Kiểm soát nuôi cấy

Kiểm soát tăng trưởng tế bào

• Nhằm hạn chế sự tăng trưởng của chủng trong
những giai đoạn cần thiết của quá trình lên men
• Cần định lượng (trực tiếp hoặc gián tiếp) lượng
sinh khối hiện diện trong từng thời điểm của quá
trình nuôi cấy
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Đếm trực tiếp
• Áp dụng đối với các vi sinh vật đơn bào có kích
thước lớn như nấm men, tảo …
• Đếm trực tiếp mẫu dịch lên men được pha loãng
dưới kính hiển vi (sử dụng buồng đếm hồng cầu
hoặc buồng đếm Breed)
• Ưu điểm: có thể xác định nhanh được
• Nhược điểm: độ chính xác không cao; không
phân biệt được tế bào sống/chết.
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Đếm trực tiếp
• Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang:
nhuộm mẫu bằng các chất nhuộm có khả năng
phát huỳnh quang
 Aacridin cam (AODC)
 4’,6-Dianidino-2-phenyl-indol (DAPI)
 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
• Số lượng vi sinh vật trong mẫu được xác định
tương ứng tỷ lệ với lượng sinh khối → ước lượng
sinh khối vi sinh vật có trong mẫu
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Đếm khuẩn lạc
• Thực hiện thông qua việc nuôi cấy mẫu trên môi
trường đặc trưng:
 Dịch lên men được pha loãng (theo dãy thập
phân) tới khi đạt tỷ lệ thích hợp
 Trải trên môi trường thạch đặc trưng
 Ủ ở nhiệt độ thích hợp
 Đếm số khuẩn lạc hiện diện trên mặt thạch sau
thời gian nuôi cấy thích hợp
→ Số khuẩn lạc tương ứng với số tế bào vi sinh
vật sống tại thời điểm lấy mẫu
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Đếm khuẩn lạc
• Ưu điểm: xác định chính xác số lượng tế bào
sống trong môi trường lên men, có độ nhạy cao,
có thể dùng để xác định số lượng tế bào sống
ngay cả khi ở trường hợp mật độ thấp
• Nhược điểm: thời gian đánh giá rất lâu
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Thông qua máy đo mật độ quang
• Phương pháp gián tiếp đánh giá nhanh sự biến
động nồng độ tế bào trong quá trình nuôi cấy.
• Nguyên tắc: khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử
không tan → hình thành một hệ huyền phù tạo độ
đục do các phần tử này cản ánh sáng → phân
tán chùm ánh sáng tới qua dịch
• Tế bào vi sinh vật được xem như là một thực thể
có thể cản ánh sáng tạo độ đục khi hiện diện
trong dịch huyền phù
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Thông qua máy đo mật độ quang
• Độ đục của dịch huyền phù tỷ lệ với mật độ tế
bào vi sinh vật trong dịch → đo độ đục với bước
sóng ánh sáng thích hợp (thường là từ 600 – 650
nm) để xác định gián tiếp mật độ tế bào
• Nhược điểm: kết quả đo thường bị ảnh hưởng
bởi các phân tử tạo màu của môi trường → độ
chính xác không cao → sử dụng chính môi
trường lên men làm “blank”
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Thông qua máy đo mật độ quang
• Độ đục tỷ lệ tuyến tính với mật độ tế bào trong chỉ
một trong khoảng giới hạn nhất định → Nếu độ
đục của mẫu vượt quá ngưỡng giới hạn của máy
thì phải pha loãng dung dịch
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Thông qua máy đo mật độ quang
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Thông qua máy đo mật độ quang
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Phân tích trọng lượng tế bào khô
• Thu một thể tích mẫu dịch lên men nhất định (V,
mL), ly tâm thu sinh khối và sấy chân không
khoảng ở 60 oC đến khi trọng lượng không đổi
(m, g)
• Tỷ số m/V (g/mL): nồng độ tế bào khô trong dịch
lên men tại thời điểm thu mẫu
• Nếu môi trường lên men có chứa nhiều phần tử
không tan, khi ly tâm, các phần tử này cùng lắng
với sinh khối → kết quả sẽ không chính xác → lọc
có kích thước thích hợp để loại bỏ và rửa lại sinh
khối nhiều lần với acid/base
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Thông qua các thông số chỉ cường độ trao đổi
chất
• Bằng cách xác định lượng O2 hấp thụ hoặc lượng
CO2 sinh ra trong quá trình lên men → gián tiếp
biết được lượng sinh khối tham gia lên men trong
từng thời điểm nhất định
• Nhược điểm: đôi khi lượng sinh khối nhiều nhưng
do điều kiện lên men không bảo đảm làm cho
quá trình trao đổi chất diễn ra chậm
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Tại sao phải kiểm soát tăng trưởng
• Bất kỳ một hệ thống lên men nào cũng có sự giới
hạn về công suất thiết kế: thể tích nồi lên men, hệ
thống sục khí, hệ thống nước giải nhiệt
• Để bảo đảm cung cấp đủ nguồn dinhdưỡng,
nguồn oxy… cho vi sinh vật trong quá trình sản
xuất: giới hạn lượng tế bào tham gia sản xuất ở
một mức nhất định, phù hợp với công suất thiết
kế
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Tại sao phải kiểm soát tăng trưởng
• Nếu lượng sinh khối tế bào nhỏ hơn công suất
thiết kế: sản lượng thu được không đạt yêu cầu
→ tăng chi phí cố định (định phí) của sản phẩm
• Nếu số lượng tế bào vượt quá giới hạn thiết kế:
khả năng đáp ứng của quy trình liên quan không
đủ → hiệu quả lên men kém, tăng chi phí biến
động (biến phí) → tăng chi phí sản xuất
➔ Cần phải kiểm soát sự tăng trưởng tế bào ở
một mức nhất định, phù hợp với công suất của
các hệ thống thiết bị liên quan
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Tại sao phải kiểm soát tăng trưởng
• Để nhận diện tình trạng bình thường hay bất
thường của quá trình lên men
• Để nhận diện nếu có hiện tượng tạp nhiễm xảy ra
 Khi nhiễm phage: mật độ tế bào đột ngột giảm
do tế bào bị vỡ khi bị phage tấn công
 Khi nhiễm tạp khuẩn: mật độ tế bào tăng lên
bất thường
Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Kiểm soát tăng trưởng bằng cách nào
• Bổ sung các chất ức chế tăng trưởng (Tween 40,
Tween 60, Penicillin)
• Thay đổi yếu tố sinh lý (nhiệt độ, độ pH của môi
trường lên men)
• Giới hạn hàm lượng cơ chất giới hạn