧化硅与2-3 ml溶剂，如下
表所示：

Column Slurrying process (ml of

Silica gel (g)
ID x L (mm) solvent)

26 x 460 150 300 – 600

36 x 460 270 500 – 900

49 x 460 470 800 – 1200

70 x 460 1000 2000 – 2500

表3：玻璃柱中二氧化硅与溶剂的比例

将塔垂直地夹紧，将浆料填充容器拧紧，然后将浆料从填充容器引入塔中。填充容器中已完全
充满溶剂，并且色谱柱入口已连接到泵。通过泵，泵送1-2柱体积的溶剂，直到二氧化硅被很
好地压实。
用湿法填充的色谱柱不需要额外的平衡步骤，可以在1-2个柱体积溶剂流过吸附材料后立即使
用。

Silica /
Solvent slurry
Pump

Funnel
Filling
vessel

Solvent

Separation
column

Filling Compacting

图2：湿法填充玻璃柱

34
 耗材和样品加载

快速型和制备型液相色谱中样品的加载

在制备色谱中，样品的加载量是最重要的，但也可能会带来挑战。要纯化的混合物应以合适
的浓度尽可能紧凑地添加到色谱柱柱床上，以实现窄的水平谱带。如果样品体积太大，则谱
带会变宽，分离效率会降低。

装载能力

Flash和Prep HPLC的上样量有很大不同。由于Flash色谱通常用于预纯化，高分辨率不是优先
考虑的因素，因此载样量往往比Prep HPLC高。在Prep HPLC中，目标更集中于获得最高纯度
的物质，因此基线必须得到分离。
正相和反相二氧化硅（如C-18、氨基或二醇基）的载样量也存在相当大的差异。由于非键合
相二氧化硅的表面积大，因此这种固定相的载样能力更高。在定量方面，正相二氧化硅的载样
能力通常比键合二氧化硅介质的载样量高约10倍。加载量（%）表示如下：

g样品/g填料 × 100

示例：在载样量为10%的120g硅胶柱上，最大样品量为12g。

标准二氧化硅（粒径40-60 μm）通常可接受10%的载样量，使用较小颗粒（15-30 μm）可以

达到30%。然而，重要的一点我们要知道，无论是反相还是正相，载样量由样品的复杂程度决
定的。对于含有多种化合物的复杂样品，决定其复杂性的因素是目标化合物与其邻近的洗脱组
分的分离程度。通常情况下，复杂样品只能少量上样。

样品加载技术

在液相色谱中，样品可以通过两种不同的方式上样：固体或液体。液体上样，是将样品溶解在
溶剂中后，直接注入色谱柱上。固体上样，是将粗样品与载体材料（如二氧化硅）的固体均匀
混合物放在色谱柱前面。

Solvent Support material

(e.g. silica)
Crude sample Crude sample

图3：液体和固体样品

35
耗材和样品加载

每种技术都有其需要考虑的特殊方面，下面将进行更详细的讨论。

液体上样是一种将样品很好地溶解在洗脱初始溶剂中的方法，可用于Flash和Prep液相色谱应
用中。推荐使用弱极性溶剂，因为强极性溶剂会降低分离度。液体上样被认为是最简单、最
快捷的方法，但可能会造成样品损失，需要考虑以下因素。

• 化合物在初始溶剂中的溶解度:样品需要完全溶解，因为进样系统或色谱柱顶部的沉淀可
能在系统中产生过大的压力，并最终导致样品流失。
• 溶解溶剂的极性：如果使用极性溶剂溶解样品，则它们可能会吸附在极性硅胶柱基质上，
并对更多极性化合物（后来在硅胶材料上洗脱的化合物）的分离产生不利影响。
• 样品溶剂的体积:体积越大，样品从一开始就迁移到填料柱床中的风险就越高，从而导致
谱带变宽、分离度降低。理想的样品体积不应超过色谱柱体积的10%。样品的保留率越
高，可装载的体积就越大。
• 样品量：每个小柱或色谱柱都有规定的装载量。理想的样品量不应超过纯化柱的最大装载
量。

在Flash液相色谱中，通常是在注射器的帮助下将液体样品手动直接注入到色谱柱顶部（如下
图）。由于高背压，无法在Prep液相色谱柱上进行手动上样。因此，上样是通过专用的进样
阀完成的，如图所示：

Syringe Syringe
(liquid sample) (liquid sample)

Injection
valve

Flash Prep
cartridge HPLC
column

图4：Flash和Prep HPLC中的液体上样

固体上样是仅适用于Flash色谱分离应用的技术，用于只能在强溶剂中溶解的样品，或用于具
有难以清除的粘性或多杂质样品。该方法还可以通过减少谱带展宽和随后的拖尾效应来改善分
辨率。一般来讲，固体上样分离较慢，但与液体上样相比，分辨率更高。推荐的样品量不应超
过色谱柱的最大载样量。

36
 耗材和样品加载

固体上样通常通过以下步骤完成：

• 将粗样品溶解在合适的极性溶剂中。
• 然后，将该混合物超声几分钟，以提高溶解度。
• 过滤混合物以除去尚未完全溶解的物质。
• 将硅胶以粗样品重量的5倍添加到上述混合物中。
• 溶剂通过旋转蒸发仪完全地除去。
• 最后，将粗样品和硅胶的混合物装入预柱（固体装样器），然后将其安装在色谱柱的前
面。连接溶剂洗脱流路。
• 待分离的组分不断地从预柱中洗脱到实际分离色谱柱中。

Solid loader
(solid sample)

Flash
cartridge

图5：在Flash色谱分离中的固体上样

支撑材料在固体上样技术中起到至关重要的作用：粗样品被吸收，使洗脱的化合物能更好地
转移和分配。它还可以将样品固定在适当的位置。这对于具有挑战性的样品（如油性提取
物）非常有利。
非键合的二氧化硅是最常用的吸附剂，但可能不是最佳的选择。通常，建议使用与色谱柱相同
类型的硅胶作为支撑材料。这样可以避免不必要的化学相互作用或样品的不可逆吸附。一种有
用的替代材料是 Celithe,由于其中性的化学特性，它不与任何物质发生相互作用。

技术 优势 劣势

液体上样 快速、简单 降低分辨率

固体上样 高分辨率 耗时

图4：固体上样和液体上样的差异

37
检测方法
检测方法

章3

38
 检测方法

快速型和制备型高效液相色谱中的检测方法

当进行色谱分离时，最重要的是确定物质从色谱柱中洗脱出来的时间点，以实现最佳的馏分收
集效果。色谱检测器是一种用于检测单个物质从色谱柱中洗脱出来时是否存在的设备。检测器
将洗脱液的变化转换为电信号并由数据系统记录。

在制备型液相色谱法中，所用检测器必须适应与工艺相关的高流速和高样品浓度。因此存在
着各种类型的检测器，并且每种类型的检测器都有其特定的优点和局限性。在下文中，将更
详细地讨论液相色谱中五种常用的检测器类型。

紫外检测器

紫外线检测器是制备色谱中最常用的检测器。紫外检测器是一种选择性检测器，这意味着它
仅测量紫外光范围（200 - 400 nm）或可见光范围（400 - 800 nm）中吸收指定波长的物质。
适用于紫外线检测的物质包括具有发色团的化合物，比如:

• 芳香环
• 两个共轭双键
• 与带有一对电子的原子相邻的双键
• 羰基
• 溴，碘或硫

紫外线检测器测量穿过溶液的紫外线的强度变化。光的吸收与光束穿过的溶液浓度有关。兰
伯特-比尔定律描述了这种关系：

E = 吸光度【无单位】
ε = 摩尔吸收系数【M–1· cm–1】
c = 液体浓度【mol/l】
d = 光束通过溶液的路径长度【cm】

每种溶剂都有一个紫外吸收截止波长。 在低于该值的波长处，溶剂本身吸收所有光。 使用紫

外检测器时，必须选择一种在测量的波长处没有明显紫外线吸收的溶剂。 否则，物质和溶剂
的信号会重叠，从而导致馏分收集不正确。

39
检测方法

典型的常用溶剂为丙酮，甲苯和苯，其包含的信息如下表所示：

溶剂 紫外截止波长（nm） 溶剂 紫外截止波长（nm）

丙酮 330 二丙醚 220

甲苯 285 正己烷 210

苯 285 环己烷 210

N，N-二甲基甲酰胺 275 乙醇 210

二甲基亚砜 275 甲醇 210

乙酸乙酯 260 丙醇 210

二氯甲烷 245 戊烷 200

氯仿 245 乙腈 200

二氯乙烷 230 水 190

四氢呋喃 220

表格1: 快速型和制备型高效液相色谱中的常用溶剂

如果化合物的吸收光谱未知，则同时使用多个波长甚至是可以记录整个紫外光谱的二极管阵列
检测器（DAD）是非常有用的。二极管阵列检测器还可以通过显示每个峰的吸收光谱来确认纯
度和化合物特性，从而避免了馏分后通过薄层色谱（TLC）去确认。例如，咖啡因，香兰素和
胡椒碱的 DAD 分析如下所示：

图形1: 咖啡因，香兰素和胡椒碱这三种化合物的常见紫外 图形2: 咖啡因，香兰素和胡椒碱的紫外信号

信号（200- 400nm）的典型色谱图 （200-400 nm）3D 数据，图内最大吸收值时

40
 检测方法

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图形3: 香兰素峰的紫外吸收光谱详情

紫外检测的优势 紫外检测的局限性

• 使用简单 • 如果化合物不具备良好的发色团，则较难检测
• 可靠 • 溶剂受紫外线截止波长的限制，尤其是在低紫
• 相对低成本 外线波长下
• 适应梯度洗脱
• 不会破坏样品
• 相对灵敏（取决于化合物活性）
• 体积小巧

