第 61 卷 第 12 期/2024 年 6 月/激光与光电子学进展 封面文章·特邀综述

1700 nm 波段超快光纤光源开发及其在
多光子成像中的应用
仝申 1，2，钟金成 1，陈新林 3，邱娉 1，王科 1*
1
深圳大学物理与光电工程学院光电子器件与系统教育部/广东省光电子器件与系统重点实验室，广东 深圳 518060；
2
徐州医科大学医学信息与工程学院，江苏 徐州 221004；
3
中国科学院大学温州研究院，浙江 温州 325001

摘要 多 光 子 成 像 在 生 物 医 学 特 别 是 脑 科 学 研 究 中 应 用 广 泛 ，为 深 层 生 物 组 织 结 构 及 动 力 学 研 究 提 供 了 非 侵 入 性 和 非
破坏性的成像手段。生物组织的吸收和强散射特性限制了成像深度。近年来，得益于原理及技术上的进步，多光子成像
在活体生物中的成像深度显著提高。其中，1700 nm 波段激发的多光子成像显著降低组织吸收及散射，与其他激发波段
相比获得了目前最大的成像深度。本文首先介绍多光子显微成像原理，并利用孤子自频移效应构建 1700 nm 波段飞秒脉
冲光源。在此基础上，介绍 1700 nm 波段多光子成像在活体小鼠脑部、皮肤结构，以及血流动力学成像中的应用。最后总
结分析 1700 nm 波段激发多光子成像目前遇到的挑战和未来发展方向。
关键词 多光子显微成像；孤子自频移；1700 nm 波段；脑成像；皮肤成像
中图分类号 O437；Q63 文献标志码 A DOI：10.3788/LOP232274

Development of an Ultrafast Fiber Laser in 1700-nm Waveband and Its

Application in Multiphoton Microscopy
Tong Shen1,2 , Zhong Jincheng1 , Chen Xinlin 3 , Qiu Ping1 , Wang Ke1*
1
Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province,
College of Physics and Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong, China;
2
School of Medical Information and Engineering, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu, China;
3
Wenzhou Institute, University of Chinese Academy of Sciences,
Wenzhou 325001, Zhejiang, China

Abstract Multiphoton imaging is extensively used in biomedical research, especially in brain science, providing
noninvasive and nondestructive imaging methods for investigating the structure and dynamics of deep biological tissues.
However, the absorption and strong scattering characteristics of these biological tissues limit the depth of imaging.
Recently, owing to advances in principles and technology, remarkable improvements have been realized in multiphoton
imaging with respect to imaging depth in living organisms. Among them, multiphoton imaging obtained by exciting the
1700 nm wavelength band considerably reduces tissue absorption and scattering, achieving the current maximum imaging
depth compared with other excitation bands. This article introduces the imaging principles of multiphoton microscopy and
utilizes the soliton self - frequency shift effect to construct a femtosecond pulse light source with a 1700 nm band.
Furthermore, the application of multiphoton imaging in live mouse brain, skin structure, and hemodynamic imaging is
discussed. Finally, the current challenges and future development directions of 1700 nm excitation multiphoton imaging
are analyzed and summarized.
Key words multiphoton microscopy; soliton self - frequency shift; 1700 nm waveband; brain imaging; skin imaging

收稿日期 ： 2023 -10 -10；修回日期 ： 2023 -11 -06；录用日期 ： 2023 -11 -08；网络首发日期：2023 -11 -18
基金项目 ： 国家自然科学基金（62075135，61975126）、深圳市光子学与生物光子学重点实验室（ZDSYS20210623092006020）
通信作者 ： * kewangfs@szu.edu.cn

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1280 nm 激 发 双 光 子 荧 光 成 像 ，深 层 脑 血 管 成 像 提 高
1 引 言 到脑表面下 1060 μm［28］；而利用 1617 nm 激发双光子荧
生 命 科 学 研 究 离 不 开 成 像 技 术 。 自 20 世 纪 90 年 光成像，实现了脑表面下 2000 μm 深层脑血管成像，成
代 康 奈 尔 大 学 Denk 等 首 次 通 过 实 验 演 示 双 光 子 激
［1］
像 深 度 穿 透 完 整 灰 质 层 和 白 质 层 到 达 海 马 体 ，接 近 双
光扫描显微成像技术以来，由于其具有深层穿透（毫米 光 子 荧 光 血 管 成 像 深 度 极 限 ，信 号 背 景 比（R SBR）为
量级）、非侵入式且无损、高空间分辨率（亚微米量级）、 1［25］。长波长激发可降低生物组织的散射，在水吸收较
功 能 成 像 和 动 力 学 追 踪 等 优 点 ，已 被 广 泛 应 用 于 生 命 低的同时（生物组织 70% 由水构成［39］），确保更多激发
科 学 研 究 ，如 描 绘 神 经 网 络［2］、诊 断 疾 病［3 4］、研 究 神 经 光 子 到 达 样 品 焦 点 ，在 深 层 产 生 更 强 的 多 光 子 信 号 。
-

细胞功能 ［5 -9］
、测 量 血 流 变 化 ［10］
等多个生命科学领域。 2）采用更高阶非线性激发，例如三光子成像，进一步抑
目前，国际上多光子成像技术发展趋势如下：1）针对亚 制 表 面 背 景 信 号 ，提 高 深 层 的 信 号 背 景 比［5，25 26，40］。 利
-

微 米 量 级 分 辨 率 成 像［11 14］，获 得 突 破 光 学 衍 射 极 限 的 用 1665 nm 激 发 三 光 子 荧 光（3PF），实 现 了 脑 表 面 下

-

超 分 辨 多 光 子 成 像 ；2）针 对 大 视 场 成 像 ［15 -16］

，例 如 全 2100 μm 深 层 脑 血 管 成 像 ，这 也 是 目 前 最 深 的 多 光 子
脑［17 18］等 ，获 得 极 大 横 向 以 及 纵 向 视 场 的 多 光 子 亚 细 脑 成 像 。 而 且 深 层 信 号 背 景 比 为 46，远 没 有 达 到 三 光
-

胞分辨率成像 ；3）针对高速成像 ［19 -23］

，尽可能提高成像 子荧光成像深度极限［26］。
速 度 捕 捉 生 物 样 品 更 快 的 动 力 学 行 为 ；4）针 对 深 层 成 围绕 1700 nm 波段多光子显微成像这一极具潜力
像［24 26］，采 用 长 波 长 激 发 技 术［27］进 一 步 突 破 现 有 的 成 的 深 层 成 像 技 术 ，本 文 介 绍 多 光 子 成 像 以 及 该 波 段 光
-

像深度，实现活体深层组织结构无损成像。 源 建 造 的 基 本 原 理 ，包 括 多 种 1700 nm 光 纤 飞 秒 脉 冲
深层生物组织成像的挑战在于生物组织结构不均 光 源 建 造 技 术 ，在 此 基 础 上 介 绍 这 些 光 源 在 活 体 小 鼠
匀，因而具有强烈的散射效应，加之生物组织对激发光 脑部及皮肤的结构、功能成像中的应用，最后展望未来
的 吸 收（对 绝 大 多 数 组 织 而 言 主 要 是 水 吸 收），使 得 激 深层生物组织成像领域的发展。
发光功率随成像深度增大呈指数衰减。以活体动物脑
成 像 为 例 ：常 用 的 钛 宝 石 激 光 器 由 775 nm 波 长 激 发 ，
2 多光子显微成像
活体小鼠脑血管的双光子荧光（2PF）成像深度仅为脑 2. 1 多光子显微成像原理
表面下 650 μm，解剖学上对应于灰质层 ［28］
。而要实现 图 1（a）、
（b）直 观 地 展 示 了 染 料 中 的 单 光 子 荧 光
更 深 层 脑 成 像（例 如 脑 部 的 白 质 层 和 海 马 体），需 要 插 和 双 光 子 荧 光 效 果 。 可 以 看 到 ：单 光 子 荧 光 在 整 个 激
［29 -31］ ［32 -34］
入光学探针 、显 微 内 窥 镜 或者移除大脑灰质 发 光 通 路 上 都 会 产 生 ，而 多 光 子 荧 光 是 多 个 激 发 光 子
层［35 36］。 这 些 技 术 违 背 了 多 光 子 无 损 、非 侵 入 成 像 的 与 物 质 相 互 作 用 ，其 非 线 性 的 相 互 作 用 特 征 导 致 只 在
-

