Giới thiệu • Chi phí thu hồi sản phẩm lên men chi ếm từ 15 – 70 % tổng giá thành của sản phẩm • Dịch lên men tại thời điểm thu nhận có chứa Sản phẩm mục tiêu với nồng độ thấp (nếu là sản phẩm ngoại bào) Tế bào nguyên vẹn, tế bào bị vỡ Các chất tan và không tan của môi trường nuôi cấy còn lại Các sản phẩm trao đổi chất khác Giới thiệu • Sản phẩm ngoại bào có thể nhạy với nhiệt hoặc dễ dàng bị phá vỡ cấu trúc do các chủng vi sinh vật tạp nhiễm → Tăng mức độ khó khăn cho quá trình thu hồi. → Cần tăng tốc độ tinh sạch đối với các sản phẩm có tính nhạy cảm cao → việc thu hồi sản phẩm phải được thực hiện trong khoảng thời gian thích hợp nhất. Lựa chọn quy trình thu hồi Dựa vào các tiêu chí sau • Xác định loại môi trường lên men (rắn, bán rắn hay lỏng) • Sản phẩm thu nhận là nội bào hay ngoại bào • Nồng độ của sản phẩm trong dịch lên men • Đặc tính lý – hóa của sản phẩm (giúp cho việc chọn lựa phương án tách) • Mục đích sử dụng của sản phẩm Lựa chọn quy trình thu hồi Dựa vào các tiêu chí sau • Độ tinh khiết thấp nhất có thể chấp nhận được • Độc tính của sản phẩm và của dịch lên men • Mức độ tạp chất trong dịch lên men • Giá cả thị trường của sản phẩm Các giai đoạn thu hồi sản phẩm • Loại bỏ các phần tử rắn có kích thước lớn và tế bào vi sinh vật: máy ly tâm hoặc máy lọc • Dịch lên men được phân đoạn hoặc được chiết tách: hệ thống lọc tinh, hệ thống chuyển đổi áp suất thẩm thấu, hấp phụ, trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, chiết tách dịch lỏng hai phase hoặc đông tụ • Các phân đoạn có chứa sản phẩm mục tiêu sẽ được tinh chế: đông tụ phân đoạn, sắc ký, kết tinh thu hồi sản phẩm • Nếu cần thu hồi một số sản phẩm khác: thay đổi một vài công đoạn trong quy trình chính Xử lý nhanh dịch lên men • Chọn lựa chủng vi sinh vật không sinh tổng hợp các chất màu hoặc các chất trao đổi không muốn • Thay đổi điều kiện lên men → giảm thiểu sự sản xuất các sản phẩm trao đổi chất không mong muốn • Xác định chính xác thời điểm thu hồi thích hợp nhất • Kiểm soát pH sau khi dừng lên men • Xử lý nhiệt độ sau khi dừng lên men • Bổ sung các chất gây kết tụ • Dùng enzyme phá thành tế bào Một số yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi sản phẩm • Vốn đầu tư • Chi phí xử lý • Các yêu cầu của toàn bộ quy trình • Hiệu suất thu hồi • Chất lượng thành phẩm • Tính sẵn có các kỹ thuật công nghệ Một số yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi sản phẩm • Phù hợp với các yêu cầu đã quy định • Nhu cầu xử lý chất thải • Quy trình liên tục hay theo mẻ • Tính tự động • Vệ sinh an toàn cho nhân viên vận hành Các phương pháp tách tế bào • Tế bào vi sinh và các nguyên liệu không tan được tách ra ngay khi thu nhận dịch lên men: lọc hoặc ly tâm • Kích thước của tế bào vi sinh rất nhỏ → dùng thêm các hệ thống hỗ trợ nhằm tăng cường tốc độ tách loại • Có nhiều phương pháp để tách loại tế bào ra khỏi dịch lên men Các phương pháp tách tế bào Lắng tủa • Dựa trên sự kết lắng do trọng lực của chất rắn trong môi trường nước • Thường được sử dụng nhiều trong thu nhận protein • Tăng cường tốc độ lắng nhờ vào một số phương pháp thúc đẩy quá trình lắng: tạo keo tụ hoặc dung dịch lên men Lắng tủa • Phương pháp tạo keo tụ Thay đổi pH (nếu không ảnh hưởng đến các bước tiếp