表格2: 紫外检测的优势和局限

41
检测方法

蒸发光散射检测器

ELSD 的一般机制涉及测量已通过蒸发溶剂的干燥颗粒散射的光量。该过程包括三个步骤：雾
化，溶剂蒸发和检测（参见下图）。在雾化过程中，雾化器将空气或氮气的气流与色谱柱或
色谱柱的流出物合并，以产生微小液滴的气溶胶。在下一步中，将液滴引入漂移管中，在其
中流动相蒸发并留下目标化合物的颗粒形式。在最后一步中，光撞击离开了漂移管的干燥颗
粒，光被散射，并且所产生的光子被光电二极管检测到。

步骤1. 雾化 步骤2. 流动相蒸发 步骤3. 检测

图形4: Process of ELSD

ELSD数学方程式描述由颗粒大小决定。峰面积（A）与色谱柱中的分析物数量有（m）：

A = amb

其中m是溶质，a 和 b 是常数，取决于很多因素，例如颗粒大小，目标物质的浓度和类型，
气体流速，流动相流速和漂移管的温度。

ELS 检测器是纯化不含发色基团的化合物的首选。这样的化合物包括碳水化合物，脂质，脂肪
和聚合物。ELS 检测器的功能不受流动相变化和梯度基线偏移的影响。ELSD 灵敏度与化合物
的物理和化学性质无关，因此仅由化合物的绝对量决定。ELSD 是一种质量型检测器，这意味
着高信号表明有大量化合物正在洗脱。作为一种半定量技术，它提供了有关样品中化合物比
例的有价值的信息。

ELSD 可以检测几乎所有化合物，但高挥发性分析物（例如酒中的乙醇）除外。 通常，目标化

合物的挥发性必须小于流动相。流动相中的任何修饰剂也必须是挥发性的。由于 ELSD 是一种
破坏性检测器，因此转移到 ELSD 的样品量应尽可能少。
流动相的沸点越低，溶剂越容易蒸发。具有高沸点的流动相（例如DMS, DMF, 甲苯或水），
要么需要在高温下蒸发，可能有破坏目标物质的风险，或者雾化成极小的液滴，即使在室温下
也可以蒸发。

42
 检测方法

溶剂 沸点°C

二甲基亚砜 189

N，N-二甲基甲酰胺 153

甲苯 111

水 100

丙醇 97

二丙醚 90

二氯乙烷 84

乙腈 82

环己烷 81

苯 80

乙酸乙酯 77

乙醇 78

正己烷 69

四氢呋喃 66

甲醇 64

氯仿 62

丙酮 56

二氯甲烷 40

表格3: flash 和制备型 HPLC 中常用溶剂的沸点

ELSD 的优势 ELSD 的局限性

• 检测挥发性比流动相低的化合物 • 仅可使用挥发性流动相
• 灵敏度高 • 样品的挥发性必须小于流动相
• 直接操作 • ELSD 是一种破坏性技术
• 梯度兼容–在梯度期间保持稳定的基线

表格4: ELSD 的优势和局限性

43
检测方法

质谱检测器

液相色谱法根据化合物的理化性质分离化合物，而质谱（MS）则按质量区分化合物。质谱仪
作为色谱检测器，可根据其唯一的质谱图识别与每个色谱峰相对应的物质。
液相色谱系统与 MS 检测器结合使用的基本组件如下所示：

液相色谱 离子源 质量分析器 检测器

图5: 带有 MS 检测的液相色谱系统的组件

该工作流程涉及将分子从色谱洗脱液转换为带电或离子化状态。质量分析器是质谱仪的组成部
分，它吸收离子化的质量，并根据荷质比将其分离。然后，分析仪将它们输出到检测器，在检
测器中将它们识别并转换为数字输出。

MS 的优势 MS 的局限性

• 灵敏度高 • 购买价格很高
• 高选择性 • 需要经常维护
• 提供结构信息

表格5: MS 检测器的优势和局限性

示差折光检测器

示差折光检测器测量介质在流过流通池时由于光引起的折射变化。检测器是非选择性的，因
为它会记录流过该池的所有物质。示差折光检测器根据以下原理进行测量：

= 折射率之间的差异
nG = 溶解样品的折射率
nL = 纯溶剂的折射率
ni = 样品的折射率
c = 样品浓度

由于折射率检测器不是特定的，因此是通用的。但是，这种检测器不适用于梯度洗脱，因为总
是将洗脱液与参比池中的纯溶剂进行比较。因此，该系统对流动相组成的变化很敏感。另外，
检测器对温度变化高度敏感。

44
 检测方法

RI 检测的优势 RI 检测的缺陷

• 检测器响应的普遍性 • 不能使用溶剂梯度
• 良好的线性动态范围——约4个数量级 • 灵敏度低
• 易于操作 • 对温度和压力波动非常敏感

表格6: RI 检测的优点和缺点

荧光检测器

当具有特殊官能团的化合物被较短波长的能量激发时，它们会发出较高波长的辐射或荧光。
荧光强度由激发波长和发射波长共同决定，这使得有选择地检测某些成分成为可能。
大约15%的化合物有天然荧光。这些化合物包括具有羰基的脂肪族和脂环类化合物以及具有
高共轭双键的化合物。具有共轭_电子的芳香组分具有最强的荧光活性。
荧光检测器是现有检测器中灵敏度最高的检测器之一。它的灵敏度是紫外检测器的10到1000
倍。

荧光检测的优势 荧光检测的缺点

• 灵敏度高 • 线性较差
• 选择性高 • 天然有荧光的化合物不多
• 对流速和温度变化无影响 • 需衍生化的复杂步骤
• 使用复杂——必须实时关注化学和仪器的变量
• 有些化学物质，如氧气。可能会淬灭荧光——
必须充分脱气

表格7: 荧光检测的优点和缺点

45
检测方法

兼容 UV 和 ELS 检测器

一般来说。制备色谱的用户需要通用、易用、灵敏度高、无损、无流动相影响的检测器。然
而，当前可用的检测器没有一个满足下表中所示的所有这些条件。

检测器名字 检测的化合物 灵敏度 梯度洗脱 破坏性 易用性

UV 发色团化合物 取决于化合物 Yes No Yes

活性

ELSD 非挥发性化合 中 Yes Yes Yes

物

MS 可电离化合物 中 Yes Yes No

RI 普遍适用 低 No No Yes

Fluorescence 荧光化合物 高 Yes No No

表格8: Flash 和制备型 HPLC 检测方法概述

UV 检测是制备色谱法的默认方法，因为它是一种成熟的技术，并且许多分子会吸收紫外光。
然而，在某些应用中，单独的紫外检测可能无法提供所需的纯化水平。特别是在合成过程
中，检测反应混合物中的所有副产物对于有效分离至关重要；有时用户不确定所有化合物是
否具有紫外活性。因此，为了安全起见，经常使用与另一检测器（最好是 ELSD）的组合，以
满足用户的需要。
UV 和 ELS 检测器都易于操作，可梯度洗脱，具有良好的灵敏度。通过选择在 μl 范围内具
有最小样品损失的检测器，可以克服 ELSD 具有破坏性的事实。除此之外，UV 和 ELSD 的
组合还可以检测几乎所有化合物：发色团和非发色团化合物、以及挥发性和非挥发性化合物
（请参见下图）。

46
 检测方法

Solvent % ELSD UV1 UV2

Time (min)

CH3 O O
CH3
H3C H
CH3
H 3C H OCH3 OH
O
H
H

H3C O HO H2N

胆甾醇乙酸酯 尼泊金甲酯 4-氨基苯甲酸

（非发色团） （发色团） （发色团）

图形6: 在混合物中发色团和非发色团化合物的分离

Time (min)

O O

N N H

N HO
O N
OCH3

咖啡因 香兰素 胡椒碱

（非挥发性） （强挥发性） （非挥发性）

图形7: 在混合物中挥发性和非挥发性化合物的分离

47
方法的开发
方法的开发

章4

48
 方法的开发

中压和高压制备中的方法开发

在通过制备型液相色谱纯化未知目标化合物之前，需要对样品的溶解度和分离表现进行详细分
析。该分析可以使用户了解样品的可重现性和分离效果。一旦找到合适的条件，就可以把这个方法
进行规模放大。根据需要，可以通过中压制备色谱，高压制备色谱或二者结合来大量纯化目标化合
物。

一般的方法开发过程如下：
• 确定纯化分离的方向(中压或高压制备)
• 分析样品溶解度
• 筛选合适的分离条件 (流动相以及固定相)
• 将上述条件放大至中压或者高压制备仪器上
• 改进分离度

确定纯化分离的方向(中压或高压制备)

在制备型液相色谱中，用户可以选择两种纯化方向：中压或高压制备型液相。 两种技术都经常使
用，但用于不同的目的：中压色谱法主要用作预纯化步骤，以较高的分离度纯化大量样品，而在高
压色谱法中，是以较低的上样量来达到最高的分离度（纯度）。根据选择，以下说明的后续步骤会
有部分不同。

分析样品溶解度

对于未知样品，第一步是分析其溶解度。通常，相似相溶，这意味着极性化合物可溶于相似极性的
溶剂（水，乙腈= ACN，乙醇或甲醇），非极性化合物可溶于非极性溶剂（例如正己烷或乙酸乙酯）
。

纯化样品的最简单方法是液体形式，因为可以将液体样品直接注射到中压或高压色谱柱内。为此，
样品的溶解液必须与中压或高压制备方法的起始条件完全兼容：正相为非极性，反相为极性（见
图1）。因此，含有非极性目标化合物的混合物最好用正相纯化，而含有极性和水溶性化合物的混合
物最好通过反相纯化。

另一方面，样品的保留效果是使目标化合物与混合物中其他化合物分离的关键因素。为了获得有效
的分离效果，化合物的极性必须与固定相相似，因此极性化合物最好通过正相纯化，而非极性化
合物最好通过反相纯化。因此，易于溶解和强保留效果是彼此矛盾的，用户必须决定这些因素中的
哪一个对其应用更为重要。