优点。因此，为了进一步提高多光子成像深度，目前采 焦 点 处 产 生 显 著 荧 光 信 号 ，因 而 多 光 子 显 微 成 像 具 有
用以下两种技术：1）在低的水吸收窗口，采用更长的激 本 征 的 三 维 成 像 能 力 、亚 微 米 量 级 成 像 分 辨 率 和 毫 米
发 波 长 ，波 长 经 历 800 nm（650~1000 nm）
［37］
、1300 nm 量 级 成 像 深 度［41 42］，如 图 1（c）所 示 。 多 光 子 显 微 成 像
-

（1000~1360 nm）
［6，28，38］
和 1700 nm（1600~1840 nm）
［24 26］
利用近红外波段激发，有效减少组织散射的影响，从而
-

波 段 ，成 像 深 度 不 断 增 加 。 例 如 ：利 用 775 nm 激 发 双 减小激发光在传输过程中的损耗，具有更强穿透性，能
光 子 荧 光 成 像 ，实 现 了 脑 表 面 下 650 μm 血 管 成 像 ［28］
； 够 实 现 深 层 生 物 组 织 成 像 。 图 1 中 STED、PALM、

图1 （a）488 nm 单光子激发荧光素（NA 为 0. 16）

单光子激发和双光子激发 。 ［41］
；（b）960 nm 飞秒脉冲双光子激发（NA 为 0. 16）
［41］
；
（c）多光子成像深度和分辨率［42］
Fig. 1 The excitation of single -photon and two -photon. (a) Single -photon excitation of fluorescein by focused 488 nm (NA is 0. 16) [41] ;
(b) two -photon excitation fluorescein by focused femtosecond pulses of 960 nm (NA is 0. 16) [41] ; (c) the depth and resolution of
MPM imaging[42]

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SOFI、MPM、PAT、UOT、OCT、OCM、NA 分 别 为 受 在多光子显微成像中，每增加一个有效衰减长度，
激辐射损耗、光激活定位显微镜、超分辨率光学波动成 为了维持焦点处的信号，需要将激发功率增大为原来的
像 、多 光 子 显 微 成 像 、光 声 成 像 、超 声 调 制 光 学 层 析 成 e 倍。有效衰减长度 le 是多光子深层成像最相关的长度
像 、光 学 相 干 断 层 成 像 、光 学 相 干 显 微 成 像 、数 值 孔 径 尺度。利用组织模型模拟脑组织的散射长度、吸收长度
的简称。 和有效衰减长度［24，44］，如图 2（a）所示。不同激发波长散
大 多 数 生 物 组 织 中 ，近 红 外 波 段 的 吸 收 主 要 是 水 射长度、吸收长度和有效衰减长度不同。可以看到：相
吸 收 ，水 吸 收 长 度 随 波 长 演 变 如 图 2（a）所 示 。 散 射 是 比于传统的 800 nm 激发波段，1300 nm 和 1700 nm 波段
指 入 射 光 子 偏 离 其 原 始 方 向 ，不 发 生 偏 离 的 光 子 称 为 具有更大的有效衰减长度，因而可以获得更深的成像深
［43］
弹 道 光 子 ，即 聚 焦 在 焦 点 处 的 光 子 。生物组织对光 度。实验上对活体小鼠开颅条件下脑部有效衰减长度
子的吸收和散射降低了焦点处的激发光的多光子信 的测量与该计算结果趋势一致：775 nm 波长激发双光子
号。在非线性光学成像中，随着成像深度 z 的增加，焦 荧光成像有效衰减长度约为 130 μm［28］，如图 3（a）所示；
点处功率呈现 Lambert-Beer 指数衰减： 920 nm 波 长 激 发 双 光 子 荧 光 成 像 有 效 衰 减 长 度 约 为

P ( z )= P ( 0 ) exp ê-
êé
ë ( )
z
ls
+
z úù
ú，
la û
（1）
150 μm［40，45］，如图 3（b）所示；1300 nm 波段激发双光子荧
光成像有效衰减长度约为 285 μm［28，46］，1300 nm 波段激
发 三 光 子 荧 光 成 像 有 效 衰 减 长 度 约 为 300 μm［44 45］，如
-

式 中 ：l s 是 散 射 长 度（散 射 系 数 的 倒 数）；la 是 吸 收 长 度
（吸 收 系 数 的 倒 数）；P（0）为 样 品 表 面 的 功 率 。 因 此 ， 图 3（a）、
（b）所示；1700 nm 波段激发三光子荧光成像有
焦点处多光子信号为 效衰减长度约为 400 μm［36，44］，如图 3（c）所示。在穿透头

S ∝ P n ( 0 ) exp ê-
êé
ë ( nz
ls
+
nz úù
la û
ú， ) （2）
骨 多 光 子 脑 成 像 条 件 下 ，由 于 头 骨 结 构 散 射 强 ，因 此 ：
1300 nm 波段激发双光子和三光子荧光成像有效衰减长
度分别约为 170 μm 和 230 μm［6］，如图 3（d）所示；1700 nm
式 中 ：n 是 光 子 数（n=2，双 光 子 激 发 ；n=3，三 光 子 激
波段激发三光子荧光成像有效衰减长度约为 40 μm［6］，
发）。考虑生物组织的散射和吸收综合影响，定义新的
如图 3（e）所示。以上结果表明，相比于其他激发波段，
特征长度——有效衰减长度 le ：
1 1 1 1700 nm 波段在活体小鼠脑部衰减长度最大，因而预期
= + 。 （3） 可以获得最深的成像深度。
le ls la

图2 衰减长度和信号背景比。
（a）基 于 水 吸 收 和 米 氏 散 射 模 拟 的 有 效 衰 减 长 度 ，黑 色 圆 形 表 示 活 体 小 鼠 大 脑 中 最 优 激 发 波 段 的 衰
（b）1300 nm 和 1700 nm 波段的双光子和三光子信号背景比［24］
减长度［44］；
Fig. 2 Attenuation length and signal background ratio. (a) The theoretical model of effective attenuation lengths based on water
absorption and Mie scattering [44] , the black circle indicates the effective attenuation lengths in mouse brain in vivo; (b) two -
photon and three -photon signal background ratio of 1300 nm and 1700 nm wavebands[24]

( )
3
虽然增加样品表面的激发功率可以补偿焦点处激 ( NA )2 P 3z
F ( t )3P = 3.5C 3 n 0 exp - ，（5）
发光能量的损失，但是随着样品表面脉冲能量的增加， λ 3
le
表面处产生的多光子背景将与焦点处信号水平接近， 式 中 ：λ 为 飞 秒 脉 冲 激 发 光 波 长 ；n0 为 成 像 介 质 的 折 射
导 致 检 测 到 的 信 号 包 含 了 焦 点 外 的 荧 光 ，最 终 导 致 焦 率 ； P 为 表 面 处 飞 秒 脉 冲 激 发 光 的 平 均 功 率 ；z 为 成
点处组织结构无法分辨。多光子成像深度的极限为 像 的 深 度 ；C 2 和 C 3 为 常 数（包 括 荧 光 染 料 浓 度 和 吸 收
R SBR 为 1 时对应的深度，其推导过程如下： 的作用截面等）。
双光子在散射介质中光束衍射产生的信号［24］为 背景信号主要在生物样品表面的一个有效衰减长

( )
2
P 2z 度内产生。
F ( t )2P = 8C 2 n 0 exp - ， （4）
πλ le n P
n

Bn ∝ I Al e = n - 1 l e， （6）
三光子信号为 A

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图3 800 nm、1300 nm 和 1700 nm 波段的有效衰减长度。

（a）775 nm 波段激发双光子荧光有效衰减长度（130 μm）和 1300 nm 激发双光
子荧光有效衰减长度（285 μm）
［28］
；（b）920 nm 激发双光子荧光有效衰减长度（150 μm）和 1300 nm 激发三光子荧光有效衰减长度
（300 μm）
［45］
（c）1700 nm 激发三光子荧光有效衰减长度（400 μm）
； ［24］
（d）1300 nm 波段激发双光子有效衰减长度（170 μm）和三光
；
子荧光有效衰减长度（230 μm，穿透头骨）
［6］
；（e）1700 nm 波段激发三光子荧光有效衰减长度（240 μm，穿透头骨）
［6］

