Khử trùng trong lên

men công nghiệp

Các khái niệm
• Khử trùng (sterilisation): loại bỏ hoặc giết toàn bộ
vi sinh vật bằng nhiệt độ, chiếu xạ… → toàn bộ
các yếu tố tạp nhiễm vi sinh bị hủy diệt triệt để
• Tẩy trùng (disinfection): ức chế hoặc làm suy
giảm số lượng vi sinh vật; chỉ được áp dụng đối
với các dụng cụ, thiết bị (non-living objects) →
hủy diệt các nhân tố gây bệnh (pathogen)
• Thanh trùng (pasteurisation): khử trùng các dịch
lỏng (sữa) để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh
Khử trùng trong lên men
• Sản phẩm lên men: được tạo ra bằng một chủng
hoặc một nhóm chủng vi sinh vật nhất định trong
môi trường dinh dưỡng
• Nếu quá trình lên men bị xâm nhiễm bởi vi sinh
vật ngoại lai (chủng tạp nhiễm)
 Cạnh tranh dinh dưỡng → thất thoát sản lượng
 Sản phẩm cuối bị tạp nhiễm (protein đơn bào)
 Phân hủy sản phẩm mong muốn
 Phân hủy tế bào (phage)
Khử trùng trong lên men
• Khử trùng nhằm loại bỏ các yếu tố gây tạp nhiễm
sinh học (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, phage)
• Mức độ kiểm soát vô trùng tùy theo vào loại sản
phẩm và quy trình lên men
• Lên men sản xuất sinh phẩm dùng làm thuốc trị
bệnh: cần phải kiểm soát tạp nhiễm chặt chẽ →
mức độ khử trùng rất nghiêm ngặt
• Lên men sản xuất các sản phẩm dùng trong thực
phẩm: mức độ kiểm soát tạp nhiễm ít nghiêm
ngặt hơn
Khử trùng trong lên men
• Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy có kiểm soát
đạt được khi:
 Sử dụng giống không bị tạp nhiễm
 Khử trùng môi trường trước khi sử dụng
 Khử trùng nồi lên men
 Khử trùng toàn bộ các nguyên liệu bổ sung vào
nồi lên men trong quá trình nuôi cấy
 Duy trì điều kiện vô trùng trong quá trình lên
men
Yêu cầu với quá trình khử trùng
• Loại bỏ một phần hoặc toàn bộ tác nhân gây
nhiễm sinh học ảnh hưởng lên quá trình lên men
(bao gồm cả tế bào sinh dưỡng và bào tử)
• Không gây những biến đổi đáng kể về chất lượng
môi trường, không tạo ra các chất độc hại gây
kìm hãm hay ức chế sự phát triển, hoặc làm suy
giảm hoạt tính sinh tổng hợp của chủng nuôi cấy
• Tác nhân khử trùng không độc hại đối với người
vận hành, thao tác đơn giản, dễ áp dụng cho quy
mô sản xuất lớn, dễ tự động hóa
Phương pháp khử trùng
Tác nhân vật lý
• Lọc: lọc không khí hoặc môi trường
 Dùng trong trường hợp thành phần môi trường
có các chất kém bền với các tác nhân như
nhiệt độ hoặc chiếu xạ, hoặc môi trường có
chứa các thành phần dễ bay hơi
 Các dạng lọc thông dụng bao gồm lọc màng,
lọc túi, lọc cartridge
Phương pháp khử trùng
Tác nhân vật lý
• Không khí nóng (hot air): dùng làm khô đồng thời
tiệt trùng các thiết bị lên men
• Hơi nước nóng (steam): dễ áp dụng cho quy mô
sản xuất công nghiệp, được sử dụng rộng rãi để
khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật và khử
trùng thiết bị lên men
• Tia UV, tia X, tia , siêu âm
Phương pháp khử trùng
Tác nhân hóa học
• Phenol: được dùng dạng dung dịch để sát trùng
các dụng cụ, thiết bị
 Tùy theo nồng độ: diệt khuẩn hay kìm khuẩn
 Hoạt tính giảm trong môi trường kiềm / có mặt
chất hữu cơ, tăng trong môi trường có muối
