Thu hồi và tinh chế

sản phẩm lên men

Giới thiệu
• Chi phí thu hồi sản phẩm lên men chi ếm từ 15 –
70 % tổng giá thành của sản phẩm
• Dịch lên men tại thời điểm thu nhận có chứa
 Sản phẩm mục tiêu với nồng độ thấp (nếu là
sản phẩm ngoại bào)
 Tế bào nguyên vẹn, tế bào bị vỡ
 Các chất tan và không tan của môi trường nuôi
cấy còn lại
 Các sản phẩm trao đổi chất khác
Giới thiệu
• Sản phẩm ngoại bào có thể nhạy với nhiệt hoặc
dễ dàng bị phá vỡ cấu trúc do các chủng vi sinh
vật tạp nhiễm
→ Tăng mức độ khó khăn cho quá trình thu hồi.
→ Cần tăng tốc độ tinh sạch đối với các sản
phẩm có tính nhạy cảm cao → việc thu hồi sản
phẩm phải được thực hiện trong khoảng thời gian
thích hợp nhất.
Lựa chọn quy trình thu hồi
Dựa vào các tiêu chí sau
• Xác định loại môi trường lên men (rắn, bán rắn
hay lỏng)
• Sản phẩm thu nhận là nội bào hay ngoại bào
• Nồng độ của sản phẩm trong dịch lên men
• Đặc tính lý – hóa của sản phẩm (giúp cho việc
chọn lựa phương án tách)
• Mục đích sử dụng của sản phẩm
Lựa chọn quy trình thu hồi
Dựa vào các tiêu chí sau
• Độ tinh khiết thấp nhất có thể chấp nhận được
• Độc tính của sản phẩm và của dịch lên men
• Mức độ tạp chất trong dịch lên men
• Giá cả thị trường của sản phẩm
Các giai đoạn thu hồi sản phẩm
• Loại bỏ các phần tử rắn có kích thước lớn và tế
bào vi sinh vật: máy ly tâm hoặc máy lọc
• Dịch lên men được phân đoạn hoặc được chiết
tách: hệ thống lọc tinh, hệ thống chuyển đổi áp
suất thẩm thấu, hấp phụ, trao đổi ion, lọc gel, sắc
ký, chiết tách dịch lỏng hai phase hoặc đông tụ
• Các phân đoạn có chứa sản phẩm mục tiêu sẽ
được tinh chế: đông tụ phân đoạn, sắc ký, kết
tinh thu hồi sản phẩm
• Nếu cần thu hồi một số sản phẩm khác: thay đổi
một vài công đoạn trong quy trình chính
Xử lý nhanh dịch lên men
• Chọn lựa chủng vi sinh vật không sinh tổng hợp
các chất màu hoặc các chất trao đổi không muốn
• Thay đổi điều kiện lên men → giảm thiểu sự sản
xuất các sản phẩm trao đổi chất không mong
muốn
• Xác định chính xác thời điểm thu hồi thích hợp
nhất
• Kiểm soát pH sau khi dừng lên men
• Xử lý nhiệt độ sau khi dừng lên men
• Bổ sung các chất gây kết tụ
• Dùng enzyme phá thành tế bào
Một số yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi sản phẩm
• Vốn đầu tư
• Chi phí xử lý
• Các yêu cầu của toàn bộ quy trình
• Hiệu suất thu hồi
• Chất lượng thành phẩm
• Tính sẵn có các kỹ thuật công nghệ
Một số yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi sản phẩm
• Phù hợp với các yêu cầu đã quy định
• Nhu cầu xử lý chất thải
• Quy trình liên tục hay theo mẻ
• Tính tự động
• Vệ sinh an toàn cho nhân viên vận hành
Các phương pháp tách tế bào
• Tế bào vi sinh và các nguyên liệu không tan được
tách ra ngay khi thu nhận dịch lên men: lọc hoặc
ly tâm
• Kích thước của tế bào vi sinh rất nhỏ → dùng
thêm các hệ thống hỗ trợ nhằm tăng cường tốc
độ tách loại
• Có nhiều phương pháp để tách loại tế bào ra khỏi
dịch lên men
Các phương pháp tách tế bào
Lắng tủa
• Dựa trên sự kết lắng do trọng lực của chất rắn