Fig. 3 Effective attenuation lengths of 800 nm, 1300 nm, and 1700 nm. (a) 2PF effective attenuation length of 775 nm (130 μm) and
2PF effective attenuation length of 1300 nm (285 μm)[28] ; (b) 2PF effective attenuation length of 920 nm (150 μm) and 3PF
effective attenuation length of 1300 nm (300 μm)[45] ; (c) 3PF effective attenuation length of 1700 nm (400 μm)[24] ; (d) 2PF
effective attenuation length (170 μm) and 3PF effective attenuation length of 1300 nm (230 μm,trough skull) [6] ; (e) 3PF effective
attenuation length of 1700 nm (240 μm,trough skull)[6]

式 中 ：n 为 光 子 数 ； I 为 激 发 光 束 的 时 间 平 均 强 度 ；A 2. 2 多光子成像模态
为样品表面激发光束的面积。因此，双光子背景为 按非线性激发阶次划分，多光子成像包括双光子、
2 n 20 l e 三 光 子 ，以 及 更 高 阶 次 显 微 成 像 。 双 光 子 显 微 成 像 包
B2 ≈ C2 P ， （7）
πz 2 ( NA )
2
括 双 光 子 荧 光 成 像 和 二 次 谐 波（SHG）成 像 ，三 光 子 显
微成像包括三光子荧光成像和三次谐波成像
三光子背景为
［43］
（THG） ，对 应 的 能 级 图 如 图 4 所 示 。 多 光 子 荧 光 成
3 n 40 l e
B3 ≈ C3 P ， （8） 像 中 ，两 个（或 多 个）激 发 光 子 同 时 作 用 于 一 个 荧 光 分
πz 4 ( NA )
4

子，将其激发到更高能级，随后释放荧光光子并被探测
因此，双光子的 R SBR 为

( )
成 像 ，荧 光 寿 命 在 纳 秒 量 级［47］。 而 二 次 谐 波 和 三 次 谐
6z ( NA )
2
2z
2

R SBR 2PE ≈ exp - ， （9） 波是参量过程，满足相位匹配才能产生显著信号，一般

λl e le
只 涉 及 虚 能 级 不 涉 及 实 际 能 级 ，发 射 是 瞬 时 的 。 二 次
三光子的 R SBR 为 谐波成像是两个入射光子转化为一个具有两倍能量的
R SBR 3PE ≈
14.7z 4 ( NA )6
λ3 l e
exp -
( )
3z
le
。 （10） 发 射 光 子 ，因 此 发 射 波 长 是 其 激 发 波 长 的 一 半 。 二 次
谐 波 成 像 发 生 在 非 中 心 对 称 生 物 组 织 中 ，例 如 横 纹 肌
（10）中 ，令 R SBR =1，即 可 求 出 对 应 的 最
在 式（9）、 的 螺 旋 结 构 和 纤 维 胶 原 蛋 白 的 聚 合 蛋 白［48 50］，并 且 要
-

大 成 像 深 度 z。 例 如 ，以 1300 nm 激 发 成 像 为 例 ，双 光 求空间结构有序，因而可用于研究有序结构蛋白组件，
子 极 限 成 像 深 度 为 1500 µm，而 三 光 子 极 限 成 像 深 度 例如胶原纤维［51 52］、微管［53 54］和肌肉纤维［55］等。三次谐
- -

为 2500 µm［24］，如图 2（b）所示。由此可见：采用三光子 波 成 像 发 生 在 组 织 结 构 界 面 处 ，不 需 要 材 料 的 非 中 心

成 像 可 以 获 得 更 大 的 理 论 成 像 深 度 ，因 为 其 可 以 更 好 对 称 。 在 生 物 组 织 中 ，细 胞［56］、脂 肪［57 58］、骨 头［59 62］、牙
- -

地抑制表面背景。 釉质［63 65］等结构都可以产生三次谐波信号。

-

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图4 多光子激发能级图［43］
Fig. 4 Energy diagrams of MPM [43]

3 基于孤子自频移技术的 1700 nm 波段
飞秒脉冲光源
3. 1 光纤中的孤子自频移效应
20 世纪 80 年代 ，Mitschke 等［66］在反常色散的光纤
中发现了孤子自频移现象。他们在实验上验证了亚皮
秒脉冲在光纤中形成孤子后，随着传输距离增加，孤子
通过脉冲内受激拉曼散射将能量连续地从高频段传输
图5 不同光纤孤子能量和模场面积［43］
到低频段，从而实现波长红移。实验上，只要增加输入
Fig. 5 Soliton energies and model field area of various optical
脉冲能量，就可以实现波长的连续红移，达到波长调谐 fibers[43]
的目的。为了获得高能量的 1700 nm 波段孤子脉冲用
于 多 光 子 成 像 ，需 要 从 理 论 上 考 虑 孤 子 能 量 的 定 标 关 所 示 。 折 射 率 导 光 型 光 子 晶 体 光 纤（index guided
PCF）
［67 68］ ［43］
和标准单模光纤（SSMF） 对应的孤子脉冲
-

系：只考虑群速度色散和自相位调制，超短脉冲在光纤
中传播满足非线性薛定谔方程［43］。 能量在 nJ 量级甚至更低 ，不适合深层成像应用。空芯
光 子 带 隙 光 纤（Aire -Core PBGF）
［69 71］
的非线性折射率
-

∂ iβ 2 ∂ 2 2
A+ ⋅ A = iγ ( ω 0 ) | A | A ， （11） 仅 为 标 准 单 模 光 纤 1/1000，使 得 孤 子 脉 冲 能 量 达 到 百
∂z 2 ∂t 2
ω0 n2 nJ 量 级 ，但 其 波 长 调 谐 范 围 只 有 几 十 纳 米 。 大 模 场
γ ( ω 0 )= ， （12）
cA eff （LMA）光纤［72 74］和光子晶体棒状光纤［75］的模场面积是
-

式中：A=A（z，t），是缓变电场包络；归一化|A|2 表示激 标 准 单 模 光 纤 的 3~60 倍 ，因 而 孤 子 脉 冲 能 量 也 提 高

光脉冲功率；ω0 表示载波频率；n2 表示光纤的非线性折 3~60 倍。相比空芯光纤，大模场光纤和棒状光纤产生
射率；c 表示真空中光速；A eff 表示有效模场面积。在光 的 孤 子 波 长 调 谐 范 围 达 百 微 米 。 因 此 ，这 两 种 光 纤 更
纤的反常色散区（β2 <0），式（11）存在基态孤子解析解： 适合多光子深层成像的应用。
t i | β2 | z 式（15）仅 给 出 了 孤 子 能 量 的 定 标 关 系 ，为 了 描 述
A= P 0 sech ( ) exp ( )， （13） 孤 子 自 频 移 效 应 ，需 要 采 用 更 精 确 的 包 含 拉 曼 项 的
T0 T 02
式 中 ：P 0 表 示 峰 值 功 率 ；T 0 表 示 脉 宽 ，脉 冲 的 半 峰 全 宽 模型［43］：

T FWHM ≈1. 763T 0 ；sech 是 双 曲 正 割 函 数 。 对 应 的 基 态 ∂C͂

- i [ β ( ω )- β ( ω 0 )- β 1 ( ω 0 ) ( ω - ω 0 ) ] C͂ =
孤子条件为 ∂z
é ω - ω 0 ùú
T 02 1 iγ ( ω )× êê1 + ú×
= ， （14） ë ω0 û
|β | 2
γP 0

∫
∞
é ù
FT êê C ( z，t ) R ( T ' ) | C ( z，T - T ' ) | dT 'úú，
2
对应的孤子脉冲能量为 （16）
ë -∞ û
2| β2 | 2cA eff| β 2 |
。
1
E = 2P 0 T 0 = = （15） éê A eff ( ω ) ùú
-
4
γT 0 ω0 n2T0 C͂ = C͂ ( z，ω )= FT [ C ( z，t ) ] = ê ú A͂ ( z，ω )，
由 式（15）可 以 看 到 ：孤 子 能 量 正 比 于 光 纤 有 效 模 ë A eff ( ω 0 ) û
场面积 A eff ，因此提高孤子能量的一个简单有效的方法 （17）
就 是 增 加 光 纤 的 有 效 模 场 面 积 A eff 。 不 同 种 类 光 纤 有 ω0 n2 n0
γ ( ω )= ， （18）
效模场面积以及其对应的孤子脉冲能量概括如图 5 Cn eff ( ω ) A eff ( ω )+ A eff ( ω 0 )

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式 中 ：β（ω）为 光 纤 的 频 域 传 播 常 数 ；β（ω 0）为 群 速 度 的 式中：fR=0. 18，是延迟拉曼响应的分数贡献；τ1=12. 2 fs，

