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细胞增殖相关知识、实验方案等

猫大后宫团荣誉出品

酸谈实验室
补充材料
 目录

MTT 法检测细胞生长 by 张汝朋 .................................................. 2

MTS/PMS 法测定生长曲线 by 雷厉 ............................................. 5

CCK-8 法检测细胞生长 by D.O.Lin 威少 ..................................... 8

锐博 EdU 细胞增殖检测试剂盒 by 逛吃逛吃逛吃 ...................... 17

碧云天不同细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择 by 张汝

朋 ................................................................................................ 25

细胞增殖 Marker by 走着走着花就开了 ..................................... 29

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 MTT 法检测细胞生长 by 张汝朋

一、原理：
MTT法又称MTT比色法，是一种常用的检测细胞存活和生长的方法。
检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水
的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基
亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其
光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与
细胞数成正比。
MTT法广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、
细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
此方法的特点是灵敏度高、经济实惠。

二、MTT溶液配制：
配制浓度为5mg/ml的MTT：称取MTT 100mg，溶于20ml的PBS，0.22μm滤
器过滤，4℃避光保存。配制过程注意避光。

三、实验步骤（以贴壁细胞为例）：
1. 细胞铺板：多用96孔板。收集对数期细胞，铺板密度为1000-10000/孔，每
孔加液量100μl（边缘孔用无菌PBS填充）。
2. 加药干预：在5%CO2，37℃细胞培养箱中培养至细胞融合度约80-90%，加
入药物干预，每组设5个复孔，在5%CO2，37℃细胞培养箱中继续培养12-
48小时。
3. 加MTT：吸去培养上清，每孔加入90μl培养基+10μl MTT溶液（MTT占比

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 10%），继续培养4h。
4. 加DMSO：终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100-150μl DMSO，
置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
5. 酶标仪检测：在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。注意同时
检测调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药
物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

四、注意事项：
1. 悬浮细胞检测。
细胞铺板，加药干预，加MTT，酶标仪检测，设置调零孔等与贴壁细胞相同。
在加DMSO时需要先将96孔板离心（1000转x10min），然后小心吸掉上清，
再加入DMSO。
2. 细胞活性。
细胞活性是关键，收集对数生长期细胞对实验结果至关重要。
3. 铺板密度。
不同细胞的铺板密度可适当调整，如细胞较小，或生长较慢，可适当提高铺
板密度。
4. 铺板均匀度。
也是使用该法的关键。细胞铺板时一定要均匀，细胞悬液一定要吹打均匀，
但是不能振荡，防止细胞死亡。强烈建议使用排枪，显著提高铺板效率，每
加两到三排，需要再次吹打细胞，避免细胞沉降影响。铺板完成后，前后左
右晃动板子，使细胞分散开，避免细胞聚集成团。
5. 96孔板加液量。
不同的实验组有不同的加液量，以100μl和200μl多见，并无优劣高下之别。
但是当使用细胞生长周期较长的细胞时，建议加200μl培养基，利于生长。

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 当然，如果加培养基200μl时，MTT的量也应该相应增加，比例仍为10%。
6. 细胞融合度。
药物或材料毒性检测时，细胞融合度应稍高，80-90%比较合适。若是检测
细胞干预措施是否促进细胞增殖或细胞生长较快时，建议融合度50-60%，
过高则细胞容易长满，影响实验结果。
7. 细胞培养基是否需要加血清。
个人建议用低血清培养基，或无血清培养基，培养基成分可能会对吸光度造
成影响。当然，因为MTT本身就是粗略检测实验，并不十分精确，也有老师
直接使用完全培养基进行实验。
8. 加MTT前一定要观察MTT的颜色。
如果发现变色尤其是变成灰绿色时，表明MTT已经发生变性，不能使用了。
另外，操作时注意避光。
9. 加DMSO时，要小心吸去培养基。一般是用移液器小心吸去即可；有些老师
喜欢用滤纸覆盖96孔板后将96孔板倒置移去培养基，效果也很好。
10. 一般认为，MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是线性
关系。
11. MTT及DMSO均有毒，操作时注意防护。
12. MTT还原产生的甲瓒不溶于水，须被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，
也可能会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者
也有损害。可以选择CCK8等更优的替代方法。