 Phenol và các dẫn xuất tác động lên màng tế
bào → phá hoại tính bán thấm của màng tế
bào chất và làm biến tính protein
 Thường được dùng kết hợp với xà phòng để
làm dung dịch sát trùng da
Phương pháp khử trùng
Tác nhân hóa học
• Các alcohol (methanol, ethanol)
 Tác dụng sát khuẩn rất mạnh, gây nên sự động
tụ protein màng
 Ở nồng độ cao, các alcohol có tính khử nước
mạnh → rút nước khỏi tế bào, cản trở sự xâm
nhập của alcohol vào nội bào → chỉ có tác
dụng ức chế vi khuẩn
 Ethanol 70% có tính sát khuẩn tốt hơn loại 90%
Phương pháp khử trùng
Tác nhân hóa học
• Các halogen: có tính độc với vi sinh vật
 Có tác dụng diệt khuẩn nhờ sự hình thành
perchloric acid → HCl và O2 → oxy hoá mạnh
có tác dụng phá huỷ các thành phần của tế bào
 Chlorine và các hợp chất như NH2Cl
(chloramine), NHCl2 (chloral) đều có tác dụng
diệt khuẩn tốt do phá hủy trực tiếp cấu trúc của
tế bào
 Iod dễ hoà tan trong cồn / dung dịch kiềm Na,
K; chỉ có tác dụng diệt khuẩn trên bề mặt
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
• Phương trình động học
-dN/dt = k.N
 N là số tế bào sống hiện diện
 t là thời gian khử trùng
 k là tốc độ chết đặc trưng của tế bào vi sinh vật
(phút -1)
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
• Phương trình động học
-dN/dt = k.N
 k chỉ đạt hằng số dưới điều kiện nhiệt độ khử
trùng không thay đổi
 k không chỉ phụ thuộc vào chủng vsv mà còn
phụ thuộc vào dạng trạng thái sinh lý (khi ở
dạng bào tử khả năng chịu nhiệt cao hơn rất
nhiều so với dạng tế bào sinh dưỡng
→ khi khử trùng phải chọn lựa điều kiện thích
hợp để có thể khử trùng hết toàn bộ các nhân tố
gây nhiễm
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
• Phương trình động học
-dN/dt = k.N
 Ở 100 oC, 40 phút: hầu hết các chủng vi sinh
vật (kể cả bào tử) đều bị diệt ngoại trừ bào tử
của Streptomyces sp (ngay cả với điều kiện
nhiệt độ như trên trong vòng 3 giờ
 Ở 115 oC, 60 phút; 120 oC, 30 phút; 130 oC, 5
phút: hầu như toàn bộ vsv chết, ngay cả đối với
trường hợp của bào tử các chủng chịu nhiệt
(thermophile)
 Ở 160 oC, 30 phút: bào tử khô của các chủng
chịu nhiệt cũng bị diệt
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
• Thời gian khử trùng để khả năng không còn tế
bào vi sinh vật tồn tại là vô cùng
• Sau một thời gian khử trùng luôn luôn tồn tại khả
năng có dưới một tế bào đang sống → cho dù
khử trùng ở nhiệt độ nào, trong thời gian bao lâu
thì nguy cơ bị tạp nhiễm cũng vẫn còn
• Cần phải hạn chế số lượng vsv tạp nhiễm trước
khi khử trùng: vệ sinh thiết bị, sử dụng nguyên
liệu có độ tinh sạch cao, ổn định … chứ không
nhất thiết là phải tăng cường các điều kiện khử
trùng
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
Động học của quá trình nhiệt tiêu hủy vsv
Khử trùng môi trường
• Khử trùng môi trường trong nuôi cấy vsv có thể
được thực hiện bằng phương pháp dùng hơi
nước hay phương pháp lọc
• Yêu cầu của phương pháp lọc: môi trường lỏng,
đồng nhất, cặn bã thô trong môi trường ít
• Khử trùng dùng hơi nước: dễ áp dụng, có hai
cách
 Gia nhiệt gián tiếp: autoclave, khử trùng liên
tục