对于高压制备分离，用户只有一个选择：样品需要在起始条件下完全溶解。这是因为液体上样是将
样品注入高压制备柱的唯一方法。而在中压制备分离中，情况有所不同。如果用户希望获得最高的
保留率，则会通过干法装载样品，因为它允许目标化合物与方法的起始条件（正相或反相）不兼
容。但是，即使在进行中压制备色谱时，通常也采用液体上样的方法将样品注入到中压制备柱中。

49
方法的开发

非极性 极性

极性 非极性

图1：正向与反向的区别

筛选合适的分离条件 (流动相以及固定相)

为了节省时间，成本并避免大规模纯化过程中的复杂性，建议在使用中压或高压色谱质之前
对固定相和流动相进行详细的筛选。有两种执行此类筛选的常用方法：薄层色谱（TLC）或分
析型HPLC。传统上，TLC用于筛选中压制备方法，而分析型HPLC用于高压制备方法。

TLC

TLC筛查是确定合适固定相和流动相的最快，最简便，最经济的方法。设备价格便宜，几乎每
个实验室都可以买到。但是在另一方面，TLC板的长度是有限的，因此分离只能在一定长度下
进行，并且在开放环境中会受到湿度和温度的影响。

TLC值和R f 值

在TLC筛选的第一步中，选择由玻璃或铝制成的二氧化硅涂层板。理想情况下，TLC板和中压
色谱柱中的二氧化硅应相同（类型和孔径），以便TLC条件可以成功应用于中压色谱柱。液
体样品（几微升的1％样品混合物）被点在板的起始位置，选定的流动相通过毛细管作用流过
TLC板。溶剂前沿几乎贯穿整个板，然后检查板上的不同斑点（见图2）。

50
 方法的开发

溶剂前沿

a b

起始线

图2：TLC板上溶剂的展开距离（a）和分析物被洗脱的距离（b）

为了分析目标化合物的分离程度，可使用以下公式计算Rf（保留因子）：

保留因子(Rf)= 分析物被洗脱的距离（b）/溶剂的展开距离（a）

Rf =1意味着样品在TLC板上无保留（随溶剂前沿一起移动），而Rf=0意味着溶剂无亲和力（保
留在了起始线）。理想状态下，Rf值应该在0.2和0.5之间。

如果Rf值太低，则固定相对化合物的保留能力太强。如果将这些TLC条件转移到色谱柱中，样
品洗脱将花费太长时间，浪费时间和溶剂。Rf值太高表示化合物与固定相之间的相互作用太
弱。当把方法放大到中压制备柱上时，这些情况可能导致峰的分辨率降低。

重要的是，目标化合物周围的斑点应尽可能彼此远离，以确保在放大的实验中具有较高的纯
度。

使用TLC来判定最合适的固定相和流动相

如果TLC测试得出Rf值在0.2到0.5之间，则所选的流动相和固定相非常适合快速色谱。如果Rf
值较低或较高，则应选择极性不同的固定相或流动相。

如果在使用硅胶TLC板（正相）时Rf值较低，则建议更改溶剂系统或使用极性较小的固定相
（例如氨基或二醇）进行中压应用。在高Rf值的情况下，化合物与硅胶TLC板的极性表面的相
互作用太弱，除了筛选合适的溶剂外，还可使用C18（反相）填料进行放大。由于C18填料比
普通二氧化硅更昂贵，因此建议在升级至色谱柱规模之前，在C18 TLC板上（反相）进行额
外的TLC筛分以确认分离效果。

51
方法的开发

溶剂的筛选可以通过Snyder选择性三角形

TLC筛选有助于找到最适合特定应用的溶剂系统。建议从最常用的溶剂开始，例如：

正相（二氧化硅）：己烷，乙酸乙酯，二氯甲烷（DCM）和甲醇

反相（键合硅胶，通常为C18）：水，乙醇，甲醇和乙腈（ACN）

如果这些流动相无法提供令人满意的结果，则值得通过Snyder选择性三角形来筛选其他合适
的溶剂。下图根据质子受体，给体或偶极作用力的性质，提供了各种溶剂选择，这些溶剂被
分组为选择性基团。 在三角形上选择尽可能远离彼此的溶剂组，就可确保分离能力的最大差
异（=选择性）。

I 异丙醚 质子受 V 二氯甲烷

乙醚 体
三乙胺
VI 二恶烷
II 丙醇 乙酸乙酯
乙醇 丙酮
甲醇 乙酰丙酮

II VII 甲苯
III 四氢呋喃 I
苯
吡啶 IV III
二甲基甲酰胺
VIII VIII 氯仿
VI
IV 醋酸 V
甲酰胺 VII

偶极作
质子给体
用力

图3：Snyder选择性三角形与溶剂组I-VIII

以下示例说明了如何使用不同的流动相进行TLC筛选（请参见下图）。此处，含有三种化合物
的混合物被不同选择性的溶剂组所洗脱。使用溶剂组VI可以实现所有三种化合物的最佳分离效
果。如果只对化合物1（最高标记处）感兴趣，那么选择溶剂组V最合适。

52
 方法的开发

图4：在四种不同溶剂条件下（溶剂组I，V，VI和VIII）测试样品分离度

如果化合物与溶剂的流动太快而与二氧化硅表面的相互作用太弱，则需要降低溶剂的强度。
溶剂强度是指从固定相的活性位点转移物质的能力。从这个意义上说，溶剂被描述为弱或
强。如果以增加强度的顺序排列溶剂，就是所谓的洗脱序列。下表显示了在正相和反相中使
用的不同溶剂强度。

正向溶剂 溶剂强度 反向溶剂 溶剂强度

正己烷 0.1 水 0

环己烷 0.2 甲醇 3

异丙醚 2.4 乙腈 3.1

甲苯 2.4 乙醇 3.6

二甲苯 2.5 异丙醇 4.2

乙醚 2.8

二恶烷 3.5

四氢呋喃 4.0

氯仿 4.3

二氯甲烷 4.3

乙酸乙酯 4.4

丙酮 5.1

表1：正向和反向溶剂的溶剂强度

53
方法的开发

下面给出一个例子。左侧使用的是二氯甲烷（DCM）展开TLC板，化合物最终运行得太快。
通过添加己烷（己烷/二氯甲烷为3/1的比例），可以减少保留。

图5：同一个样品在TLC板上用两种不同的溶剂进行展开（左：100%DCM；右：己烷/DCM为3/1）

分析型HPLC

与TLC相比，分析型HPLC主要的优势在于可以梯度进行。所以这也是把应用放大在高压制备
色谱柱上时的主要筛选方法。但是，相比TLC板，使用全自动分析型HPLC是比较昂贵的。在
使用分析型液相时，出于经济原因，一般会使用C18分析柱（反相）。C18相可以反复使用，
因为可以用有机溶剂冲刷以除去强保留的污染物。这与普通的二氧化硅不同，后者在清洗后
无法重复使用（会导致性能下降）。

样品浓度和流速根据制造商的建议进行选择。通常样品量在1-10 mg之间，流速在0.1-10 mL /
min之间。目的是在最短的时间和最大的负载量的前提下，将目标化合物从杂质中分离出来。
在用分析柱进行筛查时，可以使用与TLC相同的选择流动相和固定相的方法。一个区别是，对
于反相，常见的溶剂是将水与甲醇，乙醇或乙腈（ACN）混合。

升级到快速液相色谱或制备型HPLC

根据TLC或分析型HPLC的分析数据，可以升级到Flash色谱柱或制备型HPLC色谱柱。第一
步，建议使用小型Flash色谱柱或制备型HPLC色谱柱，如果需要，可在以后的步骤中升级至更
大的色谱柱。

从TLC中进行升级

通过 R f 值计算色谱柱体积

也可以使用Rf值来计算色谱柱体积（CV）。CV是填充的色谱柱内部未被介质占用的体积。该
体积包括间隙体积（颗粒外部的体积）和介质自身的内部孔隙率（孔体积）。加起来，这两
个体积加起来通常占填充柱体积的70％至80％。

54
 方法的开发

根据CV，可以计算出从色谱柱中洗脱化合物所需的流动相体积。这个数字可以通过保留系数
（Rf）轻松得到，具体公式如下：

CV = 1/Rf

CV和Rf值之间的相关性如下所示

A Rf 0.50

B Rf 0.40

CV 2.0 2.5

图6：样品在带有两个分离的斑点或化合物的TLC板上运行（左）和在具有两个分离的峰的色谱柱上运行（右）

Rf越小，从色谱柱中洗脱化合物所需的溶剂（CV）就越多：

Column Column Column

R f value volume R f value volume R f value volume
CV CV CV

0.9 1.11 0.6 1.67 0.3 3.33

0.8 1.25 0.5 2.00 0.2 5.00

0.7 1.43 0.4 2.50 0.1 10.0

表2：Rf和CV之间的相关性

升级至Flash色谱的理想条件是Rf值为0.2至0.5，对应于5-2 CV。ΔC应> 1，以确保目标化合

物的良好分离和纯度。色谱柱的CV可以在其技术数据中找到。

55
方法的开发

通过R f 值计算梯度

通常需要梯度洗脱（逐步改变溶剂比例）以将目标化合物与杂质充分分离。即使容易进行等
度洗脱（溶剂的恒定比例），分离结果仍然很差。通过所谓的梯度洗脱，流动相的组成会随
着洗脱强度的提高而增加溶剂的量。因此，在运行开始时，当流动相强度较低时，分析物将
在柱头处浓缩成固定相。随着流动相强度的增加，分析物将开始分配到流动相中并沿着色谱
柱移动。在某个时刻，分析物可能会完全分配到流动相中，并以与流动相相同的速度移动。
梯度通常比等度洗脱产生更少的峰展宽。

梯度可以分为线性梯度和逐步梯度。使用线性梯度意味着溶剂组成会逐渐变化，而在逐步梯
度中，将使用一系列链接的等度步骤来分离和洗脱样品组分。线性梯度比阶跃梯度更易于处
理，但线性梯度也具有较低的分离能力，如下图所示：
100 100
80 80
60 60
%