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 MTS/PMS 法测定生长曲线 by 雷厉

一、实验原理
该检测系统由水溶性甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯
基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]和电子偶联剂（吩嗪硫酸二
甲酯）PMS组成。MTS可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成甲臢化合物，新
陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，这种
甲臢化合物在490nm波长处的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外
作处理。由490nm波长处测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性
细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越
浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。MTS溶液很稳定，对
细胞没有毒性可以长时间孵育细胞。

二、物品准备
1. 使用无菌DPBS溶解MTS以及PMS粉末，过滤后，锡箔纸包裹后避光冻存于
-20℃备用。
2. 胰酶消化液提前37℃预热。
3. 准备无菌PBS以及完全培养基
4. 枪头灭菌，准备好各规格微量移液枪、细胞计数板、细胞计数仪、真空负压
吸引器、96孔平底无菌细胞培养板等。

三、铺板
1. 待细胞生长状态良好时，弃去细胞上清液，使用PBS轻轻冲洗后，吸净PBS，
加入适量37℃提前预热的胰蛋白酶，将细胞置于培养箱内进行消化。待细胞

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 消化好后使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，800rpm离心
3min，弃上清，使用PBS或DPBS重悬细胞，然后使用相同条件离心以洗去
残余胰蛋白酶，小心的吸取并弃掉上清液，加入适量培养基重悬细胞，形成
单个细胞悬液。
2. 充分混匀后吸取10μL细胞悬液，加入细胞计数板，使用细胞计数仪进行细胞
计数。
3. 根据细胞计数情况调整细胞密度，以每孔3000个细胞(具体细胞量可以根据
实际情况进行调整)接种到96孔板，每孔加入细胞悬液体积为100μL，每个样
本做5个复孔，空白调零孔不铺细胞。
注意铺板时细胞悬液应垂直缓慢加入96空板的中央，加入细胞后无需晃动，
以免细胞铺不匀，每组实验分别设置0h、24h、48h、72h共4个时间点，培
养过夜，待细胞贴壁后加药。

四、加药（检测药物对于细胞增殖影响时进行该步骤）
1. 显微镜下观察贴壁细胞铺板是否均匀。
2. 分别配制含不同浓度药物/药物溶剂的培养基，使用真空负压吸引器吸弃培
养基，注意Tip头不要触及细胞，按照事先规划好的排孔顺序分别加入含不
同浓度的药物或及溶剂的培养基100μL。
3. 边缘孔加入200μL PBS以防止培养基蒸发影响实验结果。

五、呈色
1. 吸弃培养基，每孔准确加入100μL新鲜培养基。
2. 避光解冻MTS以及PMS溶液，根据样本数量按照每孔MTS/PMS（20:1）混
合液20μL计算所需混合液总量，避光配置混合液，现配现用。
3. 每孔避光准确加入20μL配置好的混合液，混匀后37℃继续孵育2～4h。

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4. 比色：
检测酶标仪是否正常连接，并且将酶标仪设定为490nm波长；
设置程序，将96孔板放入酶标仪后，震荡混匀，测定各孔光吸收值，记录结
果。

六、分析数据
待所有时间点均测量结束后，以各自空白孔为参照进行调零，以排除培养基
对吸光光度值读数的影响，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标使用GraphPad
Prism软件绘制细胞生长曲线并且使用SPSS软件进行统计学分析。

（雷厉还提供了96孔板图，在计划实验的时候可以先把96孔板图打印出来
做分组规划。该图也可以在补充材料下载处下载到。）

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 CCK-8 法检测细胞生长 by D.O.Lin 威少

一、原理：
CCK-8细胞增殖检测试剂盒基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-
(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐），能快速灵敏地检测细胞增殖和细
胞毒性。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况
下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物
（formazan）（图1-2）
，其颜色的深浅与存活细胞数目的增殖成正比，与细胞毒
性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。