倒 数 ；α（ω）为 衰 减 系 数 ；n0 为 折 射 率 ；FT 为 傅 里 叶 变 τ2 =32. 2 fs；Θ（t）是 单 位 阶 跃 函 数 ；δ（t）是 单 位 脉 冲 函
换。光纤的非线性响应函数为 数 ；R（t）是 电 子 贡 献 引 起 瞬 时 非 线 性 响 应 和 分 子 振 动
R ( t )= ( 1 - f R ) δ ( t )+ f R h R ( t )= ( 1 - f R ) δ ( t )+ 引起的延迟拉曼响应。通过式（19）模拟 1550 nm 飞秒

fR
τ +τ
2
1

τ1 τ 2
2
2
2
( )
exp - t/τ 2 sin
()
t
τ1
Θ ( t )， （19）
脉冲泵浦源在大模场光纤中的孤子自频移［图 6（b）］，与
实验结果［图 6（a）］吻合较好。

图6 大模场光纤孤子自频移的光谱［43］。
（a）大模场光纤孤子自频移的光谱（实验）；
（b）大模场光纤孤子自频移的光谱（模拟）
Fig. 6 SSFS spectra of LMA fiber[43] . (a) SSFS spectra of LMA fiber (experiment); (b) SSFS spectra of LMA fiber (simulation)

3. 2 1700 nm 波段的飞秒脉冲光源建造 孤 子 激 发 三 次 谐 波 信 号 是 线 偏 振 的 3. 7 倍 ，如 图 7（b）

飞秒脉冲光源是多光子显微成像的基础。因此，
搭建 1700 nm 波段飞秒脉冲光源是多光子深层脑成像
的必要条件。适合 1700 nm 波段多光子深层脑成像的
飞秒脉冲光源最早通过棒状光纤中的孤子自频移实
现 ：利 用 重 复 频 率 为 1 MHz、脉 宽 360 fs 的 1550 nm 飞
秒 脉 冲 泵 浦 源 ，在 A eff 为 2300 μm 、长 度 为 36 cm 的 棒
状 光 纤 中 ，通 过 孤 子 自 频 移 技 术 产 生 1675 nm 的 飞 秒
孤 子 脉 冲 。 孤 子 能 量 为 67 nJ，脉 宽 为 65 fs，峰 值 功 率
达 到 MW ［24］
。 自 此 ，棒 状 光 纤 的 孤 子 自 频 移 光 源 成 为
1700 nm 波 段 深 层 生 物 组 织 成 像 的 常 用 光 源 ，科 研 人
员在此领域开展了一系列研究工作，利用 MHz 量级重
复 频 率 、脉 宽 500 fs 的 1550 nm 飞 秒 脉 冲 泵 浦 源
（FLCP 02CSZU，Calmar）和 棒 状 光 纤
- ［75］
纤 ，以 及 空 芯 光 纤 搭 建 了 不 同 的 1700 nm 波 段 飞 秒 脉
冲 光 纤 光 源（线 偏 振 孤 子 光 源 、圆 偏 振 孤 子 光 源 、椭 圆
偏 振 孤 子 光 源 、偏 振 孤 子 合 成 光 源 、偏 振 复 用 孤 子 光
源、空芯光纤的孤子光源，以及自相位调制飞秒脉冲光
源），不断提升光源性能：
1） Tong 等［76］利 用 1/4 波 片 转 换 1550 nm 飞 秒 脉
冲泵浦源的偏振态（线偏振、椭圆偏振和圆偏振），利用
各向同性的棒状光纤孤子自频移，实现了线偏振、椭圆
偏振和圆偏振孤子，结果表明：相同 1656 nm 孤子波长，
圆偏振孤子能量（198 nJ）是线偏振孤子能量（126 nJ）的
1. 57 倍 ，椭 圆 偏 振 孤 子 能 量 位 于 线 偏 振 和 圆 偏 振 孤 子
之间，如图 7（a）所示。同时，Tong 等
长的线偏振孤 子 和 圆 偏 振 孤 子 激 发 光 源 ，实 现 了 活 体
小 鼠 相 同 位 置 的 白 质 层 三 次 谐 波 成 像 ，并 证 明 圆 偏 振
所示。
2）Liu 等［78］利用两个偏振分束立方体将输入线偏
振 泵 浦 脉 冲 分 束 为 有 延 迟 的 正 交 线 偏 振 泵 浦 脉 冲 ，耦
合 到 棒 状 光 纤 ，并 通 过 孤 子 自 频 移 产 生 两 个 相 同 波
长 且 正 交 的 1613 nm 线 偏 振 孤 子（水 平 孤 子 能 量 为
2
75 mW，脉宽为 82. 6 fs；竖直孤子能量为 76 mW，脉宽
为 83. 3 fs）。 随 后 将 正 交 线 偏 振 孤 子 分 离 ，并 且 重 新
调 整 它 们 的 延 迟 ，使 其 在 时 间 上 重 叠 ，完 成 孤 子 合 成 ，
合 成 1613 nm 孤 子（能 量 为 151 nJ，脉 宽 为 83. 7 fs）的
能 量 提 高 了 2 倍 ，如 图 7（c）所 示 。 应 用 于 活 体 小 鼠
白质层三次谐波成像和血管的三光子荧光成像如
图 7（d）所示，三光子信号提升了 8 倍。
、大 模 场 光 3）He 等［79］通 过 两 个 偏 振 分 束 立 方 体 产 生 正 交 的
1550 nm 泵浦脉冲输入 ，经过棒状光纤孤子自频移 ，产
生 两 个 共 线 传 播 的 1620 nm 孤 子 ，从 而 将 重 复 频 率 加
倍，同时应用于三光子荧光血管成像，三光子荧光信号
提高了 2 倍 ，如图 7（e）、
（f）所示。同时 ，在保偏大模场
光纤中，利用一个半波片调节输入泵浦脉冲，产生两个
正 交 传 播 的 线 偏 振 孤 子 ，同 时 应 用 于 小 鼠 尾 腱 的 二 次
谐波成像，信号提升了 2 倍，如图 7（g）、
（h）所示。
4）Gan 等［71］将 1550 nm 飞秒脉冲泵浦源耦合进空
芯光纤 ，演示了空芯光纤的孤子自频移 ，获得 1600 nm
波长的高能飞秒脉冲孤子，能量为 503 nJ，脉宽为 428 fs。
与之 相 比 ，棒 状 光 纤 孤 子 自 频 移 产 生 的 1600 nm 孤 子
利用 1617 nm 波
［77］
能量为 96 nJ，脉宽为 72 fs。空芯光纤的能量是棒状光
纤的 5. 2 倍，脉宽是棒状光纤的 5. 9 倍。应用于 SR101
荧光染料三光子荧光成像时，相同的孤子能量，棒状光

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图7 1700 nm 波段飞秒脉冲光源搭建及多光子成像 。 （b）1617 nm 圆偏振孤子和

（a）线偏振孤子和圆偏振孤子产生的实验装置［76］；
线偏振孤子激发的活体小鼠白质层三次谐波成像［77］； （d）1613 nm 孤子（水平、垂直和合成）激
（c）偏振孤子合成的实验装置［78］；
［78］
发的小鼠白质层三次谐波成像（绿色）和血管的三光子荧光成像（红色） ；（e）非保偏棒状光纤偏振复用技术的实验装置［79］；
（f）偏振孤子（水平、垂直和合成）激发的小鼠脑血管三光子荧光成像［79］；
（g）保偏大模场光纤偏振复用技术的实验装置［79］；
（h）
偏 振 孤 子（水 平 、垂 直 和 合 成）激 发 的 小 鼠 尾 腱 二 次 谐 波 成 像［79］； （j）1600
（i）空 芯 光 纤 和 棒 状 光 纤 的 孤 子 自 频 移 实 验 装 置［71］；
nm 孤子（空芯光纤和棒状光纤）激发的 SR101 荧光染料三光子荧光成像和头骨细胞三次谐波成像［71］
Fig. 7 Construction of femtosecond pulse light source for MPM imaging at 1700 nm waveband. (a) Experimental setup for linearly -
polarization soliton and circularly -polarization soliton generation [76] ; (b) in vivo mouse white matter layer with 1617 nm circularly -
polarization soliton and linearly -polarization soliton THG imaging [77] ; (c) experimental setup for polarized soliton synthesis [78] ;
(d) THG imaging (green) and blood vessel 3PF imaging (red) of mouse white matter layer with 1613 nm soliton (horizontal,
vertical, and synthesis) [78] ; (e) experimental setup of the polarization multiplexing technology with no polarization -maintaining
PC rod fiber[79] ; (f) 3PF imaging of mouse brain blood vessels with polarized soliton (horizontal, vertical, and both) [79] ;
(g) experimental setup of the polarization multiplexing technology with polarization -maintaining LMA fiber[79] ; (h) SHG imaging
of mouse tail tendon excited with polarized soliton (horizontal, vertical, and both) [79] ; (i) experimental setup of SSFS of hollow -
core fiber and PC rod fiber[71] ; (j) SR101 fluorescent dye of 3PF imaging and skull cells of THG imaging with 1600 nm soliton
(hollow -core fiber and PC rod fiber)[71]

