đề cương kiểm nghiệm

MỤC LỤC
BÀI 1: ĐẠI CƯƠNG TPCN
1.1. So sánh sự giống nhau và khác nhau giữa thực phẩm chức năng với thuốc.
Phân tích ví dụ minh hoạ.(TRANG 4)
1.2. Phân tích các yêu cầu chung của thực phẩm chức năng và cho các ví dụ minh họa. (TRANG 7)
1.3. So sánh sự giống và khác nhau giữa thực phẩm truyền thống, thực phẩm chức năng.
Phân tích ví dụ minh họa.(TRANG 10)
1.4. Phân tích các hướng nghiên cứu thực phẩm chức năng và cho ví dụ minh họa. (TRANG 12)
BÀI 2: QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG TPCN

2.1. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật. (TRANG 15)
a. Trình bày cách phân loại và hệ thống quản lý nhà nước của chế phẩm này?
b. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở với sản phẩm này?
2.2. Sinh viên lựa chọn 1 chế phẩm thực phẩm chức năng bất kỳ chứa nhiều loại vitamin: (TRANG 22)
a. Trình bày cách phân loại và hệ thống quản lý nhà nước của sản phẩm này?
2.3. Sinh viên lựa chọn 1 chế phẩm thực phẩm chức năng dùng theo đường sonde chứa chất khoáng, vitamin,
protein. (TRANG 28)
2.4. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm thực phẩm chức năng dinh dưỡng dùng cho người tiểu đường chứa
protein, carbohydrat:(TRANG35)
BÀI 3: LẤY MẪU VÀ XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH

3.1. So sánh điểm giống nhau và khác nhau của phương pháp xử lí mẫu bằng chưng cất, chiết lỏng- lỏng và
chiết pha rắn ? (41)
3.3. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe X có thành phần như sau: (43)
Đảng Sâm 250 mg Phục Thần 250 mg Toan táo nhân sao 250 mg
Viễn Chí 150 mg Tá dược vừa đủ
Cách đóng gói: Hộp 3 vỉ x 100 viên Dạng bào chế: Viên nang mềm
Đề xuất phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu để phân tích chế phẩm này.
3.4. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe X có thành phần công thức sau: (47)
• Gừng tươi nguyên chất • Quế chi
• Đại hồi • Địa liền
Cách đóng gói: Hộp 1 chai x 330ml
Đề xuất phương pháp lấy mẫu và xử lí mẫu để phân tích chế phẩm này
BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VẬT LÝ VÀ HÓA LÝ

4.1. so sánh điểm giống nhau và khác nhau của phương pháp xác định hàm lượng nước bằng phương pháp cất
với dung môi và phương pháp karl fischer (48)
4.2. Chỉ ra và phân tích các kỹ thuật quan trọng của phương pháp xác định độ nhớt, độ cứng và độ bào mòn.
(51)
1
4.5:So sánh trong phân tích của phương pháp sắc kí khí và sắc kí lỏng hiệu năng cao.(54)
4.6. Kĩ thuật tạo dẫn xuất trong sắc ký khí (57)
BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
5.1: Sinh viên tự lựa chọn một chế phẩm thực phẩm chức năng đang được lưu hành trên thị trường. Viết quy
trình xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. (58)
5.2. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm thực phẩm chức năng đang được lưu hành trên thị trường. Viết quy
trình xác đinh vi khuẩn E.coli và Salmonella bằng phương pháp MNP.(60)
5.3. Các phương pháp phát hiện và định lượng E.coli trong thực phẩm chức năng. Nêu ưu nhược điểm của các
phương pháp.(63)
BÀI 6: XÁC ĐỊNH CÁC CARBOHYDRATE

6.1. Sinh viên tự lựa chọn 1 chế phẩm thực phẩm chức năng chứa chất xơ hòa tan. Trình bày các phương
pháp phân tích hoạt chất này trong sản phẩm.(68)
6.2. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm thực phẩm chức năng chứa oligosaccharide: Trình bày các
phương pháp phân tích hoạt chất hoạt chất này trong sản phẩm (69)
6.4. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm thực phẩm chức năng chứa tinh bột.Trình bày các phương
pháp phân tích hoạt chất này trong sản phẩm (70)
BÀI 7: XÁC ĐỊNH FLAVONOID

7.1. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm tpcn chứa quercetin: trình bày các phương pháp phân tích hoạt chất
này trong sản phẩm. Viết quy trình định lượng bằng pp quang phổ (74)
7.3. Sinh viên tự lựa chọn 01 chế phẩm thực phẩm chức năng chứa flavonoid: Trình bày các phương pháp
phân tích hoạt chất này trong sản phẩm. (76)
BÀI 8: XÁC ĐỊNH CÁC ACID AMIN VÀ PROTEIN
8.1. Tự chọn một thực phẩm chức năng bất kỳ có thành phần chính là một đến vài acid amin và/hoặc protein.
(80)
A. Dựa vào đặc điểm cấu trúc, tính chất lý hóa của thành phần chính: chỉ ra lưu ý chung khi xác định thành
phần này trong sản phẩm, liệt kê các phương pháp có thể sử dụng để xác định thành phần đó trong sản phẩm.
B. Chọn một phương pháp ở ý a: chỉ ra ưu nhược điểm của phương pháp đó, liệt kê các bước tiến hành, lưu ý
về phương pháp, kỹ thuật, điều kiện tiến hành.
8.3. Giải thích đặc điểm chung và đặc điểm riêng của các acid amin, protein có liên quan đến lựa chọn, sử
dụng các phương pháp phân tích acid amin và protein. (83)
BÀI 9: XÁC ĐỊNH CÁC VITAMIN
9.1. Nhóm sv tự chọn một sản phẩm thực phẩm chức năng bất kỳ b có thành phần chính là một đến vài
vitamin. (85)
A. Dựa vào đặc điểm về cấu trúc, tính chất lý hóa của thành phần chính: chỉ ra những lưu ý chung khi xác
định thành phần này trong sản phẩm; liệt kê các phương pháp có thể sử dụng để xác định thành phần đó
trong sản phẩm b.
B. Chọn một phương pháp ở ý (1): chỉ ra ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đó khi áp dụng để xác
định thành phần này trong sản phẩm b
Liệt kê các bước tiến hành, kèm theo những lưu ý nếu có về phương pháp, kỹ thuật, điều kiện tiến hành.
2
9.2. Liệt kê các phương pháp chiết các vitamin khác nhau từ mẫu tpcn. Giải thích nguyên tắc và ý nghĩa các
bước xà phòng hóa (89)
9.3. Giải thích đặc điểm chung và đặc điểm riêng của các vitamin có liên quan đến lựa chọn, sử dụng các
phương pháp phân tích vitamin trong tpcn. (90)
BÀI 10: XÁC ĐỊNH ACID BÉO

10.1. Nhóm sv tự chọn một chế phẩm tpcn bất kỳ c có thành phần chính là một đến vài acid béo. (91)
10.2. Giải thích đặc điểm của các acid béo liên quan đến lựa chọn, sử dụng các phương pháp phân tích acid
béo trong tpcn (94)
BÀI 11: XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU LỢI KHUẨN PROBIOTIC
11.1. Đề xuất quy trình định lượng L.bulgarius trong một chế phẩm probiotics bằng phương pháp đổ đĩa (97)
11.3: Đề xuất quy trình định lượng L.bulgaricus trong một số chế phẩm probiotics (nhóm tự chọn chế phẩm)
bằng phương pháp đổ đĩa. (100)
BÀI 12: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM
12.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt độ enzym nattokinase trong chế phẩm nattoenzym (101)
12.3. Xây dựng quy trình xác định hoạt độ enzym amylase trong một chế phẩm men tiêu hóa có amylase
(nhóm tự chọn chế phẩm).(103)
BÀI TẬP 1.1. SO SÁNH SỰ GIỐNG NHAU VÀ KHÁC NHAU GIỮA THỰC PHẨM CHỨC
NĂNG VỚI THUỐC. PHÂN TÍCH VÍ DỤ MINH HOẠ
3
Giống nhau :
• Có hình dạng, quy cách đóng gói tương tự nhau (viên nang, viên nhộng, chai, lọ...)
• Có hàm lượng hoạt chất vượt trội...
• Có liều dùng nhỏ
Khác nhau:
Thực phẩm chức năng Thuốc
Không được xem là thuốc, được quản lý Được quản lý bởi ngành dược
như thực phẩm
Phải ghi nhãn là TPCN Phải ghi nhãn là Dược phẩm
Có tác dụng phòng bệnh, hỗ trợ điều trị Tác dụng chữa, điều trị bệnh
bệnh
Có nguồn gốc từ thực phẩm tự nhiên/ thực Nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp
phẩm tự nhiên
Không cần sự chỉ định sử dụng của bác sĩ Phải có sự chỉ định của bác sĩ
Có thể bán ở nhà thuốc và các nơi khác Chỉ được bán tại các nhà thuốc
nhau như siêu thị, cửa hàng chuyên biệt
Có thể bán hàng theo hình thức đa cấp Cấm bán hàng theo hình thức đa cấp
Công bố trên TPCN (Sản xuất theo Luật TP) Thuốc (sản xuất theo Luật Dược)
nhãn
Hàm lượng Không quá 3 lần mức nhu cầu hàng Cao
chất, hoạt chất ngày của cơ thể
Ghi nhãn TPCN hỗ trợ các chức năng của các Thuốc có chỉ định, liều dùng, chống
bộ phần cơ thể chỉ định
Thực hành tốt GMP của TPCN (Ban hành 2004) GMP của thuốc (Ban hành 1990)
Lượng dùng Tự nguyện Theo chỉ định

Phân phối Siêu thị, hiệu thuốc Bệnh viện, hiệu thuốc, nhà thuốc
Đăng ký tiêu YT-CNTC, XNTC, ATTP-XNCB, VD- , VN- , V- ,VS-....

chuẩn ĐKSP
4
Đối tượng Cả người bệnh và người khỏe Người bệnh
Chỉ định Cả người khỏe và người ốm Khi ốm

Có thể suốt đời (Tự nguyện) Có thể suốt đời (Bắt buộc)
Dạng bào chế Viên, bột, cốm, dung dịch uống, hít.... Đa dạng hơn: Tiêm, truyền, viên đặt...
GPP Quy định để riêng Sắp xếp theo quy định GPP
Số đăng ký sản Số đăng ký TPCN: Số Đăng ký sản phẩm Thuốc

phẩm
- Cục an toàn thực phẩm cấp: . 3 nội dung:
Số thứ tự 7 Năm cấp/ATTP-
V.....-xxx-yy - Số thứ tự - Năm cấp
INCE OF DKSP
Trong đó:
- Giấy xác nhận công bố phù hợp
quy định an toàn thực phẩm cấp - Nội dung 1: VN - thuốc nhập
bởi Cục an toàn thực phẩm: Số khẩu: VD- thuốc SX trong
thứ tự 1 Nam cấp 1 ATTP- nước, VS – thuốc ngoài da -
XNCB Nội dung 2 số thứ tự cấp cho
từng thuốc theo quy định của
- Chi cục an toàn vệ sinh thực
đơn vị quản lý.
phẩm tình thành phố cấp. Số
thứ tự/Năm cấp/YT + Tên viết - Nội dung 3 năm thuốc đó được
tắt tỉnh, thành phố-TNCB hoặc cấp SĐK
XNCB
VÍ DỤ: SO SÁNH 2 SẢN PHẨM: HERBALIFE EXTRA CAL VÀ BIOCALCIUM