图1. CCK-8试剂盒工作原理

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二、用途：
1. 药物筛选
2. 细胞增殖测定
3. 细胞毒性测定
4. 肿瘤药敏试验
5. 生物因子的活性检测

三、CCK-8测细胞增殖适用范围：
1. 适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量
2. 不能检测组织中的细胞数量
3. 不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要
配合其他实验结果进行综合判断【威少：流式凋亡也爱这么说，都在推脱责
任→需要全科会诊。猫大：威少在胡说，大家别信他。】

四、优势：

检测方法 MTT 法 XTT 法 WST-1 法 CCK-8 法

甲臜产物的水溶性 差（需加有机溶剂溶 好 好 好
解后再检测）
产品性状 粉末 2 瓶溶液 溶液 1 瓶溶液
使用方法 配成溶液后使用 现配现用 即开即用 即开即用
检测灵敏度 高 很高 很高 高
检测时间 较长 较短 较短 *短
检测波长 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
细胞毒性 高， 很低， 很低， 很低，
细胞形态完全消失 细胞形态不变 细胞形态不变 细胞形态不变
试剂稳定性 一般 较差 一般 很好
批量样品检测 可以 非常适合 非常适合 非常适合
便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷

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五、材料
CCK-8：DOJINDO东（同）仁化学-日本（发明了CCK8）、MCE、汉恒、尚宝、
碧云天和美伦都有相应产品。
10%FBS培养液
96孔培养板
10μL、100-200μL的枪或多通道移液器
CO2培养箱
带有450nm滤光片的酶标仪（有的品牌在490nm测）

六、预实验：根据细胞习性摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间
1. 接种细胞数量：先参考说明书或者师门推荐，没有的话需要自己摸索，一个
96孔板最少接种1000个细胞数量；具体接种数量还需要结合自己前期各种
药物处理造模+病毒感染+质粒转染等总处理时间+观察增殖曲线的总时间
（5天以内，可以适当缩短，特别是昙花一样的原代）+平时估摸的细胞生长
速度。注意在规划总时间内不要让细胞长满，不然后面的数据就不太准确了。
2. CCK-8试剂孵育时间：一般2-4h，先参考说明书，从2h，2.5h，3h，3.5h，
4h一步步检测，等到一个时间点以后，再增加孵育时间，用酶标仪检测到的
数值几乎没有变化即可。

七、分组设计（三种情况）：
1. 一板有多个时间点和多个组：如猫大版的，就是一个板里面组数太少和复孔
太少

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2. 一板有多个时间点和一个组：分6个时间点测，一组最多9个复孔，最后一竖
排留作调零孔；几个组就几个96孔板，一个板多个时间点的可能容易细胞污
染，但是一遍做下来好像也没啥事，大家多练练细胞培养技术就没问题
3. 一板有一个时间点和多个组：安排测几次CCK-8就需要几个96孔板，一般是
需要5-6次，也就是需要5-6个96孔板；耗费96孔板，但是可以同时检测的组
数和复孔就多了
具体用哪一种设计请结合自己的实际情况。

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八、大概流程（图片来自东仁说明书）

九、具体流程
1. 细胞计数：
对消化下来的细胞悬液进行细胞计数，一般计数2-3次取平均。

细胞计数板示意图

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2. 细胞铺板
根据预接种细胞数量+细胞计数结果调整细胞浓度，铺96孔板（加样均
匀），每孔100μL，将铺好细胞（对数期）的96孔板放入37℃培养箱培养。
（铺好了板，这个实验就成功了80%；没铺好，这个实验基本就是瞎做
了。）
铺板注意事项：
(1) 铺板要混匀：
a) 可以先往孔里加50μL培养基，再接种50μL细胞悬液；
b) 不时地混匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不
等，可以每接种几个孔就混匀一下；
c) 铺完板后，还可以轻敲板底，帮助细胞分散均匀。或者用振荡器摇板帮助
细胞分散。
(2) 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入
CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易
产生气泡，会干扰OD值读数
(3) 每次测定都需要在同一块板上设置调零孔。
(4) 培养板周围一圈孔容易蒸发，为了减少误差，培养板的四周只加无菌
PBS，而不作为指标检测孔。
(5) 加液时，枪尖贴着孔内壁慢慢加，避免出现气泡，它们会影响OD值的读
数。