trong môi trường nước
• Thường được sử dụng nhiều trong thu nhận
protein
• Tăng cường tốc độ lắng nhờ vào một số phương
pháp thúc đẩy quá trình lắng: tạo keo tụ hoặc
dung dịch lên men
Lắng tủa
• Phương pháp tạo keo tụ
 Thay đổi pH (nếu không ảnh hưởng đến các
bước tiếp theo)
 Bổ sung các chất có khả năng làm đông tụ:
 Muối calcium, muối Fe, muối Al: gây đông tụ
vi khuẩn, nấm men, tảo…
 Tanic acid, titan chloride và các ammonium
bậc 4 làm tăng tốc độ lắng tụ sinh khối
Candida
 Hàn the: gây đông tụ tế bào nấm men
 Bổ sung các loại keo có điện tích nghịch
Các phương pháp tách tế bào
Ly tâm
• Dựa vào trọng lượng của tế bào
• Lực ly tâm càng lớn, việc tách loại tế bào ra khỏi
dịch lên men càng dễ
• Lực ly tâm phụ thuộc vào tốc độ quay của rotor
(rpm) và bán kính thùng quay theo phương trình
C = m.w2/R
• Trong đó m: khối lượng (kg)
w: tốc độ thùng quay (m/s)
R: bán kính thùng quay (m)
Các phương pháp tách tế bào
Ly tâm
Các phương pháp tách tế bào
Lọc
• Quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất
về mặt kích thước qua vật liệu lọc: phân tử có
kích thước lớn hơn kích thước lỗ lọc được giữ lại
bên trên, dung dịch đi xuyên qua lọc nhờ áp suất
• Được sử dụng để thu sinh khối các chủng vi sinh
vật có kích thước tế bào lớn: tế bào càng lớn, lọc
càng nhanh và hiệu suất lọc càng cao
• Chỉ áp dụng trong trường hợp thu nhận sinh khối
tảo do kích thước lớn, với các chủng vi sinh vật
kích thước nhỏ: lọc không hiệu quả
Các phương pháp tách tế bào
Lọc – các yếu tố ảnh hưởng
• Chênh lệch áp suất
 Độ lệch áp (ΔP): trước và sau màng lọc →
động lực của quá trình lọc
 ΔP càng lớn thì tốc độ lọc càng cao
 Động lực của quá trình lọc được tạo ra bằng
áp lực của cột chất lỏng / lọc áp suất / lọc chân
không
 Nếu ΔP quá lớn: lớp bã trên mặt lọc bị nén
chặt, lỗ lọc bị thu hẹp → nghẹt lọc, màng lọc bị
rách, hư hỏng thiết bị → thiết kế ΔP phù hợp
Các phương pháp tách tế bào
Lọc – các yếu tố ảnh hưởng
• Chất trợ lọc
 Bột mịn dùng để hỗ trợ quá trình lọc → tạo
thành lớp bã bổ sung trên bề mặt lọc → tăng
khả năng giữ pha rắn và giảm trở lực của pha
lỏng
• Vật ngăn lọc
 Nhằm để ngăn cản và giữ lại pha rắn,
 Bề dày và tính chất của vật ngăn lọc ảnh
hưởng đến tốc độ lọc → xốp, mỏng và dễ thay
thế (vải lọc, màng xốp, tơ nhân tạo, cát sỏi)
Các phương pháp tách tế bào
Lọc – các phương pháp
• Lọc chân không thùng quay
• Lọc khung bản
• Lọc tiếp tuyến
Các phương pháp tách tế bào
Lọc – các loại màng lọc
• Màng lọc ép: dùng các loại bằng gang hoặc bằng
thép không rỉ, có thể khử trùng bằng nhiệt độ cao
• Màng lọc dĩa: gồm một chồng dĩa làm bằng
khung kim loại thưa mắt cáo, bọc trong vật liệu
lọc như giấy amian hoặc cellulose
• Màng lọc kim loại bằng những dĩa mỏng thép
không rỉ, có rãnh nhỏ trên một mặt được chồng
lên nhau trong một trụ rỗng, được bổ sung các
chất phụ gia thích hợp để làm tăng hiệu lực lọc
Các phương pháp tách tế bào
Lọc – các loại màng lọc
• Các phễu lọc chân không hình trống: có lưu
lượng lớn, chủ yếu dùng để lọc môi trường lên
men.