40 40
20 20
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min) Time (min)
Absortion %B Absortion %B
逐步 线性

图7：使用不同的梯度类型（逐步和线性）在Flash色谱柱上进行样品分离。 使用逐步梯度可以看到混合物中更多的化
合物（峰）。

梯度筛选也可以通过TLC进行。以下示例显示了溶剂强度如何影响TLC板上的分离，以及线性
梯度和逐步梯度如何影响色谱柱上的分离。

图8：不同溶剂条件下在TLC板上进行样品分离（溶剂的百分比，其中B =强溶剂）

56
 方法的开发

通过分析型HPLC进行升级

计算装载量，流速和色谱柱尺寸

借助一些公式，可以将分析型HPLC升级为制备型HPLC。最简单的方法是保持硅胶的粒径以及
分析柱的长度与制备型HPLC柱的粒径相同。在这种情况下，适用以下载样量（体积或浓度）
，流速和直径的公式：

载样量A= 载样量B x (直径A/直径B)2 x (长度A/长度B)

流速A= 流速B x (直径A/直径B)2

A=制备型HPLC色谱柱 B=分析型HPLC色谱柱

为了完成该方法，制备型HPLC使用相同的梯度曲线（溶剂和时间之比）。 例：

分析型 制备型

色谱柱直径: 4.6 mm 色谱柱直径: 30 mm

色谱柱长度: 150 mm 色谱柱长度: 150 mm

粒径: 5 microm 粒径: 5 microm

载样量: 0.1 g 载样量: 4.25 g

流速: 1 mL/min 流速: 42.5 mL/min

梯度 10-90% B: 15 min 梯度 10-90% B: 15 min

Flash或制备型HPLC运行的典型排序和CV

典型的快速HPLC或制备型HPLC方法包括四个步骤：平衡（准备色谱柱），进样（装载样
品），分离（梯度步骤）和冲洗（清洗色谱柱）。Flash色谱柱的平衡步骤通常比制备型HPLC
色谱柱要花费更长的时间，因为色谱柱是干燥的，因此需要时间弄湿。存在以下与CV相关的
经验法则：

平衡：4-6 CV，梯度起始条件（弱溶剂）
进样体积：最大 0.1 CV
分离：从弱溶剂到强溶剂的4-6 CV梯度
冲洗：2-3 CV强溶剂

通常，方法中提到的CV很大程度上取决于样品的保留度和用户的需求。例如，以高分离度纯
化保留时间较长的样品将需要更多的CV。

57
方法的开发

提高分离度

在色谱中，分离度（R）描述色谱图中两个相邻峰的相对位置（保留时间）。它是对两个洗脱
峰的区分度的度量，其计算方法如下：

tR1/2:化合物1/2的保留时间，是指从物质注入到最大峰值之间的时间
w1/2 :峰1/2的基本宽度，在弯曲切线之间测量b0.5（1/2）：峰1/2在半高处的宽度

tR2

tR1

h
/2

h /2
b 0.5(1)
b 0.5(2)

h /2 h
/2

w1 w2

Time

图9：具有两个峰（两种化合物）且保留时间（tR）不同的色谱图。x轴以分钟为单位测量时间，而浓度值绘制在y轴
上。

分离度是色谱柱的特定特征，适用于使用相同测试混合物进行比较的目的。R越小，两个峰之
间的距离越短。在R = 2和1.5之间，峰开始重叠，这意味着部分化合物同时洗脱，因此没有
分离。例如，如果假设两个峰具有高斯分布并且具有相同的峰高和峰宽，则在R = 1.5时，重
叠率为0.15％，而在R = 1时，重叠已经为0.23％。通常，用户必须决定允许多少重叠。对于
大多数快速应用，R = 1-1.5就足够了，并且可以提供最佳的时间/收益比，而在制备型HPLC
中，必须进行基线分离。

58
 方法的开发

R = 1.5 R = 2.0 R = 4.0

Time (min) Time (min) Time (min)

图10：不同的分离度会影响峰重叠

为了获得最佳分离度，需要满足三个条件：

• 化合物必须保留在固定相上。此过程通过名为“保留”的参数来量化
• 化合物的保留方式必须不同。这通过称为选择性的参数来量化
• 获得的峰必须足够窄，以避免或减少重叠。 这可以通过称为柱效的参数来量化

tR3
tR2
Signal Intensity

tR1

tR0

Retention Selectivity Efficiency Time, t

图11：色谱图的保留，选择性和柱效

这三个主要因素，即柱效，选择性因子和保留因子，可以用熟悉的拆分方程式进行数学表
达：

Rs: 分离度
N: 柱效
α: 选择性
k: 保留时间

在以下各节中，将详细讨论不同的参数及其对分离度的影响。

59
方法的开发

选择性

该因子，也称为分离因子，主要涉及系统的化学性质，可以是固定相或流动相化学性质。通
过改变这两个特性，可以使两个相邻峰之间的距离发生变化。选择因子α表示如下：

tR1/2: 化合物1和化合物2的保留时间是指从物质注入到最大峰值之间的时间
tR0: 死体积时间，指的是未保留化合物的洗脱时间或溶剂流过色谱柱所需的时间。

如果两种化合物同时洗脱，因此无法分离，则选择性因子为1。该值越大，分离越简单，如下
图所示：

α = 1.1 α = 1.3 α= 2
分离度差 部分分离 基线分离
因此选择性低 因此有最佳选择性 因此有最佳选择性

图12：不同选择性因子α的分离

选择性因子是最影响分离度的参数。因此，如前所述，对流动相和固定相的筛选应该是方法
开发过程中的第一步。

保留时间

保留因子是化合物在固定相中花费的时间与化合物在流动相中花费的时间之比。化合物与表
面的相互作用越强，保留时间越长，保留因子越高。此因素主要受以下因素影响：

• 流动相组成
• 固定相的性质
• 色谱柱长度

60
 方法的开发

优化流动相组成是增加保留因子的最简单方法。这通常是通过使用较弱溶剂的流动相来实
现，当流动相的溶剂强度较低时，溶质与固定相的相互作用时间较长，洗脱时间也较长。

保留因子k(也称容量因子)用以下公式表示：

tR: 化合物的保留时间，是指样品从注射到出现最大峰值时的时间
tR0: 死时间，是指未保留化合物的洗脱时间或溶剂通过色谱柱所需的时间。

k值越大，分离时间越长；k值越小，分离时间越短。实际工作中理想的k值约为1至5之间。这
对应于TLC中的Rf值为0.5-0.2。k值大于5时，分离度只有很小的提高，如下图所示：

4.5
4
3.5
3
分离度

K影响很小的区域
2.5
2
1.5
1
0.5 1<k<5-k影响最大
0
0 5 10 15 20 25
k

图13：保留因子k与分离度之间的相关性

保留因子很容易受影响，但在影响分离度方面比较有限。

61
方法的开发

柱效

柱效由理论塔板数N表示，它表明了色谱柱的性能。值越大，分散越小，峰越窄，柱效越高。
理论塔板数计算如下：

tR: 化合物的保留时间，是指样品从注射到出现最大峰值时的时间。
w: 峰的宽度，在拐点处正切之间的值。
b0.5: 峰高一半处的宽度。

每块板代表样品组分在固定相和流动相之间进行一次吸附-解吸步骤所需的理论距离（见下
图）。

解析
一个理论塔板 吸附
分离

图14：理论塔板数的描述

色谱柱中可用的理论塔板数越多，固定相和流动相之间的平衡就越多，分离的效果也越好。

对于具有给定长度L的色谱柱，高塔板数对应于每个塔板之间的距离较小，该参数也称为塔板
高度（H）。塔板高通常被称为“等效于理论塔板的高度”（HETP），可用以下公式表示：

塔板高项可衡量色谱柱的填充效率。N高而H低，则实现高效分离。

62
 方法的开发

理论塔板数受许多参数的影响，如下图所示：

流动相因素
• 粘度
• 化学性质
• 扩散到填料中的速率
• 线速度（流速/柱截面面积）

溶质因素
• 化学性质
• 色谱柱上的样品载样量
• 进样用溶剂
• 进样浓度
• 每个阶段的扩散速率
• 两相之间的传质速率
• 容量系数K

固定相因素
• 粒度尺寸
• 粒度分布
• 颗粒形状
• 孔隙大小
• 孔隙形状
• 表面面积
• 表面化学

数值因素
• 峰形
• 峰值不对称
• 计算方法
• 测量的准确性和精确性

机械因素
• 填充层结构的均匀性
• 柱床内的孔隙和通道的范围
• LC系统中死体积过大
• 柱入口样品分布不当
• 柱出口后样品过度混合

图15：影响柱效因素的不同方式

63
 方法的开发

柱效因子主要取决于固定相的粒径、溶剂的线性流速和样品量，下面将进行详细讨论。增加
色谱柱长度仅在理论上有所帮助，因为它会对运行时间和压力有显著的影响，并会导致峰宽
扩大的扩散效应。

柱效因子可以很容易地改变，并在提高分离度方面给出令人满意的结果。

粒径

二氧化硅的粒径越小，总表面积越大。这增加了吸附和解吸次数，即理论塔板数。如下图所
示塔板数与粒径之间的关系：

12000

10000
理论塔板数 N

8000

6000

4000

2000

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
粒径（微米）

图16：粒径和理论塔板数N的关系

以下为不同粒径硅胶对分离影响的不同色谱图：

Solvent % ELSD UV1 UV2 UV3

663 0.50 359 0.50

530 0.40 287 0.40

ELSD (mV)

398 0.30 215 0.30

AB
AB
265 0.20 143 0.20
AB AB
133 0.10 71 0.10

0 0.00 -1 0.00
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12
Time (min) Time (min)
硅胶，50μm 粒径 硅胶，15μm 粒径