3. 细胞处理
4-6h后观察到细胞贴壁后（细胞系快，原代慢），开始造模+操作分子+治疗
药物等相应处理（各回各家，各找各妈）。
如果细胞培养时是含药物的，那么调零孔里也要含有相应的药物——调零

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 孔就是除了不加细胞，其他啥都加。

4. 加入CCK-8
现在主流有三种做法：
(1) 直接往培养液加入10μL的CCK-8；
(2) 吸掉旧培养液，不加PBS清洗，再加入新配好的CCK-8；
(3) 吸掉旧培养液，PBS洗一遍，再加入新配好的CCK-8。
推荐做法：处理完毕后到达0、1、2、3、4、5天，吸掉旧培养液，每孔加入
10μL CCK-8+100μL培养基（按每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液，
配mix混合液，多配一孔，不要有气泡），继续培养2.5-3h左右（具体时间需
要摸索，说明书是1-4h）。
注意事项：
(1) 加入试剂速度要快，以避免试剂残留和加样速度不一所致反应时间不同造成
的显色误差。
(2) 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基
（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药
物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养
基中加入药物后的空白吸收即可；
(3) 培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，
白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量（～10^5
个细胞/孔）。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞，在加入
CCK-8培养1-4h后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决
定。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。对于
贴壁细胞，CCK-8的培养时间一般为1-4h，但在培养30min左右即可取出肉
眼观察显色程度（根据细胞种类而定，需要摸索一下条件）。

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 注意：CCK-8的的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。
(4) 如果OD值太低：①适当增加细胞数量；②延长加入CCK-8试剂后的染色时
间。

5. 酶标仪检测
用酶标仪测定在检测波长450nm和参比波长600nm的吸光度OD值（尚宝
的特殊，检测波长为490nm），具体怎么操作机器找师兄或者老师学习，傻
瓜式操作。
如果使用双波长检测，检测波长450nm-490nm，450nm最灵敏。参比波长
600-650nm。
如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，
但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
不一定要设定参比波长，CCK-8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比
波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而
消去，因此不会对检测造成影响。
若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1% SDS
溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24h内测定，吸光度不会发生
变化。

6. 数据处理

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 锐博 EdU 细胞增殖检测试剂盒 by 逛吃逛吃逛吃

一、产品简介
EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物。细胞以分裂
的方式进行增殖，期间会发生DNA的复制，此时，EdU可以代替胸腺嘧啶（T）
掺入正在复制的DNA分子中。锐博EdU细胞增殖检测试剂盒通过基于EdU与
Apollo®荧光染料的特异性反应，能够快速检测细胞DNA复制活性，从而快速准
确地检测细胞的增殖能力。
在酸谈实验室讲过使用BrdU掺入法检测细胞增殖。与EdU一样，BrdU是另
一种T类似物，在BrdU掺入DNA后，使用anti-BrdU抗体和荧光二抗可以检测到增
殖的细胞。然而，锐博试剂盒使用的是Apollo®染料去识别掺入DNA的EdU，这种
染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，即使单个增殖细胞也能准确
检测，灵敏度更高；而且无需剧烈的DNA变性（酸解、热解、酶解等），只需要
温和固定和透化细胞，能够较好地保护细胞形态，有效避免变性带来的样品损伤，
得到的染色图像更清晰完整，更准确，而且DNA整体结构和细胞内的抗原识别位
点得以较好的保存，可以叠加其他染料或抗体进行多重标记；由于是基于染料显
色的方法，无需抗原抗体反应，检测周期更短。同样，EdU不光能检测培养的细
胞，也能检测组织。
锐博的细胞增殖检测试剂盒有很多种，注意选择适合自己实验要求的盒子。
我这里介绍的试剂盒C10310-1/2/3适用于体外培养细胞的增殖检测，适合用荧
光显微镜或者激光共聚焦显微镜观察。三种试剂盒的差别为所含Apollo®荧光染
料不同，分别是Apollo®567、Apollo®643和Apollo®488，可根据仪器检测通道
及其它复染情况选择合适试剂盒进行实验。三种染料的波长信息见下表1，激发
光谱和发射光谱见图1。