theo) Bổ sung các chất có khả năng làm đông tụ: Muối calcium, muối Fe, muối Al: gây đông tụ vi khuẩn, nấm men, tảo… Tanic acid, titan chloride và các ammonium bậc 4 làm tăng tốc độ lắng tụ sinh khối Candida Hàn the: gây đông tụ tế bào nấm men Bổ sung các loại keo có điện tích nghịch Các phương pháp tách tế bào Ly tâm • Dựa vào trọng lượng của tế bào • Lực ly tâm càng lớn, việc tách loại tế bào ra khỏi dịch lên men càng dễ • Lực ly tâm phụ thuộc vào tốc độ quay của rotor (rpm) và bán kính thùng quay theo phương trình C = m.w2/R • Trong đó m: khối lượng (kg) w: tốc độ thùng quay (m/s) R: bán kính thùng quay (m) Các phương pháp tách tế bào Ly tâm Các phương pháp tách tế bào Lọc • Quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất về mặt kích thước qua vật liệu lọc: phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ lọc được giữ lại bên trên, dung dịch đi xuyên qua lọc nhờ áp suất • Được sử dụng để thu sinh khối các chủng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn: tế bào càng lớn, lọc càng nhanh và hiệu suất lọc càng cao • Chỉ áp dụng trong trường hợp thu nhận sinh khối tảo do kích thước lớn, với các chủng vi sinh vật kích thước nhỏ: lọc không hiệu quả Các phương pháp tách tế bào Lọc – các yếu tố ảnh hưởng • Chênh lệch áp suất Độ lệch áp (ΔP): trước và sau màng lọc → động lực của quá trình lọc ΔP càng lớn thì tốc độ lọc càng cao Động lực của quá trình lọc được tạo ra bằng áp lực của cột chất lỏng / lọc áp suất / lọc chân không Nếu ΔP quá lớn: lớp bã trên mặt lọc bị nén chặt, lỗ lọc bị thu hẹp → nghẹt lọc, màng lọc bị rách, hư hỏng thiết bị → thiết kế ΔP phù hợp Các phương pháp tách tế bào Lọc – các yếu tố ảnh hưởng • Chất trợ lọc Bột mịn dùng để hỗ trợ quá trình lọc → tạo thành lớp bã bổ sung trên bề mặt lọc → tăng khả năng giữ pha rắn và giảm trở lực của pha lỏng • Vật ngăn lọc Nhằm để ngăn cản và giữ lại pha rắn, Bề dày và tính chất của vật ngăn lọc ảnh hưởng đến tốc độ lọc → xốp, mỏng và dễ thay thế (vải lọc, màng xốp, tơ nhân tạo, cát sỏi) Các phương pháp tách tế bào Lọc – các phương pháp • Lọc chân không thùng quay • Lọc khung bản • Lọc tiếp tuyến Các phương pháp tách tế bào Lọc – các loại màng lọc • Màng lọc ép: dùng các loại bằng gang hoặc bằng thép không rỉ, có thể khử trùng bằng nhiệt độ cao • Màng lọc dĩa: gồm một chồng dĩa làm bằng khung kim loại thưa mắt cáo, bọc trong vật liệu lọc như giấy amian hoặc cellulose • Màng lọc kim loại bằng những dĩa mỏng thép không rỉ, có rãnh nhỏ trên một mặt được chồng lên nhau trong một trụ rỗng, được bổ sung các chất phụ gia thích hợp để làm tăng hiệu lực lọc Các phương pháp tách tế bào Lọc – các loại màng lọc • Các phễu lọc chân không hình trống: có lưu lượng lớn, chủ yếu dùng để lọc môi trường lên men. • Màng lọc vô trùng: các vật liệu lọc bảo đảm mức độ vô trùng và có đạt các tiêu chuẩn Tính chất lý học cho phép chịu được áp suất khử trùng Có khả năng lọc nhanh và có thể tái sử dụng Có thể khử trùng được bằng hơi nước hoặc hơi nóng Các phương pháp tách tế bào Tạo bọt • Phân tách tế bào ra khỏi dịch lên men dựa trên sự khác nhau về độ hoạt động bề mặt của các chất: tế bào được lôi kéo theo các bọt khí đi ra khỏi pha lỏng → phân tách với pha lỏng → dễ dàng loại bỏ Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Đông