• Giống nhau
- Hình thức: viên nén
- Đều có hàm lượng hoạt chất rất cao
- Liều dùng tương đối nhỏ
- Đối tượng: tình trạng cơ thể thiếu calci và người có nhu cầu calci cao như: người cao tuổi, phụ nữ có
thai,…
- Công dụng: giúp hấp thu calci tối ưu, hỗ trợ xương chắc khoẻ.
Herbalife Xtra Cal Biocalcium
5
Ghi nhãn tpcn hỗ trợ xương chắc khỏe và hấp thu Dược phẩm
canxi
Số đăng kí 1335/2021/ĐKSP VD – 19296- 13
đăng kí tiêu ĐKSP, ATTP-XNCB VD
chuẩn
Hàm lượng Calci 376 mg Calci lactat pentahydrate 650mg
hoạt chất
Vitamin D3 4 mcg
Magnesi 67 mg
Kẽm 2,5 mg
Chỉ định Người trưởng thành có nhu cầu bổ Người giảm calci huyết và thiếu calci do
sung calci cho hệ xương khớp khoẻ chế độ ăn thiếu calci hoặc bệnh loãng
mạnh và ổn định xương.
Chế độ ăn thiếu calci, đặc biệt nhu cầu
calci tăng (phụ nữ có thai, cho con bú,…)
Liều dùng 1-3 viên/ ngày Theo chỉ định bác sĩ, trung bình:
- Người lớn: 6-12 viên/ngày
- Trẻ em: 2-5 viên/ngày
Phân phối phân phối theo hệ thống, kinh doanh tại nhà thuốc, hiệu thuốc
đa cấp
Chống chỉ Không có Bệnh nhân tang calci huyết, tăng calci niệu,
định sỏi calci, suy thận nặng, u ác tính phá huỷ
xương…
Quá mẫn với 1 trong các thành phần thuốc.
BÀI TẬP 1.2. PHÂN TÍCH CÁC YÊU CẦU CHUNG CỦA THỰC PHẨM CHỨC NĂNG VÀ CHO
CÁC VÍ DỤ MINH HỌA.
Các yêu cầu chung của thực phẩm chức năng, đặc điểm:
6
1. Là giao thoa giữa thực phẩm và thuốc: Thực phẩm chức năng giống thực phẩm về bản chất nhưng
khác về hình thức và giống thuốc về hình thức nhưng khác về bản chất.
 Thực phẩm chức năng (TPCN) và thực phẩm:
 Giống nhau: Đều là thực phẩm
 Khác nhau:
- TPCN là thực phẩm hỗ trợ, bổ sung các chất cho cơ quan, cơ thể
- Thực phẩm là nguyên liệu thô từ động thực vật như rau, củ, quả, trứng, cá,...
 Thực phẩm chức năng (TPCN) và và thuốc:
 Giống nhau: về hình thức
 Khác nhau:
- TPCN là thực phẩm hỗ trợ, bổ sung các chất cho cơ quan, cơ thể
- Thuốc là chất hoặc hỗn hợp chất dùng để phòng bệnh, chữa bệnh, chuẩn đoán bệnh hoặc điều chỉnh chức
năng sinh lý của cơ thể..
2. Sản xuất thực phẩm chức năng theo công thức có bổ sung đơn phần mới hoặc làm giàu, tăng hơn các
thành phần thông thường để tạo lợi ích cho sức khỏe.
Hoạt chất Biotin với bảng thành phần như sau:
3.Thực phẩm chức năng có thể loại bỏ các chất bất lợi, bổ sung chất có lợi, tăng cường sức khỏe, giảm
thiểu nguy cơ và tác hại của bệnh tật với những bằng chứng lâm sàng được tài liệu khoa học
chứng minh
Ví dụ:
Thực phẩm chức năng Dầu cá Nature Made Fish Oil gồm 3 loại acid béo chủ yếu là: EPA, DHA, DPA và
được sản xuất từ cá đánh bắt tự nhiên, tinh chế để loại bỏ thuỷ ngân, cũng như các hợp chất có hại như
dioxin, furan và polychlorinated biphenyls (PCB) để có các tác dụng như:
1. Ngăn ngừa nhồi máu cơ tim với bằng chứng: Omega-3 có tác dụng giảm viêm nhiễm ở động mạch vốn có
thể dẫn đến đau tim, đồng thời được xem là một chất chống đông máu có khả năng cải thiện tuần hoàn
máu. "Ngoài ra còn có bằng chứng cho thấy Omega-3 có thể giúp điều hòa nhịp tim" - Giáo sư Tom
Sanders chuyên về dinh dưỡng và bệnh tiểu đường tại Cao đẳng King Luân Đôn (Anh) cho biết.
2. Cải thiện trí nhớ với Bằng chứng: Một nghiên cứu công bố trên tạp chí Thần kinh học (Mỹ) đầu năm nay
cho thấy chế độ ăn giàu Omega-3 có thể làm tăng khối lượng của phần não phụ trách trí nhớ và giúp
phòng chống căn bệnh mất trí nhớ. Omega-3 cũng được cho có khả năng làm giảm sự hình thành các
mảng bám trong não có liên quan đến bệnh Alzheimer.
3. Tăng cường thị lực với bằng chứng: Các thử nghiệm tại Đại học Harvard (Mỹ) cho thấy những con chuột
được nuôi bằng chế độ ăn giàu Omega-3 ít có khả năng bị chảy máu võng mạc, có thể dẫn đến thoái
hóa điểm vàng do tuổi tác nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở người già. Omega-3 còn có thể giúp
phòng ngừa hội chứng khô mắt.
7
4.Thực phẩm chức năng tác dụng với một hoặc nhiều chức năng trong cơ thể, mang lại lợi ích với sức
khỏe nhiều hơn lợi ích dinh dưỡng cơ bản.
• Ví dụ:
Theo Giáo sư Đạo Đắc Cửu Bảo (Ung thư Bạch Mai - Khoa học phổ thông), hồng sâm linh chi có công dụng
✔ Trên tuần hoàn :hỗ trợ tăng cường lưu thông máu, giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch ở người cao tuổi.
Giúp ổn định nhịp tim, điều hòa huyết áp.
✔ Thần kinh: Hỗ trợ làm dịu thần kinh, giảm stress. Người cao tuổi thường xuyên mất ngủ, hay quên, người
làm việc căng thẳng, áp lực là những đối tượng được khuyên dùng sản phẩm này.
✔ Viên sâm còn giúp ổn định đường huyết, hỗ trợ tích cực cho những bệnh nhân mắc tiểu đường.
✔ Sản phẩm còn giúp gia tăng sự dẻo dai của nam giới, tăng cường và cải thiện các chức năng sin.h l.ý giúp
cuộc sống vợ chồng thêm hạnh phúc.
5. Sản phẩm được sử dụng qua đường tiêu hóa ở dạng viên nang mềm, viên nén, viên nang cứng, viên bao
phim, dung dịch, bột, trà, cao.
• Ví dụ
- Cao thìa canh: dạng cao lỏng
- Omega 3: dạng viên nang mềm
- Hồng sâm hàn quốc: dạng bột, dung dịch..
6. Nguyên liệu sản xuất TPCN phải có nguồn gốc tự nhiên ( thực vật, động vật, khoáng vật)
Ví dụ:
1) Viên uống dây thìa canh có nguyên liệu sản xuất là cây thìa canh ( thực vật)
• THÀNH PHẦN:
Mỗi viên nén bao phim chứa:
- Cao khô Dây thìa canh (Gymnema extract): ........300mg
Tương đương 3,0g dược liệu Dây thìa canh khô.
- Phụ liệu vừa đủ 1 viên 650mg.
7. Sản phẩm thực phẩm chức năng phải đánh giá đầy đủ về chất lượng, an toàn, hiệu quả, ít tai biến và tác
dụng phụ.
2. Chỉ tiêu hoá lý: bao gồm chỉ tiêu cảm quan, hàm ẩm, pH, sự phân lớp, tỷ trọng,...
8
8. Sản phẩm thực phẩm chức năng phải ghi nhãn theo quy định của thực phẩm chức năng
- Thông tư 43/2014/TT-BYT về quản lý thực phẩm chức năng quy định:
1. Phải ghi cụm từ thể hiện tên nhóm thực phẩm: “Thực phẩm bổ sung” hoặc tên nhóm trong quy chuẩn
kỹ thuật quốc gia trên phần chính của nhãn.
2. Phải chỉ rõ đối tượng cụ thể, phù hợp với mức đáp ứng của liều khuyên dùng đã công bố hoặc phù hợp
với bằng chứng khoa học đã được chứng minh về liều dùng khuyến cáo với những thành phần chưa có
quy định mức đáp ứng."
3. 3. Khi lấy thành phần chính tạo nên công dụng của sản phẩm làm tên sản phẩm thì phải ghi rõ ở bên
cạnh hoặc dưới tên sản phẩm trên phần nhãn chính và trong thành phần cấu tạo ở nhãn sản phẩm nội
dung sau:
4. a) Hàm lượng hoạt chất trong thành phần đó nếu định lượng được; hoặc
5. b) Hàm lượng thành phần đó nếu không định lượng được hoạt chất trong thành phần.
6. 4. Không ghi cơ chế tác dụng trên nhãn sản phẩm.
7. 5. Phải ghi cụm từ “Chú ý: Thực phẩm này không phải là thuốc và không có tác dụng thay thế thuốc
chữa bệnh”
- Điều 24 Nghị định số 15/2018/NĐ-CP, nhãn thực phẩm dinh dưỡng y học và thực phẩm dùng cho chế độ ăn
đặc biệt phải đáp ứng các điều kiện sau đây:
1. Phải có hướng dẫn chi tiết quy trình vệ sinh dụng cụ và cách thức pha để bảo đảm vệ sinh, an toàn
thực phẩm và đủ dinh dưỡng, phù hợp với tình trạng sức khỏe của đối tượng sử dụng.
2. Yêu cầu về hướng dẫn cách sử dụng:
a) Phải rõ ràng, chi tiết trong hồ sơ công bố sản phẩm;
b) Phải cảnh báo đối tượng không được phép sử dụng, nếu có.”
9. Thực phẩm chức năng được bổ sung hàng ngày, không thay thế được bữa ăn truyền thống nhằm mục
đích duy trì sự sống, tăng cường sức khỏe và giảm nguy cơ bệnh tật
Ví dụ:
9
- Khi sử dụng viên uống bổ sung Fe hàng ngày nhưng vẫn phải ăn thức ăn chứa sắt.
- Bổ sung ngũ cốc không thay thế được việc ăn rau, ăn các thành phần chứa dinh dưỡng khác.
BÀI TẬP 1.3: SO SÁNH SỰ GIỐNG VÀ KHÁC NHAU GIỮA THỰC PHẨM TRUYỀN THỐNG VÀ
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG. PHÂN TÍCH VÍ DỤ MINH HỌA:
GIỐNG NHAU:
- Đều cung cấp các chất dinh dưỡng và thỏa mãn nhu cầu cảm quan
- Duy trì sự sống, sức khỏe và sắc đẹp
- Dùng thường xuyên và suốt đời
- Có nguồn gốc tự nhiên
- Dùng cho mọi đối tượng
KHÁC NHAU
Thực phẩm truyền thống Thực phẩm chức năng
Định nghĩa Là sản phẩm con người ăn, Là sản phẩm để hỗ trợ (phục hồi, tăng cường và duy
uống ở dạng tươi sống hoặc đã trì) các chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có
qua sơ chế, chế biến, bảo quản tác dụng dinh dưỡng hoặc không, tạo cho cơ thể tình
trạng thoải mái, tăng cường đề kháng và giảm bớt
nguy cơ và tác hại bệnh tật.
2. Chức năng Cung cấp các chất dinh dưỡng Có lợi cho sức khỏe, giảm nguy cơ và tác hại bệnh
và thỏa mãn nhu cầu cảm quan. tật.
Bảo vệ sức khỏe.
3. Chế biến Theo công thức thô dựa trên Theo công thức tinh (bổ sung thành phần có lợi, loại
kinh nghiệm và kiến thức của bỏ thành phần bất lợi) dựa vào bằng chứng khoa học.
người đầu bếp
Không loại bỏ chất bất lợi
Tác dụng tạo Tạo năng lượng cao Ít tạo năng lượng
năng lượng
5. Liều dùng Tùy thuộc khoái khẩu Liều dùng thấp
Dùng số lượng lớn (g-kg) Dùng số lượng nhỏ (g-mg)
6. Đối tượng Mọi đối tượng Định hướng cho các đối tượng đặc biệt là người già,
sử dụng trẻ em, PNCT, người có nguy cơ sức khỏe và người
ốm
10
7. Nguồn gốc Nguyên liệu thô từ thực vật, Là hoạt chất chiết từ động vật, thực vật tự nhiên.
nguyên liệu động vật có nguồn gốc tự nhiên.
8. Thời gian Khó sử dụng cho người ốm, già Có thể dùng cho các đối tượng đặc biệt
và phương và bệnh lý đặc biệt.
thức dùng
9. Mục đích Cung cấp năng lượng, tăng Bổ sung vào khẩu phần ăn hằng ngày, không đại diện
sử dụng trưởng và phát triển, duy trì sự cho thực phẩm truyền thống và không phải là duy
sống cho con người nhất trong chế độ ăn hàng ngày
Thực phẩm truyền thống Thực phẩm chức năng
Rau má Rutin-C Rau má
Chức năng - Thức ăn, nước giải khát: giải - Viên uống Rutin-C Rau Má giúp mát gan,
nhiệt, giảm nóng trong, nhuận gan, thông mật lợi tiểu, tăng cường chức năng gan
giải độc, thanh lọc cơ thể trong các trường hợp: chức năng gan suy giảm,
viêm gan, xơ gan, men gan cao, gan nhiễm mỡ,
- Chữa đau bụng, tiêu chảy, đau
dùng nhiều bia rượu, thuốc lá.
bụng kinh nguyệt, chữa nhọt, rôm
sẩy, mẩn ngứa - Cải thiện các triệu chứng chảy máu, nứt kẽ
hậu môn hay biến chứng xuất huyết trên bệnh
nhân trĩ.
- Đáp ứng nhu cầu vitamin C hằng ngày.
Chế biến Theo công thức thô, kinh nghiệm Theo công thức tinh
của người đầu bếp: xào, ăn sống,
Bổ sung các thành phần có lợi: vitamin C,
nấu canh, xay,…
vitamin PP, vitamin B2
Tác dụng tạo năng Tạo năng lượng cao Ít tạo năng lượng
lượng
Liều dùng Tùy theo nhu cầu và cách chế biến - Trẻ em: Uống 1 viên/lần x 1 - 2 lần/ngày.
- Người lớn: Uống 1 viên/lần x 2 - 3 lần/ngày.
Đối tượng sử dụng Mọi đối tượng - Người lớn và trẻ em, người bị nóng trong, rối
loạn chức năng gan gây mệt mỏi, chán ăn, vàng
da, bảo vệ và phục hồi chức năng gan do dùng
nhiều rượu bia, thuốc lá, hóa chất, người bị
viêm gan, xơ gan, men gan cao, gan nhiễm mỡ.
- Người gầy yếu, mệt mỏi, chán ăn, suy dinh
dưỡng
11
- Đối tượng hay bị táo bón, khó tiêu, bị trĩ hoặc
nguy cơ mắc bệnh trĩ, trĩ dẫn đến chảy máu và
đau rát, nứt kẽ hậu môn.
Nguồn gốc nguyên Rau mọc hoang dại ở tự nhiên Rutin, rau má, vitamin C, cao diếp cá, cao
liệu Actiso, vitamin PP, vitamin B2
Thời gian và Dùng đường uống, ăn, đắp lên da, Có thể dùng cho các đối tượng đặc biệt
phương thức dùng …
Dùng đường uống
Mục đích sử dụng Thực phẩm, giải khát Bổ sung dinh dưỡng, thanh nhiệt, giải độc giúp
làm mát gan, thông mật lợi tiểu, tăng cường
Tăng sức bền thành mạch, ngăn
chức năng gan
ngừa xuất huyết. Đồng thời kích
thích lưu thông máu, tăng nuôi
dưỡng các cơ quan nội tạng quan
trọng.
BÀI TẬP 1.4. PHÂN TÍCH CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM CHỨC NĂNG VÀ CHO VÍ
DỤ MINH HỌA.
1. Nghiên cứu lý luận và kế thừa nền y học cổ truyền phương Đông
- Ở Việt Nam, ngành thực phẩm chức năng phát triển.
- Các thầy thuốc, các nhà khoa học đã nghiên cứu rất sâu lý luận khoa học của nền y học phương Đông,
nghiên cứu kế thừa bài thuốc, cây thuốc trong dân gian để vận dụng vào thực tế chăm sóc sức khỏe cho
nhân dân.
- Thực phẩm chức năng “khác” thuốc: là các sản phẩm đều có nguồn gốc tự nhiên, có tác động phục hồi,
tăng cường, duy trì chức năng của các cơ quan trong cơ thể.
- Đối tượng: người ốm và người khỏe.
- Mục đích sử dụng: chủ động phòng ngừa bệnh tật và kịp thời chữa trị bệnh mới phát hiện
- Ví dụ: “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” là cuốn sách về dược liệu nổi tiếng của nhà dược học
Đỗ Tất Lợi. Bộ sách đã giới thiệu hơn 700 vị thuốc, gồm 164 cây thuốc, 77 vị thuốc động vật, 20 vị
thuốc khoáng vật được dùng trong 23 nhóm. Như: Các cây thuốc và vị thuốc chữa bệnh phụ nữ có 29
vị; các cây thuốc và vị thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa có tới 73 vị; các cây thuốc và vị thuốc trị giun
sán có 12 vị; các cây thuốc và vị thuốc chữa lỵ có 31 vị,…
 Cuốn sách “Cây thuốc và bài thuốc biệt dược”: mô tả 327 cây thuốc được dùng phổ biến trong
thực tế
 Cuốn sách “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”: mô tả 920 cây thuốc và 80 động vật
làm thuốc dùng trong 58 bệnh và chứng bệnh khác nhau.
12
2. . Nghiên cứu hoạt chất từ thực vật Ở nước ta, nghiên cứu thực phẩm chức năng đã có nhiều công trình
nghiên cứu thành công và được đưa vào sản xuất.
 Ví dụ:
 Nghiên cứu B-caroten, lycoten, vitamin E từ quả gấc: Dầu đỏ của quả gấc chứa rất nhiều beta-caroten,
lycopen và các hợp chất khác có tác dụng vô hiệu hóa 75% các chất gây ung thư, chống ô xy hóa,
chống lão hóa tế bào, chống suy dinh dưỡng, thiếu vi chất ở trẻ em,… Trong lớp màng đỏ bao quanh
hạt gấc còn chứa rất nhiều vitamin E chất chống oxi hóa, chống lão hóa tế bào. Các chất thiên nhiên
này góp phần giữ gìn sự thanh xuân, chống sạm da, khô da, rụng
 Nghiên cứu curcumin từ củ nghệ: Các thành phần hóa học quan trọng nhất của nghệ là một nhóm các
hợp chất được gọi là curcuminoid, trong đó bao gồm curcumin (diferuloylmethane),
demethoxycurcumin, và bisdemethoxycurcumin. Curcumin hoặc nghệ có thể ngăn chặn một số giai
đoạn phát triển ung thư ở dạng đa khối u. Một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất trong nghệ có đặc
tính chống nấm và kháng khuẩn.
 Nghiên cứu Limonene, vitamin C, flavonoid, pectin từ vỏ quả bưởi: Vỏ quả chứa tinh dầu 0,3%–0,9%,
trong đó có myrcen 1,93–50,66%, limonene 41,45–93,59%; flavonoid toàn phần (neohesperidin,
poncirin, isosakuranetin, 7–β–neohesperidosid) 2,50–3,20%; pectin; vitamin C, A... Có khả năng
chống oxy hóa, kháng viêm, hỗ trợ điều trị các tình trạng về đường hô hấp, cải thiện sức khỏe tim
mạch, dưỡng và hỗ trợ trị rụng tóc.
 Ngoài ra, có rất nhiều nghiên cứu về các hoạt chất tự nhiên như nghiên cứu saponin từ cây đinh lăng,
nghiên cứu hoạt chất nhóm alkaloid của cây trinh nữ hoàng cung, v.v...
3. Nghiên cứu công nghệ chế biến, sản xuất thực phẩm chức năng
- Thực phẩm chức năng là những sản phẩm giao thoa giữa thực phẩm và thuốc.
- Xu hướng nhiều công ty hiện nay là dùng dây truyền sản xuất thuốc để sản xuất thực phẩm chức năng.
- Đồng thời, có nhiều nghiên cứu các công nghệ mới như công nghệ nano, công nghệ sinh học,… để sản
xuất thực phẩm chức năng.
- Ví dụ:
 Công nghệ nghiền Cryogen: Đây là công nghệ nghiền sinh học ở nhiệt độ -196C. Dùng nitơ hóa
lỏng để đẩy toàn bộ oxy ra, viên nang được ép chân không, tránh cho các thành phần thảo dược bị
oxy hóa. Mức độ nghiền cực kỳ nhỏ và mịn đến 125 micromet (đảm bảo các hạt thẩm thấu dễ dàng
và đạt đến 98% vào cơ thể).
 Chiết xuất bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn: Kỹ thuật này sử dụng CO2 ở áp suất cao và nhiệt
độ vừa phải để trích ly nên các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sẽ không bị phân hủy. Sự thay
đổi áp suất và nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chọn lọc các chất hòa tan, nhờ đó có thể phân đoạn sản
phẩm ly trích ở các nồng độ cao thấp khác nhau. CO2 sau khi trích sẽ hoàn toàn tách ra ở dạng khí
sau khi giảm áp nên sản phẩm có thể được coi là 100% sạch không dung môi độc hại, đem lại giá
trị sử dụng và giá trị thương mại cao cho sản phẩm trích ly.
13
4. Nghiên cứu tính hiệu quả và an toàn
- Các nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích xác định tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm
thực phẩm chức năng.
- Nghiên cứu được thực hiện trên in vitro, in vivo và trên lâm sàng.
- Các nghiên cứu giúp cho công tác quản lý thực phẩm chức năng ngày càng chặt chẽ và khoa học
hơn.
 Ví dụ: Nghiên cứu tính hiệu quả và an toàn của thực phẩm chức năng Ginko Biloba: Một phân tích
tổng hợp từ 4 thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên với 1628 bệnh nhân có các triệu chứng hành vi và tâm
lý của sa sút trí tuệ, bệnh nhân sa sút trí tuệ (có thể là bệnh Alzheimer (AD), bệnh mạch máu xảy ra sa
sút trí tuệ hoặc bệnh Alzheimer đi kèm bệnh mạch máu não). Về điểm số của người chăm sóc, bệnh
nhân được điều trị bằng GbE 761® đã cải thiện đáng kể so với những người dùng giả dược trong tất cả
các triệu chứng ngoại trừ ảo tưởng, ảo giác và phấn chấn/ hưng phấn. Egemen Savaskan và các
5. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng với công nghệ hiện đại và quy mô công nghiệp
- Hướng chủ yếu là các sản phẩm bổ sung vitamin, chất khoáng, acid amin, enzym, probiotic, hormon,
carbonhydrat.
- Các sản phẩm từ thảo dược, động vật.
- Các thực phẩm chức năng đặc biệt cho người già, trẻ nhỏ, phụ nữ có thai, cho mục đích sức khỏe đặc
biệt và cho mục đích y học đặc biệt.
- Ví dụ: Nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất polysaccharopeptide PSK và PSP từ nấm Vân chi
(trametes versicolor) ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng
6. Khoa học thực phẩm chức năng Khoa học thực phẩm chức năng là quá trình đi từ việc xác định mối tương
quan giữa một hoặc một vài thành phần thực phẩm với một chức năng nào đó trong cơ thể đến lợi ích với
sức khỏe.
 Mục tiêu:
- Chức năng tiêu hóa: sự cân bằng vi sinh vật đường ruột, hoạt động bài tiết, tăng cường hệ miễn dịch,
sự lưu chuyển trong đường ruột.
- Bổ sung các chất chống oxy hóa không phải vitamin như phytochemiscal, các chất oxy hóa nguồn gốc
thảo dược.
- Sự chuyển hóa các đại chất dinh dưỡng như carbohydrat, acid amin, acid béo, sự cân bằng hormon như
insullin và glucagon trong chuyển hóa glucose.
- Sự phát triển của bào thai và trẻ nhỏ: chế độ ăn của bà mẹ đều có tác động tới sự phát triển của bào thai
và trẻ nhỏ.
- Sự hiểu biết, hành vi, tâm trạng của người dùng: nhiều vấn đề được đặt ra về vai trò tác động của thành
phần thực phẩm tới chức năng này.
14
 Ví dụ: Mối tương quan giữa curcumin từ củ nghệ và chiết xuất gừng trong hỗ trợ bảo vệ niêm mạc dạ
dày: Thành phần curcumin có trong củ nghệ đã được khoa học thế giới chứng minh có rất nhiều tác
dụng đến bệnh dạ dày:
- Hỗ trợ ngăn ngừa loét dạ dày, bảo vệ niêm mạc.
- Hỗ trợ chống viêm, giảm tiết acid, trung hòa dịch vị
- Hỗ trợ ức chế khoảng 65 chủng vi khuẩn HP -nguyên nhân gây viêm loét dạ dày.
- Hỗ trợ ức chế sự tiến triển của ung thư dạ dày. Chiết xuất gừng cũng thể hiện đặc tính hỗ trợ chống
viêm, giảm đau. Kết hợp với nhau giúp hỗ trợ bảo vệ niêm mạc dạ dày trước các tác động của vi khuẩn
HP, acid dịch vị, các thức ăn, đồ uống có hại... Từ đó, giúp hỗ trợ giảm các triệu chứng viêm loét dạ
dày tá tràng: đau thượng 1 hơi, trào ngược,...
 Từ các nghiên cứu đó áp dụng công nghệ tiên tiến sản xuất thực phẩm chức năng CumarGold New.
BÀI 2.1: SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 01 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CÓ NGUỒN
GỐC THỰC VẬT.
a. Trình bày cách phân loại và hệ thống quản lý nhà nước của chế phẩm này?
Thực phẩm chức năng trinh nữ hoàng cung
I. Phân loại
- Là thực phẩm chức năng bảo vệ sức khỏe
- Dạng bào chế: viên nang cứng
- Chứa các hoạt chất có nguồn gốc thực vật được chiết xuất từ: trinh nữ hoàng cung, tam thất, bán chi
liên, khương hoàng, bạch hoa xà thiệt thảo. Trong đó trinh nữ hoàng cung là dược liệu chính.
II.Hệ thống quản lý nhà nước của thực phẩm chức năng Trinh nữ hoàng cung
2.1 Hệ thống quản lý nhà nước
Theo Luật An toàn thực phẩm 55/2010/QH12 quy định:
Theo quản lý Nhà nước
• Thực phẩm chức năng Trinh nữ hoàng cung thuộc nhóm thực phẩm bảo vệ sức khoẻ: là sản phẩm được
chế biến dưới dạng viên nang cứng có chứa các hoạt chất có nguồn gốc thực vật được chiết xuất từ:
trinh nữ hoàng cung, tam thất, bán chi liên, khương hoàng, bạch hoa xà thiệt thảo. Trong đó trinh nữ
hoàng cung là dược liệu chính.
* Theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 quy định trách nhiệm quản lý an toàn thực phẩm nói chung và
thực phẩm chức năng nói riêng như sau:
15
- Chính phủ thống nhất quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm
- Bộ Y tế chịu trách nhiệm trước Chính phủ thực hiện quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm
- Các bộ, cơ quan ngang bộ trong phạm vi nhiệm vụ, quyền hạn của mình có trách nhiệm phối hợp với
Bộ Y tế thực hiện quản lý nhà nước an toàn thực phẩm
- Uỷ ban nhân các cấp thực hiện quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm trong phạm vi địa phương
 Trách nhiệm chung của Bộ Y tế
- Chủ trì xây dựng, trình cơ quan nhà nước có thẩm quyền ban hành và tổ chức thực hiện chiến lược
quốc gia, quy hoạch tổng thể về an toàn thực phẩm.
- Ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chỉ tiêu và mức giới hạn an toàn đối với sản phẩm thực
phẩm; dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm.
- Yêu cầu các bộ, ngành, Ủy ban nhân dân cấp tỉnh báo cáo định kỳ, đột xuất về công tác quản lý an
toàn thực phẩm.
- Quy định về điều kiện chung bảo đảm an toàn thực phẩm đối với CTCP Dược phẩm quốc tế
Dolexphar, Lô C -2, KCN Đại An mở rộng, Cẩm Giàng, Hải Dương.
- Chủ trì tổ chức thực hiện công tác tuyên truyền, giáo dục pháp luật về an toàn thực phẩm; cảnh báo
sự cố ngộ độc thực phẩm bảo vệ sức khỏe Trinh nữ hoàng cung.
- Thanh tra, kiểm tra đột xuất đối với toàn bộ quá trình sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh thực phẩm
bảo vệ sức khỏe Trinh nữ hoàng cung.
- Chủ trì xây dựng, ban hành hoặc trình cơ quan nhà nước có thẩm quyền ban hành và tổ chức thực
hiện chiến lược, chính sách, quy hoạch, kế hoạch và văn bản quy phạm pháp luật về an toàn thực
phẩm thuộc lĩnh vực được phân công quản lý
- Quản lý an toàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất, sơ chế, chế biến, bảo quản, vận chuyển,
xuất khẩu, nhập khẩu, kinh doanh đối với phụ gia, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm chức năng;
- Quản lý an toàn thực phẩm đối với dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm trong quá trình
sản xuất, chế biến, kinh doanh thực phẩm thuộc lĩnh vực được phân công quản lý;
- Thanh tra, kiểm tra, xử lý vi phạm pháp luật về an toàn thực phẩm trong quá trình sản xuất, xuất
khẩu, nhập khẩu, kinh doanh thực phẩm thuộc lĩnh vực được phân công quản lý.
A. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm
Cục An toàn vệ sinh thực phẩm là cơ quan giúp Bộ trưởng Bộ Y tế thực hiện chức năng quản lý nhà nước
về vệ sinh an toàn thực phẩm có nhiệm vụ thực thi, điều hành công tác quản lý nhà nước về vệ sinh an
toàn thực phẩm trong phạm vi cả nước theo thẩm quyền được quy định.
B. Cơ quan quản lý tuyến tỉnh
16
Sở Y tế là cơ quan thực hiện quản lý nhà nước về lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm trên toàn địa bàn
tỉnh. Hai bộ phận thuộc Sở chịu trách nhiệm về lĩnh vực này là Phòng nghiệp vụ y và Thanh tra sở y tế.
C. Cơ quan quản lý tuyến huyện
Tuyến huyện gồm Phòng Y tế huyện và Trung tâm Y tế dự phòng huyện
Vai trò tương tự cơ quan tuyến tỉnh nhưng phạm vi thực hiện trên địa bàn huyện
 Dạng bào chế: viên nang cứng