• Màng lọc vô trùng: các vật liệu lọc bảo đảm mức
độ vô trùng và có đạt các tiêu chuẩn
 Tính chất lý học cho phép chịu được áp suất
khử trùng
 Có khả năng lọc nhanh và có thể tái sử dụng
 Có thể khử trùng được bằng hơi nước hoặc
hơi nóng
Các phương pháp tách tế bào
Tạo bọt
• Phân tách tế bào ra khỏi dịch lên men dựa trên
sự khác nhau về độ hoạt động bề mặt của các
chất: tế bào được lôi kéo theo các bọt khí đi ra
khỏi pha lỏng → phân tách với pha lỏng → dễ
dàng loại bỏ
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Đông lạnh - giải đông
 Sử dụng để ly giải tế bào vi khuẩn và tế bào
động vật hữu nhũ
 Làm đông huyền phù vi khuẩn trong bể ethanol
khô hay máy làm đông, sau đó giải đông ở
nhiệt độ phòng 37 oC.
 Nguyên lý: tế bào sẽ trương lên khi bị đông
lạnh; vỡ ra khi các tinh thể đá được hình thành
trong chu trình đông; tan ra trong chu trình giải
đông
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Đông lạnh - giải đông
 Cần phải lập lại nhiều lần chu trình đông – giải
đông để đạt hiệu quả ly giải cao
 Ưu điểm: không gây biến tính protein mục tiêu,
không bổ sung bất kỳ loại hóa chất nào
 Nhược điểm: hiệu quả ly giải thấp, tốn nhiều
thời gian
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Trượt rắn
 Đẩy nguyên liệu tế bào đã đông lạnh khoảng
âm 25 oC qua một lỗ hẹp ở áp suất cao
 Ít được sử dụng ở quy mô công nghiệp: không
thể dùng một lượng lớn nguyên liệu để phá vỡ
tế bào
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Trượt lỏng
 Dùng phá vỡ tế bào vi khuẩn và nấm men,
được sử dụng rộng rãi phục vụ cho nghiên cứu
cũng như ở qui mô công nghiệp
 Nguyên tắc: dịch huyền phù tế bào được nén
dưới áp suất cao di chuyển qua một lỗ hẹp sau
đó đi qua buồng có thể tích lớn hơn → áp suất
giảm đột ngột → tế bào vỡ ra.
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Trượt lỏng
 Máy đồng hóa áp lực cao Manton-Gaulin: một
máy bơm kiểu piston, có thiết bị điều chỉnh áp
suất hoạt động theo yêu cầu vận hành, có thể
đạt tới 95 Mpa
 Tốc độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein phụ
thuộc vào: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng
độ và tiền xử lý (đông lạnh: các tế bào vi sinh
vật thường dễ vỡ nếu chúng được làm lạnh
trước)
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Trượt lỏng
 Máy đồng hóa áp lực cao Manton-Gaulin
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Nghiền
 Tế bào có thể được phá vỡ bằng phương pháp
cơ học nhờ hệ thống chứa 1 dãy đĩa quay và
các hạt nhỏ
 Hạt này được làm từ những vật liệu có khả
năng chống chịu cơ học tốt: thủy tinh, allumina
ceramide hay các hợp chất titan
 Sản phẩm đặc trưng: Dyno-Muhle (WA
Bachofen, Basle, Switzerland), dùng giải phóng
protein khỏi tế bào vi sinh vật khác nhau
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Nghiền
 Dịch huyền phù tế bào được bơm vào buồng,
sau đó được khuấy trộn với tốc độ rất nhanh
đủ để phá vỡ cả các tế bào vi khuẩn dai nhất
 Buồng phân hủy cần được làm lạnh để giữ
hoạt tính của protein khỏi tác động do sự sinh
nhiệt trong quá trình nghiền
 Thể tích buồng 600 mL có thể thực hiện nghiền
tới 5 kg tế bào vi khuẩn / h, ở quy mô sản xuất,
buồng có thể tích lên tới 250 L
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Siêu âm
 Sóng siêu âm (20 KHz đến 1 MHz) tạo ra xen
kẽ các sóng áp suất cao và áp suất thấp trong
chất lỏng mà nó truyền qua
 Chu kỳ áp suất thấp: sóng siêu âm tạo ra các
bong bóng chân không nhỏ trong chất lỏng
 Chu kỳ áp suất cao: bong bóng ị phá vỡ hoàn
toàn (Cavitation)
 Cavitation gây ra lực cắt thủy động lực mạnh
→ tác động lên màng tế bào → gây vỡ tế bào
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp vật lý
• Siêu âm
 Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, không cần bổ
sung chất vào hỗn hợp cần tách
 Nhược điểm: chi phí đầu tư cao, lực tác động
mạnh có thể làm vỡ các sản phẩm nhạy cảm
với lực
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp hóa học
• Dùng áp suất thẩm thấu
 Nước đi từ dung dịch nhược trương vào tế bào