纤三光子荧光信号是空芯光纤的 24 倍；应用于头骨细 子 光 源 ，孤 子 脉 宽 为 80 fs。 利 用 该 光 源 ，结 合 基 因 编

胞三次谐波成像时，相近的三次谐波信号，空芯光纤孤 码 红 色 钙 指 示 剂 ，实 现 了 活 果 蝇 大 脑 的 神 经 细 胞 的 跨
子 能 量 是 棒 状 光 纤 的 3. 2 倍 ，如 图 7（j）所 示 。 因 此 ，空 层功能成像。Delahaye 等［73］利用大模场反共振光纤的
芯光纤的孤子自频移光源不适合深层脑成像。 孤 子 自 频 移 输 出 1680 nm 孤 子 ，孤 子 能 量 为 70 nJ，脉
5）Chen 等 将 1550 nm 飞 秒 脉 冲 泵 浦 源 耦 合 进
［80］
宽 为 85 fs，实 现 了 HT29 细 胞 三 光 子 荧 光 成 像 和 离 体
13. 5 cm 的 保 偏 大 模 场 光 纤 ，并 通 过 自 相 位 调 制 得 到 小鼠脑成像。
1603 nm 波 长 的 飞 秒 脉 冲 光 源 ，脉 冲 能 量 为 167 nJ，脉
4 1700 nm 波 段 多 光 子 深 层 生 物 组 织
宽 为 170 fs。 利 用 该 技 术 搭 建 1700 nm 波 段 飞 秒 脉 冲
光源，能够降低光源成本。 成像
此 外 ，国 际 上 其 他 团 队 也 开 展 了 1700 nm 波 段 光 4. 1 活体小鼠深层脑血管成像
源 建 造 及 多 光 子 成 像 工 作 ：Tao 等 ［81］
采用重复频率为 脑血管成像是深层脑成像的重要应用领域。大脑
2 MHz、脉宽 131 fs 的 1550 nm 光纤激光的啁啾脉冲放 主 要 由 各 种 细 胞 和 血 管 构 成 ，血 管 的 作 用 是 协 调 脑 内
大 系 统 ，结 合 棒 状 光 纤 的 孤 子 自 频 移 输 出 1700 nm 孤 神 经 细 胞 网 络 正 常 发 育 ，提 供 神 经 细 胞 和 胶 质 细 胞 所

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需 的 营 养 物（ 葡 萄 糖 和 氧 气 ）并 清 除 代 谢 产 物 。 4. 4 μm。 随 后 ，Wen 等［82］优 化 飞 秒 脉 冲 孤 子 光 源 ，利

2013 年，康奈尔大学 Xu 团队 通过 36 cm 的棒状光纤
［24］
用 44 cm 的 棒 状 光 纤 孤 子 自 频 移 获 得 高 能 的 1665 nm
孤 子 自 频 移 获 得 1675 nm 孤 子 光 源（67 nJ），首 次 实 现 孤子光源（113 nJ），实现了活体小鼠脑表面下 1650 μm
了活体小鼠白质层的三次谐波成像（无标记）和海马体 的 深 层 血 管 成 像 。 对 比 文 献［24］可 知 ，相 同 荧 光 标 记
三光子荧光血管成像，成像深度为 1340 μm，如图 8（a） 物（Texas red）下 ，脑 血 管 成 像 的 深 度 和 速 度 都 显 著
所 示 。 系 统 的 横 向 分 辨 率 为 0. 9 μm，轴 向 分 辨 率 为 提高。

图8 1700 nm 波段激发三光子荧光活体小鼠深层脑血管成像。
（a）Texas red 标记脑血管三光子荧光成像的三维重构图和不同深度
（b）ICG 标记脑血管双光子荧光成像的三维重构图和不同深度血管二维图［25］；
血管的信号背景比［24］； （c）Qtracker655 标记脑
血管三光子荧光成像的三维重构图和不同深度脑血管的信号背景比［26］
Fig. 8 3PF of mouse deep brain vasculature imaging with 1700 nm waveband in vivo. (a) 3D reconstruction of 3PF images of the
-

mouse brain vasculature with Texas red -labeled and the signal background ratio of different depth vessels [24] ; (b) 3D
reconstruction of 2PF images of the mouse brain vasculature with ICG -labeled and the different depths of two -dimensional of
blood vessels[25] ; (c) 3D reconstruction of 3PF images of the mouse brain vasculature with Qtracker655 -labeled and the signal
background ratio of different depth vessels[26]

提升成像深度的有效策略之一是采用更亮的标记 未 达 到 理 论 极 限（R SBR =46，受 限 于 最 大 激 光 功 率）。

物。Liu 等［26］利用自建的 1700 nm 波段三光子作用截面
测量系统，测量了不同近红外荧光标记物的三光子作用
截面，结果表明：Qtracker655 量子点的作用截面比有机
染料 SR101 和 Texas red 大 4~5 个数量级。对比不同荧
光 标 记 物（SR101、Texas red、Qtracker655）三 光 子 荧
光 成 像 ，成 像 深 度 分 别 达 到 脑 表 面 下 1340 μm
1650 μm［82］和 2100 μm，如 图 8（c）所 示［26］。 相 比 最 初
1700 nm 波 段 三 光 子 荧 光 血 管 成 像（1340 μm），
Qtracker655 量 子 点 标 记 深 层 血 管 成 像 的 速 度 提 高 了
10 倍 ，成 像 深 度 提 高 了 760 μm，这 也 是 目 前 1700 nm
波段激发活体动物三光子荧光成像最大成像深度。
1700 nm 波 段 激 发 不 仅 可 以 用 于 三 光 子 成 像 ，还
能 用 于 双 光 子 成 像 ：Cheng 等 ［25］
利 用 1617 nm 波 长 的
圆 偏 振 孤 子 光 源 激 发 吲 哚 菁 绿（ICG）双 光 子 荧 光 成
像，实现了活体小鼠脑表面下 2000 μm 深层血管成像，
如 图 8（b）所 示 。 此 外 ，定 量 对 比 1700 nm 波 段 的 双 光
子（2000 μm）和 三 光 子（2100 μm）荧 光 血 管 成 像 信 号
背 景 比 可 以 发 现 ：1700 nm 波 段 双 光 子 荧 光 血 管 成 像
已接近理论极限（R SBR =1），而三光子荧光血管成像远
除了 1700 nm 波段飞秒脉冲孤子光源激发的活体小鼠
深层脑血管成像外，Chen 等［80］还利用大模场光纤的自
相 位 调 制 技 术 制 备 了 1603 nm 波 长 飞 秒 脉 冲 光 源 ，也
实 现 了 活 体 小 鼠 深 层 脑 血 管 三 光 子 荧 光 成 像 ，成 像 深
度为 1500 μm。该技术可以显著降低系统成本以及建
［83］
、 造 难 度 ，但 该 技 术 波 长 调 谐 范 围 受 限 ，最 长 波 长 仅 为
1603 nm。
除 了 商 用 的 荧 光 染 料 ，近 年 来 不 断 涌 现 的 各 种 新
材 料 ，如 聚 集 诱 导 发 光 材 料（AIE）等 ，在 1700 nm 波 段
激 发 多 光 子 荧 光 成 像 领 域 也 有 重 要 应 用 。 Liu 等［84］利
用 1600 nm 波长激发聚集诱导发光的二元有机纳米材
料（AIE -BONAPs）实现了活体小鼠深层脑血管三光子
荧光成像 ，成像深度为脑表面下 1680 μm，如图 9（a）所
示 。 Xu 等［85］利 用 1665 nm 波 长 激 发 AIEgens -DPNA -
NZ 荧光染料，实现活体小鼠脑表下 1700 μm 三光子荧
光 深 层 血 管 成 像 ，同 时 海 马 体 微 血 管 的 分 辨 率 为
2. 2 μm，如 图 9（b）所 示 。 Li 等［86］通 过 设 计 一 种 具 有 高
荧 光 量 子 产 率 和 大 三 光 子 作 用 截 面 的 AIE 材 料 ——
DPCZ -BT，利用 1665 nm 激发三光子荧光成像，实现了