lạnh - giải đông Sử dụng để ly giải tế bào vi khuẩn và tế bào động vật hữu nhũ Làm đông huyền phù vi khuẩn trong bể ethanol khô hay máy làm đông, sau đó giải đông ở nhiệt độ phòng 37 oC. Nguyên lý: tế bào sẽ trương lên khi bị đông lạnh; vỡ ra khi các tinh thể đá được hình thành trong chu trình đông; tan ra trong chu trình giải đông Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Đông lạnh - giải đông Cần phải lập lại nhiều lần chu trình đông – giải đông để đạt hiệu quả ly giải cao Ưu điểm: không gây biến tính protein mục tiêu, không bổ sung bất kỳ loại hóa chất nào Nhược điểm: hiệu quả ly giải thấp, tốn nhiều thời gian Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Trượt rắn Đẩy nguyên liệu tế bào đã đông lạnh khoảng âm 25 oC qua một lỗ hẹp ở áp suất cao Ít được sử dụng ở quy mô công nghiệp: không thể dùng một lượng lớn nguyên liệu để phá vỡ tế bào Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Trượt lỏng Dùng phá vỡ tế bào vi khuẩn và nấm men, được sử dụng rộng rãi phục vụ cho nghiên cứu cũng như ở qui mô công nghiệp Nguyên tắc: dịch huyền phù tế bào được nén dưới áp suất cao di chuyển qua một lỗ hẹp sau đó đi qua buồng có thể tích lớn hơn → áp suất giảm đột ngột → tế bào vỡ ra. Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Trượt lỏng Máy đồng hóa áp lực cao Manton-Gaulin: một máy bơm kiểu piston, có thiết bị điều chỉnh áp suất hoạt động theo yêu cầu vận hành, có thể đạt tới 95 Mpa Tốc độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein phụ thuộc vào: loại tế bào, điều kiện lên men, nồng độ và tiền xử lý (đông lạnh: các tế bào vi sinh vật thường dễ vỡ nếu chúng được làm lạnh trước) Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Trượt lỏng Máy đồng hóa áp lực cao Manton-Gaulin Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Nghiền Tế bào có thể được phá vỡ bằng phương pháp cơ học nhờ hệ thống chứa 1 dãy đĩa quay và các hạt nhỏ Hạt này được làm từ những vật liệu có khả năng chống chịu cơ học tốt: thủy tinh, allumina ceramide hay các hợp chất titan Sản phẩm đặc trưng: Dyno-Muhle (WA Bachofen, Basle, Switzerland), dùng giải phóng protein khỏi tế bào vi sinh vật khác nhau Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Nghiền Dịch huyền phù tế bào được bơm vào buồng, sau đó được khuấy trộn với tốc độ rất nhanh đủ để phá vỡ cả các tế bào vi khuẩn dai nhất Buồng phân hủy cần được làm lạnh để giữ hoạt tính của protein khỏi tác động do sự sinh nhiệt trong quá trình nghiền Thể tích buồng 600 mL có thể thực hiện nghiền tới 5 kg tế bào vi khuẩn / h, ở quy mô sản xuất, buồng có thể tích lên tới 250 L Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Siêu âm Sóng siêu âm (20 KHz đến 1 MHz) tạo ra xen kẽ các sóng áp suất cao và áp suất thấp trong chất lỏng mà nó truyền qua Chu kỳ áp suất thấp: sóng siêu âm tạo ra các bong bóng chân không nhỏ trong chất lỏng Chu kỳ áp suất cao: bong bóng ị phá vỡ hoàn toàn (Cavitation) Cavitation gây ra lực cắt thủy động lực mạnh → tác động lên màng tế bào → gây vỡ tế bào Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp vật lý • Siêu âm Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, không cần bổ sung chất vào hỗn hợp cần tách Nhược điểm: chi phí đầu tư cao, lực