 Công dụng của Trinh nữ hoàng cung:
• Hỗ trợ giảm sự tiến triển của u xơ tử cung ở nữ giới.
• Phì đại lành tính tuyến tiền liệt ở nam giới.
Hệ thống quản lý nhà nước của TPCN trinh nữ hoàng cung
1. YÊU CẦU KỸ THUẬT
TÊN CƠ QUAN CHỦ QUẢN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TC
CTCP Dược phẩm quốc tế Dolexphar Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Có hiệu lực từ ngày…tháng…
năm…
Trinh nữ hoàng cung
1.1. Công thức bào chế cho 1 đơn vị chế phẩm:

Bạch hoa xà thiệt thảo 500mg
Tam thất 120mg
17
Bán chi liên 200mg
Trinh nữ hoàng cung 1800mg
Khương hoàng 50mg
Vỏ nang gelatin, avicel, chất chống đông vón ( talc ), magie strearat vừa đủ
1.2. Yêu cầu chất lượng
1.2.1. Cảm quan, hình thức: Viên nang cứng, màu xanh, không mùi, không vị.
1.2.2. Độ đồng đều khối lượng: Không được có quá hai đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh
lệch số với khối lượng trung bình quy định và không được có đơn vị nào có khối lựơng vượt gấp đôi giới
hạn đó.
1.2.3. Định tính: Cho phản ứng dương tính với các thuốc thử chung của Alcaloid.
1.2.4. Định lượng: Theo qui định trong chuyên luận riêng (khối lượng dược liệu quy đổi phải đạt từ lớn
hơn hoặc bằng 15% so với khối lượng tính theo liều sử dụng làm thuốc).
1.2.4. Độ rã: Đạt yêu cầu phép thử độ rã của viên nang mềm.
1.2.5. Thời gian rã: < 30 phút
1.2.6. Vi sinh vật
STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Mức tối đa
1 Colifoms CFU/g 10
2 E.Coli CFU/g 0
3 Clostridium CFU/g 5
perfringens
4 Tổng số BTNM-NM CFU/g 102
5 Tổng số VK hiếu khí CFU/g 104
6 S.Aureus CFU/g 0
7 Bacillus cereus CFU/g 10
8 Salmonella spp. CFU/25g 0
18
1.2.7. Chỉ tiêu kim loại nặng
STT Tên chỉ tiêu Đơn vị Mức tối đa
1 Chì (Pb) ppm 3
2 Cadimi (Cd) ppm 1
2. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

2.1. Hình thức: Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.
2.2. Độ đồng đều khối lượng:
• Thực hiện theo phương pháp 2 của phụ lục 11.3 của DĐVN IV
• Cách thử: trước tiên chọn ngẫu nhiên 20 viên để tiến hành thử độ đồng đều khối lượng cân khối lượng
của từng viên nang với mỗi viên nang này mở nang lấy hết thuốc ra. Dùng bông lau sạch bột thuốc
bám ở mặt trong, cân khối lượng vỏ nang. Hiệu số giữa khối lượng nang thuốc và khối lượng vỏ nang
sau khi được làm sạch chính là khối lượng thuốc trong nang.
Công thức: mthuốc trong nang = mnang thuốc - mvỏ nang
Kết quả được đánh giá dựa vào bảng 11.3.1
KLTB viên (mg) Phần trăm chênh lệch so với KLTB viên (%)
Nhỏ hơn 300mg 10
Bằng hoặc lớn hơn 300mg 7.5
2.3. Định tính, định lượng