ưu trương hơn khi tế bào nằm trong dung dịch
 Chỉ có thể áp dụng cho những tế bào không có
thành (tế bào động vật)
 Với các tế bào có thành (tế bào thực vật, vi
khuẩn, nấm men) phải xử lý thêm bằng các
enzyme (lysosyme, celluloase, pectinase,
hemicellulase...) để loại thành tế bào trước khi
xử lý tiếp bằng áp suất thẩm thấu
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp hóa học
• Dùng áp suất thẩm thấu
 Dịch thu được bao gồm sản phẩm sinh học
quan tâm và dung dịch nhược trương dùng
phá màng tế bào → cần cô đặc
 Ưu điểm: thực hiện nhanh chóng, dễ làm, ít tốn
chi phí, không cần tốn thời gian và công sức để
loại bỏ các tạp chất hóa học
 Nhược điểm: cần lượng dung dịch rất lớn để
phá màng → khó thu dịch tế bào với nồng độ
đậm đặc
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp hóa học
• Dùng các tác nhân acid hoặc base
 Dùng acid để thủy phân các thành phần tế bào:
hàm lượng acid cao → thay đổi về bản chất
hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản
phẩm có trong tế bào
 Với enzyme ổn định ở giá trị pH cao: sử dụng
dung dịch kiềm để phân giải các tế bào vi
khuẩn
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp hóa học
• Dùng chất phá màng
 Sử dụng chất tẩy rửa: phá vỡ các rào cản lipid
xung quanh tế bào bằng cách phá vỡ tương
tác lipid - lipid, lipid - protein và protein –
protein
 Dung môi hữu cơ: EDTA (thay đổi tính thấm
màng tế bào), acetone (hòa tan phospholipid)
Phương pháp phá màng tế bào
Phương pháp sinh học (enzyme)
• Lysozyme:
 Phá hủy thành tế bào vi khuẩn thông qua việc
xúc tác sự thủy phân của liên kết 1,4-beta giữa
các tiểu phần N-acetylmuramic acid và N-
acetyl-D-glucosamide trong chitodextrin
 Có trong một số chất tiết như nước mắt, nước
bọt, sữa người và màng nhầy, trong các bào
quan của bạch cầu trung tính và trong lòng
trắng trứng
Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm
Chiết lỏng - lỏng
• Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích
vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn
được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể
một dung môi có chứa chất phân tích) được để
trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình
chiết
• Chiết tĩnh
• Chiết ngược dòng: Hai pha lỏng không trộn được
vào nhau được bơm liên tục và đi ngược chiều
nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết
Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm
Thẩm tích
Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm
Kết tủa
• Kết tủa bằng muối
• Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
• Thay đổi pH
• Tủa bằng ion kim loại
 Thu hồi
sinh khối vi tảo
Giới thiệu
• Vi tảo: sinh vật đơn bào, kích thước hiển vi, phân
bố trong hầu hết các loại hình môi trường đất, đá,
nước, đôi khi ký sinh trên các sinh vật khác
• Hiệu quả đồng hóa carbon vô cơ cao hơn rất
nhiều so với các nhóm thực vật khác
• Dễ dàng nuôi cấy trên nhiều điều kiện môi trường
sống và mô hình sản xuất khác nhau
• Không mang tính cạnh tranh với các đối tượng
canh tác truyền thống
• Là nguồn thức ăn truyền thống và bổ dưỡng cho
con người nhất là ở các quốc gia Châu Á
Giới thiệu
• Một số loài đang được sử dụng rộng rãi:
Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis,
Dunaliella salina, Spirulina platensis: sinh trưởng
nhanh, dễ thu hoạch và giá trị dinh dưỡng cao
• Thành phần dinh dưỡng: carbohydrate, protein,
lipid, acid béo không no, các chất chống oxy hóa
(polyphenol, polysaccharide, vitamin A, B2, B6, C,
E...), các muối khoáng (iodine, kali, sắt, magne,
calci...), các amino acid thiết yếu
Giới thiệu
• Được nuôi thu sinh khối trong các hệ thống nuôi
đơn giản: được bơm trực tiếp vào các bể hay hệ
thống nuôi trồng thủy sản
• Cách thức nuôi tồn tại nhiều hạn chế
 Sinh khối tế bào vi tảo trong dịch nuôi cấy
chiếm tỷ lệ rất nhỏ (khoảng 1 0/00 trọng lượng
tươi)
 Thiếu tính chủ động trong sản xuất (phụ thuộc
rất nhiều vào kết quả vụ nuôi cấy, đặc biệt là
trong các hệ thống nuôi hở)
 Khó khăn trong vận chuyển và bảo quản.