tác động mạnh có thể làm vỡ các sản phẩm nhạy cảm với lực Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp hóa học • Dùng áp suất thẩm thấu Nước đi từ dung dịch nhược trương vào tế bào ưu trương hơn khi tế bào nằm trong dung dịch Chỉ có thể áp dụng cho những tế bào không có thành (tế bào động vật) Với các tế bào có thành (tế bào thực vật, vi khuẩn, nấm men) phải xử lý thêm bằng các enzyme (lysosyme, celluloase, pectinase, hemicellulase...) để loại thành tế bào trước khi xử lý tiếp bằng áp suất thẩm thấu Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp hóa học • Dùng áp suất thẩm thấu Dịch thu được bao gồm sản phẩm sinh học quan tâm và dung dịch nhược trương dùng phá màng tế bào → cần cô đặc Ưu điểm: thực hiện nhanh chóng, dễ làm, ít tốn chi phí, không cần tốn thời gian và công sức để loại bỏ các tạp chất hóa học Nhược điểm: cần lượng dung dịch rất lớn để phá màng → khó thu dịch tế bào với nồng độ đậm đặc Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp hóa học • Dùng các tác nhân acid hoặc base Dùng acid để thủy phân các thành phần tế bào: hàm lượng acid cao → thay đổi về bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế bào Với enzyme ổn định ở giá trị pH cao: sử dụng dung dịch kiềm để phân giải các tế bào vi khuẩn Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp hóa học • Dùng chất phá màng Sử dụng chất tẩy rửa: phá vỡ các rào cản lipid xung quanh tế bào bằng cách phá vỡ tương tác lipid - lipid, lipid - protein và protein – protein Dung môi hữu cơ: EDTA (thay đổi tính thấm màng tế bào), acetone (hòa tan phospholipid) Phương pháp phá màng tế bào Phương pháp sinh học (enzyme) • Lysozyme: Phá hủy thành tế bào vi khuẩn thông qua việc xúc tác sự thủy phân của liên kết 1,4-beta giữa các tiểu phần N-acetylmuramic acid và N- acetyl-D-glucosamide trong chitodextrin Có trong một số chất tiết như nước mắt, nước bọt, sữa người và màng nhầy, trong các bào quan của bạch cầu trung tính và trong lòng trắng trứng Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm Chiết lỏng - lỏng • Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết • Chiết tĩnh • Chiết ngược dòng: Hai pha lỏng không trộn được vào nhau được bơm liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm Thẩm tích Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm Kết tủa • Kết tủa bằng muối • Kết tủa bằng dung môi hữu cơ • Thay đổi pH • Tủa bằng ion kim loại Thu hồi sinh khối vi tảo Giới thiệu • Vi tảo: sinh vật đơn bào, kích thước hiển vi, phân bố trong hầu hết các loại hình môi trường đất, đá, nước, đôi khi ký sinh trên các sinh vật khác • Hiệu quả đồng hóa carbon vô cơ cao hơn rất nhiều so với các nhóm thực vật khác • Dễ dàng nuôi cấy trên nhiều điều kiện môi trường sống và mô hình sản xuất khác nhau • Không mang tính cạnh tranh với các đối tượng canh tác truyền thống • Là nguồn thức ăn truyền thống và bổ dưỡng cho con người nhất là ở các quốc gia Châu Á Giới thiệu • Một số loài đang được sử dụng rộng rãi: Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Dunaliella salina, Spirulina platensis: sinh trưởng nhanh, dễ thu hoạch và giá trị dinh dưỡng cao • Thành phần dinh dưỡng: carbohydrate, protein, lipid, acid béo không no, các chất chống oxy hóa (polyphenol, polysaccharide, vitamin A, B2, B6, C, E...), các muối khoáng (iodine, kali, sắt, magne, calci...), các amino acid thiết yếu Giới thiệu • Được nuôi thu sinh khối trong các hệ thống nuôi đơn giản: được bơm trực tiếp vào các bể hay hệ thống nuôi trồng thủy sản • Cách thức nuôi tồn tại nhiều hạn chế Sinh khối tế bào vi tảo trong dịch nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất nhỏ (khoảng 1 0/00 trọng lượng tươi) Thiếu tính chủ động trong sản xuất (phụ thuộc rất nhiều vào kết quả vụ nuôi cấy, đặc biệt là trong các hệ thống nuôi hở) Khó khăn trong vận chuyển và bảo quản. Giới thiệu • Kinh phí cho việc thu hồi vi tảo chiếm khoảng 20 – 30% vào tổng chi phí sản xuất sinh khối vi tảo • Các kỹ thuật loại nước khác nhau chỉ phù hợp cho từng loài vi tảo khác nhau. → cần tìm ra giải pháp thu hoạch vi tảo để hiệu quả thu hoạch cao, không gây độc hại cho thủy sản nuôi, cắt giảm chi phí đầu tư và dễ vận hành Các phương pháp thu hoạch vi tảo Ly tâm • Có thể áp dụng ở quy mô công nghiệp • Phù hợp cho nhiều loại vi tảo với số lượng sinh khối lớn và nhanh chóng. • Sản phẩm không bị nhiễm bẩn do không cần đưa tác nhân hóa học vào Các phương pháp thu hoạch vi tảo Ly tâm • Cấu trúc tế bào vi tảo dễ bị tác động do nhiệt độ nâng cao • Lực ly tâm mạnh gây chết và ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng của vi tảo • Chi phí đầu tư máy móc, thiết bị đắt tiền, tiêu tốn năng lượng lớn và khó khăn trong công tác vận hành Các phương pháp thu hoạch vi tảo Lọc • Vận hành đơn giản và phổ biến • Ít gây vỡ tế bào vi tảo • Không tốn nhiều kinh phí máy móc thiết bị • Sử dụng màng siêu lọc sẽ tăng hiệu quả thu hoạch Các phương pháp thu hoạch vi tảo Lọc • Thời gian thu hoạch kéo dài, chỉ phù hợp để thu nhận các loài tảo đơn bào có kích thước lớn • Hiệu suất thu hồi thấp và dễ tắt nghẽn màng lọc • Màng siêu lọc có thể hạn chế các nhược điểm trên, tuy nhiên chi phí màng lọc cao và tiêu tốn nhiều năng lượng Các phương pháp thu hoạch vi tảo Lắng • Vận hành đơn giản và chi phí đầu tư thấp • Tốc độ lắng chậm, thời gian lắng quá lâu nên hiệu suất thu thấp và chủ yếu thu các tế bào lão hóa Các phương pháp thu hoạch vi tảo Tuyển nổi • Chi phí đầu tư thiết bị không cao • Hiệu quả thu thấp và có khả năng tồn tại dư lượng kim loại nặng ảnh hưởng đến sức khỏe động vật nuôi Các phương pháp thu hoạch vi tảo Keo tụ • Chi phí đầu tư thiết bị thấp, vận hành đơn giản • Hiệu suất thu hồi sinh khối cao và có thể bảo quản thời gian dài sau thu hoạch • Sử dụng một số chất hữu cơ và vô cơ rẻ tiền, thông dụng và hiệu quả thu cao ở nồng độ thấp → tránh dùng các chất trợ lắng vô cơ và hữu cơ có khả năng tồn tại và gây hại cho động vật nuôi do dư lượng kim loại nặng Các phương pháp thu hoạch vi tảo Keo tụ • Có thể dùng polymer sinh học (chitosan) không gây độc hại, hiệu quả cao và có thể tiết kiệm kinh phí khi kết hợp với các phương pháp khác • Đòi hỏi sử dụng liều lượng cao nên hạn chế ứng dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp • Môi trường có độ mặn cao sẽ ảnh hưởng đến quá trình keo tụ vi tảo: các polyelectrolyte bị ức chế trong môi trường mặn, chỉ hiệu quả ở độ mặn dưới 5g/L → sử dụng chitosan keo tụ các loài vi tảo nước ngọt mang lại hiệu quả thu hoạch cao hơn các loài vi tảo biển