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图9 AIE 标记活体小鼠深层脑血管成像。
（a）AIE -BONAPs 标记活体小鼠深层脑血管三光子荧光成像三维重构图和不同深度的血
（b）AIE -DPNA -NZ 标 记 活 体 小 鼠 深 层 脑 血 管 三 光 子 荧 光 成 像 三 维 重 构 和 不 同 深 度 脑
管 二 维 图 ，绿 色 表 示 三 次 谐 波 成 像［84］；
（c）MTTCM NP 标记活体小鼠深层脑血管三光子荧光成像和不同深度脑血管的信号背景比［87］
血管的信号背景比［85］；
Fig. 9 In vivo mouse deep -brain vasculature imaging with AIE -labeled. (a) 3D reconstruction of 3PF images of mouse deep -brain
vasculature with AIE -BONAPs labeled and the different depths of two -dimensional of blood vessels, green represents THG
imaging[84] ; (b) 3D reconstruction of 3PF images of mouse deep -brain vasculature with AIE - DPNA -NZ labeled and the signal
background ratio of different depth brain blood vessels in vivo [85] ; (c) 3PF imaging of mouse deep -brain blood vessels with
MTTCM NP labeled and the signal background ratio of different depth brain blood vessels in vivo [87]

活体小鼠脑表面下 1860 μm 深层血管成像。Deng 等［87］ 1800 μm 脑血管的 R SBR 为 20，如图 9（c）所示。Li 等［88］报
利 用 1660 nm 波 长 激 发 MTTCM 荧 光 染 料 ，实 现 脑 表 道了一种新型 AIE 荧光探针 DCTBT，利用 1700 nm 激
面 下 1900 μm 深 层 脑 血 管 三 光 子 荧 光 成 像 ，而 深 层 发双光子荧光成像，实现了活体小鼠脑表面下 2180 μm

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深 层 脑 血 管 成 像 ，这 是 目 前 最 深 的 双 子 荧 光 成 像 。 此 波段激发不同种类近红外荧光标记物的活体小鼠深层
外 ，Li 等 报道了一种 π 共轭结构低聚集纳米探针
［89］
脑血管的多光子荧光成像，这些新材料除在 1700 nm 波
（OFET NPs），结 合 1700 nm 波 段 三 光 子 荧 光 成 像 技 段 具 有 大 的 多 光 子 作 用 截 面 外 ，还 具 有 良 好 的 生 物 兼
术，对活体小鼠脑血管成像，在低浓度（550 μmol/L）下， 容性，因而特别适合 1700 nm 波段多光子深层生物组织
实现了脑表面 1696 μm 血管成像。表 1 列举了 1700 nm 成像，为该波段荧光标记物提供了多样化选择。
表1 1700 nm 波段不同荧光标记物活体小鼠深层脑血管成像
Table 1 In vivo mouse deep -brain blood vessels imaging of different fluorescence indicator with 1700 nm window
Wavelength /nm Material MPM Concentration Depth /μm Reference
1610 BONAPs 3PM 50 mg/kg 1680 ［84］
1617 ICG 2PM 2 mmol/L 2000 ［25］
1620 SR101 3PM 3. 3 mg/ml 1340 ［83］
1660 MTTCM NPs 3PM 2 mmol/L 1900 ［87］
1665 Texas red 3PM 700 μmol/L 1650 ［82］
1665 Qtracker655 3PM 2 μmol/L 2100 ［26］
1665 DPNA-NZ 3PM 2 mmol/L 1700 ［85］
1665 DPCZ-BT 3PM 2 mmol/L 1860 ［86］
1700 DCTBT 2PM 2 mmol/L 2180 ［88］
1720 OEFT NPs 3PM 550 μmol/L 1696 ［89］

4. 2 活体小鼠深层血流速度测量 4. 3 活体小鼠深层脑细胞成像
脑部的细胞依靠血液循环来持续提供氧气和营养 脑 科 学 的 研 究 重 点 是 脑 部 的 细 胞 ，包 括 神 经 细 胞
物 质 并 清 除 代 谢 产 物 ，血 流 速 度 是 反 映 神 经 细 胞 活 动 和胶质细胞等。细胞和血管之间的偶联构成支配生物
和某些脑部疾病的关键。在测量血流速度的各种方法 各 种 行 为 和 生 理 过 程 的 神 经 网 络 。 因 此 ，研 究 深 层 脑
中 ，多 光 子 显 微 成 像 技 术 由 于 毫 米 量 级 成 像 深 度 和 亚 细 胞 成 像 对 脑 科 学 发 展 具 有 重 要 意 义 。 2013 年 ，
微米量级分辨率广泛应用于血流动力学测量。具体测 Horton 等［24］利用 1700 nm 波段三光子荧光成像技术首
量步骤如下：将荧光染料注射到动物体内，首先确定待 次 实 现 了 转 基 因 小 鼠 海 马 体 神 经 细 胞 成 像 ，成 像 深 度
测血管，然后对待测血管进行重复线扫成像，产生明暗 为 1076 μm，如图 11（b）所示。这是首次在非侵入的条
交 替 条 纹 ，最 后 通 过 计 算 条 纹 斜 率 测 量 血 流 速 度 。 例 件 下 实 现 的 小 鼠 海 马 体 神 经 细 胞 成 像 。 Liu 等［83］利 用

如 ，Liu 等［26］利 用 Qtracker655 量 子 点 荧 光 标 记 物 实 1700 nm 波 段 三 光 子 作 用 截 面 测 量 系 统 ，测 量 SR101

荧 光 染 料 作 用 截 面 ，确 定 SR101 荧 光 标 记 物 的 最 优 激
现 了 活 体 小 鼠 白 质 层 和 海 马 体 血 流 速 度 测 量 ，测 量
发 波 长 。 通 过 眼 眶 注 射 SR101 荧 光 标 记 物 ，实 现 了 普
脑 表 面 下 不 同 深 度 950 μm（0. 94 mm/s）、1330 μm
通 小 鼠 深 层 脑 部 星 形 胶 质 细 胞 成 像 ，成 像 深 度 为 脑 表
（0. 84 mm/s）和 1600 μm（1. 13 mm/s）的 血 流 速 度 。
面 下 910 μm，如 图 11（a）所 示 。 对 比 星 形 细 胞 双 光 子
1600 μm 的深层血流速度测量是目前多光子成像最大
荧 光 成 像 的 脑 表 面 下 670 μm［93］，成 像 深 度 提 高 了
深 度 血 流 动 力 学 测 量 ，如 图 10（a）所 示 。 此 外 ，采 用
30%。 此 外 ，Cheng 等［94］利 用 1700 nm 波 段 三 光 子 作
AIE 材料，Xu 等［85 88］也实现了对活体小鼠脑灰质层、白
-

用 截 面 测 量 系 统 ，对 比 dylight594 和 dylight649 荧 光 标
质 层 和 海 马 体 的 血 流 速 度 测 量 ，甚 至 是 穿 透 完 整 头 骨
记 物 三 光 子 作 用 截 面 ，确 定 最 优 激 发 波 长 和 最 大 的 三
的血流速度测量，如图 10（b）、
（d）所示。
光子作用截面。利用脑部微针注射技术标记小鼠脑部
考虑到荧光标记物注射对活体生物有一定的影
微 胶 质 细 胞 ，结 合 1700 nm 波 段 三 光 子 荧 光 成 像 实 现
响，因此，研究人员还致力于开发无标记多光子成像血 活体小鼠灰质层和白质层的微胶质细胞成像，成像深度
流速度测量技术，例如三次谐波成像。Cheng 等［90 92］利
-