图17：使用不同粒径的Flash色谱柱进行分离

64
 方法的开发

减小粒径是提高分离度的简便快捷方法。但这种方法应谨慎使用，因为小颗粒聚集在一起有
一个明显的缺点。即颗粒越小，推送流动相通过色谱柱所需的压力就越大。运行过程中产生
的压力受几个参数影响。

ΔP:压力变化（bar） dp:粒径（μm）
F:流速（mL/min） r:色谱柱半径（mm）
L:色谱柱长度（mm） n:溶剂粘度（cP）（水溶液为1；50%的甲醇水溶液为2）
K:色谱柱渗透率因子

粒径和色谱柱半径是影响压力的两个主要因素。压力与两者的平方成反比。粒径减小一半，
压力将增加4倍。因此，在改变颗粒尺寸时考虑到这一点是非常重要的。

流速

流动相的流速对分离也起着至关重要的作用。塔板高H在一定流量（最佳流速）下达到最小高
度，然后随着流速的增加而再次增大，如下图所示。

最佳流速
塔板高

最小塔板高度

流速

图18：流动相流速（速度）与塔板高H的相关性

流速与塔板高H之间的关系也可以用范德姆特方程中的常熟来解释。

H:塔板高度
dp:粒径
u:流速

65
 方法的开发

在最佳流速以下，分析时间和纵向扩散将显著增加，最终影响柱效。在最佳流速以上，分析
物对固定相的吸附会导致部分样品滞后，从而导致柱效降低。另一个缺点是较高流速会产生
较高的压力。
柱效低 压力高
分析时间长 柱效低

最佳流速

图19：低于和高于最佳流速的影响

实际流速通常比最佳流速高，因为流速太慢会导致分离时间过长。因此，使用者需要在时间
和分离度之间找到一个好的平衡。

流速对柱效的影响随颗粒尺寸的差异而不同。对于大颗粒，影响更明显；而对于小颗粒，影
响则不太明显。这意味着小颗粒可以在不降低分离度的情况下加快分离速度，如下图所示：
1000
50 μm 30 μm
900
800
700
H*= plate height

25 μm
600
500

400
300

200 15 μm

100 10 μm
0
0 20 40 60
Flow rate (mL/min)

图20：流速和塔板高度H的相关性

载样量

载样量是指进入到色谱柱中的样品的量，以每克吸附剂所含样品的克数表示。理论塔板高度
与柱效的关系如下：

66
 方法的开发

Plate height (H)

• 载样量B0 = 200 μg/g SiO2

• 分析鉴别载样量：B<B0
• 制备纯化载样量：B>B0

Loading (B) B0

图21：理论塔板高（H）与载样量（B）的关系

拐点称为线性容量B0。定义为理论塔板高（H）增加10%时的载样量。

色谱柱的载样量在每次运行中都有所不同，这取决于特定的选择系数α和保留系数k。但是，
通常正相硅胶分离的最大载样量在100-300mg/g之间，而反相硅胶的载样量则要低3-4倍。色
谱柱过载（B＞B0）会降低柱效，这在制备色谱中几乎总是这样。由于处理时间将大大增加，
因此无法以非常低的载样量进行工作。以下是具有不同上样量的色谱图示例：

0 5 10 0 5 10 0 5 10
2,5 mg/g Silica gel 25 mg/g Silica gel 50 mg/g Silica gel

色谱柱：26 x 460 mm，硅胶填料40-63 μm

洗脱液：石油醚/乙酸乙酯=4：1；85mL/min

图22：样品量对柱效的影响

如上例所示，随着样品量的增加，相邻的峰开始重叠。峰重叠会导致材料损失，但每次运行
可处理更多样品，因此处理速度更快，并且节省资源。但在分析色谱中，由于其目的是获得
高分辨率的定性鉴别而不是样品制备，所以实际进样量要低于填充材料的承受量（B＞B0）。

67
应用
色谱百科
卷5
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

广泛的应用

随着仪器、高压柱和中压柱的不断发展，快速和制备型 HPLC 已经成为越来越多应用领域的

纯化方法之选。由于目标化合物及其特性差异很大，无法使用一种通用方法执行所有样品类型
的分离。相反，长期的经验有助于确定最适合每个分子组的特定纯化条件。下文针对以下每种
分子讨论快速色谱法、制备型 HPLC、固定相和流动相、样品装载和检测方法：蛋白质/肽、
维生素、天然产品/提取物、脂质、碳水化合物和小分子药物。

蛋白质/肽

肽和蛋白质是自然界中四个基本的大分子类别之一。人们对其作为治疗性药物的潜力进行了多
项研究。蛋白质在活细胞的几乎所有基本过程中均起着很重要的作用，活细胞的大部分信息编
码在核酸中，由蛋白质控制。蛋白质由称为氨基酸的基本构件组成。在溶液中，蛋白质形成高
度组织化的三维结构，这些结构与其生物学功能密切相关。肽是更小版本的蛋白质，因为它们
包含更少数量的氨基酸（2 – 50 个氨基酸）。
(2)
(1) (3)

四肽由 4 个氨基酸组成：Val-Gly-Ser-Ala 肽和蛋白质的结构。(1) 单个氨基酸；(2) 肽，氨基酸链；(3) 蛋白质，

具有二级结构的较长氨基酸链

固定相和流动相

反相色谱法已经成为分离肽和小分子蛋白质的最重要的工具。此方法常用的溶剂包括水和低极
性溶剂的组合，包括乙腈、异丙醇或乙醇。乙腈一直是最受欢迎的溶剂，因为它易挥发且可以
从收集到的馏分中轻松去除，它的黏性较低且具有极小的紫外光吸收度。习惯上，执行肽分离
时会在流动相中加入三氟乙酸 (TFA)。TFA 可用于控制 pH 值（缓冲），与相反电荷的离子基
形成复合物以增强保留作用（离子配对）。由于反相色谱法使用极性有机溶剂作为流动相，因
此该方法仅可用于能够承受苛刻条件的化合物。这种色谱分析法一般适用于肽和更稳定的小分
子蛋白质，肽和小分子蛋白质在纯化后自然再折叠。

69
应用

标准的二氧化硅孔径 60 – 100 Å 仅适用于小分子。更大分子的蛋白质无法进入这些小孔，

导致可供分离的表面可用率下降，最终导致分离度下降。为了提高分离度，更大分子的蛋白质
需要 200 – 300 Å 范围内的大孔径。同样，反相色谱法首选更小的孔径，因为可以有效地分离
即使是非常相似的化合物。因此，制备型 HPLC 更适用于分离肽或小分子蛋白质。

反相色谱法中使用的典型固定相是烷基键合二氧化硅。基于目标肽或蛋白质的极性和分子量来
选择相。C8 和 C4 相仅用于极性极大且使用 C18 时完全无保留的化合物，而 > 5 kDa 的化合
物只需要大孔径。

样品装载

使用制备型 HPLC 时，装载肽/蛋白质样品的唯一选择是以液态形式装载。对于非常疏水的混

合物，建议使用极性较低的溶剂，例如乙腈，而对于更亲水的样品，一般使用乙醇或异丙醇。
对于高亲水性化合物的溶解度问题，可以通过添加 DMSO 或 DMF 作为进样溶剂以使样品溶
解于最小体积中加以解决。一般来说，使浓度尽可能高、体积尽可能小可以最大程度减少频带
扩展、峰加宽和分离损耗。

也可以通过快速色谱法对肽/蛋白质进行纯化，其中样品可以通过液态或固态装载来进样。
固态装载一般可以帮助改善分离度，是出现溶解度问题时很受欢迎的选择。粗样品被吸收到支
撑材料（肽/蛋白质的支撑材料一般是 C18）上，然后被置于分离中压柱前面。洗脱的化合物
被转移和分布到分离中压柱中，其效率高于通过非同质溶液执行的操作。

检测

紫外吸收光谱法通常用于肽和蛋白质。波长 280 nm 下的紫外吸光度测量值已经证实特别

有用，因为可以直接通过蛋白质序列预测出 280 nm 下的摩尔吸光系数（消光系数）。但是，
此方法仅适用于包含色氨酸或酪氨酸残基的蛋白质。如果蛋白质或肽不含或仅含极少芳香酸，
则收集 205 nm 下的吸光度，主要是由于肽键的性质所致。

应用示例

相极性的影响

70
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

溶剂 % ELSD UV1
(1) 111 0.65
AB
87 0.51
ELSD (mV)

UV (AU)
62 0.38
AB
37 0.24

12 0.11

-12 -0.03
0 4 8 12 16
时间（分）

(2) 133 0.77

106 AB 0.62
ELSD (mV)

79 0.46

UV (AU)
AB
53 0.31

26 0.15

-1 0.00
0 4 6 9 12 15
时间（分）

运行 1 运行 2

样品 溶解酵素和 BSA 的混合物 溶解酵素和 BSA 的混合物

样品装载 液态 液态

A：水、20 mM 醋酸铵 A：水、20 mM 醋酸铵

流动相 B：乙腈/水 20 mM 醋酸铵 B：乙腈/水 20 mM 醋酸铵
(80/20) (80/20)

• 0.5 分钟：20% • 0.5 分钟：20%

梯度（溶剂 B%） • 10 分钟：20 – 90% • 9.5 分钟：20 – 90%
• 5.5 分钟：90% • 5 分钟：90%

制备型 HPLC 色谱柱， 制备型 HPLC 色谱柱，

固定相 C18WP，10 µm 球形， C4WP，10 µm 球形，
150 x 20 mm 150 x 20 mm

流速 15 mL/min 15 mL/min

检测 UV 210 nm，ELSD UV 210 nm，ELSD

图 1：通过制备型 HPLC 使用 C18WP (1) 和 C4WP (2) 对溶解酵素和 BSA 的混合物进行分离。由于分子

量大，BSA (60kDa) 和溶解酵素 (14.3 kDa) 可以仅使用 C4 进行分离。WP 表示宽孔 (300 Å)。

71
 应用

相孔径的影响

溶剂 % UV1 UV 扫描
(1) 0.50

0.40 AB
UV (AU)

0.30
AB
0.20

0.10

0.00
0 3 6 9 12 15
时间（分）

(2) 0.50

0.40 AB
0.30
UV (AU)

AB
0.20

0.10

0.00
0 3 6 9 12 15
时间（分）

运行 1 运行 2

样品 白鸡蛋混合物 白鸡蛋混合物

样品装载 液态 液态

A：水、20 mM 醋酸铵 A：水、20 mM 醋酸铵

流动相 B：乙腈/水 20 mM 醋酸铵 B：乙腈/水 20 mM 醋酸铵
(80/20) (80/20)