 Định tính và định lượng hoạt chất chính Alcaloid trong cây Trinh nữ hoàng cung
• Định tính
A. Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 20 ml ethanol 96 % (TT), đun sôi trên cách thủy 5 min, lọc, lấy 2 ống nghiệm,
mỗi ống cho 1 ml dịch lọc để làm các phản ứng sau:
+ Ống 1: Thêm vài giọt dung dịch natri hydroxyd 5 % (TT), dung dịch chuyển từ màu vàng nhạt sang màu
cam đậm.
19
+ Ống 2: Thêm 0,5 ml acidhydrocloric (TT), thêm một ít bột magnesi (TT), dung dịch có màu đỏ.
B. Lấy 2 g bột dược liệu, làm ẩm bằng amoniac (TT), thêm 30 ml cloroform (TT), lắc siêu âm 15 min, lọc. Cô
dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N (TT), lọc, lấy 3 ống
nghiệm, mỗi ống cho 2 ml dịch lọc để làm các phản ứng sau:
• Ống 1: Thêm 1 giọt thuốc thử Mayer (TT): cho tủa trắng.
• Ống 2: Thêm 1 giọt thuốc thử Bouchardat (TT): cho tủa nâu.
• Ống 3: Thêm 1 giọt thuốc thử Dragendorff (TT): cho tủa đỏ cam.
C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ( phụ lục 5.4)
• Định lượng Alaloid toàn phần:
• Dược liệu phải chứa ít nhất 0,2 % alcaloiđ toàn phần tính theo lycorin (C 16H17O4) tính trên dược liệu
khô kiệt.
Liều dùng hàng ngày 4 – 10g, khối lượng dược liệu Trinh nữ hoàng cung có trong chế phẩm: 1800mg = 1,8g.
(1,8 / 4) x 100 = 45% ( >15%)
=> Vậy chế phẩm đạt yêu cầu về khối lượng dược liệu Trinh nữ hoàng cung, tính theo liều dùng làm thuốc.
• Phương pháp sắc ký lỏng (phụ lục 5.3): Dược liệu phải chứa không dưới 0,08% (theo khối lượng)
crinamidin (C17H19NO5) tính theo dược liệu khô kiệt.
• Định lượng Alaloid toàn phần:
• Dược liệu phải chứa ít nhất 0,2 % alcaloiđ toàn phần tính theo lycorin (C 16H17O4) tính trên dược liệu
khô kiệt.
Liều dùng hàng ngày 4 – 10g, khối lượng dược liệu Trinh nữ hoàng cung có trong chế phẩm: 1800mg = 1,8g.
(1,8 / 4) x 100 = 45% ( >15%)
=> Vậy chế phẩm đạt yêu cầu về khối lượng dược liệu Trinh nữ hoàng cung, tính theo liều dùng làm thuốc.
• Phương pháp sắc ký lỏng (phụ lục 5.3): Dược liệu phải chứa không dưới 0,08% (theo khối lượng)
crinamidin (C17H19NO5) tính theo dược liệu khô kiệt.
• 2.4 Độ rã ( phụ lục 11.6)
• Nếu không có chỉ dẫn gì khác, dùng nước làm môi trường thử, thời gian rã phải trong vòng 30 phút.
Nếu thử trong môi trường nước không đạt, thay nước bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1N (TT) hoặc
dịch dạ dày (TT). Nếu nang nổi trên mặt nước, có thể dùng đĩa đè lên.
• 2.5 Thời gian rã: < 30 phút
• 2.6. Chỉ tiêu vi sinh vật
20
• Các viên nang được kiểm tra giới hạn vi sinh vật để đảm bảo không có nhiễm các vi khuẩn và nấm
mốc gây bệnh bằng các thử nghiệm vi sinh. Các phép thử này thường được thực hiện bằng cách ủ các
viên nang trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật và đếm các khuẩn lạc hình thành sau một khoảng thời
gian nhất định. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy và thời gian thử nghiệm, cũng như duy trì các điều
kiện vô trùng trong quá trình thử nghiệm là rất quan trọng để đánh giá chính xác độ nhiễm vi sinh vật
bằng phương pháp này.
2.7. Chỉ tiêu kim loại nặng
• Theo QCVN 8-2:2011/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn bị ô nhiễm kim loại nặng
trong thực phẩm, có thể dùng các phương pháp thử sau (có thể sử dụng các phương pháp tương
đương):
* Phương pháp xác định hàm lượng chì:
• TCVN 7602: 2007 (AOAC 972.25): Thực phẩm. Xác định hàm lượng chì bằng phương pháp quang phổ hấp
thụ nguyên tử
• TCVN 8126: 2009: Thực phẩm. Xác định hàm lượng chì, cadmi, kẽm, đồng và sắt. Phương pháp quang phổ
hấp thụ nguyên tử sau khi đã phân hủy bằng vi sóng
* Phương pháp xác định hàm lượng cadimi:
• TCVN 7603: 2007 (AOAC 973.34): Thực phẩm. Xác định hàm lượng cadimi bằng phương pháp quang phổ
hấp thụ nguyên tử
3. ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN
- Đóng gói: 1 hộp 10 vỉ x 60 viên nang cứng
- Nhãn: Ghi rõ ràng, đúng quy chế. Ghi cụm từ thể hiện nhóm thực phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe”. Phải
ghi cụm từ “Chú ý: Sản phẩm này không phải là thuốc và không có tác dụng thay thế thuốc chữa bệnh” ngay
sau phần ghi công dụng, tham khảo Nghị định số 89/2006/NĐ-CP ngày 30/08/2006 của Chính phủ về nhãn
hàng hóa
- Bảo quản: Nơi khô ráo thoáng mát, nhiệt độ dưới 30 độ C
BÀI TẬP 2.2 SINH VIÊN LỰA CHỌN 1 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẤT KỲ CHỨA
NHIỀU LOẠI VITAMIN:
I. Giới thiệu chung về Multivita TH
* Multivita TH là sản phẩm được bào chế dưới dạng viên nang mềm dùng cho trẻ em và người lớn gầy yếu,
suy dinh dưỡng. Multivita TH bổ sung vitamin tổng hợp và khoáng chất.
21
* Thông tin cơ bản của Multivita TH
▹Tên sản phẩm đăng ký: Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Multivita TH
▹Số đăng ký: 13/2020/2801275521-DKCB
▹Công ty đăng ký: Công ty Cổ phân dược TH pharma
▹Xuất xứ: Việt Nam
*Thành phần Multivita TH
Vitamin A 600UI , Vitamin D3 100UI, Vitamin C 30mg, Vitamin PP 7.5mg , Vitamin B6 2mg ,Vitamin B1
1mg, Vitamin B2 1mg , Vitamin b5 1mg , Vitamin B12 1mg , Kẽm 1.5mg, Magnesi 20mg. Phụ liệu vừa đủ
*Công dụng chỉ định
▹Bổ sung vitamin tổng hợp và khoáng chất cho cơ thể
▹Bổ sung vitamin A, Vitamin C, Vitamin D3, Vitamin nhóm B,…
▹Giúp ăn ngon miệng.Tăng cường sức đề kháng cho cơ thể…
*Đối tượng sử dụng
oTrẻ em biếng ăn, suy dinh dưỡng, chậm lớn, sức đề kháng kém, người mệt mỏi, mới ốm dậy
oTrẻ em và người lớn đang bị hoặc muốnn giảm nguy cơ khô mắt, mỏi mắt
oNgười gầy yếu, người mới ốm bệnh cần bồi bổ sức khoẻ nhanh
II.Cách phân loại và hệ thống quản lý nhà nước.
-Cách phân loại Theo quản lý Nhà nước Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Multivita TH thuộc nhóm Thực phẩm
bảo vệ sức khoẻ: là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang mềm có chứa hỗn hợp các Vitamin A,
Vitamin D3, Vitamn C, Vitamin PP, Vitamin nhóm B, kẽm, magnesi có nguồn gốc tự nhiên.
-Hệ thống quản lý Nhà nước
* Theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 quy định trách nhiệm quản lý an toàn thực phẩm nói chung và
Như câu 2.1
III.Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở
1.Yêu cầu kỹ thuật

22
1.1. Công thức điều chế
1.2. Yêu cầu chất lượng:

1.2.1. Tính chất
1.2.2. Độ đồng đều khối lượng

Không được có quá hai đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh lệch so với khối lượng trung bình viên
quy định và không được có đơn vị nào có khối lượng vượt gấp đôi giới hạn đó. Giới hạn này dựa vào khối
lượng trung bình viên của viên nang.
1.2.3.Độ rã
Thời gian rã phải trong vòng 30 phút
1.2.4.Các chỉ tiêu vi sinh vật
Bảng chỉ tiêu vi sinh vật phải công bố và kiểm nghiệm
23
1.2.5. Kim loại nặng
Một số chỉ tiêu kim loại nặng phải công bố và kiểm nghiệm
1.2.6. Định tính

 Định tính vitamin PP
▹ Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của
nicotinamid chuẩn
▹ Điểm chảy: 128 °C đến 131°C (Phụ lục 6.7).
 Định tính vitamin C
▹ Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại cửa acid
ascorbic chuẩn
▹ pH của dung dịch S phải từ 2,1 đến 2,6 (Phụ lục 6.2).
 Định tính vitamin B2
Dịch lọc có màu lục vàng nhạt và có huỳnh quang lục vàng đậm. Huỳnh quang mất đi khi thêm dung
dịch kiềm hay acid vô cơ.
 Định tính vitamin B5
▹ Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu của phép thử Góc quay cực riêng
▹ Thêm 1 ml dung dịch natri hydroxyd loãng (TT) và 0,1 ml dung dịch đồng sulfat 12,5 % (TT) vào 1
ml dung dịch S, xuất hiện màu xanh da trời.
1.2.7.Định lượng
Hàm lượng của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùng hằng ngày của nhà sản
xuất phải đạt được tối thiểu 15% RNI được quy định tại Phụ lục số 01 ban hành kèm theo Thông tư này
Hàm lượng tối đa của vitamin, khoáng chất có trong thực phẩm tính theo liều khuyên dùng hằng ngày của nhà
sản xuất không được vượt quá ngưỡng dung nạp tối đa của các vitamin và khoáng chất được quy định tại Phụ
lục số 02 ban hành kèm theo Thông tư này
Hàm lượng vitamin và khoáng chất có trong sản phẩm phải được ghi trên nhãn bằng số và phải được công bố
dưới dạng tỉ lệ phần trăm (%) tính theo RNI, dựa trên liều khuyên dùng hằng ngày của sản phẩm hoặc dựa trên
một đơn vị sử dụng (serving size).
24
1. Phương pháp thử
2.1.Tính chất
Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu trên.
2.2. Độ đồng đều khối lượng
-Trước tiên chọn ngẫu nhiên 20 nang để tiến hành thủ độ đồng đều hàm lượng. Cân khối lượng của từng
nang, với mỗi nang này tiến hành cắt mở nang, tháo hết thuốc ra. Dùng ether hoặc dung môi hữu cơ thích
hợp rửa vỏ nang, để khô tự nhiên cho đến khi nang hết mùi dung môi, cân khối lượng của vỏ nang sau khi
làm khô.Hiệu số giữa khối lượng nang thuốc và khối lượng vỏ nang sau khi được làm sạch chính là khối
lượng thuốc trong nang.
- Đánh giá kết quả: Không được có quá hai đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh lệch so với
khối lượng trung bình viên quy định và không được có đơn vị nào có khối lượng vượt gấp đôi giới hạn đó.
Giới hạn này dựa vào khối lượng trung bình viên của viên nang.
2.3. Độ rã
Nếu không có chỉ dẫn gì khác, dùng nước làm môi trường thử, cho đĩa vào mỗi ống thử, thời gian rã phải
trong vòng 30 phút. Nếu thử trong môi trường nước không đạt, thay nước bằng dung dịch acid hydrocloric
0,1N (TT) hoặc dịch dạ dày giả (TT). Nếu được chất có tương tác với đĩa, có thể thử không dùng đĩa. Nếu
nang không rã do dính vào đĩa, thử lại với 6 viên khác không dùng đĩa. Mẫu thử đạt yêu cầu nếu cả 6 viên
đều rã.
2.4. Vi sinh vật
Các viên nang được kiểm tra giới hạn vi sinh vật để đảm bảo không có nhiễm các vi khuẩn và nấm mốc
gây bệnh bằng các thử nghiệm vi sinh. Các phép thử này thường được thực hiện bằng cách ủ các viên nang
trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật và đếm các khuẩn lạc hình thành sau một khoảng thời gian nhất
định. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy và thời gian thử nghiệm, cũng như duy trì các điều kiện vô trùng
trong quá trình thử nghiệm là rất quan trọng để đánh giá chính xác độ nhiễm vi sinh vật bằng phương pháp
này.
2.5. Kim loại nặng
Phương pháp kiểm nghiệm
Kiểm nghiệm kim loại nặng là nhóm chỉ tiêu cơ bản đã được Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm quốc gia thực hiện phân tích với các quy trình đã được tối ưu, được công nhận ISO/IEC 17025, bao
gồm:
Kiểm nghiệm kim loại nặng – các nguyên tố: chì, cadmi, asen, thủy ngân, thiếc, antimon, cobalt, nickel,
crom, mangan, đồng, selen, molybden) bằng ICP-MS
Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố chì bằng GF-AAS
Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố cadmi bằng GF-AAS
25
Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố asen bằng HVG-AAS
Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố thủy ngân bằng thiết bị phân tích trực tiếp DMA-80
2.6. Định lượng
2.6.1.Định lượng vitamin B1,B6
- Định lượng vitamin B1,B6 bằng phương pháp sắc ký lỏng
Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 100 mg thiamin hydroclorid hay thiamin nitrat,
thêm 70 ml dung dịch acid hydrocloric 0,005 M(TT), để siêu âm 10 min, pha loãng với dung dịch acid
hydrocloric 0,005 M (TT) thành 100,0 ml, lắc đều. Lọc, loại bỏ dịch lọc đầu. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc với
dung dịch acid hydrocloric 0,005 M (TT) thành 100,0 ml, lắc đều. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10
cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 244 nm. Tốc độ
dòng: 2,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và
dung dịch thử.
2.6.2.Định lượng vitamin D3
- Phương pháp sắc ký lỏng ( Phụ lục 5.3 ), trong điều kiện tránh ánh sáng.
- Pha động: Methanol - ethyl acetat – nước ( 90 : 7 : 3 ).
- Dung dich chuẩn: Dung dich vitamin D3 chuẩn trong ethanol ( TT ), có nồng độ chính xác khoảng 20
IU / ml .
- Dung dịch thử . Cân 20 nang , tính khối lượng trung bình của thuốc trong nang , trộn đều. Cân chính
xác một lượng dầu chứa trong nang tương ứng với 500 IU vitamin D3, vào binh định mức 25 ml.
Thêm khoảng 20 ml ethanol (TT), lắc kỹ để hòa tan (nếu cần, trước khi thêm ethanol có thể cho thêm 1
ml ethyl acetat (TT) để hòa tan hết dầu). Thêm ethanol (TT) đến định mức, lắc đều. Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (25 cm × 4,6 mm ) được nhồi pha tĩnh (5 um đến 10 um). Detector quang phổ từ ngoại
đặt ở bước sóng 265 nm. Tốc độ dòng : 1,0 ml / min . Thể tích tiêm : 100 um.
- Cách tiến hành : Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử . Tính hàm lượng
vitamin D3 trong nang dựa vào diện tích ( hay chiều cao ) pic vitamin D3 thu được của dung dịch thử ,
dung dịch chuẩn và nồng độ vitamin D3 của dung dịch chuẩn.
2.6.3.Định lượng vitamin B12
- Phương pháp sắc ký lỏng ( Phụ lục 5.3 ) .
- Pha động : Hỗn hợp methanol - nước ( 35 : 65 ) . Điều chỉnh pha động , nếu cần .Dung dịch chuẩn:
Dung dịch cyanocobalamin chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 10 pg / ml.Dung dịch thử : Dung dịch
cyanocobalamin chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 10 pg / ml. Dung dịch thử : Loại bỏ lớp vỏ bao .
Cân 20 viên , tinh khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn.Cân chính xác một lượng bột
viên tương ứng với khoảng 250 μg cyanocobalamin vào bình 50 ml , thêm 25,0 ml nước , lắc kỹ trong
15 phút ( hay để siêu âm 5 phút ) , lọc ( hay ly tâm) Sử dụng dịch lọc ( hay dịch trong ở trên ) Điều
26
kiện ký hiệu : Cột kích thước ( 25 cm × 4,6 mm ) được nhồi pha tĩnh C ( 5 μm ) . Máy dò quang phổ từ
ngoại khả kiến đặt ở bước sóng 550 nm . Tốc độ dòng : 1,0 ml / min . Thể tích tiêm 20 μl.
- Cách tiến hành : Kiểm tra tính phủ hợp của hệ thống sắc ký : Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn ,
phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic chỉnh trên sắc ký đô thị được trong
6 lần tiêm lập lại không được quá 3,0 % . Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch
thử .
2.6.4.Định lượng vitamin A
- Phương pháp đo quang sau khi chiết tách vitamin A
- Lấy một lượng chế phẩm chứa khoảng 50 000 IU vitamin A vào bình nút mài, thêm 3 ml dung dịch
kali hydroxyd (TT) 50 % mới pha, 30 ml ethanol (TT), đun sôi 30 min trên cách thủy có lắp ống sinh
hàn hồi lưu, dưới dòng khí nitrogen không có oxygen. Làm nguội nhanh rồi dùng 30 ml nước cất
chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn. Chiết 4 lần mỗi lần với 50 ml ether (TT) và bỏ lớp dưới khi tách
lớp hoàn toàn. Tập trung dịch chiết lại rồi rửa dịch chiết 4 lần, mỗi lần 50 ml nước cất, (chú ý lắc rất
nhẹ nhàng ở 2 lần đầu để tránh tạo thành nhũ tương). Làm hay hơi dịch chiết ether trên cách thủy dưới
dòng khí nitrogen không có oxygen hoặc cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 30 °C đến hết
dung môi. Hòa tan cắn trong một lượng 2-propanol (TT) vừa đủ để thu được dung dịch chứa 10 IU đến
15 IU vitamin A trong 1 ml. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở các bước sóng 300 nm, 310 nm,
325 nm, và 334 nm trong cốc dày 1 cm với mẫu trắng là 2-propanol (TT), sau đó xác định bước sóng
có hấp thụ cực đại.
2.7.Định tính
2.7.1. Định tính vitamin PP
▹ Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của
nicotinamid chuẩn
▹ Điểm chảy: 128 °C đến 131°C (Phụ lục 6.7).
2.7.2. Định tính vitamin C
▹ Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại cửa acid
ascorbic chuẩn
▹ pH của dung dịch S phải từ 2,1 đến 2,6 (Phụ lục 6.2).
2.7.3.Định tính vitamin B2
Cân một lượng bột viên tương ứng với khoảng 1 mg riboflavin, thêm 100 ml nước, lắc kỹ, lọc. Dịch
lọc có màu lục vàng nhạt và có huỳnh quang lục vàng đậm. Huỳnh quang mất đi khi thêm dung dịch
kiềm hay acid vô cơ.
2.7.4.Định tính vitamin B5
27
▹ Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu của phép thử Góc quay cực riêng. c. Trong phần 3-Aminopropanol,
vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) phải giống về vị trí, màu sắc và kích thước so với vết
chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1).
▹ Thêm 1 ml dung dịch natri hydroxyd loãng (TT) và 0,1 ml dung dịch đồng sulfat 12,5 % (TT) vào 1
ml dung dịch S, xuất hiện màu xanh da trời.
2.8. Đóng gói- Bảo quản-Hạn dùng
▹ Đóng gói: Hộp 10 vỉ x 10 viên nén bao phim.
 Nhãn đúng quy chế
▹ Bảo quản: Nơi khô mát, tránh ánh sáng
▹ Hạn sử dụng: 36 tháng kể từ ngày sản xuất
BÀI TẬP 2.3. SINH VIÊN LỰA CHỌN 1 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DÙNG THEO
ĐƯỜNG SONDE CHỨA CHẤT KHOÁNG, VITAMIN, PROTEIN.
a) Trình bày cách phân loại và hệ thống quản lý nhà nước của sản phẩm này ?
b) Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm này?
I-CÁCH PHÂN LOẠI VÀ HỆ THỐNG QUẢN LÝ NHÀ NƯỚC:
1. Cách phân loại:
Thực phẩm dinh dưỡng y học FOMEAL thuộc nhóm Thực phẩm dinh dưỡng y học (thực phẩm dinh dưỡng
dùng cho mục đích y tế đặc biệt-Medical food): Là sản phẩm dinh dưỡng chuyên biệt cho người bệnh ăn qua
ống thông; cung cấp dinh dưỡng cân bằng với năng lượng chuẩn (1 kcal/ml) từ nguồn nguyên liệu an toàn và
lành mạnh từ thiên nhiên( 20 vitamin và khoáng chất), công thức dinh dưỡng phối hợp Peptide và Triglyceride
chuôi trung bình (mcts) dễ hấp thu, giúp cải thiện dung nạp cho người bệnh.
2. Hệ thống quản lý nhà nước:
-Theo Luật an toàn thực phẩm 55/2010/QH12 quy định trách nhiệm quản lý an toàn thực phẩm nói chung và
Như câu 2.1
- Quy định về điều kiện chung bảo đảm an toàn thực phẩm đối với Công ty TNHH Khoa học dinh dưỡng
Orgalife-số 27 đường 65, phường Tân Phong, quận 7, Tp HCM; nhà máy Orgalife -Lô B4C, đường 4, KCN
Phúc Long, huyện Bến Lức, tỉnh Long An.
- Chủ trì tổ chức thực hiện công tác tuyên truyền, giáo dục pháp luật về an toàn thực phẩm; cảnh báo sự cố
ngộ độc thực phẩm dinh dưỡng y học FOMEAL.
II. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở
28
A. Yêu cầu chất lượng
TÊN CƠ QUAN CHỦ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TC
QUẢN
Công ty TNHH Khoa học Thực phẩm dinh dưỡng Có hiệu lực từ ngày…tháng…
Dinh dưỡng Orgalife năm…
Y học Fomeal
1. Nhóm các chỉ tiêu vật lý- cảm quan