为 1124 μm，是微胶质细胞双光子荧光成像（300 μm）的

用 1700 nm 波 段 三 光 子 荧 光 及 三 次 谐 波 同 时 成 像 ，证 3. 7 倍［95］，如图 11（c）所示。
实 后 者 同 样 可 用 于 血 流 速 度 测 量 ，由 于 红 细 胞 可 产 生 4. 4 活体小鼠头骨及穿透头骨成像
强 的 三 次 谐 波 信 号 ，因 此 可 以 利 用 线 扫 测 量 红 细 胞 的 在自然生理环境下观察活体小鼠脑成像对神经网
流 动 速 度 。 采 用 三 次 谐 波 线 扫 成 像 技 术 ，Liu 等［92］实 络和血管成像的发展意义重大。颅窗植入、开颅和头骨
现 了 活 体 小 鼠 灰 质 层 和 白 质 层 的 血 流 速 度 测 量 ，最 大 打磨等手术对活体小鼠脑部会造成一定的生理影响。
深 度 为 脑 表 面 下 960 μm，这 也 是 目 前 最 深 的 1700 nm 例如，开颅手术有可能改变颅内压，从而影响血管旁的
波 段 无 标 记 三 次 谐 波 成 像 血 流 速 度 测 量 ，如 图 10（c） 流体流动［96］。手术过程的机械压力会诱导小鼠皮层的
所示。 小胶质细胞和星形胶质细胞激活［97］。因此，1700 nm 波

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图 10 1700 nm 波段活体小鼠脑血流速度测量。 ［26］

（a）在体测量小鼠脑血管三光子荧光成像（Qtracker655） ；（b）活体小鼠三光子荧光
血流速度测量（AIE -DPNA -NZ）
［85］
；（c）无标记在体测量小鼠脑血管三次谐波成像［92］，红色为三光子荧光成像，绿色为三次谐
（d）穿透头骨在体测量三光子小鼠脑血管成像（MTTCM NP）
波成像； ［87］

Fig. 10 In vivo measurement of mouse brain blood flow speed at 1700 nm waveband. (a) The measurement of mouse brain blood flow
speed with 3PF imaging in vivo (Qtracker655) [26] ; (b) the measurement of mouse brain blood flow speed with 3PF imaging in
vivo (AIE -DPNA -NZ) [85] ; (c) the label-free measurement of mouse brain blood flow speed with THG imaging in vivo [92] , red
represents 3PF imaging, green represents THG imaging; (d) the measurement of mouse brain blood vessels through the intact
skull for blood flow speed with 3PF imaging in vivo (MTTCM NP)[87]

段三光子成像技术是穿透头骨成像的一种重要手段。 等［6］利 用 1300 nm 波 段 三 光 子 成 像 ，实 现 了 穿 透 头 骨

例如，Wang 等［59］利用 1700 nm 波段三次谐波成像和三 脑表面下 510 μm 的血管成像，而且实现了头骨表面下
光子荧光成像揭示了活体小鼠头骨中骨细胞以及所处 140 μm 神经细胞成像。同时他们利用长波长 1700 nm
环 境 的“ 三 明 治 ”结 构 ，如 图 12（a）所 示 。 此 外 ，Wang 波 段 三 光 子 荧 光 成 像 ，实 现 了 穿 透 头 骨 脑 表 面 下

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图 11 1700 nm 波段激发活体小鼠深层脑细胞三光子荧光成像。
（a）深层脑星形细胞三光子荧光成像三维重构图和不同深度星形细胞
二维图［83］；
（b）转基因小鼠深层神经细胞三光子荧光成像三维重构图［24］；
（c）深层脑小胶质细胞三光子荧光成像三维重构图［94］
Fig. 11 In vivo mouse deep -brain cell of 3PF imaging at 1700 nm waveband. (a) 3D reconstruction of deep -brain astrocytes of 3PF
imaging and the different depths of 2D of astrocytes[83] ; (b) 3D reconstruction of transgenic mouse of deep -brain neurons of 3PF
imaging[24] ; (c) 3D reconstruction of deep -brain microglia of 3PF imaging[94]

图 12 1700 nm 波段活体小鼠穿透头骨三光子脑血管成像。
（a）头骨细胞的三次谐波和三光子荧光成像［59］；
（b）穿透头骨的三光子荧
光脑血管成像三维重构图［6］；
（c）透明头骨的脑血管三光子荧光成像三维重构图［99］。
（d）穿透完整头骨的三光子荧光血管成像
（MTTCM NP）和不同深度血管成像的信号背景比［87］
Fig. 12 In vivo through -skull mouse brain vasculature of 3PF imaging at 1700 nm window. (a) THG and 3PF imaging of skull cells[59] ;
(b) 3D reconstruction of through -skull mouse brain vasculature of 3PF imaging[6] ; (c) 3D reconstruction of transparent -skull
imaging of brain vasculature for 3PF imaging[99] ; (d) the 3PF blood vessels through the intact skull and the signal background
ratio of blood vessels images at different depths [87]

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700 μm 的血管成像，如图 12（b）所示。Horton 等 ［98］

利用 和细胞的体内循环汇入静脉参与全身血液循环。因
1700 nm 波 段 飞 秒 脉 冲 光 源 激 发 Qtracker655 量 子 点 ， 此，可视化皮肤中的淋巴管成像是理解其结构、功能和
实 现 活 体 小 鼠 穿 透 头 骨 成 像 ，脑 血 管 成 像 深 度 为 动力学的关键。Wang 等［105］利用 1700 nm 波段激发双光
750 μm。而 Chen 等［99］利用透明头骨技术，结合 1700 nm 子荧光成像实现了活体小鼠腿部皮肤表面下 300 μm 的
波段三光子荧光血管成像实现了活体小鼠脑表面下 淋 巴 管（ICG 标 记）无 创 成 像 ，可 视 化 其 结 构 和 收 缩 动
850 μm 的深层血管成像，如图 12（c）所示。此外，Deng 力 学 。 同 时 ，利 用 1700 nm 波 段 激 发 二 次 谐 波 和 三 次
等 ［87］
利用 AIE 材料（MTTCM NPs），结合 1665 nm 波长
- 谐 波 成 像 可 视 化 了 淋 巴 管 局 部 环 境［105］，如 图 13（b）所
激发三光子荧光成像，实现了完整头骨表面下 1100 μm 示 。 髓 鞘 是 周 围 神 经 系 统 关 键 组 成 部 分 ，手 指 皮 肤 的
深 层 血 管 成 像 。 Li 等 ［88］
报 道 了 新 的 AIE 荧 光 探 针 结构异常与神经病变有关。最近，He 等［106］利用 1700 nm
DCTBT，利 用 1700 nm 激 发 双 光 子 荧 光 成 像 ，实 现 了 波段三光子荧 光 成 像 ，结 合 特 异 性 荧 光 染 料 标 记 手 指
完 整 头 骨 脑 表 面 下 1135 μm 深 层 脑 血 管 成 像 ，这 是 目 皮 肤 的 髓 鞘 ，实 现 了 皮 肤 表 面 下 340 μm 髓 鞘 成 像 ，如
前 1700 nm 波段穿透头骨最深的双光子荧光成像。 图 12（c）所示。此外，在小鼠背部皮肤利用 1700 nm 波
4. 5 活体小鼠深层皮肤成像 段三光子荧光成像实现了弹性纤维（Sulforhodamine B
多 光 子 显 微 成 像 除 了 应 用 于 脑 科 学 研 究 外 ，还 常 标 记）的 深 层 成 像［107］，如 图 13（d）所 示 ，皮 肤 中 横 向 分
应用于皮肤科学研究。可视化皮肤组织结构特别是活 辨 率 为 0. 9 μm，轴 向 分 辨 率 为 4. 17 μm。 而 外 源 性 荧
［100 -101］ ［102］
体皮肤对皮肤疾病诊断 、皮肤衰老检测 等方面 光标记物对生物组织来说有毒性且存在光漂白影响，
的 研 究 意 义 重 大 。 皮 肤 分 为 表 皮 层 、真 皮 层 和 皮 下 脂 所以无标记三次谐波成像在皮肤成像中具有重要作
肪 层 。 目 前 ，1700 nm 波 段 激 发 三 光 子 显 微 成 像 实 现 用 。 由 于 髓 鞘 富 含 脂 质 结 构 ，能 够 产 生 强 的 三 次 谐 波
了 活 体 小 鼠 完 整 的 皮 肤 成 像（无 标 记）。 例 如 ，Wang 信 号 。 因 此 ，可 利 用 1700 nm 波 段 三 光 子 成 像 研 究 小
等［103 104］利用 1700 nm 波段的二次谐波和三次谐波成像 鼠趾部皮肤的髓鞘结构，结果表明，无标记的三次谐波
-