• 0.5 分钟：20% • 0.5 分钟：20%

梯度（溶剂 B%） • 10 分钟：20 – 90% • 10 分钟：20 – 90%
• 4.5 分钟：90% • 4.5 分钟：90%

制备型 HPLC 色谱柱，

制备型 HPLC 色谱柱，C18，
固定相 C18WP，10 µm 球形，
10 µm 球形，150 x 20 mm
150 x 20 mm

流速 15 mL/min 15 mL/min

UV 210 nm，UV 扫描 UV 210 nm，UV 扫描

检测
(200 – 800 nm) (200 – 800 nm)

图 2：通过制备型 HPLC 使用 C18 (1) 和 C18WP (2) 快速中压柱对白鸡蛋混合物进行分离。使用更大的孔径 (300Å VS

100Å) 会使得峰型更加尖锐，从而获得更佳的基线分离度。WP 表示宽孔 (300 Å)。

72
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

维生素

维生素是维持器官正常代谢功能的必需营养素。它们可以帮助伤口愈合、提高免疫力、具有激
素类功能以及调节骨骼和其他器官的矿物质代谢。它们还可以将食物转化为能量，以及修复细
胞损伤。人体可从不同的食物和环境来源或片剂形式的合成产品中吸收维生素。维生素分为水
溶性或脂溶性维生素。维生素的溶解度决定了维生素在人体内如何起作用，但大多数具有多种
功能。

水溶性维生素 C 脂溶性维生素 A

固定相和流动相

可以在正相或反相条件下执行维生素纯化。主要根据维生素的溶解度进行选择。溶解度是指样
品在溶剂中是否充分溶解的特性。水溶性维生素一般可以通过使用水和低浓度有机溶剂（例如
乙腈或乙醇）的反相进行纯化。通常用于控制 pH 值的缓冲剂包括磷酸盐、甲酸和醋酸。如果
使用高于 95% 的水相浓度，建议使用包含极性封尾的 C18 相，这可以防止烷基链塌陷。

脂溶性维生素也可以通过使用较低极性但不含水的溶剂的反相进行纯化，例如二氯甲烷
(DCM)、乙腈和乙醇。对于高度非极性的维生素，使用高度非极性溶剂（例如己烷）和中度极
性溶剂（例如乙酸乙酯）时，正相是另一种选择。

一般来说，如果使用二氧化硅或 C18 时保留度低，建议使用中度极性的相，例如氨基或

二醇。这两种相均可以在正相 (NP) 或反相 (RP) 下使用。

73
应用

HILIC 概览

高度极性维生素通常无法通过正相或反相进行分离。在 NP 条件下，化合物在固定相上吸附性
太强（极性），因此洗脱可能非常耗时。同样，极性化合物在水性流动相中显示出极佳溶解
度，因此与典型的 NP 溶剂不相容。而对于 RP，问题又有所不同。高度极性的化合物完全不
与固定相发生相互作用（非极性），仅在溶剂前沿洗脱。因此，分离未能发生。

用于分离这些极性化合物的备选方法是亲水作用色谱法 (HILIC)。分离发生在极性固定相上，
但是是在使用水的反相溶剂条件下。因此，流动相在极性固定相 vs. 缺水流动相表面上形成富
水层。与 RP 相反，梯度洗脱从低极性有机溶剂开始，然后通过增加极性水含量来洗脱极性分
析物。

有机流动相
有机流动相
H2O 流动相（极性）
H2O 流动相（极性）

HILIC 固定相 HILIC 固定相

图 3：HILIC 应用中从保留（左侧）到洗脱（右侧）期间使用的流动相和固定相

HILIC 将三种液相色谱法的特征结合在一起：分析物是极性的（离子色谱法），固定相是高
度极性的 (NP)，流动相使用水混合物 (RP)，但梯度洗脱从高有机溶剂浓度开始，水是最强洗
脱剂。HILIC 原理目前仍在继续研究中，但 HILIC 中的保留被认为是一种混合模式机制，即
富有机物流动相与富水层之间发生分析物的分割。但是，其他重要的相互作用也促成 HILIC
分离，例如氢基键合、静电相互作用和偶极-偶极相互作用。如果在 HILIC 环境中引入一种极
性分析物，其可能使用任意此类保留机制。
带电 带电
分析物 分析物
极性中性
+ -
分析物 中性分析物

H 键合 分割 静电吸引 静电排斥

OH OH OH OH O- O- O- O-

富水相

固定相

图 4：极性分析物与 HILIC 中的固定相的可能相互作用

74
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

HILIC 中最常使用的溶剂是乙腈，因为它与水的溶混性极佳、具有良好的 HILIC 保留度且黏

性低。但是也可以使用其他许多极性有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、二氧六环、
丙酮和 DMF。在 HILIC 中的相对溶剂强度相似：

丙酮 < 丙醇 < 乙腈 < 乙醇 < 二氧六环 < DMF ~ 甲醇 < 水

任何极性色谱表面均可用于 HILIC 分离，可分为三个大组：

• 中性（二醇相、氨基相）：主要由极性官能团组成，例如氨基化合物、天冬氨基类、
二醇、交联二醇、氰基和环糊精。这些基团在通常用于 HILIC 流动相的 pH 值范围
(pH 3 – 8) 内为中性形式。保留机制是通过亲水作用实现的，不可能发生静电相互作用。
• 带电（普通二氧化硅相、氨丙基相）：来自阴离子或阳离子官能团的强静电相互作用。
氨丙基相的主要氨基带正电荷，因此对阴离子酸化合物显示出高亲和力。保留机制基于阴
离子交换。这些固定相有高亲水性，因此有助于中性极性化合物的保留和分离。纯二氧化
硅相可用于分离更小极性的化合物。二氧化硅表面包含 pKa 为 3.5 的酸性表面硅烷醇基。
这意味着超过等于 pKa 的 pH 值时，这些基团将被离子化，允许二氧化硅固定相充当可与
带正电荷的基本分析物发生相互作用并保留这些分析物的阳离子交换剂。
• 两性离子：弱静电相互作用。两性离子 HILIC 相的功能最全，且通常是方法开发期间的第
一色谱柱选择。两性离子相包含永久带正电荷和负电荷的官能团，例如季铵（正）和磺酸
（负）官能团。亲水性质和弱离子交换特性有助于分离中性、酸性和碱性分析物、极性和
亲水性化合物以及无机离子。

选择最合适的 HILIC 相的原则是记住中性分析物一般比带电荷分析物的亲水性低，且保留这些

分析物需要高亲水性相，例如两性离子和氨基相。相反，由于静电吸引，带电荷的化合物在带
电荷色谱柱上保留太充分，因此中性和两性离子相提供更好的结果。

样品装载

可以在快速或制备型 HPLC 条件下执行维生素纯化。对于制备型 HPLC，必须以液态形式进样

样品，而在快速色谱法中，这是一个选择问题。固态装载不仅比液态装载更复杂，还会向样品
传递热量，这对某些维生素来说可能是破坏性的。因此，维生素在方法的起始条件下必须是可
溶的，也就是说对于正相是非极性的，对于反相是极性的。

75
应用

检测

所有维生素均可通过紫外吸收进行检测，但是由于其多重结构的原因，水溶性和脂溶性维生
素的紫外光谱差异显著。因此，分析维生素的混合物时，建议使用多波长检测以实现最佳灵
敏度。为了安全起见，可以使用 DAD（二极管阵列检测器）来记录全紫外光谱。DAD 也可
通过显示每个峰的吸收光谱来确认纯度和化合物鉴别，消除了馏分后使用薄层色谱法 (TLC)
的需要。

应用示例

抗坏血酸（维生素 C） 盐酸硫胺素（维生素 B1） 烟酸（维生素 B3）

吡哆醇（维生素 B6） 4 氨基苯酸 (4 PABA) 泛酸（维生素 B5）

咖啡因

76
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

在 C18 与 C18 AQ 制备型 HPLC 色谱柱上进行分离的比较

溶剂 % UV1 UV2
(1) 0.78

0.63 AB
AB
UV (AU)

0.47

0.31 AB
0.16 AB
0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

(2) 1.02

0.81 AB
0.61 AB
UV (AU)

0.41
AB
0.20 AB
0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
时间（分）

运行 1 运行 2

维生素 C、B1、B3、B6、 维生素 C、B1、B3、B6、

样品 4 PABA、B5 和咖啡因的 4 PABA、B5 和咖啡因的
混合物 混合物

样品装载 液态 液态

A：水 Na3PO4 25 mM A：水 Na3PO4 25 mM

流动相 pH 3 缓冲剂 pH 3 缓冲剂
B：甲醇 B：甲醇

• 3 分钟：5 – 8% • 3 分钟：3 – 7%
• 3.4 分钟：8 – 25% • 3.4 分钟：8 – 25%
梯度（溶剂 B%）
• 1.5 分钟：70% • 1.5 分钟：70%
• 2.1 分钟：85% • 4 分钟：85%