- Cảm quan: Chế phẩm lỏng, không bị đông vón.
- Mùi: Không ôi khét
2. Nhóm các chỉ tiêu chất lượng
2.1. Thành phân đa lượng
2.1.1. Chất đạm
Định lượng protein tổng lớn hơn hàm lượng công bố (sai số ± 10%). 2.1.2. Chất béo
Định lượng chất béo tổng lớn hơn hàm lượng công bố (sai số ± 10%). 2.2. Thành phân vi lượng
2.2.1. Vitamin
Định lượng các vitamin sai số không nhỏ hơn 20% hàm lượng trên nhãn và không lớn hơn quy định tại thông
tư 43/2014/TT-BYT
2.2.2. Nguyên tố vi lượng

Định lượng nguyên tố vi lượng sai số không nhỏ hơn 20% hàm lượng trên nhãn và không lớn hơn quy định tại
thông tư 43/2014/TT-BY
29
2.2.3. Acid amin: Định lượng từng acid amin sai số nhỏ hơn hoặc bằng 20% hàm lượng công bố 18 acid amin
với 9 acid amin thiết yếu trong môi hộp
3. Nhóm chỉ tiêu an toàn

3.1. Xác định hàm lượng kim loại nặng
3.2. Chỉ tiêu vi sinh vật

Bảng chỉ tiêu vi sinh vật phải công bố và kiểm nghiệm
STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Mức tối đa
1 Coliforms CFU/g 10
2 E.Coli CFU/g 0
3 Clostridium perfrigens CFU/g 5
4 Tổng số BTNM-NM CFU/g 102
30
5 Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g 104
6 S. Aureus CFU/g 0
7 Bacilus cereus CFU/g 10
8 Salmonella spp. CFU/25g 0
4. Đối tượng sử dụng
Công bố sản phẩm phải chỉ rõ: Người bệnh được chỉ định ăn qua ống thông; người bệnh kém hấp thu hoặc ăn
uống khó khăn; người bệnh suy nhược cơ thể; người bệnh trước hoặc sau phẫu thuật; người có nhu câu thay
thế bữa ăn, bổ sung dinh dưỡng.
*Sản phẩm thích hợp sử dụng cho người lớn và trẻ em từ 4 tuổi trở lên, có thể sử dụng cho phụ nữ mang thai
và cho con bú dưới sự hướng dẫn của bác sĩ. 5. Nội dung ghi trên nhãn
Ngoài việc phải đáp ứng các yêu câu tại Điều 6 của Thông tư 43/2014/TT- BYTBYT, nhãn thực phẩm dinh
dưỡng y học và thực phẩm dùng cho chế độ ăn đặc biệt phải đáp ứng các điều kiện sau đây:
- Thực phẩm dinh dưỡng y học phải ghi cụm từ thể hiện tên nhóm thực phẩm: “Thực phẩm dinh dưỡng y học”
trên mặt chính của nhãn để phân biệt với thực phẩm thông thường và ghi dòng chữ: “Sử dụng cho người bệnh
với sự giám sát của nhân viên y tế”.
- Thực phẩm dùng cho chế độ ăn đặc biệt phải ghi cụm từ: “Sản phẩm dinh dưỡng (cho đối tượng cụ thể)”
trên mặt chính của nhãn để phân biệt với thực phẩm thông thường.
- Phải có hướng dẫn chi tiết quy trình vệ sinh dụng cụ và cách thức pha để bảo đảm vệ sinh, an toàn thực phẩm
và đủ dinh dưỡng, phù hợp với tình trạng sức khỏe của đối tượng sử dụng.
- Yêu câu về hướng dẫn cách sử dụng: Phải rõ ràng, chi tiết
Sản phẩm được sử dụng để nuôi ăn qua ống thông hoặc dùng uống trực tiếp. Lắc kỹ trước khi sử dụng. Lượng
khuyến nghị thông thường:
Trẻ 4-8 tuổi: 1 hộp 237 ml/ngày. Trẻ từ 9-13 tuổi: Tùy theo nhu câu dinh dưỡng có thể dùng tối đa 3-5 hộp
237 ml/ngày hoặc 1 – 2 hộp 500 ml/ngày. Trẻ từ 14 tuổi trở lên và người lớn: Tùy theo nhu câu dinh dưỡng có
thể dùng tối đa 3- 6 hộp 237 ml/ngày hoặc 2-3 hộp 500 ml/ngày.
*Lượng khuyến nghị cho từng bệnh nhân cụ thể cân theo hướng dẫn của chuyên gia y tế.
B. Phương pháp thử
1. Nhóm các chỉ tiêu vật lý- cảm quan
Phương pháp: Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt các yêu câu đã nêu trên. 2. Nhóm các chỉ tiêu chất lượng
2.1. Thành phân đa lượng
2.1.1. Định lượng protein tổng: Đo độ hấp thụ thực của protein ở bước sóng 280 nm
31
Nguyên lý: Protein trong dung dịch hấp thụ tia tử ngoại ờ bước sóng 280 nm, do sự có mặt các amino acid dây
thơm, chủ yếu là tyrosin và tryptophan trong cấu trúc protein.
Tiến hành: Dung dịch thử: Pha loãng mẫu thử đến hàm lượng protein trong khoảng 0,2 mg/ml đến 2 mg/ml
bằng dung dịch đệm thích hợp. Dung dịch chuẩn: Pha loãng mẫu chuẩn bằng cùng dung dịch đệm với mẫu thử
và có hàm lượng protein tương ứng với mẫu thử. Giữ dung dịch thử và chuẩn ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ
các dung dịch này bằng cóng thạch anh ở bước sóng 280 nm (Phụ lục 4.1 DĐVN V), dùng nước cất làm mẫu
trắng. Hàm lượng protein trong mẫu thử (Cu) được tính bởi:
công thức: Cu = Cs (Au/As)
Trong đó: Cs là hàm lượng protein trong dung dịch chuẩn; Au là độ hấp thụ của mẫu thử; As là độ hấp thụ của
dung dịch chuẩn.
2.1.2. Định lượng chất béo tổng
Nguyên lý: Dựa trên phản ứng của lipid với vanilin trong môi trường acid sulfuric và acid phosphoric tạo
thành hợp chất màu.Đo hợp chất màu này ở bước sóng 540 nm, từ đó xác định hàm lượng lipid trong mẫu thử.
Tiến hành: Mẫu thử được điều chỉnh bằng nước cất để có nồng độ protein khoảng 200 μg/ml. Hút dung dịch
dâu ô liu (olive oil) chuẩn 500 μg/ml vào các ống nghiệm lân lượt 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; thêm nước
cất vừa đủ 1 ml. Hút 1 ml mẫu thử vào ống nghiệm, 1 ml nước cất vào mẫu trắng. Thêm 3 ml acid sulfuric. 95
% vào môi ống nghiệm, lắc mạnh bằng máy lắc. Đun cách thủy 100 °C trong 10 min, làm lạnh bằng nước đá
trong 5 min. Thêm 13 ml dung dịch phospho vanilin (TT) vào môi ống nghiệm, lắc kỹ. Đun cách thủy 37 °C ±
2 °C trong 30 min, làm lạnh, để yên ở nhiệt độ phòng 30 min. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 540
nm, dựng đường chuẩn, từ đó tính ra hàm lượng lipid trong mẫu thử. Đơn vị tính: μg/100 μg protein. Cách pha
các dung dịch: Dung dịch dâu ô liu (olive oil) chuẩn 5000 μg/ml: Cân 0,25 g olive oil vào bình định mức 50
ml, thêm ethanol (TT) vừa đủ, lắc kỹ. Bảo quản dung dịch ở 4 °C đến 7 °C, dùng trong 1 tháng. Trước khi
dùng, pha loãng 10 lân bằng nước cất. Dung dịch vanilin 0,6 %: Hòa tan 6,0 g vanilin (TT) trong 6 ml đến 7
ml ethanol (TT), chuyển vào bình định mức 1 L, thêm nước cất đến định mức. Dung dịch phospho vanilin:
Cho 350 ml dung dịch vanilin 0,6 % và 50 ml nước cất vào cốc thủy tinh, khuấy đều. Thêm 600 ml acid
phosphoric 85 % (TT) trong khi đang khuấy từ.
2.2. Thành phân vi lượng
2.2.1. Định lượng vitamin A và vitamin E bằng phương pháp HPLC
a-Hoá chất thuốc thử:
+ Methanol tinh khiết sắc ký.
+ Nước tinh khiết sắc ký.
+ Ethanol tuyệt đối (TT). b-Điều kiện sắc ký:
+ Cột RP 18 (250mm x 4.6mm; 10µm). + Detector UV : Vitamin A - 330 nm; Vitamin E - 284 nm.
+ Tốc độ dòng : 1 - 2 ml/phút. + Pha động : Methanol - nước - ethyl acetate (93: 3: 7).
+ Thể tích tiêm : 20µl.
32
+ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 250 mg vào bình định mức 100ml, thêm 50ml ethanol tuyệt đối, lắc
kỹ. Thêm vừa đủ ethanol tuyệt đối tới vạch , lắc đều, lọc.
+ Dung dịch chuẩn: Pha riêng rẽ từng dung dịch chuẩn vitamin E và vitamin A trong ethanol tuyệt đối để thu
được dung dịch có nồng độ tương đương với dung dịch thử, lọc.
+ Lân lượt tiêm dung dịch thử và dung dịch chuẩn của Vitamin A và Vitamin E.
+ Sắc ký đồ thu được theo thời gian lưu tăng dân các vitamin sẽ được tách ra theo thứ tự Vitamin A ra trước
rồi đến Vitamin E ra sau.
+ Kết quả: Từ diện tích hoặc chiều cao pic và nồng độ của Vitamin A và Vitamin E trong dung dịch chuẩn và
dung dịch thử, tính được hàm lượng Vitamin A và vitamin E. 2.2.2. Định lượng vitamin B3, vitamin B6 và
vitamin C bằng phương pháp HPLC Cột RP 18 (250mm x 4.6mm; 5µm). Detector UV : 280 nm. Tốc độ
dòng : 1,2 ml/phút. Pha động :
- Natri heptansulfonat 1,1g
- Kali clorid 2,0g. - Acid acetic băng 10ml. - PEG 2ml.
- Nước cất 838 ml. - Methanol vừa đủ 1000ml. Thể tích tiêm: 20µl. - Dung dịch thử: Cân chính xác chế phẩm
khoảng 250mg cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml dung dịch acid acetic 1% , lắc để hoà tan, thêm acid
acetic 1% vừa đủ, lắc đều, lọc. Đo HPLC.
- Dung dịch chuẩn: chuẩn bị riêng từng dung dịch chuẩn các Vitamin C, Vitamin B3, Vitamin B6 trong dung
dịch Acid acetic 1% để có nồng độ các vitamin tương đương với dung dịch thử, lọc. Đo HPLC.
- Kết quả: Từ diện tích hoặc chiều cao pic và nồng độ của các vitamin trong dung dịch chuẩn và dung dịch
thử, tính được hàm lượng các vitamin B3, B6, và vitamin C.
2.2.3. Định lượng nguyên tố vi lượng
Kiểm nghiệm khoáng chất và vi khoáng là nhóm chỉ tiêu cơ bản đã được Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia thực hiện phân tích với các quy trình đã được tối ưu, được công nhận ISO/IEC 17025 \
Định lượng Ca, Fe, Zn bằng ICP-OES( quang phổ phát xạ plasma)
Định lượng iod bằng ICP-MS( phổ khối plasma cảm ứng)
2.2.4. Kiểm nghiệm acid amin
Định lượng từng acid amin bằng phương pháp sắc ký ( sắc ký lỏng áp suất thấp hoặc áp suất cao)
Tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin sắc ký trao đổi ion tạo dẫn chất sau cột với thuốc thử ninhydrin
là một trong các kỹ thuật thông dụng nhất để phân tích định lượng các acid amin. Theo nguyên tắc, sắc ký trao
đổi cation, dùng lithi làm đổi ion trong pha động được áp dụng để phân tích các mẫu thử sinh học phức tạp;
trái lại, sắc ký trao đổi cation, dùng natri làm đổi ion trong pha động, nhanh hơn, được dùng với các mẫu thứ
đơn giản hơn, gồm hôn hợp các acid amin đã được thủy phân từ protein/peptid ra. Việc phân tích acid amin
trên cột trao đổi ion được thực hiện thông qua sự phối hợp giữa thay đổi pH và thay đổi lực ion của pha động
(chương trình dung môi), phương trình nhiệt độ cũng thường được áp dụng để tăng nhanh sự phân tách. Các
33
acid amin bậc nhất tác dụng với ninhydrin cho hợp chất màu tím, hấp thụ cực đại ở bước sóng 570 nm. Trái
lại, các acid amin bậc 2 (các amino acid) như prolin, tác dụng với ninhydrin cho hợp chất màu vàng, hấp thụ
cực đại ở 440 nm. Vì vậy ta phát hiện các dẫn chất của acid amin thu được sau cột ở các bước sóng 440 nm và
570 nm. 3. Nhóm chỉ tiêu an toàn
3.1. Xác định hàm lượng kim loại nặng
Phương pháp kiểm nghiệm:
Kiểm nghiệm kim loại nặng là nhóm chỉ tiêu cơ bản đã được Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm
quốc gia thực hiện phân tích với các quy trình đã được tối ưu, được công nhận ISO/IEC 17025, bao gồm:
- Kiểm nghiệm kim loại nặng – các nguyên tố: chì, cadmi, asen, thủy ngân, thiếc, antimon, cobalt, nickel,
crom, mangan, đồng, selen, molybden) bằng ICP-MS
- Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố chì bằng GF-AAS
- Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố cadmi bằng GF-AAS
- Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố asen bằng HVG-AAS
- Kiểm nghiệm kim loại nặng – nguyên tố thủy ngân bằng thiết bị phân tích trực tiếp DMA-80.
3.2. Kiểm nghiệm vi khuẩn gây bệnh
Kiểm tra giới hạn vi sinh vật để đảm bảo không có nhiễm các vi khuẩn và nấm mốc gây bệnh bằng các thử
nghiệm vi sinh. Các phép thử này thường được thực hiện bằng cách ủ dung dịch thử trong môi trường nuôi cấy
vi sinh vật và đếm các khuẩn lạc hình thành sau một khoảng thời gian nhất định. Việc lựa chọn môi trường
nuôi cấy và thời gian thử nghiệm, cũng như duy trì các điều kiện vô trùng trong quá trình thử nghiệm là rất
quan trọng để đánh giá chính xác độ nhiễm vi sinh vật bằng phương pháp này.
BÀI TẬP 2.4. SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 01 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DINH
DƯỠNG DÙNG CHO NGƯỜI TIỂU ĐƯỜNG CHỨA PROTEIN, CARBOHYDRAT:
 Sữa Quasure Light Bibica (400g/ lon)
a,Trình bày cách phân loại và hệ thống quản lý nhà nước của sản phẩm
Cách phân loại: Thực phẩm dinh dưỡng đặc biệt
Hệ thống quản lý nhà nước của sản phẩm:
Chính phủ có vai trò quan trọng trong việc quản lý sản phẩm sữa Quasure Light BIBICA, đặc biệt là về các
quy định pháp lý và chính sách hỗ trợ cho các hoạt động sản xuất và kinh doanh của công ty BIBICA.
-Chính phủ đóng vai trò quan trọng trong việc đưa ra các quy định pháp lý và quy chuẩn về chất lượng sản
phẩm, bảo vệ quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng, và đảm bảo sự cạnh tranh công bằng trong thị
trường. Các quy định pháp lý này bao gồm các quy định về tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm, quy định về an
34
toàn thực phẩm, quy định về đóng gói và nhãn mác, quy định về bảo vệ môi trường và quy định về hành chính
kinh doanh.
-Ngoài ra, Chính phủ cũng có trách nhiệm hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt động sản xuất và kinh
doanh của công ty BIBICA, nhằm phát triển kinh tế, tạo việc làm và đóng góp vào ngân sách quốc gia. Việc
hỗ trợ có thể là thông qua các chính sách thuế, tài chính, đầu tư, khuyến khích nghiên cứu và phát triển công
nghệ, hoặc hỗ trợ đào tạo và phát triển nhân lực.
Tóm lại, chính phủ đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo tính an toàn, chất lượng và công bằng trong
các hoạt động sản xuất và kinh doanh của công ty BIBICA, cũng như hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho các
hoạt động này nhằm phát triển kinh tế đất nước.
Bộ Y tế sẽ yêu cầu Công ty Cổ phần Sữa BIBICA phải đăng ký và cấp phép sản phẩm trên thị trường theo quy
định của pháp luật về thực phẩm. Theo đó, BIBICA phải đáp ứng các tiêu chuẩn về chất lượng, vệ sinh an
toàn thực phẩm và các yêu cầu khác trước khi được cấp phép lưu hành trên thị trường.
-Bên cạnh đó, Bộ Y tế sẽ thường xuyên kiểm tra và giám sát sản phẩm sữa Quasure Light BIBICA trên thị
trường, bao gồm cả quá trình sản xuất, đóng gói, vận chuyển và bảo quản của sản phẩm, để đảm bảo sản phẩm
đáp ứng các tiêu chuẩn về chất lượng và an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng. Nếu sản
phẩm vi phạm các quy định và tiêu chuẩn này, Bộ Y tế sẽ có các biện pháp xử lý tương ứng để đảm bảo an
toàn và sức khỏe của người tiêu dùng.
- Ngoài Bộ Y tế, sản phẩm sữa Quasure Light BIBICA còn chịu sự quản lý của nhiều bộ phận khác trong nhà
nước, nhằm đảm bảo tính an toàn, chất lượng và công bằng trong các hoạt động sản xuất và kinh doanh.
Một số bộ phận khác trong nhà nước có trách nhiệm quản lý sản phẩm này bao gồm:
-Bộ Công Thương: Bộ này có trách nhiệm quản lý các hoạt động kinh doanh và thị trường, bao gồm cả hoạt
động sản xuất, đóng gói, vận chuyển và bán lẻ sản phẩm sữa Quasure Light BIBICA trên thị trường.
-Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn: Bộ này có trách nhiệm quản lý hoạt động sản xuất, chăn nuôi, thu
hoạch và chế biến các sản phẩm từ nguồn nguyên liệu nông nghiệp, trong đó có sữa và các sản phẩm liên quan
đến sữa.
-Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng: Tổng cục này có trách nhiệm quản lý và đưa ra các quy định và
tiêu chuẩn về chất lượng và đo lường trong các hoạt động sản xuất, trong đó có sản phẩm sữa Quasure Light
BIBICA.
-Cục An toàn vệ sinh thực phẩm: Cục này có trách nhiệm đảm bảo an toàn và vệ sinh thực phẩm trên toàn
quốc, bao gồm cả sữa và các sản phẩm từ sữa.
-Tất cả các bộ phận này đều có trách nhiệm đảm bảo rằng sản phẩm sữa Quasure Light BIBICA đáp ứng các
tiêu chuẩn về chất lượng và an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng.
- UBND đóng vai trò quan trọng trong việc quản lý sản phẩm sữa Quasure Light BIBICA tại địa phương, đảm
bảo tính an toàn và phát triển bền vững của hoạt động sản xuất và kinh doanh của công ty BIBICA.
b,Dự thảo tiểu chuẩn cơ sở với sản phẩm này:
TÊN CƠ QUAN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TC
CHỦ QUẢN
35
BIBICA Sữa QUASURE Light Có hiệu lực từ
400g ngày ... tháng... năm...
Yêu cầu kỹ thuật:
2.1. Các chỉ tiêu cảm quan:
TT Chỉ tiêu Yêu cầu
1 Trạng thái Dạng bột, đồng nhất, không bị vón cục, không có tạp chất lạ
2 Màu sắc Từ màu trắng sữa đến màu kem nhạt
3 Mùi Mùi thơm vani đặc trưng, không có mùi lạ
4 Vị Vị ngọt, không có vị lạ
2.2. Các chỉ tiêu hóa lý