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 表1. 配套染料的相关波长信息

图1. 三种染料激发光谱和发射光谱（虚线：激发光谱；实线：发射光谱）

注意！如果使用荧光显微镜检测，可选Apollo®488及Apollo®567，如果使用
激光共聚焦显微镜，三种染料均可。Apollo染色的化学反应会使GFP，EGFP，
R-PE失活，因此经Apollo染色后就无法直接在荧光显微镜或者激光共聚焦显微
镜下观察这些荧光蛋白了，但是可以用相应的抗体标记后进行间接的观察。
PS：Apollo®567标记的细胞为红色，Apollo®488标记的细胞为绿色，个人建
议使用Apollo®567，因为红色更加的明显，绿油油的不是太好。

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二、实验参数设置参考
表2. EdU培养基及染色反应液的使用参考量

表3. EdU孵育使劲设定参考

表4. Apollo®染色反应液的配制参考

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 表5. 细胞实验EdU孵育浓度及时间参考

三、需要自备的试剂
1×PBS（pH7.2~7.6）
渗透剂（含0.5% Triton X-100的PBS）
甘氨酸溶液(2mg/mL)（去离子水配置）
细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)

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四、实验流程
荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）
1. 细胞培养
取对数生长期的细胞，以每孔4×103至1×105细胞（可根据细胞大小、生长
速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密度）接种于96孔板中，培
养至正常生长阶段。个人觉得用96孔板做足矣，而且EdU重复性佳，一般
我选择分子操作后的细胞铺板，24h恢复正常形态后开始做。
也可以根据实验需要进行各种药物处理后再进行下步操作。
2. EdU标记
(1) 用完全培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量含EdU的
培养基（终浓度为50μM）；
注：短时间孵育（<2h）宜采用高浓度（10~50μM），长时间孵育（>24h）
宜采用低浓度（10μM），则需调整稀释比例为5000:1；
配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质，建议现配现用。
(2) 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2h，弃培养基；
注：最佳孵育时间和细胞周期相关（表3和表5），大多数肿瘤细胞系均可
采用2h孵育时间；
EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质
持续供给(表1)；
(3) PBS清洗细胞2次，每次5min。
注：清洗目的是将未掺入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型
而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。
注意啊，根据细胞贴壁能力选择晃的速度，细胞洗没了你就去哭吧。
3. 细胞固定
(1) 每孔加入50μL细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室温固定30min，弃

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 固定液；
注：低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持；也可采用其他方式进行细
胞固定。个人不建议用甲醇固定。
(2) 每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；
注：目的是中和过量的醛基，保证染色反应体系。当采用非醛类固定剂进
行细胞固定时可酌情省略此步骤；
(3) 每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；
(4) 每孔加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)，脱色摇床缓慢摇动渗透
10min；PBS清洗1次，5min。（TritonX-100比较粘稠，可以适当多吸一
点。在进行这个步骤时可以去配Apollo®染色反应液以及下面用到的东西
了。）
注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附
性较高，可能需要增强细胞膜通透性，因此需要延长渗透时间。
4. Apollo染色（从以下步骤开始，需避光操作，上锡纸~）
(1) 每孔加入100μL的1×Apollo®染色反应液（反应液的配制见表4），在脱色摇
床上室温避光孵育30min后，弃染色反应液；（染色反应液现配现用！）
注：染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜（染色液用量见表2）；孵
育时间可以进行适当调整，调整范围为10~30min。
(2) 加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)，脱色摇床缓慢摇动10min，重
复2~3次，弃渗透剂；
（可选）每孔每次加入100μL甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗2次，
每次5分钟。注：一般情况下可省略这一步，只有某些细胞对染料的吸附性
较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。
（可选）可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的染色，提前计划好
染色方案和检测通道，必要时进行相关的染料兼容性测试。

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1. DNA染色
(1) 用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，
避光保存；
(2) 每孔加入100μL 1×Hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床缓慢摇动
孵育30min后，弃染色反应液；
(3) 每孔每次加入100μL PBS清洗1~3次；
(4) 可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100μL PBS，4℃保存待用。