制备型 HPLC 色谱柱，

制备型 HPLC 色谱柱，C18，
固定相 C18AQ，10 µm，
10 µm，150 x 20 mm
150 x 20 mm

流速 20 mL/min 20 mL/min

检测 UV 205 nm、254 nm UV 205 nm、254 nm

图 5：通过制备型 HPLC 使用 C18 (1) 和 C18AQ (2) 色谱柱对维生素混合物进行分离。C18 显示出最先洗脱的化合物

的峰重叠，而 C18AQ 可分离出所有化合物

77
 应用

反相与 HILIC 的比较

溶剂 % UV1 UV2
(1) 0.50

0.40
UV (AU)

0.30
AB
0.20

0.10
AB
0.00
0 1 2 3 4 5
时间（分）

(2) 0.50
AB
0.40

0.30
UV (AU)

AB
0.20

0.10
AB
0.00
0 1 2 3 4 5 6
时间（分）

运行 1 运行 2

烟酸、硫胺素、4 氨基苯酸的 烟酸、硫胺素、4 氨基苯酸的

样品
混合物 混合物

样品装载 液态 液态

A：85%/15% ACN/水 NH4Ac

A：95%/5% 水/MeOH 20 mM pH5 缓冲剂
流动相
B：甲醇 B：水 NH4Ac 20 mM pH5
缓冲剂

• 1 分钟：5% • 0.7 分钟：0%

梯度（溶剂 B%） • 4 分钟：5 – 100% • 1.7 分钟：0 – 100%
• 3.6 分钟：100%

快速中压柱，C18，30 µm， 快速中压柱，二醇基，

固定相
球形，4 g 30 µm，球形，4 g

流速 15 mL/min 15 mL/min

检测 UV 230 nm、260 nm UV 230 nm、260 nm

图 6：通过快速色谱法在反相条件下使用 C18 (1) 和在 HILIC 条件下使用二醇基 (2) 对维生素混合物进行分离。此混合

物仅可使用 HILIC 进行分离

78
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

天然产品/提取物

天然化合物被定义为诸如植物、微生物或动物等生物体所生成的化学物质。一般来说，天然产
品通过初级或次级代谢路径生成。微生物生长所必需的代谢物被称为初级代谢物，而初级代谢
的最终产物被称为次级代谢物。次级代谢物在微生物与其环境之间的相互作用中发挥着重要的
功能，例如作为对抗食草动物和病原体的防御化合物、作为吸引传粉者的鲜花色素或作为激素
或信号分子。许多此类次级代谢物是高附加值化学品，经常被用作食品、化妆品和药品中的
成分。它们也是药品开发的重要来源，被用作抗癌药物和抗感染药物。

植物代谢物

初级代谢物 次级代谢物

碳水化合物、脂肪、 生物碱类、酚醛塑料、甾醇类、
蛋白质、核酸 类固醇、香精油、木质素

直接参与生长 由于防御目的而生成

固定相和流动相

由于种类繁多，天然产品的极性可能从极低到极高不等。因此，取决于感兴趣化合物的分子
结构，这些化合物的纯化可能大不相同。一般是根据提取溶剂的选择而进行选择。通过正相可
以实现己烷、DCM、EtAc 和其他非水溶性溶剂提取物的最佳纯化效果。通过反相可以实现乙
醇和水提取物的最佳纯化效果。

天然提取物高度复杂，因为它们由许多从植物或其他天然来源提取的不同化合物组成。因此，
要从通常需要结合两种分离技术的混合物中提纯出某种单一化合物：快速色谱法作为足够分离
度下的预纯化步骤，然后通过制备型 HPLC 在更低进样量条件下实现更高分离度。除了选择
固定相（二氧化硅、C18、氨基、二醇等）的极性，还需要确定二氧化硅粒径。快速色谱法使
用 15 – 50 µm 范围内的二氧化硅粒径，而制备型 HPLC 一般使用 5 – 15 µm 范围的粒径。

79
应用

大粒径 小粒径

优点 优点
• 低价 • 二氧化硅的表面积更大，导致更高进样量
• 低背压 （以填料的 % 计）和更高分离度，导致运行
• 高流速 时间缩短和溶剂消耗更低
局限性
局限性 • 投资成本更高，因此粒径越小，价格越高
• 低分离度 • 背压更高，这会限制流速的灵活性（对于高
• 低进样量 黏性溶剂而言）

表 1：大粒径和小粒径二氧化硅的优点和局限性

样品装载

天然提取混合物一般体积较大。可以手动将混合物进样到快速中压柱上，或者如果样品体积超
过进样注射器的容量，可以使用进样泵进样。对于体积非常大、可能导致风险频带加宽因此分
离度下降的样品，建议首先让样品吸附到支撑材料上，然后再执行固体进样。除了已洗脱化合
物的转移和分布更好，固体进样导致杂质留在支撑材料中，而不是进入分离中压柱。可以在制
备型 HPLC 色谱柱上对预纯化的提取样品进行进一步分离，此类色谱柱仅允许进样液体。

检测

由于结构多样性，大多数天然产品混合物只能通过紫外光和 ELSD 的结合才能完全检测

出来。许多天然产品缺失发色团或在不同的波长范围下吸收紫外光，导致无法依赖于单一的
检测源。DAD 扫描是检测和分析所有 UV 活性化合物的最佳方式，而非发色团化合物可通
过 ELSD 显影。

应用示例

快速和制备型 HPLC 的结合

辣椒素

80
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

溶剂 % UV1 UV2

2 5 7 8 9 11 12
(1) 0.30

0.24
UV (AU)

0.18

0.12

0.06 AB AB AB AB
0.00
0 5 10 15 20 25 30 35 40
时间（分）

17 19 21 23 25 27 29 31 33 34
(2) 0.10

0.08

0.06
UV (AU)

AB AB AB
0.04

0.02

0.00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
时间（分）

运行 1 运行 2

烟酸、硫胺素、4 氨基苯酸的
样品 红辣椒提取物
混合物

样品装载 固态 固态

A：DCM A：水
流动相
B：乙腈 B：乙腈

梯度（溶剂 B%） 10% 50%

快速中压柱，二氧化硅， 制备型 HPLC 色谱柱，C18，

固定相
40 µm，不规则，12 g 10 µm，25 x 360 mm

流速 10 mL/min 15 mL/min

检测 UV 227 nm、254 nm UV 227 nm、254 nm

图 7：通过快速色谱法 (1) 和制备型 HPLC (2) 对红辣椒提取物进行分离。快速馏分 9 – 11 是在制备型 HPLC 色谱柱上

收集和进样的。制备型 HPLC 馏分 19 – 26 包含 78 – 95% 纯辣椒素

81
 应用

通过使用更小粒径实现更高分离度

溶剂 % ELSD UV1
(1) 563 0.50

530 0.40
ELSD (mV)

UV (AU)
398 0.30

265 AB 0.20

133 AB 0.10

0 0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

(2) 333 0.50

266 0.40
ELSD (mV)

200 0.30

UV (AU)
133 AB 0.20

66 AB 0.10

0 0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

运行 1 运行 2

样品 乳香树提取物 乳香树提取物

样品装载 固态 固态

A：正己烷 A：正己烷
流动相
B：乙酸乙酯 B：乙酸乙酯

2.3 分钟：10% 2.3 分钟：10%

梯度（溶剂 B%）
9.7 分钟：10 – 60% 9.7 分钟：10 – 60%

快速中压柱，二氧化硅， 快速中压柱，二氧化硅，
固定相
50 µm，不规则，12 g 20 µm，不规则，12 g

流速 30 mL/min 30 mL/min

检测 UV 254 nm，ELSD UV 254 nm，ELSD

图 8：通过快速色谱法使用大二氧化硅粒径 (1) 和小二氧化硅粒径 (2) 对乳香树提取物进行分离。使用更小

粒径时分离度提高。通过 ELSD（绿线）可以检测到所有化合物，紫外信号（蓝线）仅对于部分化合物可见

82
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

UV 和 ELS 检测的结合

丁香酚和石竹烯

溶剂 % ELSD UV1 UV2

500 2.00
AB AB
400 1.60
ELSD (mV)

UV (AU)
300 1.20

200 AB 0.80

100 0.40

0 0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

样品 丁香提取物

样品装载 液态

A：0.5% 甲酸水溶液
流动相
B：甲醇

7 分钟：30 – 100%
梯度（溶剂 B%）
5 分钟：100%

固定相 快速中压柱，C18，40 µm，不规则，12 g

流速 30 mL/min

检测 UV 220 nm、254 nm；ELSD

图 9：通过快速色谱法使用 UV（紫蓝线）和 ELS（绿线）对丁香提取物中的丁香酚和石竹烯进行分离

脂肪

脂肪是一个多样化的分子组，这些分子由于参与中间代谢（同时作为能量储存和能量分子）、
膜结构、信号传导和保护（抗氧化剂、热绝缘和减震）而具有重要的生理作用。脂肪由多种形
式组成，可以分为脂肪酸（例如脂肪醇和酸）、甘油糖脂类（例如单、双和三酰基甘油酯）、
甘油磷脂类（例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸）、鞘脂类、固醇脂类（例如胆固醇、

83
应用

胆汁酸、维生素 D）、孕烯醇酮脂类（例如维生素 E 和 K）、糖脂类和聚酮类（例如黄曲霉

毒素 B1）。

硬脂酸，一种饱和脂肪酸 亚麻油酸，一种不饱和脂肪酸

固定相和流动相

由于其非极性性质，脂肪可溶于有机溶剂中，但不溶于水。纯化脂肪有两种可能性：正相或
反相，但仅使用有机溶剂。在正相中，可以使用诸如己烷、乙酸乙酯或 DCM 等溶剂。但高极
性固定相可能导致低保留度，因为脂肪中可与高极性二氧化硅表面发生相互作用的极性基团数
量有限。因此这会导致分离度极低。因此，一般优先选择反相 (C18)。但由于其疏水性，会使
用更多非极性的溶剂，例如 DCM、乙腈或甲醇。这种所谓的非水相反相技术可同时解决亲脂性
化合物的溶解度和保留问题。

对于无法通过二氧化硅或 C18 进行纯化的脂肪，例如氨基或二醇等中度极性的相是一个很好

的备选项。这两种相均可以在 RP 或 NP 条件下使用，因此为有效地纯化高度亲脂性化合物提
供了更多可能性。由于其极性不同，氨基和二醇可能对化合物的洗脱顺序产生很大影响。

