·234· 中 国 药 品 标 准 Drug Standards of China 2020，21（ 3）

苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素检查法研究
1 1 1 2 1*
王尧尧 ，王贺 ，谢益晖 ，周杨 ，顾德周
（ 1. 扬子江药业集团有限公司，江苏 泰州 225321；
2. 江苏省畜产品质量检验测试中心 ，江苏 南京 210036）

摘要 目的： 建立苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素的常规检测方法 。方法： 按《中国药典 》2015 年版通则 1143 细

菌内毒素检查法进行，采用不同厂家的鲎试剂对不同批号的苯磺顺阿曲库铵分别进行干扰试验 。结果： 在验
－1 －1
证条件下，供试品用稀释剂Ⅰ溶解制备成 5 mg·mL ，并用稀释剂Ⅰ稀释 40 倍至 0. 125 mg·mL 后再用
BET 水稀释 2 倍至 0. 062 5 mg·mL － 1 ，对细菌内毒素检查法无干扰作用。 结论： 建立的方法用于检查苯磺
顺阿曲库铵的细菌内毒素可行。
关键词： 苯磺顺阿曲库铵； 细菌内毒素； 凝胶法； 干扰试验
中图分类号： Ｒ 921. 2 文献标识码： A 文章编号： 1009 － 3656（ 2020） － 3 － 0234 － 5
doi： 10. 19778 / j. chp. 2020. 03. 010

Investigation on bacterial endotoxin test of cisatracurium besilate

WANG Yaoyao1 ，WANG He1 ，XIE Yihui1 ，ZHOU Yang2 ，GU Dezhou1*
（ 1． Yangtze Ｒiver Pharmaceutical Group Co． ，Ltd，Taizhou 225321，China；
2 Jiangsu Quality Inspection and Testing Center for Animal Products，Nanjing 210036，China）

Abstract Objective： To establish a bacterial endotoxin test method for cisatracurium besilate. Methods： The
bacterial endotoxin test was carried out according to general notice 1143 of Chinese Pharmacopoeia 2015. The
Tachypieus Amebocyte Lysates（ TALs） from the different manufacturers were used to perform the interference tests on
different batches of cisatracurium besilate. Ｒesults： The sample was dissolved to 5mg·mL － 1 with thinner Ⅰ，and
the solution was diluted for 40 times to 0. 125 mg·mL － 1 with thinner Ⅰ，then the solution was diluted for 2 times
to 0. 062 5 mg·mL － 1 with water for BET under the validated condition. There was no interference on the concen-
tration of 0. 062 5 mg·mL － 1 . Conclusion： The established method can be used for bacterial endotoxin test of ci-
satracurium besilate.
Key words： cisatracurium besilate； bacterial endotoxin； gel method； interference test

苯磺顺阿曲库铵属于一种新型苄异喹啉类中效
非去极化肌松药，是一种高度选择性、短效非去极化
［1-3］
的神经-肌肉接头阻断剂
菌内毒素检查有抑制作用，会螯合鲎试剂中的二价
阳离子，导致鲎试剂中的二价阳离子浓度不足 ，对细
菌内毒素与鲎试剂的反应造成干扰 。加入适量的二
2+
价金属离子（ Mg ） ，来消除苯磺顺阿曲库铵对内毒
［4］
素检查 的 干 扰 作 用 。 按 照《中 华 人 民 共 和 国 药
。苯磺顺阿曲库铵对细 典》（ 以下简称《中国药典 》） 2015 年版通则 1143 细
菌内毒素检查法对苯磺顺阿曲库铵进行细菌内毒素
检查法的研究，为建立该品种的细菌内毒素检查法
提供科学依据。

第一作者简介： 王尧尧，大学本科； 研究方向： 药品质量分析。Tel： 19975155935； E-mail： wangyaoyao. yangzijiang. com