五、图像获取及分析
建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，
但不应超过3天。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂封片后4℃保
存并及时进行检测。
个人亲测，染色完成三周以后，荧光显微镜下观察仍获得较好结果，不过
还是建议染色完成后立即进行观测

六、问题解答
1. 什么样的信号才是真正的EdU阳性信号？
(1) Apollo染色信号与核染色信号（Hoechst33342或DAPI等核染信号）完全重
合，或者不核重合的信号明显强于胞浆上的信号（染料附着等）。
(2) 一般部分细胞上的信号呈现上述特征，而不是全部细胞。
2. 整个细胞都有EdU信号，或背景信号很强。
(1) 染色后洗涤不充分，可尝试加强洗涤解决。
(2) 染色过程中干片，导致染料粘附严重。
(3) 多聚甲醛固定时间过长而未使用甘氨酸中和。
(4) 没有阳性信号而曝光过度导致背景严重。

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3. 没有阳性信号。
(1) EdU处理时间太短导致没有阳性信号。体外细胞实验一般EdU处理时间宜为
细胞周期长度的1/5-1/10，阳性率约为20%-30%，体内实验需根据目的组织
细胞的增殖速度进行调整，若细胞增殖速度慢，需要采用长时间的EdU处理
时间。
(2) 染色过程干片等因素导致未染上信号。
(3) 对于阴性结果，可设置阳性对照（常见肿瘤细胞株如Hela EdU处理2小时或
EdU处理6小时以上的小鼠小肠上皮组织）以确认染色过程无误，对于目的
样品，可先使用较长的EdU处理时间以尽量先检测出信号，再根据具体信号
比例进行EdU处理时间的调整。
4. 细胞中表达有GFP，Apollo染色后检测不到GFP的荧光信号。
Apollo染料会造成GFP的失活，故Apollo染色后无法直接检测GFP，建议
可以使用GFP抗体进行复染以间接检测GFP。

（锐博的EdU试剂盒略贵。国货精品专卖碧云天有类似的产品，价格美好
很多。）

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 碧云天不同细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择