 Gia nhiệt trực tiếp: khử trùng theo mẽ
Khử trùng môi trường
• Khi khử trùng nghiêm ngặt → gây biến đổi thành
phần môi trường do phản ứng giữa các thành
phần hoặc làm phân hủy các chất không bền
nhiệt, dễ bay hơi → kết quả lên men giảm đáng
kể
• Khi pH của môi trường thấp: hiệu quả khử trùng
tăng lên
• Nếu nồng độ các chất trong môi trường (đường,
protein, chất béo) cao: giảm hiệu quả khử trùng
của môi trường
Khử trùng môi trường
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Duy trì tốt chất lượng môi trường sau khử trùng
• Dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất
• Dễ dàng kiểm soát tự động
• Giảm sự tăng thể tích môi trường do hơi nước
ngưng tụ
• Lượng tiêu thụ hơi nước nóng ổn định trong suốt
quá trình
• Giảm thiểu sự ăn mòn nồi lên men
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Hệ thống khử trùng liên tục bao gồm:
 Bồn chuẩn bị môi trường
 Bơm
 Thiết bị hiệu chỉnh lưu tốc truyền dịch
 Thiết bị gia nhiệt sơ cấp
 Thiết bị gia nhiệt
 Tháp lưu
 Thiết bị kiểm soát nhiệt độ khử trùng
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Nguyên lý hoạt động của hệ thống bao gồm hai
giai đoạn là khử trùng thiết bị của hệ thống và
khử trùng môi trường
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Khử trùng thiết bị của hệ thống
 Hệ thống trước khi sử dụng cho khử trùng môi
trường: bản thân nó cần phải được khử trùng
để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm
 Tác nhân khử trùng là nước nóng từ bồn chứa
được bơm vào hệ thống qua thiết bị gia nhiệt
→ nhiệt độ của nước được nâng lên 120 oC
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Khử trùng thiết bị của hệ thống
 Nước nóng sau đó đi vào tháp lưu và được hồi
lưu về bồn chứa sau khi đi qua thiết bị gia nhiệt
sơ cấp
 Thời gian tuần hoàn nước khử trùng trong hệ
thống khoảng từ 1 – 2 giờ sẽ bảo đảm được
tính vô trùng
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Khử trùng môi trường
 Hệ thống thiết bị sau khi được khử trùng xong,
chuyển van 3 chiều từ hướng bồn chứa nước
nóng sang hướng bồn chuẩn bị môi trường
 Môi trường trong bồn được bơm đưa vào hệ
thống khử trùng qua thiết bị gia nhiệt sơ cấp rồi
đi vào thiết bị gia nhiệt
 Nhiệt độ khử trùng được cài đặt ở giá trị thích
hợp (ví dụ 120 oC) và tự kiểm soát bằng hệ
thống tự động
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Khử trùng môi trường
 Hệ thống có đầu cảm biết nhiệt và một van tự
động kiểm soát lượng hơi nước nóng cung cấp
vào thiết bị gia nhiệt
 Khi nhiệt độ khử trùng chưa đạt theo giá trị cài
đặt → van tự động mở ra để cung cấp thêm
hơi nước nóng cho hệ thốngKhi nhiệt độ
 Khi nhiệt độ vượt quá giá trị cài đặt → van tự
động sẽ đóng lại, hạn chế hơi nước nóng đi
vào thiết bị gia nhiệt
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Khử trùng môi trường
 Thiết bị gia nhiệt có thể là dạng các “tấm trao
đổi nhiệt” (heat exchange plates) được lắp
ghép liên kế nhau tạo nên các khoang hở bên
trong cho phép hai pha dịch trao đổi nhiệt cho
nhau
 Hoặc dạng xoắn ốc (spiral, coil)