* 通讯作者简介： 顾德周，硕士研究生，中级工程师； 研究方向： 药品质量分析。Tel： 13810085366； E-mail： gudezhou@ yangzi-
jiang. com
中 国 药 品 标 准 Drug Standards of China 2020，21（ 3） ·235·
1 材料 150800-201601，规格 9000 EU / 支 ） ； 细 菌 内 毒 素 检
1. 1仪器 查用水 （ Water for Bacterial Endotoxins Test，以下简
TAL-40D 型干式恒温器 （ 湛江安度斯生物有限 称 BET 水 ） ，湛 江 安 度 斯 生 物 有 限 公 司，批 号
公司） ； IKA MS3 型自动漩涡混合器 （ 广州仪科实验 1812140，规格 50 mL / 瓶） ； 稀释剂Ⅰ（ 江安度斯生物
室技术有限公司 ） ； FED400 型干燥箱 （ 德国宾德公 有限公司，批号 1805240，规格 4 mL / 支） 。
司） ； XSE205DU 型电子天平（ 梅特勒-托利多公司 ） ；
其他器皿包括试管、微量移液器及微量移液器配套 2 方法与结果
的枪头（ 无热原） 等。 鲎试剂灵敏度复核试验
2. 1
1. 2 药品与试剂 根据 4 批鲎试剂灵敏度的标示值 （ λ ） ，将细菌
苯磺顺阿曲库铵（ Sicor Societa' Ltaliana Cortico- 内毒素工作标准品用 BET 水溶解，置漩涡混合器上
steroidi S. Ｒ. L， 批 号 321845-1812001、321845- 混匀 15 min，然后制成浓度为 2 λ、λ、0. 5 λ 和 0. 25 λ
1812002、321845-1812003） ； 鲎试剂 （ 湛江安度斯生 四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在漩
－1
物 有 限 公 司，0. 25 EU · mL ，批 号 1810243； 涡混合器上混合 30 s，阴性对照管（ Negative control，
0. 125 EU·mL － 1 ，
批号 1811261； 福州新北生化工业 NC） ，按《中国药典 》2015 年版通则 1143 细菌内毒
－1
有 限 公 司，0. 25 EU · mL ，批 号 18040712； 素检查法复核本试验所用鲎试剂的灵敏度，结果 4
0. 125 EU·mL － 1 ，批 号 18090512； 规 格 0. 1 mL / 批鲎试剂灵敏度的测定值 （ λ c ） 均在 0. 5 ～ 2. 0 λ 范
支） ； 细菌内毒素工作标准品 （ 中国食品药品检定研 围内，符合《中国药典 》规定，可用于细菌内毒素检
究院，批 号 150601-201885，规 格 80 EU / 支； 批 号 查，详见表 1 和表 2。

－1
表1 鲎试剂灵敏度复核结果（ 0. 25 EU·mL ）
Tab. 1 Confirmation test of labeled lysate sensitivity

批号 内毒素浓度（ Concentration of endotoxin） / （ EU·mL － 1 ） λc /

NC
（ Batch of TAL） 0. 5 0. 25 0. 125 0. 062 5 （ EU·mL － 1 ）
1810243 + + + + + + + + － － － － － － － － － － 0. 25
18040712 + + + + + + － + － － － － － － － － － － 0. 297

－1
表2 鲎试剂灵敏度复核结果（ 0. 125 EU·mL ）
Tab. 2 Confirmation test of labeled lysate sensitivity

批号 内毒素浓度（ Concentration of endotoxin） / （ EU·mL － 1 ） λc /

NC
（ Batch of TAL） 0. 25 0. 125 0. 062 5 0. 031 2 （ EU·mL － 1 ）
1811261 + + + + + + + + + + + + － － － － － － 0. 062 5
18090512 + + + + + + + + + + + + － － － － － － 0. 062 5