Là yêu cầu kỹ thuật của nhà sản xuất, nếu Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia có các chỉ tiêu này thì cần phải tham
chiếu:
Mức Phương pháp thử
Đơn
TT Tên chỉ tiêu công
vị tính
bố
Độ ẩm % < 5% TCVN 7729:2007 (ISO 5537:2004) Sữa bột – Xác định

độ ẩm (phương pháp chuẩn)
1
Hàm lượng protein sữa % TCVN 7774:2007(ISO 5542:1984), TCVN 8099-1:2009

trong chất khô không (ISO 8968-1:2001), TCVN 8099-5:2009 (ISO 8968-
béo của sữa. 34 5:2001).
2
TCVN 7774:2007 (ISO 5542:1984) Sữa – Xác định hàm
lượng protein – Phương pháp nhuộm đen amido (Phương
pháp thông thường)
2.3. Các chỉ tiêu vi sinh vật

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Mức tối đa Phương pháp thử
1 Coliforms CFU/g 10 TCVN
36
2 E.Coli CFU/g 0 TCVN
3 Clostridium perfringens CFU/g 5 TCVN
4 Tổng số BTNM-NM CFU/g 102 TCVN
5 Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g 104 TCVN
6 S. aureus CFU/g 0 TCVN
7 Bacillus cereus CFU/g 10 TCVN
8 Salmonella spp. CFU/25g 0 TCVN
1.4. Hàm lượng kim loại nặng

Đơn vị Mức tối Phương pháp thử
TT Tên chỉ tiêu
tính đa
Arsen (As) 0.3 TCVN 7601:2007

1 ppm Thực phẩm – Xác định hàm lượng asen bằng phương pháp bạc
dietyldithiocacbamat
Chì (Pb) 3 TCVN 7933:2008 (ISO 6733:2006), TCVN 7929:2008 (EN

14083:2003)
2 ppm
Xác định hàm lượng chì Phương pháp quang phổ hấp thụ
nguyên tử dùng lò graphit.
3 Thủy ngân (Hg) ppm 0.1 TCVN 7993:2008 (EN 13806:2002)

Cadimi (Cd) ppm 1 TCVN 7603:2007
4 Thực phẩm – Xác định hàm lượng cadimi bằng phương
pháp quang phổ hấp thụ nguyen từ
Thành phần cấu tạo:

Dinh Dưỡng Đơn Bột(mỗi Yêu cầu công bố Phương pháp
vị 100g) kiểm nghiệm
Protein g 18 ± 10% TCVN
Chất béo g 14 ± 10% TCVN
MCT g 1,6 ± 10% TCVN
PUFA g 2 ± 10% TCVN
MUFA g 5,4 ± 10% TCVN

37
Carbohydrat T g 58 Công bố định lượng hoạt chất nếu kiểm nghiệm định TCVN
lượng được, sai số 10 %. Công bố định tính nếu chỉ
kiểm nghiệm được định tính.
Isomalt g 15 Công bố định lượng hoạt chất nếu kiểm nghiệm định TCVN
Inulin g 5 Công bố định lượng hoạt chất nếu kiểm nghiệm định TCVN
VITAMIN/Vitamins
*Thành phần chứa trên 05 vitamin thì kiểm nghiệm >50% số vitamin nhưng không ít hơn 04 (ưu tiên
vitamin tan trong dầu)
Vitamin A mcg 550 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
không nhỏ hơn 20% hàm lượng ghi trên nhãn và không
lớn hơn hàm lượng quy định tại thông tư 43/2014/TT-
BYT)
Vitamin D mcg 6 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
BYT)
Vitamin C mg 78 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
BYT)
Acid Folic mg 120 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
BYT)
D-biotin mcg 30 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
BYT)
38
Beta-caroten mcg 600 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
BYT)
NGUYÊN TỐ VI LƯỢNG
Natri mg 440 Công bố định lượng các nguyên tố vi lượng đã kiểm TCVN
nghiệm (sai số không nhỏ hơn 20% hàm lượng ghi trên
nhãn và không lớn hơn hàm lượng quy định tại thông tư
43/2014/TT-BYT)
Kali mg 860 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
không nhỏ hơn 20% hàm lượng ghi trên nhãn và không lớn
hơn hàm lượng quy định tại thông tư 43/2014/TT-BYT)
Clo mg 260 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
Canxi mg 500 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
Phospho mg 486 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
Magie mg 100 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
Sắt mg 7,5 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
Kẽm mg 4,5 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
I-ốt mcg 60 Công bố định lượng các vitamin đã kiểm nghiệm (sai số TCVN
39
Chỉ tiêu về khả năng hòa tan của sữa bột
Chỉ tiêu Đơn vị Yêu cầu
Chỉ số hòa tan ml Theo TCVN
Độ phân tán Theo TCVN
Phương pháp thử:

Độ phân tán: cho 10g sữa bột gầy hoặc 13g sữa bột nguyên cream vào 100ml nước ở 20 , khuấy đều trong
20 giây rồi cho hỗn hợp vào bình thử
Chỉ số hòa tan: phương pháp chung xác định chỉ số hòa tan là cho 10g sữa bột gầy ( hoặc 13g sữa bột
nguyên kem) vào 100ml nước ở 20 khuấy trộn trong một thời gian xác định, sau đó đem li tâm trên thiết bị
chuẩn với số vòng quay và thời gian xác định. Sau quá trình li tâm, ta tách bỏ một thể tích xác định phần
lỏng, tiếp cho một lượng nước cất vào ống ly tâm, lắc đều rồi đem ly tâm lần hai. Thể tích cặn thu được
chính là chỉ số hào tan của sản phẩm sữa bột. Vậy chỉ số hòa tan càng lớn thì độ hòa tan càng thấp.
Thời hạn sử dụng: Có nêu rõ vị trí ghi ở đâu trên bao bì của sản phẩm bán lẻ, ghi rõ thời hạn sử dụng,
tham khảo Nghị định số 89/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 08 năm 2006 của Chính phủ về nhãn hàng hóa.
Hướng dẫn sử dụng và bảo quản:
Hướng dẫn sử dụng: Cho khoảng 120-130ml nước sôi để ấm (50oC) vào ly sạch . Thêm vào 4 muỗng bột
(35g). Khuấy trộn đều được 150ml dung dịch Quasure light cũng cấp 150kcal.
Bảo quản :Bảo quản và trưng bày ở nơi khô ráo, thoáng mát; Không cần bảo quản trong tủ lạnh; Nên sử
dụng hết trong 1 tháng sau khi mở nắp; sau khi pha xong, nên dùng ngay hoặc đậy kín và sử dụng trong 2
giờ.,
Chất liệu bao bì và quy cách bao gói.
Sữa bột đóng hộp thiếc 400g
Nội dung ghi nhãn:
Việc ghi nhãn các sản phẩm sữa dạng bột phải theo đúng quy định tại Nghị định số 89/2006/NĐ-CP ngày
30/08/2006 của Chính phủ về nhãn hàng hóa và các văn bản hướng dẫn thi hành.
8.Xuất xứ và thương nhân chịu trách nhiệm về chất lượng hàng hóa
Sản phẩm của: CÔNG TY CỔ PHẦN BIBICA
Địa chỉ: 443 Lý Thường Kiệt, Phường 8, Q.Tân Bình, TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam.
Sản xuất tại : Công Ty Cổ Phần Dược Phẩm IMEXPHARM
Đường số 2A, KCN Vĩnh Lộc, Q.Tân Bình, TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam.
40
BÀI 3.1. SO SÁNH ĐIỂM GIỐNG NHAU VÀ KHÁC NHAU CỦA PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ MẪU
BẰNG CHƯNG CẤT, CHIẾT LỎNG- LỎNG VÀ CHIẾT PHA RẮN ? (TRANG 40,44)
Phương pháp chưng cất Phương pháp chiết lỏng-lỏng Phương pháp chiết pha rắn
Chưng cất là kỹ thuật Hai pha lỏng không trộn lẫn được Mẫu ở trạng thái lỏng hay hơi còn chất
tách dựa trên sự khác biệt vào nhau, trong hai dung môi này chiết ở dạng rắn, thể hạt nhỏ, xốp (5-10 µm
về điểm sôi của các chất có thể có một dung môi chứa chất đường kính). Chất chiết gọi là pha tĩnh và
theo đó có thể lấy được phân tích được để trong một dụng được nhồi vào cột sắc ký nhỏ (kích thước
một chất hay một nhóm cụ chiết (phễu chiết). Khi lắc chiết,
10 x 1cm hay dung lượng 5- 10 mL). Chất
chất dựa vào mức độ sai chất phân tích sẽ được phân bố chiết là các hạt silica trung tính, các hạt
biệt về nhiệt độ sôi, trang vào hai dung môi theo tính chất nhôm oxide hay silicagel đã alkyl hóa nhóm
thiết bị và điều kiện của chúng để đạt tới trạng thái cân
-OH bằng những nhóm alkyl mạch thẳng
(nhiệt độ) chưng cất. bằng. C2, C4, C8 hay C18 v.v. hay nhóm phenyl.
Hạt nhồi được chế tạo trong điều kiện
tương tự như điều kiện chế tạo pha tĩnh của
HPLC nhưng các hạt này có độ xốp lớn hơn
và diện tích bề mặt xốp thường từ 50-200
m2/g. Khi xử lý mẫu, dung dịch chứa chất
phân tích được đưa lên cột có chứa pha rắn
này. Pha tĩnh sẽ tương tác với các chất mẫu
và giữ lại một nhóm chất phân tích, còn các
nhóm khác sẽ đi ra khỏi cột cùng với dung
môi hòa tan mẫu. Như thế nhóm chất phân
tích tồn tại trên pha tĩnh và sẽ được rửa giải
ra khỏi cột bằng một dung môi thích hợp.
- Nhiệt độ chưng cất. - Hệ số nhiệt động KD của cân - Pha tĩnh hấp phụ hay trao đổi chọn lọc với
bằng chiết là yếu tố quyết định một nhóm chất phân tích
hiệu quả của sự chiết. - Hệ số KD phải lớn
- Dung môi chiết phải tinh khiết - Quá trình chiết xảy ra nhanh, đạt cân bằng
cao, để không làm nhiễm bẩn thêm nhanh
các chất phân tích vào mẫu. - Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch
- Dung môi chiết phải hoà tan tốt cao để rửa giải thuận lợi
các chất phân tích, nhưng lại - Điều kiện chiết xuất càng đơn giản càng
không hoà tan tốt với các chất tốt.
khác có trong mẫu.
Có 3 kiểu chưng cất: Có 2 PP chiết: Có 5 kiểu chiết:

+ Chưng cất thông + Chiết tĩnh + Chiết theo cơ chế hấp phụ pha thường
thường + Chiết theo dòng chảy liên tục. (silica trung tính và aluminium oxit)
+ Chưng cất lôi cuốn hơi + Chiết theo cơ chế hấp phụ pha đảo (silica
41
nước gel được alkyl hóa nhóm OH)
+ Chưng cất áp suất thấp + Chiết theo cơ chế có khả năng trao đổi
(cô quay chân không). ion (cationit, anionit, cặp ion)
+ Chiết theo cơ chế rây hay sàng lọc phân
tử theo kích thước
+ Chiết theo cơ chế hấp phụ pha khí-rắn
(purge and trap extraction)
- Làm sạch các tạp chất - Được ứng dụng phổ biến và rất - Chiết pha rắn là kỹ thuật chiết mới ra đời,
như các chất keo, nhựa có hiệu quả trong lĩnh vực tách đang phát triển và được ứng dụng trong
bẩn, … trong quá trình chiết và làm giàu các chất phân khoảng vài chục năm trở lại đây nhất là ở
sản xuất rượu hoặc tích phục vụ cho việc xác định các nước tiên tiến.
chưng cất tinh dầu. hàm lượng vết của chúng trong
- Thu các sản phẩm từ mẫu. Nhất là tách và làm giàu các
quá trình như chưng cất kim loại, các chất hữu cơ độc hại
rượu, chưng cất cồn và trong các loại mẫu nước, nước
chưng cất tinh dầu, … thải, nước biển, nước khoáng.
- Nâng cao chất lượng
của sản phẩm vì qua quá
trình chưng cất sẽ đem
đến sản phẩm có độ tinh
khiết cao hơn.
*Ưu điểm: + PP chiết đơn giản, + Có tính chọn lọc với các hợp
- Là phương pháp đơn giản, hiệu quả đế tách các dễ thực hiện chất hữu cơ vì thế thích hợp
hợp chất hữu cơ từ mẫu + Thích hợp cho cả cho phân tích vết
- Có thể được thực hiện với các thiết bị đơn giản, chiết phân tích và + Thao tác đơn giản, nhanh
giá thành thấp và thời gian phân tích ngắn\ chiết điều chế lượng hơn các kỹ thuật khác.
- Cho phép tách các hợp chất từ mẫu theo các bậc lớn + Trong quá trình chiết có cả
nhiệt độ khác nhau, giúp cho việc xác định thành + Lấy riệng chất PT, sự làm giàu chất phân tích.
phần của mẫu dễ dàng hơn loại được các chất ảnh
*Nhược điểm: hưởng, nhất là chất
- Không hiệu quả khi phân tích các hợp chất với nền của mẫu
nhiệt độ sôi tương đương nhau hoặc quá gần + Thích hợp cho làm
nhau, dẫn đến việc khó tách các chất ra khỏi giàu lượng nhỏ chất
nhau phân tích (có thể 10-
- Không thể phân tích được cá hợp chất không 50 lần)
bay hơi hoặc các hợp chất có tính chất khacsnhau + Phục vụ cho chiết
về áp suất hơi cấc mẫu vô cơ và hữu
Có thể làm giảm hoặc mất độ tinh khiết của mẫu cơ
nếu quá trình chưng cất không được thực hiện + Sản phẩm chiết phù
đúng cách hợp được cho nhiều
phương pháp phân
tích.
42
BÀI TẬP 3.3. THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE X CÓ THÀNH PHẦN NHƯ SAU:
Đảng Sâm 250 mg Phục Thần 250 mg Toan táo nhân sao 250 mg
Viễn Chí 150 mg Tá dược vừa đủ
Cách đóng gói: Hộp 3 vỉ x 100 viên Dạng bào chế: Viên nang mềm
Đề xuất phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu để phân tích chế phẩm này. (TRANG 37)
 Các khái niệm cơ bản
1.1: Mẫu phân tích:
Mẫu phân tích là một lượng mẫu quy định ( tính theo khối lượng hay thể tích) với lượng tối thiểu cần
thiết được lấy từ đối tượng phân tích. Mẫu phân tích được đóng gói , bảo quản rồi đem về phòng thí
nghiệm để phân tích các chỉ tiêu cần thiết, mẫu phải đúng và đại diện cho đối tượng cần phân tích.
1.2: Lấy mẫu phân tích:
Lấy mẫu phân tích là các thao tác kỹ thuật nhằm thu được một lượng đối tượng cần phân tích mang về
phòng thí nghiệm, xử lí thành dung dịch mẫu đồng nhất rồi tiến hành phân tích để xác định các chỉ tiêu
cần thiết.
1.3: Xử lí mẫu phân tích
Xử lý mẫu phân tích là quá trình vật lí và hóa học để phân hủy, phá hủy cấu trúc của các chất trong
mẫu ban đầu. Sau đó mẫu được hòa tan để giải phóng và chuyển các chất cần xác định về một dạng
đồng thể phù hợp với phương pháp phân tích đã chọn.
1.4: Thực phẩm chức năng dạng viên nang:
Thực phẩm chức năng dạng viên nang là thực phẩm – thuốc chứa một hay nhiều hoạt chất trong vỏ
nang. Vỏ nang thường được làm từ gelatin hay tinh bột.
1.5: Kiểm nghiệm viên nang mềm:
Kiểm nghiệm viên nang mềm là việc lấy mẫu, xem xét các tiêu chuẩn kĩ thuật, tiến hành các thử
nghiệm tương ứng và cần thiết nhằm xác định viên nang mềm đó có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng để
quyết định việc chấp nhận sử dụng hay loại bỏ nó.
2:Các quy định
2.1:Yêu cầu đối với người lấy mẫu:
 Là thành viên của đoàn thanh tra, kiểm tra.
 Được đào tạo và có chứng chỉ về kỹ thuật lấy mẫu thực phẩm.
 Phải trực tiếp lấy mẫu tại cơ sở hoặc theo chỉ định của đoàn thanh tra.
 Phải tiến hành lập Biên bản lấy mẫu, Biên bản bàn giao mẫu và dán tem niêm phong theo mẫu được
quy định.
43
2.2: Trách nhiệm của người lấy mẫu:
 Phải chuẩn bị đầy đủ thủ tục, dụng cụ, thiết bị lấy mẫu và bảo quản mẫu.
 Thực hiện đúng các quy trình kỹ thuật đảm bảo tính khách quan, trung thực trong quá trình lấy mẫu,
vận chuyển và bàn giao mẫu cho đơn vị kiểm nghiệm
2.3: Quá trình lấy mẫu :
 Quá trình lấy mẫu phải được giám sát và ghi chép đầy đủ. Tất cả các dấu hiệu không đồng nhất, hư
hỏng của sản phẩm và bao bì bảo quản đều phải ghi chép lại.
 Sau khi kết thúc quá trình lấy mẫu, mẫu kiểm nghiệm phải được bàn giao ngay cho đơn vị kiểm
nghiệm trong thời gian sớm nhất.
3:Phương pháp tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu
3.1: Chuẩn bị mẫu phân tích để xác định hàm lượng kim loại nặng:
3.1.1 . Lấy mẫu, sơ chế :
- Chọn một số viên sao cho có lượng mẫu tối thiểu 20 gam và tối đa 50 gam、tách bỏ vỏ, cho vào lọ
thủy tinh trung tính nút nhám ( hay tốt nhất là lọ PE ) -> đậy nút kín và bảo quản trong tủ lạnh ở 4 -
7°C dùng trong 3 tuần.
3.1.2 . Chuẩn bị mẫu
*Phương pháp xử lý ướt trong lò vi sóng :
Cân lấy 1,500 gam mẫu vào bình chứa mẫu, nhũ hóa bằng 4 mL nước cất hai lần, lắc đều, thêm 20 mL
acid 65 % và 3 mL H2O, 30 %, đậy nắp lắc đều, đặt bình mẫu vào hộp rotor của lò vi sóng , cài đặt
chương trình và tiến hành phân hủy mẫu . =>Sau đó chuyển định lượng toàn bộ mẫu sang cốc đun
dung tích 250 ml , đun sôi đều làm bay hơi hết acid dư ( tốt nhất là dùng đèn IR chiếu vào cốc mẫu đã
đun sôi ) , đến còn ẩm , để nguội , sau đó hòa tan bã bằng 25 mL dung dịch acid HNO , 5 % và định
mức thành mL , lắc đều . => Xác định các kim loại nặng ( As , Cd , Co , Cr , Cu , Hg , Mn , Ni , Pb ,
Zn ) bằng phương pháp AAS , hay ICP - OES , hoặc ICP – AMS.
3.2 . Chuẩn bị mẫu để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật ( HCBVTV )
3.2.1 . Lấy mẫu và sơ chế:
Chọn một số viên sao cho có lượng mẫu tối thiểu 30 gam và tối đa 50 gam , tách bỏ vỏ , cho vào lọ
thủy tinh trung tính nút nhám hay tốt nhất là lọ PE, đậy nút kín và bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 7°C
dùng trong 3 tuần, để phân tích các kim loại và cả HCBVTV.
3.2.2. Chuẩn bị mẫu:
Lấy 3,00 gam vào bình mẫu và nhũ hóa bằng 12 mL nước cất, lắc đều (mẫu B), để yên 40 phút. Sau
khi mẫu đã được ngâm nhũ hoá làm ướt đồng đều, chiết tách lấy các HCBVTV ra khỏi nền mẫu rồi
chuyển chúng vào dung môi clorofom bằng kỹ thuật chiết pha rắn hỗn hợp
44
3.2.3. Chuẩn bị mẫu để phân tích kháng sinh:
A. Lấy mẫu và sơ chế mẫu:
Chế phẩm nghiền thành bột, nhũ hóa bằng nước cất, tỷ lệ 1/3 - 1/4, lắc đều và ngâm trong 2 giờ trước
khi xử lý. Sau khi đã có mẫu đã nhũ hóa, để xử lý mẫu chiết tách các chất kháng sinh cần được tiến
hành như sau:
- Chiết tách các chất kháng sinh họ B-lactam:
+ Chiết bằng MeOH có 10% ACN, đệm phosphat 0,05 M và có pH = 9.
+ Chiết bằng ACN có 10 % H2O, đệm Phosphat 0,05M có pH=9.
45
B. Xử lý mẫu phân tích:
- Chiết tách các chất kháng sinh họ B-lactam:
Chiết lỏng – lỏng bằng hai cách sau đây: Chiết bằng MeOH có 10% ACN, đệm phosphat 0,05 M và
pH=9. Hoặc chiết bằng ACN có 10% H,O, đệm phosphat 0,05 M và pH=9.
- Chiết tách cloramphenicol:
Chiết lỏng – lỏng bằng dung môi methanol có 10% ACN
BÀI 3.4. THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE X CÓ THÀNH PHẦN CÔNG THỨC SAU:
Gừng tươi nguyên chất, Quế chi, Đại hồi, Địa liền
Cách đóng gói: Hộp 1 chai x 330ml
Đề xuất phương pháp lấy mẫu và xử lí mẫu để phân tích chế phẩm này. (TRANG 37,40)
Theo thông tư 14.2011.TT.BYT Khối lượng cần lấy để kiểm nghiệm thực phẩm chức năng là đối tượng sản
phẩm cần phân tích ở dạng lỏng nên quy đổi lượng cần lấy là 100ml -1500ml
• Lọ thể tích 330 ml trong mức cần thiết nên lấy 1 lọ đại diện tiến hành lấy mẫu phân tích.
THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ: Pipet dung tích từ 10ml đến 100ml. Chai lọ nút mài. Dụng cụ lấy mẫu chuyên
dùng để lấy mẫu tử trong sản phẩm
PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU
Kỹ thuật lấy mẫu:Lắc đều lọ sản phẩm mẫu phân tích, dùng pipet hay môi kim loại chuyển một lượng
cần thiết sản phẩm vào trong lọ đã được đốt nóng cổ trước.
46
Bảo quản mẫu: Sau khi lấy mẫu, mẫu được bảo quản ở điều kiện bình thường, tại phòng thí nghiệm
khô thoáng, có không khí sạch, không bị ánh nắng chiếu vào.
Phương pháp xử lý
Phương pháp chiết lỏng – lỏng
- Phương pháp chiết tĩnh: Là phương pháp chiết đơn giản, chỉ cần một số phễu chiết quả lê dung tích
100-250mL, có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm.
Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay hay máy lắc nhỏ.
- Nguyên tắc chiết:
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là hai pha lỏng không trộn lẫn được vào nhau, trong hai dung môi
này có thể có một dung môi chứa chất phân tích được để một dụng cụ chiết (phễu chiết). Khi lắc chiết,
chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo
tính chất của chúng để đạt tới trạng thái cân bằng. Vì thế hệ số nhiệt động KD của cân bằng chiết là
yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết. Chiết theo kiểu này có hai phương pháp là chiết tĩnh và chiết
theo dòng chảy liên tục. Trong phân tích, phương pháp chiết tĩnh được sử dụng phổ biến hơn.
BÀI TẬP 4.1: SO SÁNH ĐIỂM GIỐNG NHAU VÀ KHÁC NHAU CỦA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤT VỚI DUNG MÔI VÀ PHƯƠNG PHÁP KARL
FISCHER. (TRANG 51,52)
Giống nhau:
- Cả hai phương pháp đều được sử dụng để xác định độ ẩm.
- Cả hai đều đáp ứng các yêu cầu về độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại trong quá trình xác định hàm
lượng nước.
- Được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: hóa học, dược phẩm, thực phẩm và nước uống
Khác nhau:
Tiêu chí Phương pháp cất với dung môi Phương pháp Karl Fischer
Nguyên tắc Dựa vào tính chất và khả năng của 1 số Dựa trên phảm ứng toàn lượng nước với lưu
dung môi hữu cơ dễ bay hơi lôi cuốn huỳnh dioxyd (SO2) và iod (I2) trong dung môi
lượng nước chứa trong mẫu khan chứa 1 chất base hữu cơ thích hợp
H3C-OH + SO2 + RN  [RNH]SO3CH3
H2O + I2 + [RNH]SO3CH3 + 2RN 
[RNH]SO4CH3 + 2[RNH]I
Xác định Lỏng Lỏng, rắn

hàm lượng
nước trong
mẫu
47
Phù hợp Hàm lượng ẩm thấp Hàm lượng ẩm cao và thấp
Ứng dụng Thường được sử dụng để xác định độ ẩm Rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm,
thực phẩm có chứa nhiều chất dễ bay hơi dược phẩm, dầu mỏ, vật liệu xây dựng,...
hoặc chứa nhiều chất béo
Hóa chất Dung môi Toluen (hay dùng) Thuốc thử Karl Fischer và dung môi Methanol
(hay dùng)
Xác định Không cần xác định Có cần xác định