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Thời gian khử trùng được kiểm soát bằng lưu
lượng môi trường nạp vào hệ thống khử trùng
• Tháp lưu được thiết kế nhằm lưu giữ môi trường
sau khi gia nhiệt một thời gian nhất định tùy thuộc
vào lưu tốc truyền dịch
• Thời gian khử trùng được kiểm soát thông qua
lưu lượng dịch bơm vào hệ thống theo công thức
t = V/F
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
t = V/F
• t: thời gian khử trùng,
• V: là thể tích tháp lưu
• F: là lưu lượng dịch môi trường nạp vào hệ thống
• Với thể tích tháp lưu V = 10K L, để thời gian khử
trùng t đạt 15 phút thì tốc độ bơm dịch môi
trường vào hệ thống khử trùng F = 10/15×60 =
40K L/hr
Khử trùng môi trường
Khử trùng liên tục
• Lưu tốc dịch nạp vào hệ thống được kiểm soát tự
động bằng một thiết bị đo lưu lượng trên đường
ống và van tự động
• Khi lưu lượng dịch khác biệt với giá trị cài đặt thì
van tự động sẽ tự đóng/mở để điều chỉnh lưu
lượng đúng theo giá trị đã cài đặt
Khử trùng môi trường
Khử trùng theo mẻ
• Toàn bộ các thành phần môi trường được chuẩn
bị trong nồi lên men, sau đó gia nhiệt trực tiếp
vào bồn đến khi đạt nhiệt độ nhất định cần cho
khử trùng (121 – 125 oC)
• Tính thời gian khử trùng kể từ khi nhiệt độ môi
trường đạt giá trị cài đặt
• Môi trường sau khử trùng được hạ nhiệt độ bằng
cách cấp nước lạnh vào hệ thống giải nhiệt của
nồi (thường là dạng ống xoắn vòng, coil hoặc
dạng tháp ống, tube)
Khử trùng môi trường
Khử trùng theo mẻ
• Trong quá trình khử trùng cần khuấy trộn dịch
môi trường nhằm bảo đảm gia nhiệt đồng nhất
cho toàn bộ môi trường
• Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ
kiểm soát quá trình khử trùng và hiệu quả khử
trùng tốt
• Nhược điểm: thời gian gia nhiệt dài, làm nguội
môi trường chậm → tổng thời gian chịu nhiệt của
môi trường cao → ảnh hưởng lớn đến chất lượng
của môi trường sau khi khử trùng
Khử trùng môi trường
Khử trùng theo mẻ
• Do phải gia nhiệt trực tiếp nên một lượng lớn
nước ngưng từ hơi nước nóng làm cho thể tích
môi trường sau khử trùng tăng lên đáng kể →
giảm nồng độ các chất trong môi trường
• Khắc phục: giảm thể tích nước pha loãng khi
chuẩn bị môi trường
• Tính tự động hóa của phương pháp kém
Khử trùng môi trường
Khử trùng theo mẻ
• Để xác định điều kiện khử trùng cho một loại môi
trường nào đó, cần thực hiện hai loạt thí nghiệm
thay đổi nhiệt độ và thời gian khử trùng
• Đánh giá sự tồn tại của vi sinh vật tạp nhiễm
(bằng cách trải các môi trường sau khử trùng lên
đĩa petri rồi ủ hoặc thực hiện nuôi cấy lắc…) và
kết quả lên men khi nuôi cấy chủng sản xuất
Khử trùng nồi lên men
• Phương pháp và điều kiện khử trùng nồi khác
nhau tùy mức độ nghiêm ngặt trong kiểm soát tạp
nhiễm của quy trình lên men
• Đối với các trường hợp mức độ kiểm soát không
cao như trong lên men rượu, lên men dấm:
không cần phải dùng hơi nước để khử trùng, có
thể dùng cồn để tiệt trùng trước khi sử dụng
• Lên men amino acid, lên men kháng sinh: cần
phải dùng hơi nước nóng để khử trùng với áp
suất cao (≥ 1,5 kgf/cm2) để đạt nhiệt độ khử trùng
~ 125 oC trong thời gian dài (≥ 2 giờ)