2. 2 供试品最大有效稀释倍数的确定 内毒素检查。
我司的内控标准为每 1 mg 苯磺顺阿曲库铵中 2. 3 预干扰试验
含内毒素的量应小于 2. 0 EU。称取供试品适量，加 －1
用灵敏度为 0. 25 EU·mL 的鲎试剂，对稀释
－1
稀释剂Ⅰ溶解，配成初始浓度为 5 mg·mL 的供试 －1
倍数不超过 320 倍 （ 即不低 0. 015 6 mg·mL ） 的
品溶液，按《中国药典 》2015 年版通则 1143 细菌内 不同浓度的溶液进行预干扰试验，以确定样品的不
毒素检查法的规定，MVD = cL / λ，计算各灵敏度鲎 干扰浓度。称取供试品适量，加稀释剂Ⅰ适量使溶
试剂对应的样品最大有效稀释倍数 （ Maximum Valid －1
解，制备成初始浓度为 5 mg·mL 的溶液，用稀释
Dilution，MVD） ： MVD0. 25 = 40 （ 0. 125 mg · mL － 1 ） 、 剂Ⅰ分别稀至 0. 25、0. 125、0. 062 5、0. 031 2 mg ·
－1
MVD0. 125 = 80 （ 0. 062 5 mg · mL ） 、MVD0. 06 = 160 mL － 1 作为 2 倍的供试品溶液备用。 再用 BET 水分
（ 0. 031 2 mg·mL － 1 ） 、MVD0. 03 = 320（ 0. 015 6 mg· 别稀至 0. 125、
0. 062 5、 0. 015 6 mg·mL － 1
0. 031 2、
mL － 1 ） ； 在不超过对应 MVD 的稀释倍数下进行细菌 （ 即分别稀释 40 倍、
80 倍、 320 倍 ） 作为供试
160 倍、
·236· 中 国 药 品 标 准 Drug Standards of China 2020，21（ 3）
品阴性对照溶液。对这些浓度的苯磺顺阿曲库铵溶 性对照溶液（ Positive product control，PPC） ，同时做 2
液进行细菌内毒素检测预干扰试验，将供试品阴性 支阳性对照管 （ Positive control，PC） 及 2 支阴性对
对照溶液（ Negative product control，NPC） ，供试品阳 照管 NC，结果见表 3。

表3 样品预干扰试验结果
Tab. 3 The results of pre-interference test

鲎试剂 供试液名称 供试品浓度（ Concentration of sample） / （ mg·mL － 1 ）

PC NC
批号（ Batch of TAL ） （ The test liquid） 0. 125 0. 062 5 0. 031 2 0. 015 6
1810243 NPC － － － － － － － － + + － －
PPC + + + + + + + +
18040712 NPC － － － － － － － － + + － －
PPC + + + + + + + +

由表 3 结果知，供试品溶液 （ 原液 ） 的稀释浓度 mg·mL － 1 ） 充分振荡使溶解，分别制备成初始浓度

C 在 0. 015 6 ～ 0. 125 mg·mL － 1 时，对鲎试剂与细菌 －1
为 5 mg · mL 的 溶 液，用 稀 释 剂 Ⅰ 稀 释 40 倍 至
内毒素反应无干扰作用，且试验结果有效。 则可选 0. 125 mg·mL － 1 后再用 BET 水稀释 2 倍至 0. 062 5
－1
用灵敏度不低于 0. 25 EU·mL 的鲎试剂进行正式 mg·mL － 1 。将细菌内毒素标准品用 BET 水逐步配
干扰试验。 制 成 5 个 浓 度 的 标 准 品 溶 液，即 4 λ （ 0. 5 EU ·
2. 4 干扰试验 mL － 1 ） 、2 λ （ 0. 25 EU · mL － 1 ） 、λ （ 0. 125 EU ·
根据预 干 扰 试 验 结 果，选 用 灵 敏 度 为 0. 125 mL － 1 ） 、
0. 5 λ（ 0. 006 25 EU·mL － 1 ） 、0. 25 λ （ 0. 0312
EU·mL － 1 的鲎试剂进行正式干扰试验。 称取三个 EU·mL － 1 ） 。按细菌内毒素检查法进行干扰试验，
批号的苯磺顺阿曲库铵，加稀释剂Ⅰ适量 （ V = M /5 结果见表 4。