流动相的极性 – 化合物的溶解度
正相 正相和反相 反相

己烷/乙酸乙酯 水/甲醇
二氯甲烷/ 水/乙腈
甲醇 水/乙醇

二氧化硅 氨基 二醇 C4 C8 C18

固定相的极性 – 化合物的保留

图 10：正相和反相中流动相和固定相的极性

84
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

样品装载

由于其亲脂性，仅可在使用有机溶剂时以液态形式进样脂肪。如果出现溶解度问题，使用快速
色谱法时可以将固态进样作为一种选择。在诸如二氧化硅等支撑材料中加入亲脂性化合物，
然后通过蒸发去除溶剂。最后，将固体样品置于分离中压柱前面，在此化合物逐渐从支撑材料
中洗脱出来。

检测

由于脂肪的紫外吸光度极低，因此通过紫外光进行检测很有挑战性。传统的脂肪检测方法是
折光率 (RI) 或低波长 UV (190 – 205 nm)。但是，RI 检测的灵敏度极低且梯度不相容，导致无
法有效检测出碳水化合物。低波长 UV 缺乏灵敏度，且为流动相的吸收特征带来了一个问题。
这两种技术均显示出基线漂移严重和平衡时间过长，因为检测器对溶剂中的光谱学变化作出
回应。这个问题可以通过 TLC 进行纯化后分析按体积进行收集或通过备选检测技术 ELSD
加以解决。因此，对于结构多样化的脂肪的检测，建议使用 ELSD 以成功地监测所有亲脂性化
合物的分离。

应用示例

UV 和 ELS 检测的结合

三硬脂精

85
 应用

溶剂 % ELSD UV1
(1) 200 0.50

180 0.40
ELSD (mV)

UV (AU)
120 0.30
AB
80 0.20

40 0.10

0 0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

(2) 500 0.50

400 0.40
ELSD (mV)

300 0.30

UV (AU)
200 AB 0.20

100 0.10

0 0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

运行 1 运行 2

单硬脂酸甘油酯、二硬脂 单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸
样品 酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯的 甘油酯和三硬脂酸甘油酯的
甘油酯混合物 甘油酯混合物

样品装载 液态 液态

A：乙腈 A：乙腈
流动相
B：二氯甲烷 B：二氯甲烷

2 分钟：100%
8 分钟：10 – 100%
梯度（溶剂 B%） 9 分钟：100 – 10%
3 分钟：100%
2 分钟：10%

快速中压柱，C18，40 µm， 快速中压柱，氨基，40 µm，

固定相
不规则，12 g 不规则，12 g

流速 30 mL/min 30 mL/min

检测 UV 210 nm，ELSD UV 210 nm，ELSD

图 11：通过快速色谱法使用 C18 (1) 和氨基 (2) 中压柱对甘油酯混合物进行分离。运行 1 是在反相条件下完成的，

运行 2 是在正相条件下完成的。化合物 1（单硬脂酸甘油酯）、2（二硬脂酸甘油酯）和 3（三硬脂酸甘油酯）的洗脱
顺序发生变化。所有化合物仅可通过 ELSD（绿线）检测出来

86
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

碳水化合物

碳水化合物是植物、动物和微生物中常见的化学成分。它们在生物体中发挥着多个作用，例如
能量储存、结构构件、辅酶成分、遗传分子 DNA 的主链。碳水化合物是分布最广泛的有机
物质，在所有生命中均发挥着重要的作用。

碳水化合物是自然生成的化合物，或是此类化合物的衍生物，化学通式为 Cx(H2O)y。取决于
其分子量，碳水化合物可以分为低分子量碳水化合物（例如单糖和二糖类）和更为复杂的高分
子量低聚糖和多糖类。

单糖类（葡萄糖） 二糖类（蔗糖） 多糖类（直链淀粉）

固定相和流动相

碳水化合物是亲水物质，可溶于水和乙醇中，难溶于大多数有机溶剂中。碳水化合物
的 -OH 基主要负责其溶解度。因此，水混合物被用作溶剂，一般结合乙腈作为弱溶剂。在这
些反相条件下，使用 C18 作为固定相可能导致高极性碳水化合物的保留度低。相反，氨基已
被证实是最合适的选择，因为氨基的非极性小于 C18，可以在反相条件下使用。

样品装载

碳水化合物一般在反相方法的起始条件中可溶。因此，液态装载是装载样品到高压柱或中压柱
上的第一选择。化合物以水混合物的形式进样。

检测

正如上文脂肪部分中所述，碳水化合物也提出了特别的检测挑战，因为它们缺少发色团。
传统的检测方法包括折光率 (RI)、低波长 UV (190 – 205 nm) 或通过 TLC 进行纯化后分析。
目前 ELSD 被用作碳水化合物的主要检测技术。

87
 应用

UV 和 ELS 检测的结合

葡萄糖 麦芽糖 阿卡波糖

溶剂 % ELSD UV1 UV2

300 0.10

240 0.08
AB
ELSD (mV)

UV (AU)
180 AB 0.06

120 0.04

80 0.02

0 0.00
0 3 6 9 12 15
时间（分）

样品 葡萄糖、麦芽糖和阿卡波糖的合成混合物

样品装载 液态

A：0.1% TFA 水溶液

流动相
B：乙腈

1 分钟：90%
梯度（溶剂 B%） 7 分钟：90 – 70%
8 分钟：70%

固定相 快速中压柱，氨基，40 µm，不规则，12 g

流速 36 mL/min

检测 UV 220 nm、254 nm；ELSD

图 12：通过快速色谱法对碳水化合物混合物（葡萄糖、麦芽糖和阿卡波糖）进行分离。所有化合物仅可通过 ELSD
（绿线）检测出来

88
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

小分子药物

小分子药物是指被定义为具有低分子量和简单化学结构的有机化合物的药物，可以通过化学合
成进行生产。典型分子质量介于 0.1 至 1 kDa 范围内。小分子药物的主要优势其能够穿过细胞
膜到达细胞内靶点，非常稳定且可以口服给药。小分子药物可能是根据由理性药物设计推导出
来的线索进行开发的，也可能是从天然资源中分离得出的。

小分子药物的示例：

阿司匹林 苯海拉明

固定相和流动相

小分子药物的用途非常广泛，并且其结构和化合物极性也极其多样化。副反应和降解过程可能
形成与目标化合物高度相似的杂质。需要在纯化过程中去除这些杂质，鉴于其化学和物理结构
与产品的相似性，这可能非常有挑战性。杂质和目标药物的化学结构决定了最适用于纯化的色
谱法类型。取决于化合物的极性，可以使用快速或制备型 HPLC，二者通常结合用于正相或反
相条件下。正相和反相的优点和局限性请参见下表：

优点 局限性

正相 (NP)

分离后可以通过蒸发轻松去除 有机溶剂的成本更高，且存在
流动相
有机溶剂 安全性和环境问题

固定相 二氧化硅介质的成本很低 二氧化硅介质仅可单次使用

反相 (RP)

水需要的浓缩（蒸发）时间
流动相 水/乙醇混合物的成本非常低
很长

固定相 键合硅 (C18) 可以多次使用 键合硅 (C18) 的成本很高

表 2：正相和反相的优点和局限性。

89
应用

对于大多数合成，粗反应混合物通过正相色谱法进行纯化。但是，对于小分子药物，需要重点
关注的是这些混合物是水溶性混合物。因此，一般目标是在水条件下使用反相，但这并不适用
于所有混合物，因此正相仍然是一种选择。

样品装载

由于其多功能性，小分子药物可以采用液态或固态（仅限快速色谱法）形式进样到高压柱或中
压柱上。装载主要取决于化合物的极性以及选择的纯化技术。鉴于化合物在所用技术（反相为
极性，正相为非极性）的起始条件下易溶，因此液态装载是第一选择。但在一些情况下，化合
物在起始溶剂中不溶，因此需要以固体样品形式进样。

检测

绝大部分的小分子药物是紫外吸收化合物，因此通过紫外检测器可以很容易检测出来。但是，
在一些情况下，正相溶剂会干扰化合物在极低 UV 波长下的吸收，或者化合物完全对紫外光无
活性。这种情况下的替代方案是使用 ELSD，此方法可以测量化合物散射的光。但由于部分小
分子药物倾向于呈半挥发性，因此建议仅在室温条件下执行 ELSD。否则，目标化合物会以与
溶剂相似的方式挥发掉，因此无法检出。

应用示例

UV 和 ELS 检测的结合
(1) (2) (3) (1) 2-氨基-5-二乙基氨基戊烷 20 mg
(2) 8-氨基-6-甲氧基喹啉 HBr 1 mg
(3) 伯氨喹 10 mg

90
 应用
Basic Principles of Flash and Prep HPLC

溶剂 % ELSD UV1 UV2

1500 0.20
AB AB
1200 0.16
ELSD (mV)

UV (AU)
900 0.12
AB
800 0.08

300 0.04

0 0.00
0 2 4 6 8 10 12
时间（分）

样品 伯氨喹的合成混合物

样品装载 液态

A：水
流动相
B：甲醇

5 分钟：30 – 100%
梯度（溶剂 B%）
7 分钟：100%

固定相 快速中压柱，C18，40 µm，不规则，12 g

流速 36 mL/min

检测 UV 220 nm、254 nm；ELSD

图 13：通过快速色谱法对伯氨喹的合成混合物进行分离。部分化合物仅可通过紫外光检出，部分仅可通过 ELSD
（绿线）检出

91
92
References

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dische Grundlagen der HPLC. Weinheim, Germany: VCH.

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Application Review No. 003/2020. Purification of Peptides/Proteins & Selection of Chromato­

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93
注意

94
95
BÜCHI Labortechnik AG Meierseggstrasse 40 Switzerland – 9230 Flawil
T+41 71 394 63 63 marketing@buchi.com www.buchi.com