by 张汝朋

产品编号 产品名称 主要用途 Formazan 检 测 灵 检 测 检测指标 细胞毒性 试 剂 稳 大 批 量 使 用 便 直接检测

的水溶性 敏度 时间 定性 样 品 检 捷程度 细胞增殖

C0009 MTT 细胞增殖及 细 胞 增 殖 及 差 ++ 较长 A560- 高， + ++ + 否

细胞毒性检测试 细 胞 毒 性 检 600nm 细胞形态消

剂盒 测 失

C0035 C0036 WST-1 细胞增殖 细 胞 增 殖 及 好 +++ 较短 A420- 低， ++++ ++++ +++ 否

C0036L 及细胞毒性检测 细 胞 毒 性 检 480nm 细胞形态不

试剂盒 测 变

C0037 C0038 Cell Counting 细 胞 增 殖 及 好 +++ 较短 A420- 低， +++++ ++++ ++++ 否

C0039 C0040 Kit-8 细胞毒性检 480nm 细胞形态不

测 变

C0041 C0042 Enhanced Cell 细 胞 增 殖 及 好 ++++ 较短 A420- 低， +++++ ++++ ++++ 否

C0043 C0046 Counting Kit-8 细胞毒性检 480nm 细胞形态不

测 变

C0065 CellTiter-Lumi™ 细 胞 增 殖 及 不涉及 +++++ 极短 化学发光 细 胞 会 被 裂 ++++ +++++ +++++ 否

发光法细胞活力 细 胞 毒 性 检 解

检测试剂盒 测

C0068 CellTiter-Lumi™ 细 胞 增 殖 及 不涉及 +++++ 极短 化学发光 细 胞 会 被 裂 ++++ +++++ +++++ 否

Plus 发光法细胞 细 胞 毒 性 检 解

活力检测试剂盒 测

C0071 BeyoClick™ 细胞增殖 不涉及 +++++ 较短 绿色荧光 细 胞 需 被 固 ++++ +++ ++ 是

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 EdU-488 细胞增 定

殖检测试剂盒

C0075 BeyoClick™ 细胞增殖 不涉及 +++++ 较短 红色荧光 细 胞 需 被 固 ++++ +++ ++ 是

EdU-555 细胞增 定

殖检测试剂盒

C0078 BeyoClick™ 细胞增殖 不涉及 +++++ 较短 红色荧光 细 胞 需 被 固 ++++ +++ ++ 是

EdU-594 细胞增 定

殖检测试剂盒

C0081 BeyoClick™ 细胞增殖 不涉及 +++++ 较短 远红外荧 细 胞 需 被 固 ++++ +++ ++ 是

EdU-647 细胞增 光 定

殖检测试剂盒

C0085 BeyoClick™ 细胞增殖 不涉及 +++++ 较短 DAB 显 细 胞 需 被 固 ++++ +++ ++ 是

EdU 细胞增殖检 色 定

测 试 剂 盒 (DAB

法)

C0088 BeyoClick™ 细胞增殖 不涉及 +++ 较短 TMB 显 细 胞 需 被 固 ++++ +++ ++ 是

EdU 细胞增殖检 色 定

测 试 剂 盒 (TMB

法)

试剂盒选择的一些建议：
2. 关于CCK-8、Enhanced CCK-8和WST-1法：
如果对细胞增殖或细胞毒性的检测要求灵敏度很高，并且希望比较便捷，在
研究经费许可的条件下，建议选择使用Enhanced Cell Counting Kit-8 (C0041、
C0042、C0043或C0046)。如果既希望检测灵敏度很高并且检测比较便捷，但又
希望价格不是太贵，可以选择选择Cell Counting Kit-8 (C0037、C0038、C0039
或C0040)，或选择WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(C0035、C0036或
C0036L)。

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3. 关于CTL和CTL Plus：
如果有检测多孔板的化学发光仪器，并且对于检测的灵敏度要求特别高或者
希望进行高通量检测，推荐使用CellTiter-Lumi™发光法细胞活力检测试剂盒
(CTL，C0065)或CellTiter-Lumi™ Plus发光法细胞活力检测试剂盒(CTL Plus，
C0068)，这两个产品已经广泛用于高通量的药物筛选。CTL和CTL Plus最大的优
点在于检测灵敏度特别高，可以检测到低至约12个细胞，并且检测速度非常快(约
十分钟就可完成一个96孔板的检测)，特别适合用于高通量检测。CTL和CTL Plus
两者相比，CTL Plus的检测上限更高，线性范围更宽，并且发光值随时间的稳定
性也更高一些。经费非常充裕时推荐使用CTL Plus，但CTL在96孔板中单孔的细
胞数量不超过3万时也能满足常规的高通量检测需要。

4. 关于BeyoClick™系列产品：
如果需要直接检测细胞增殖，推荐使用基于BrdU掺入法的升级版本EdU掺
入法的BeyoClick™系列产品(C0071、C0075、C0078、C0081、C0085和C0088)。
其中C0071、C0075、C0078和C0081是荧光法，激发波长分别为488、555、594
和647nm，非常适合用于直观的荧光显微镜定性检测或流式细胞仪和荧光酶标仪
的定量检测，也非常适合用于高通量的高内涵筛选(High-Content Screening,
HCS)。C0085是DAB显色法，可用普通显微镜进行观察和拍照；C0088是TMB
显色法，可通过比色法进行定量检测。BeyoClick™系列产品不仅能用于培养细
胞的增殖检测，也能用于活体组织中的细胞增殖检测。BeyoClick™系列产品用
于活体组织的增殖检测时，需要预先掺入EdU。基于EdU掺入法的细胞增殖检测
的效果等同于最经典的[3H]thymidine掺入方法，检测的是DNA的复制，但无需使
用放射性同位素，而CCK-8、MTT等方法是比较间接的用于检测细胞增殖的方法，
并且不能用于检测活体组织中细胞的增殖。