表4 样品干扰试验结果
Tab. 4 The results of interference test

鲎试剂 供试品批号 内毒素浓度（ Concentration of endotoxin） / （ EU·mL － 1 ） λ c ，Et /

NPC NC
批号（ Batch of TAL ） （ Batch of sample） 0. 25 0. 125 0. 062 5 0. 031 2 （ EU·mL － 1 ）
1811261 BET 水 + + + + － － － － － － － － λ c = 0. 125
321845-1812001 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125
BET 水 + + + + + + － － － － － － λ c = 0. 062 5
321845-1812002 + + + + + + + + + + + + － － － － Et = 0. 062 5
BET 水 + + + + + + － － － － － － λ c = 0. 062 5
321845-1812003 + + + + + + + + + + + + － － － － Et = 0. 062 5
18090512 BET 水 + + + + + + － － － － － － λ c = 0. 062 5
321845-1812001 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125
BET 水 + + + + ﹢﹣ － － － － － － λ c = 0. 088
321845-1812002 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125
BET 水 + + + + + + － － － － － － λ c = 0. 062 5
321845-1812003 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125

－1 －1
λc = log （ ∑Xs /2） 、Et = log （ ∑Xt /4） 。 照系列的结果 λ c 在 0. 5 λ ～ 2 λ 之间 （ 包括 0. 5 λ 和
其中： Xs，Xt 分别为鲎试剂标示灵敏度对照溶 2 λ） ，符合鲎试剂灵敏度复核实验要求 ，试验有效 。
液和干扰试验溶液的反应终点浓度的对数值 。 两个 厂 家 鲎 试 剂 干 扰 试 验 系 列 的 结 果 Et 在
由表 4 结果可知 ，平行 3 批次干扰试验中 ，阴 0. 5 λ ～ 2 λ之间 （ 包 括 0. 5 λ 和 2 λ ） ，符 合 规 定 。 说
－1
性对照溶液 NC、供试品阴性对照溶液 NPC 的所有 明供试品使用稀释剂Ⅰ溶解制成 5 mg·mL ，用
平行管均为 阴 性 ； 两 个 厂 家 鲎 试 剂 标 示 灵 敏 度 对 稀释剂Ⅰ稀释 40 倍后用 BET 水稀释 2 倍 ，采用灵
中 国 药 品 标 准 Drug Standards of China 2020，21（ 3） ·237·
－1
敏度 λ 为 0. 125 EU· mL 的 鲎 试 剂 进 行 试 验 无 另一份加入内毒素溶液和稀释剂Ⅰ使溶解，得含内
－1
干扰 ，可用于细菌内毒素检查 。 毒 素 浓 度 为 20 EU · mL 的 供 试 品 浓 度 为
2. 5 样品处理方法的有效性验证 5 mg·mL － 1 的溶液，同干扰试验中确定的稀释倍数
由于苯磺顺阿曲库铵供试品的制备过程中采用 稀释，最终得未加内毒素的供试品阴性对照溶液 、预
了稀释剂Ⅰ，为考察供试品制备过程稀释剂Ⅰ对供 加内毒素终浓度为 2 λ 的溶液。 取两份溶液等比例
试品本底细菌内毒素不存在破坏或不影响本底细菌 混合制成含内毒素终浓度为 λ 的溶液、取未加内毒
内毒素的检出，通过在供试品中预先添加一定浓度 素的供试品阴性对照溶液和含内毒素终浓度为 λ
的细菌内毒素（ 添加内毒素的体积小于供试品体积 的溶液等比例混合制成含内毒素终浓度为 0. 5 λ 的
的 10% ） ，按供试液制备方法制备后，最终得一系列 溶液、取未 加 内 毒 素 的 溶 液 和 含 内 毒 素 终 浓 度 为
含预加 内 毒 素 浓 度 为 2 λ、λ、0. 5 λ、0. 25 λ 的 溶 液。 0. 5 λ 的溶 液 等 比 例 混 合 制 成 含 内 毒 素 终 浓 度 为
制备方法如下： 平行称取供试品两份，其中一份用稀 0. 25 λ 的溶液。再用灵敏度为 0. 125 EU·mL － 1 的
－1
释剂Ⅰ溶解，得供试品浓度为 5 mg·mL 的溶液。 鲎试剂进行试验。结果见表 5。