技术实现了角质层、皮脂腺、胶原蛋白和脂肪细胞在小 成 像 和 三 光 子 荧 光 成 像 共 定 位 ，三 次 谐 波 成 像 也 可 以
鼠 耳 朵 和 背 部 皮 肤 中 的 无 标 记 成 像 ，如 图 13（a）所 示 。 实 现 皮 肤 深 层 髓 鞘 成 像 ，具 有 无 标 记 和 不 受 光 漂 白 影
淋 巴 管 在 淋 巴 系 统 中 参 与 细 胞 间 质 中 的 液 体 、大 分 子 响的优点［108］。

图 13 1700 nm 波 段 活 体 小 鼠 多 光 子 皮 肤 成 像 。 ［104］
（a）小 鼠 皮 肤 二 次 谐 波（红 色）和 三 次 谐 波 成 像（绿 色） ；（b）小 鼠 后 肢 淋 巴 管 的 双
光子荧光和二（三）次谐波的成像，红色为三次谐波成像，绿色为双光子荧光和二次谐波成像［105］；
（c）小鼠脚趾皮肤髓鞘的三
光子荧光成像［106］；
（d）小鼠皮肤弹性纤维三光子荧光成像［107］
Fig. 13 In vivo mouse skin imaging of MPM at 1700 nm waveband. (a) Mouse skin for SHG imaging (red) and THG imaging (green) [104];
(b) mouse hindlimb lymphatic vessel for 2PF imaging and SHG (THG) imaging, red represents THG imaging, green
represents 2PF imaging and SHG imaging[105] ; (c) mouse digital skin myelin for 3PF imaging[106] ; (d) mouse skin elastic fibers for
3PF imaging[107]

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[2] Zheng T, Yang Z Q, Li A N, et al. Visualization of
5 总结和展望 brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical
sectioning tomography[J]. Optics Express, 2013, 21(8):
多 光 子 显 微 成 像 因 其 非 侵 入 性 、毫 米 量 级 成 像 深
9839-9850.
度 、亚 微 米 量 级 分 辨 和 光 学 层 析 等 优 点 在 生 物 医 学 和 [3] Yan J, Zhuo S M, Chen G, et al. Real-time optical
脑科学研究有独特的优势。相比传统的钛宝石激发双 diagnosis for surgical margin in low rectal cancer using
光 子（800 nm）荧 光 成 像 ，1700 nm 波 段 激 发 的 多 光 子 multiphoton microscopy[J]. Surgical Endoscopy, 2014,
显 微 成 像 可 降 低 生 物 组 织 散 射 影 响 ，在 活 体 小 鼠 深 层 28(1): 36-41.
脑成像以及皮肤成像领域获得了多光子成像技术的最 [4] Galli R, Sablinskas V, Dasevicius D, et al. Non-linear
optical microscopy of kidney tumours[J]. Journal of
大深度。首先，介绍了多光子显微成像的原理，根据生
Biophotonics, 2014, 7(1/2): 23-27.
物 组 织 的 吸 收 和 散 射 ，确 定 深 层 脑 成 像 最 优 激 发 波 [5] Ouzounov D G, Wang T Y, Wang M R, et al. In vivo
段——1700 nm 波段。其次，介绍了用于建造 1700 nm three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled
波段飞秒脉冲光源的孤子自频移技术和不同种类光纤 neurons deep in intact mouse brain[J]. Nature Methods,
的 孤 子 自 频 移 的 产 生 。 最 后 ，对 近 年 来 1700 nm 波 段 2017, 14(4): 388-390.
[6] Wang T Y, Ouzounov D G, Wu C Y, et al. Three-
多 光 子 显 微 成 像 技 术 在 活 体 小 鼠 脑 血 管 成 像（不 同 近
photon imaging of mouse brain structure and function
红外荧光染料标记）、血流速度测量、穿透头骨成像、脑
through the intact skull[J]. Nature Methods, 2018, 15
细 胞（神 经 细 胞 、星 形 细 胞 和 小 胶 质 细 胞）成 像 和 皮 肤 (10): 789-792.
成像（角质层、皮脂腺、脂肪细胞、胶原蛋白、淋巴管、髓 [7] Chow D M, Sinefeld D, Kolkman K E, et al. Deep
鞘和弹性纤维）的应用进行了介绍和分析。 three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish
目前，1700 nm 波段激发三光子荧光成像受到激发 [J]. Nature Methods, 2020, 17(6): 605-608.
[8] Yildirim M, Sugihara H, So P T C, et al. Functional
光源和荧光标记物的限制，成像深度限制在 2100 μm，因
imaging of visual cortical layers and subplate in awake
此可在深层生物组织成像中采取以下措施提高成像深
mice with optimized three-photon microscopy[J]. Nature
度：1）结合自适应光学技术［14，109 110］，通过矫正生物导致
-

Communications, 2019, 10: 177.

的光波波前畸变来进一步提高活体生物成像深度和分 [9] Wang T Y, Xu C. Three-photon neuronal imaging in
辨 率 。 2）开 发 近 红 外 波 段 的 高 亮 度 荧 光 探 针［84 85］，近 deep mouse brain[J]. Optica, 2020, 7(8): 947-960.
-

红 外 荧 光 探 针 对 生 物 样 本 光 损 伤 小 、具 有 深 层 组 织 [10] O’Herron P, Chhatbar P Y, Levy M, et al. Neural

correlates of single-vessel haemodynamic responses in
穿 透 能 力（散 射 低），以 及 生 物 样 品 中 的 生 物 分 子 的
vivo[J]. Nature, 2016, 534(7607): 378-382.
背 景 自 发 荧 光 干 扰 小 ，有 利 于 深 层 组 织 成 像 。 尽 管 [11] Chen C P, Qin Z Y, He S C, et al. High-resolution two-
1700 nm 波 段 激 发 三 光 子 荧 光 成 像 在 活 体 小 鼠 脑 血 管 photon transcranial imaging of brain using direct
结 构 和 血 流 动 力 学 测 量 方 面 取 得 重 要 进 展 ，但 该 技 术 wavefront sensing[J]. Photonics Research, 2021, 9(6):
在 脑 细 胞 成 像 和 脑 细 胞 动 力 学 方 面 应 用 受 限 ，目 前 限 1144-1156.
制于转基因小鼠（无法对普通小鼠成像）和部分红色荧 [12] Zheng W, Wu Y C, Winter P, et al. Adaptive optics
improves multiphoton super-resolution imaging[J]. Nature
光标记物（远少于绿色荧光标记物）的细胞成像。虽然
Methods, 2017, 14(9): 869-872.
成功演示了 1700 nm 波段三光子星形细胞［83］和小胶质 [13] Liu R, Li Z Y, Marvin J S, et al. Direct wavefront
细胞［94］深层成像，拓展了该技术的脑部结构成像应用， sensing enables functional imaging of infragranular axons
但 是 与 传 统 800 nm 波 段 相 比 ，1700 nm 波 段 三 光 子 脑 and spines[J]. Nature Methods, 2019, 16(7): 615-618.
成 像 观 察 脑 部 细 胞 结 构 数 量 相 差 甚 远 ，显 著 限 制 了 该 [14] Streich L, Boffi J C, Wang L, et al. High-resolution
structural and functional deep brain imaging using
技 术 在 深 层 脑 科 学 研 究 中 的 应 用 。 而 近 年 来 ，腺 相 关
adaptive optics three-photon microscopy[J]. Nature
病 毒［111 112］的 发 展 ，提 供 了 不 同 脑 部 结 构（例 如 神 经 细
-

Methods, 2021, 18(10): 1253-1258.

胞、寡突细胞、星形细胞、小胶质细胞和内皮细胞等）特 [15] Sofroniew N J, Flickinger D, King J, et al. A large field
异 性 荧 光 标 记 。 因 此 ，结 合 1700 nm 波 段 激 发 三 光 子 of view two-photon mesoscope with subcellular
荧光成像技术为深层脑部结构成像提供了可视化技术 resolution for in vivo imaging[J]. eLife, 2016, 5: e14472.
支持。最后 ，最新研究表明 ：2200 nm 波段也是一个低 [16] Stirman J N, Smith I T, Kudenov M W, et al. Wide
field-of-view, multi-region, two-photon imaging of neuronal
损 耗 的 激 发 窗 口 ，也 可 以 应 用 于 深 层 生 物 组 织
activity in the mammalian brain[J]. Nature Biotechnology,
成像［113 119］。
-

2016, 34(8): 857-862.

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