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5. 关于MTT法：
如果对细胞增殖或细胞毒性的检测要求不是很高，从经济角度可以选择MTT
细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(C0009)。该试剂盒可以满足常规的细胞增殖或
细胞毒性的检测，主要缺点是形成的formazan水溶性很差，需要额外的步骤溶解
formazan。另外一个缺点是MTT不太稳定，保存过程中很容易氧化变质，导致无
法进行正常的检测。CCK-8、Enhanced CCK-8和WST-1法都是MTT法的升级方
法。

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 细胞增殖 Marker by 走着走着花就开了

一、与细胞增殖直接相关的Marker
1. PCNA（增殖细胞核抗原、周期素）：（下图来源于Wikipedia）

https://en.wikipedia.org/wiki/Proliferating
PCNA蛋白三维结构图（图片来源于Wikipedia）
a) 分子量36KDa，定位于核内。
b) 主要功能：
1）为DNA聚合酶δ的辅助蛋白；
2）参与DNA损伤的修复；
3）参与细胞周期的调控；
4）和p21相互作用。P21是CDK的抑制因子，因此PCNA通过和p21相互作
用，间接影响细胞周期和增殖。
c) 在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA：
可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明
显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；
不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1

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 期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M
期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为
评价细胞增殖状态的一个指标。
d) PCNA在DNA修复和复制过程中发挥了作用，这会导致结果的“假阳性”—
—某些没有发生增殖，但是发生了DNA修复的细胞，也会上调PCNA的表达，
这会让研究者误以为细胞发生了增殖。

2. Ki-67（细胞核相关抗原）：（下图来源于Wikipedia）

Ki-67蛋白三维结构图（图片来源于Wikipedia）
a) 分子量345-395KD，核蛋白双分子，在维持细胞增殖中发挥至关重要的作用。
b) Ki-67存在于非G0期的所有细胞中，开始于G1中期，S至G2期呈逐渐上升趋
势，到M期达到峰值，在M末期，被迅速降解。Ki-67标记指数（LI）
，即组织
中Ki-67染色比例，预示着细胞的生长信息。
c) 主要功能：
1）推测Ki-67可以调节细周期；
2）Ki-67能和DNA或者RNA发生相互结合；
3）Ki-67在细胞分裂期参与合成核糖体。

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3. MCM（minichromasome maintenance protein，微小染色体维持蛋白）。

PMID: 26222030

a) MCM只存在于真核细胞中。MCM在有丝分裂的晚期和G1期与染色质紧密
结合，在S期和G2期分开。MCM蛋白只在细胞的增殖期才能检测到，它的
表达在G1/S转换点达到峰值，在分化期和静息期时，表达缺失，因此可以作
为细胞增殖的特殊标志物。当细胞进入G0期和分化、衰老时，MCM表达的
水平下降至不能检出，这确保了DNA复制在每次细胞周期中只进行1次。
b) 真核细胞中MCM蛋白通常以MCM2~7六聚体形式发挥生物学功能，称为
MCM复合物，是由MCM2~7蛋白以1:1:1:1:1:1的比例形成一种异六聚体复
合物(MCM2-MCM6-MCM4-MCM7- MCM3-MCM5)。
c) 主要功能：
MCM蛋白是复制前复合物(pre-RC)的一部分，在真核细胞DNA复制起始中
发挥重要作用。
（参考二十四型细胞增殖、百度百科等）

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二、肿瘤干细胞相关分子标志物
卵巢癌干细胞：CD133（DOI:10.1158/0008-5472）、乙醇脱氢酶
（DOI:10.1158/1078-0432）、CD44/CD117（DOI:10.1158/0008-5472）、
CD24（DOI:10.1038/onc.2010.35）

（表格摘自汉恒生物网站）

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三、抑癌基因
1. 细胞信号转导和表观遗传学调控，如APC参与信号转导，NFl催化RNAs失活
等。
2. 细胞周期负调控，如Rb、p53、CDKN2A基因参与细胞周期调节。
3. 负调控转录因子，如WT、DCC等基因。
4. 与发育和干细胞增生相关调控，如APC、Axin、VHL、WTl等基因。
5. DNA错配修复，如MSH、MLH等基因

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