表5 样品处理方法的有效性验证结果
Tab. 5 The effectiveness validation results of sample preparation met

鲎试剂 供试品批号 内毒素浓度（ Concentration of endotoxin） / （ EU·mL － 1 ） λ c ，Et /

NPC NC
批号（ Batch of TAL ） （ Batch of sample） 0. 25 0. 125 0. 062 5 0. 031 2 （ EU·mL － 1 ）
1811261 BET 水 + + + + － － － － － － － － λ c = 0. 125
321845-1812001 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125
BET 水 + + + + + + － － － － － － λ c = 0. 0625
321845-1812002 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125
BET 水 + + + + + + － － － － － － λ c = 0. 0625
321845-1812003 + + + + + + + + － － － － － － － － Et = 0. 125
18090512 BET 水 + + + + － － － － － － － － λ c = 0. 125
321845-1812001 + + + + － － － － － － － － － － － － Et = 0. 25
BET 水 + + + + － － － － － － － － λ c = 0. 125
321845-1812002 + + + + + + － － － － － － － － － － Et = 0. 177
BET 水 + + + + － － － － － － － － λ c = 0. 125
321845-1812003 + + + + － － － － － － － － － － － － Et = 0. 25

由表 5 结果可知，平行 3 批次有效性试验中，阴 都为阴性，阳性对照溶液 PC 的平行管都为阳性，供

性对照溶液 NC、供试品阴性对照溶液 NPC 的所有 试品阳性溶 液 PPC 的 平 行 管 都 为 阳 性 时，试 验 有
平行管均为阴性； 两个厂家鲎试剂标示灵敏度对照 效。供试品阴性对照溶液 NPC 的平行管都为阴性，
系列 的 结 果 λc 在 0. 5 λ ～ 2 λ 之 间 （ 包 括 0. 5 λ 和 供试品溶液符合规定。
2 λ） ，符合鲎试剂灵敏度复核实验要求，试验有效。
两个厂家鲎试剂干扰试验系列的结果 Et 在 0. 5 λ ～ 3 讨论
2 λ 之间（ 包括 0. 5 λ 和 2 λ） ，说明供试品制备过程能 由于苯磺顺阿曲库铵易与二价阳离子发生螯合
有效地将供试品中的内毒素提取出 。 作用，进而导致鲎试剂活性降低，对内毒素检查有一
2. 6 样品细菌内毒素检查 定的干扰作用，故考虑用补足二价阳离子的方法排
称取 3 个批号的供试品适量，加稀释剂Ⅰ溶解， 除供试品对鲎试剂的干扰。首先考察供试品的干扰
－1
制成 5 mg·mL 的供试品溶液。 分别用稀释剂Ⅰ 程度，初步确定供试品的不干扰稀释倍数 ，以便初筛
［5］
稀释 40 倍后再用 BET 水稀释 2 倍，使用 λ 为 0. 125 出对检查无干扰的供试品浓度范围 。 预试验结
－1
EU·mL 的鲎试剂，按所建立方法进行细菌内毒素 果表明，供试品稀释至 40 倍到 320 倍时无干扰作
检查，结果见表 6。 用，可以选择 80 倍进行正式干扰试验。
由表 6 结果可知，阴性对照溶液 NC 的平行管 正式干 扰 试 验 是 确 定 样 品 在 该 浓 度 下 对 细
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菌内毒素检测试验 有 无 干 扰 ，为 能 否 使 用 细 菌 内 0. 5 λ ～ 2 λ 之 间 （ 包 括 0. 5 λ 和 2 λ ） ，说 明 供 试 品
［6-7］
毒素检 查 法 提 供 依 据 。 在 正 式 干 扰 试 验 中， 对细菌内毒素检测 试 验 无 干 扰 ，可 用 于 细 菌 内 毒
三批次 的 苯 磺 顺 阿 曲 库 铵 干 扰 系 列 结 果 Et 在 素检测 。