Khử trùng nồi lên men
• Quá trình khử trùng cần phải bảo đảm hơi nước
nóng phải được luân chuyển trong bất kỳ không
gian nào của thiết bị
• Nước ngưng tụ lại ở đáy nồi phải được liên tục
xả ra nhằm tránh một số vị trí của nồi không bảo
đảm nhiệt độ khử trùng
• Sau khi khử trùng xong phải luôn luôn giữ nồi lên
men ở áp suất dương bằng không khí đã được
lọc sạch, tránh không khí từ bên ngoài xâm nhập
vào nồi một khi áp suất âm
Khử trùng nồi lên men
• Quy trình thao tác khử trùng nồi lên men
• Các van xả, van thoát khí (V1, V2, V4, V9, V12)
phải ở trạng thái mở trước khi bắt đầu khử trùng
• Đóng van khí nén (V5), van cấp môi trường (V7),
van nạp giống (V11) và mở các van V3, V8, V10
• Cấp hơi nước nóng vào nồi, mở V6
• Khi nhiệt độ đạt 100 oC, mở nhỏ các van xả (V1,
V2, V4, V9, V12)
Khử trùng nồi lên men
• Khi nhiệt độ đạt yêu cầu (125 oC) bắt đầu tính
thời gian khử trùng
• Khi thời gian khử trùng đạt yêu cầu, dừng quá
trình khử trùng bằng cách đóng van cấp hơi nước
nóng (V6) và ngay lập tức mở van cấp không khí
nén (V5)
• Khi toàn bộ nước ngưng (condensate) trong nồi
lên men, trong đường ống đều được thoát ra
ngoài, đóng các van xả (V1, V2, V9, V12).
• Duy trì áp suất không khí trong bồn và sẵn sàng
để nhận môi trường chuẩn bị cho nuôi cấy
Khử trùng nồi lên men
Khử trùng nồi lên men
Lọc không khí
• Không khí trước khi sục vào nồi lên men cần phải
được lọc bỏ các tác nhân gây tạp nhiễm
• Phương pháp vô trùng không khí thường là sử
dụng thiết bị lọc
• Thiết bị của hệ thống lọc bao gồm:
 Lọc thô: loại bỏ các hạt có kích thước lớn (5 –
30 μm), thường là dạng màng lọc làm bằng sợi
thủy tinh
 Lọc tinh: lọc bỏ các tế bào vi sinh vật (và cả
bào tử), kích thước màng lọc 0,1 – 0.3 μm, làm
bằng các lớp sợi PE (polyethylene)
Lọc không khí
• Hệ thống thiết bị cung cấp và xử lý không khí nén
cung cấp cho hệ thống lên men bao gồm
 Máy nén khí
 Thiết bị giải nhiệt
 Thiết bị ly tâm (cyclone) tách nước
 Thiết bị gia nhiệt
 Thiết bị lọc thô
 Thiết bị lọc tinh
Lọc không khí
• Hệ thống thiết bị cung cấp và xử lý không khí nén
cung cấp cho hệ thống lên men
Lọc không khí
• Không khí được nén lại với áp suất từ 1 – 3
kgf/cm2 bằng máy nén khí công nghiệp
• Tùy theo nhu cầu sử dụng của hệ thống lên men
mà công suất của máy nén khí được lựa chọn
khác nhau
• Không khí sau khi được nén nhanh ở áp suất cao
thường sinh nhiệt
• Thiết bị giải nhiệt giúp hạ nhiệt độ (15 – 20 oC)
của khí nén đột ngột làm cho hơi ẩm trong khí
nén ngưng tụ lại và được loại bỏ qua thiết bị tách
ẩm (cyclone)
Lọc không khí
• Không khí nén được sấy gia nhiệt trở lại (38 – 40
oC) để làm cho phần nước ngưng (nếu còn) trong

khí nén khuếch tán đồng nhất trở lại, tránh tình
trạng các “giọt” nước ngưng này (nếu còn) gây
ẩm trên màng lọc và làm giảm tính hiệu quả của
th iết bị lọc
• Phần khí nén sau đó đi qua thiết bị lọc thô nhằm
loại bỏ những phần tử bụi có kích thước lớn sau
đó qua thiết bị lọc tinh, loại bỏ các tách nhân gây
nhiễm sinh học
• Tùy theo mức độ nghiêm ngặt của hệ thống mà
kích thước lọc của thiết bị lọc tinh khác nhau