Giới thiệu
• Kinh phí cho việc thu hồi vi tảo chiếm khoảng 20
– 30% vào tổng chi phí sản xuất sinh khối vi tảo
• Các kỹ thuật loại nước khác nhau chỉ phù hợp
cho từng loài vi tảo khác nhau.
→ cần tìm ra giải pháp thu hoạch vi tảo để hiệu
quả thu hoạch cao, không gây độc hại cho thủy
sản nuôi, cắt giảm chi phí đầu tư và dễ vận hành
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Ly tâm
• Có thể áp dụng ở quy mô công nghiệp
• Phù hợp cho nhiều loại vi tảo với số lượng sinh
khối lớn và nhanh chóng.
• Sản phẩm không bị nhiễm bẩn do không cần đưa
tác nhân hóa học vào
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Ly tâm
• Cấu trúc tế bào vi tảo dễ bị tác động do nhiệt độ
nâng cao
• Lực ly tâm mạnh gây chết và ảnh hưởng đến
chất lượng dinh dưỡng của vi tảo
• Chi phí đầu tư máy móc, thiết bị đắt tiền, tiêu tốn
năng lượng lớn và khó khăn trong công tác vận
hành
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Lọc
• Vận hành đơn giản và phổ biến
• Ít gây vỡ tế bào vi tảo
• Không tốn nhiều kinh phí máy móc thiết bị
• Sử dụng màng siêu lọc sẽ tăng hiệu quả thu
hoạch
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Lọc
• Thời gian thu hoạch kéo dài, chỉ phù hợp để thu
nhận các loài tảo đơn bào có kích thước lớn
• Hiệu suất thu hồi thấp và dễ tắt nghẽn màng lọc
• Màng siêu lọc có thể hạn chế các nhược điểm
trên, tuy nhiên chi phí màng lọc cao và tiêu tốn
nhiều năng lượng
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Lắng
• Vận hành đơn giản và chi phí đầu tư thấp
• Tốc độ lắng chậm, thời gian lắng quá lâu nên
hiệu suất thu thấp và chủ yếu thu các tế bào lão
hóa
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Tuyển nổi
• Chi phí đầu tư thiết bị không cao
• Hiệu quả thu thấp và có khả năng tồn tại dư
lượng kim loại nặng ảnh hưởng đến sức khỏe
động vật nuôi
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Keo tụ
• Chi phí đầu tư thiết bị thấp, vận hành đơn giản
• Hiệu suất thu hồi sinh khối cao và có thể bảo
quản thời gian dài sau thu hoạch
• Sử dụng một số chất hữu cơ và vô cơ rẻ tiền,
thông dụng và hiệu quả thu cao ở nồng độ thấp
→ tránh dùng các chất trợ lắng vô cơ và hữu cơ
có khả năng tồn tại và gây hại cho động vật nuôi
do dư lượng kim loại nặng
Các phương pháp thu hoạch vi tảo
Keo tụ
• Có thể dùng polymer sinh học (chitosan) không
gây độc hại, hiệu quả cao và có thể tiết kiệm kinh
phí khi kết hợp với các phương pháp khác
• Đòi hỏi sử dụng liều lượng cao nên hạn chế ứng
dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp
• Môi trường có độ mặn cao sẽ ảnh hưởng đến
quá trình keo tụ vi tảo: các polyelectrolyte bị ức
chế trong môi trường mặn, chỉ hiệu quả ở độ mặn
dưới 5g/L → sử dụng chitosan keo tụ các loài vi
tảo nước ngọt mang lại hiệu quả thu hoạch cao
hơn các loài vi tảo biển