表6 样品细菌内毒素检查结果
Tab. 6 The bacterial endotoxin test results of samples

鲎试剂批号 供试品批号 供试品浓度（ Concentration of sample） /

NPC PPC PC NC
（ Batch of TAL） （ Batch of sample） （ mg·mL － 1 ）

1901212 321845-1812005 10 － － + + + + － －
321845-1812004 10 － － + + + + － －
321845-1812006 10 － － + + + + － －
18090512 321845-1812005 10 － － + + + + － －
321845-1812004 10 － － + + + + － －
321845-1812006 10 － － + + + + － －

样品处理有效性试验是通过在供试品中预先添 um bromide pre-injection for treating cardiovascular disease in 45

2015，24（ 21） ： 207
cases［J］． China Pharm，
加一定浓度的细菌内毒素，按供试液制备方法处理
［3］ 陈忠华，周其富，陈念平，等 . 预注苯磺顺阿曲库铵对芬太尼
后，最终得一系列含预加内毒素浓度为 2 λ、λ、0. 5 λ、
诱发咳嗽的影响［J］． 中国药学杂志，2014，49（ 6） ： 509
0. 25 λ 的溶液。预先添加内毒素的供试品干扰试验 CHEN ZH，ZHOU QF，CHEN NP，et al． Effects of intravenous
系列的 结 果 Et 在 0. 5 λ ～ 2 λ 之 间 （ 包 括 0. 5 λ 和 cisatracurium besilate pretreatment on fentanyl-induced cough［J］．
2 λ） ，可认为供试液制备过程对供试品本底细菌内 Chin Pharm J，2014，49（ 6） ： 509
［4］ 李树馀 . 注射用顺苯磺酸阿曲库铵细菌内毒素检测动态浊度
毒素不存在破坏作用。
34（ 2） ： 340
法的研究［J］． 药物分析杂志，2014，
本次试验结果表明，苯磺顺阿曲库铵加稀释剂
LI SY. Study on bacterial endotoxin test of cisatracurium besilate
－1
Ⅰ溶解，制成 5 mg·mL 的供试品溶液。用稀释剂 for injection using the dynamic turbidity method［J］． Chin J Pharm
Ⅰ稀释 40 倍后再用 BET 水稀释 2 倍，用灵敏度为 Anal， 34（ 2） ： 340
2014，
0. 125 EU · mL － 1 的鲎试剂进行检查可行，具 有 简 ［5］ 陈青连，姚振，冯雅 . 苯磺顺阿曲库铵注射液细菌内毒素检查
法研究［J］． 中国药业， 28（ 9） ： 42
2019，
便、灵敏、快速、准确等优点，可满足苯磺顺阿曲库铵
CHEN QL，YAO Z，FENG Y. Bacterial endotoxin test for cisatra-
细菌内毒素的质量控制的要求。
28（ 9） ： 42
curium besilate injection［J］． China Pharm，2019，
［6］ 张横，蔡彤，高华 . 盐酸莫西沙星注射液细菌内毒素检查方
参考文献 28（ 12） ： 1298
法学研究［J］． 中国药事，2014，
［1］ 张璐，强淑萍，张云静，等 . 注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质 ZHANG H，CAI T，GAO H. Study of bacterial endotoxin test for
的 LC-MS 初步鉴定［J］． 中国药科大学学报，2013，44（ 1） ： 65 moxifloxacin hydrochloride injection［J］． Chin Pharm Aff，2014，
ZHANG L，QIANG SP，ZHANG YJ，et al． Preliminary identifica- 28（ 12） ： 1298
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by LC-MS［J］． J China Pharm Univ 2013，44（ 1） ： 65 的方法学研究［J］． 中国药学杂志， 45（ 2） ： 151
2010，
［2］ 骆菲菲，马骏 . 苯磺顺阿曲库铵复合哌库溴铵预注用于伴心 CAI T，ZHANG GL，LI B，et al． Study of bacterial endotoxin test
血管疾病患者手术 45 例［J］． 中国药业，2015，24（ 21） ： 207 on 84 drugs for injection［J］． Chin Pharm J， 45（ 2） ： 151
2010，
LUO FF，MA J. Cisatracurium besilate combined with pipecuroni- （ 收稿日期： 2019-11-12）