đương lượng
thuốc thử
Dụng cụ - Bình cầu (A) nối qua ống (D) với ống - Cốc chuẩn độ 60 ml gắn điện cực kép platin
hình trụ (B); ống này gắn với ống hứng - Ống dẫn khí nitrogen gắn với buret và gắn
chia độ (E) (được chia độ đến 0,1 ml) ở vào ống thông chứa chất hút ẩm
phía dưới và lắp với ống sinh hàn ngược - Máy khuấy từ hoặc khí nitrogen khô
(C) ở phía trên - Điện kế đi qua 2 cực platin
- Bếp điện có biến trở hoặc đun cách dầu
Tiến hành 1. Rửa sạch dụng cụ rồi làm khô * Chuẩn bị mẫu thử:
2. Thêm 200 ml toluen + 2 ml nước ● Cân chính xác 1 lượng mẫu thử chứa
vào bình khô, cất 2h - để nguội 30’  khoảng 10 - 50 mg nước đem định
đọc thể tích ống hứng (V1) lượng
3. Thêm chính xác 0,01g mẫu thử Thao tác phải nhanh và thực hiện trong
chứa 2 - 3 ml nước vào bình cầu phòng có độ ẩm thấp để tránh ẩm ở ngoài
4. Thêm mảnh đá, đun nóng nhẹ 15’ ảnh hưởng đến chất phân tích
5. Khi toluen sôi thì điều chỉnh nhiệt * Phương pháp định lượng trực tiếp:
với tốc độ là 2 giọt/s ● Cho khoảng 20 ml methanol khan vào
6. Khi được nửa ống hứng  tăng tốc bình chuẩn độ, chuẩn độ bằng thuốc
độ cất lên 4 giọt/s thử Karl Fischer đến điểm tương
7. Cất đến khi không thấy nước tăng đương
lên, dùng 5 – 10 ml toluen rửa thành ● Cho nhanh 1 lượng mẫu thử vào cốc
trong ống sinh hàn, tiếp tục cất 5’ chuẩn độ, đóng nút ngay, khuấy đều
8. Tách nguồn cất nhiệt, để ống hứng 1’(để phản ứng xảy ra)  chuẩn độ
nguội đến nhiệt độ phòng tiếp bằng thuốc thử Karl Fischer đến
9. Nếu còn nước dính trên thành ống điểm tương đương
thì dùng 5 ml toluen rửa kéo xuống Hàm lượng nước: X = N.F
10. Đợi lớp nước và lớp toluen đã * Phương pháp định lượng gián tiếp:
phân tách hoàn toàn, đọc thể tích (V2) Pha dung dịch nước chuẩn:
48
Hàm lượng nước trong mẫu - Pha 2 ml nước tinh khiết với methanol
khan 1000 ml
- Lấy chính xác 25 ml dung dịch này, chuẩn
thử: p% = độ bằng thuốc thử Karl Fischer đến điểm
tương đương
Hàm lượng nước dung dịch nước
chuẩn: W = V.F/25
Tiến hành:
- Cho một lượng methanol vào cốc định
lượng vừa đủ ngập điện cực, chuẩn độ bằng
thuốc thử Karl Fischer
- Cho nhanh chế phẩm vào cốc, đóng nút
ngay. Thêm tiếp thuốc thử Karl Fischer sao
cho thừa khoảng 1 ml. Đóng nút để yên 1’
(tránh ánh nắng, thi thoảng khuấy)
- Chuẩn độ phần thuốc thử Karl Fischer thừa
bằng dung dịch nước chuẩn vừa pha
Hàm lượng nước trong mẫu thử: A =
F.V1 – W.V2
Ưu điểm - Dễ làm, đơn giản - Là phương pháp tham chiếu có độ chính xác
- Ít hóa chất cao, nhanh chóng
- Nguyên liệu dễ kiếm - Thao tác thực hiện chuẩn độ đơn giản, ít tốn
kém
- Không phát hiện sự thất thoát của các chất
bay hơi trong quá trình chuẩn độ
- Phạm vi xác định độ ẩm rộng
- Chỉ cần 1 lượng mẫu nhỏ
Nhược điểm - Lâu, tốn thời gian - Phương pháp phải được điều chỉnh cho từng
- Ít chính xác, tính toán sai số, phức tạp mẫu cụ thể
- Tốn nhiều dung môi và sử dụng dung môi
methanol gây độc
- Nước trong 1 số hóa chất hữu cơ như
aldehyde, xeton,... không phù hợp trong
phương pháp này
- Không phù hợp với các dung môi như LiCl
(Lithium Clorua)
BÀI TẬP 4.2: CHỈ RA VÀ PHÂN TÍCH CÁC KỸ THUẬT QUAN TRỌNG CỦA PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH ĐỘ NHỚT, ĐỘ CỨNG VÀ ĐỘ BÀO MÒN.
49
Các phương pháp xác định độ nhớt, độ cứng, độ bào mòn
- Độ nhớt:
• Phương pháp đo thời gian chảy của chất lỏng qua ống mao quản
• Phương pháp đo thời gian rơi của trái cầu
- Độ cứng: Xác định độ cứng bằng thiết bị đo độ cứng
- Độ bào mòn: Xác định độ cứng bằng thiết bị đo độ bào mòn
1. Phương pháp xác định độ nhớt:
Định nghĩa:
• Độ nhớt của chất lỏng là một đặc tính của chất lỏng liên quan chặt chẽ đến lực ma sát nội tại cản lại sự di
động tương đối của các lớp phân tử trong lòng chất lòng đó.
• Độ nhớt động lực hay độ nhớt tuyệt đối, ký hiệu là ⴄ, là lực tiếp tuyến trên một đơn vị diện tích bề mặt,
được biết như một ứng suất trượt - (biểu thị bằng pascal), cần thiết để di chuyển một lớp chất lỏng 1 m2
song song với mặt phẳng trượt ở tốc độ (v) là 1 m/s so với lớp chất lỏng song song ở một khoảng cách (x)
là 1 m.
Phương pháp 1: Phương pháp đo thời gian chảy của chất lỏng qua ống mao quản:
- Nguyên tắc: Nhiều nhớt kế mao quản với những kích thước khác nhau, thích hợp cho việc xác định độ
nhớt của các chất lỏng khác nhau. Mỗi loại có một hàng số dụng cụ (k) riêng. Trong số những nhớt kế
mao quản, nhớt kế Ostwald thường hay được sử dụng nhất.
- Nhớt kế chữ U được điền đầy chất lỏng trong các ống mao dẫn và bầu chứa. Nhớt kế được đặt thẳng
đứng và trong thiết bị ổn nhiệt.
- Quá trình đo độ nhớt được thực hiện bằng việc xác định thời gian chảy của chất lỏng qua ống mao dẫn.
Khi chất lỏng chảy đến vị trí trên của bầu chữa là thời điểm tính thời gian chảy, chất lỏng chuyển động
đến vạch dưới của bầu chứa là thời điểm kết thúc tính thời gian.
- Từ thời gian chảy từ điểm a đến b, tính toán ra các giá trị về độ nhớt và các thông số vật lý khác như
khối lượng phân tử của chất đo.
- Cách xác định độ nhớt bằng nhớt kế Oswald
- Dùng pipet dài để chuyển qua miệng ống B chất lỏng cần xác định độ nhớt đã được ổn định nhiệt độ ở
20 °C ± 0,1 °C (trừ khi có chỉ dẫn khác) vào bầu chứa V, sao cho không dính hoặc chỉ dính rất ít chất
lỏng đem thử vào thành ống B ở phía trên bầu V.
- Đặt nhớt kế thẳng đứng và chìm hết bầu V trong môi trường điều nhiệt ở nhiệt độ 20 °C ± 0,1 °C (trừ
khi có chỉ dẫn khác) trong 30 phút. Sau đó dùng quả bóp cao su (phụ kiện của dụng cụ đo độ nhớt) thổi
từ miệng ống B để chất lỏng dâng lên quá ngấn chuẩn a thì ngừng bơm, bỏ quả bóp cao su khỏi miệng
ống B để chất lỏng đem thử chảy tự do về bầu V.
- Ghi thời gian cần thiết để vòng khum dưới của chất lỏng đem thử chuyển dịch từ ngấn a đến ngấn b.
Làm như vậy 5 lần, lấy trung bình cộng của các kết quả đo được làm thời gian t cần xác định. Sai số các
kết quả đo không vượt quá 0,5 %. Để đã mắc sai số lớn, cần chọn nhớt kế thích hợp sao cho thời gian t
không được dưới 200 s.
- Tính độ nhớt lực học ⴄ hoặc độ nhớt động học v lần lượt theo công thức sau:
 h = k . r . t (1)
 n = k . t (2)
Trong đó: h là độ nhớt động lực (mPa.s hoặc cP);
- n là độ nhớt động học (mm2 /s hoặc cSt) ;
50
- k là hằng số dụng cụ đo
- r là khối lượng riêng của chất lỏng đem thử (g/cm3 );
- t là thời gian chảy (s)
 Khi không có giá trị k, có thể tự xác định hằng số k bằng cách dùng một chất lỏng đã biết trước độ
nhớt ⴄ hoặc v và tính k theo công thức (1) hoặc (2). Nhớt kế đã bị sửa chữa thì khi sử dụng lại, phải
được chuẩn lại.
 Nếu dùng nhớt kế mao quản với máy đo tự động thì vận hành máy theo quy trình hướng dẫn của hãng
sản xuất máy. Thời gian cần thiết để chất lỏng đem thử chuyển dịch từ ngấn a đến ngắn b sẽ được tự
động ghi lại.
- Ngoài ra, có thể xác định độ nhớt qua Máy đo độ nhớt
Phương pháp 2: Phương pháp đo thời gian rơi của trái cầu: Phương pháp này thích hợp cho các chất lỏng
trong suốt và có độ nhớt cao (từ 8 poise đến 1000 poise).
- Nguyên tắc: Độ nhớt được đo bằng cách ghi lại thời gian cần thiết để một viên bi tròn rơi từ từ trong
một đoạn ống có chiều dài nhất định chứa chất lỏng cần đo độ nhớt.
- Dụng cụ: Gồm 1 ống thử a, dài 30 cm, đường kính trong là 2 cm ± 0,05 cm. Trên thành ống có khắc 5
ngấn vòng quanh, mỗi ngấn cách nhau 5 cm. Ông thử a được đặt trong bình điều nhiệt b có chứa nước,
phía trên có nắp đậy. Trên nắp có các lỗ để đặt nhiệt kể chia độ đến 0,1 °C, que khuấy c và phễu g.
Trái cầu là những viên bi bằng thép có đường kính 0,15 cm. Viên bi sẽ được thả vào ống thử a qua một
ống nhỏ d có đường kính trong là 0,3 cm. Ông d có một lỗ ngang cao hơn mực chất thử trong ống a,
đầu dưới của ống d ở ngang ngắn trên cùng của ống a và thấp hơn mặt chất thử 3cm.
- Khi không có dụng cụ như trên có thể dùng các nhớt kế khác có tính năng tương tự, đảm bảo cung cấp
giá trị độ nhớt với độ chính xác và độ đúng như những nhớt kế đã mô tả ở trên (ví dụ: Nhớt kế
Hoppler).
- Phương pháp đo:
• Đổ chất lỏng cần xác định độ nhớt vào ống thử a sao cho mực chất lỏng cao hơn đầu dưới của ống d 3
cm. Đặt các viên bi vào một ống thử nghiệm nhỏ lồng qua lỗ đặt phễu g. Giữ chất lỏng cần thử và các
viên bi trong môi trường điều nhiệt có nhiệt độ ở 20 °C ± 0,1 °C trong 30 min (trù khi có chỉ dẫn khác).
Sau đó thả từng viên bi vào trong chất lỏng đem thử qua ống d.
• Ghi thời gian rơi của 5 viên bi từ ngắn thứ hai đến ngắn thứ năm (15 cm). Lấy trung bình cộng của 5 lần
đo này làm thời gian t cần xác định.
- Tính độ nhớt động lực của chất lỏng đem thử theo công thức:
ⴄ = k.t (pk - p)
Trong đó: ⴄ là độ nhớt lực học (mPa.s hay cP)
p là khối lượng riêng của chất lỏng g/cm3
Pk là khối lượng riêng của viên bi g/cm3 t là thời gian rơi của bi (s)
k là hằng số của viên bi
Phương pháp 3:
 Thiết bị thường dùng là loại nhớt kế quay, dựa trên việc đo lực trượt trong môi trường lỏng được đặt
giữa hai ống hình trụ đồng trục, một ống được quay nhờ môtơ, còn ống kia quay được do sự quay của
ống thứ nhất tác động vào. Dưới những điều kiện như vậy, độ nhớt (hay độ nhớt biểu kiến) trở thành
phép đo (M) độ lệch của góc đối với ống hình trụ thứ 2, tương ứng với momen lực, biểu thị bằng N-in.
51
 Đối với lớp chất lỏng rất mỏng, độ nhớt động lực n, biểu thị bằng Pa-S được tính theo công thức:
• Hằng số k của máy được tính ở các tốc độ quay khác nhau bằng cách sử dụng các chất lỏng có độ nhớt
chuẩn. Các máy luôn được cung cấp một bảng có các hằng số liên quan đến diện tích bề mặt của các
ống trụ được dùng và tốc độ quay của chúng. Độ nhớt được tính theo công thức:
Cách đo: Đo độ nhớt theo sự chỉ dẫn cách vận hành nhớt kế quay. Nhiệt độ đo được chỉ dẫn trong
chuyên luận. Nếu không thể đặt được tốc độ trượt chính xác như chỉ dẫn thì đặt tốc độ trượt cao hơn
một chút và thấp hơn một chút sau đó dùng phương pháp nội suy để tính độ nhớt.
2. Phương pháp xác định độ cứng
- Định nghĩa:
 Độ cứng của thuốc viên nén là thông số xác định lượng tối thiểu làm vỡ viên theo hướng chịu lực kém
nhất của viên tức là theo đường kính của viên.
 Độ cứng của viên phụ thuộc nhiều yếu tố nên dược điển không quy định mà tùy thuộc nhà sản xuất ấn
định cho phù hợp.
- Nguyên tắc:
Tác động một lực qua đường kính viên cho đến lúc viên bị vỡ. Xác định lực gây vỡ viên. Lực này phụ
thuộc vào tốc độ tác động, vào đường kính viên. Giới hạn lực gây vỡ viên tùy thuộc vào từng loại viên.
- Tiến hành:
Tiến hành theo USP 34: General Chapters: <1217> TABLET BREAKING FORCE
Bước 1: Lấy mẫu viên, khởi động máy và đặt số viên cần đo (tối thiểu 6 viên)
Bước 2: Đưa viên lên giá đo và tiến hành đo ( chú ý thao tác chuyển mẫu viên)
Bước 3: Đọc kết quả: giá trị độ cứng của từng viên, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn.
Bước 4: Tắt máy và làm vệ sinh máy.
- Tiêu chuẩn chất lượng:
Để bảo đảm độ bền cơ học của viên, viên nén thông thường có độ cứng khoảng từ 4-8 kg
- Thiết bị: Xác định bằng thiết bị đo độ cứng (Tablet hardness tester).
Đơn vị đo: kilogam lực.
3. Phương pháp xác định độ bào mòn
- Định nghĩa: Độ bào mòn là tỷ lệ % của thuốc viên nén bị mất đi do vỡ, mòn sau quá trình thử nghiệm,
thể hiện độ bền bề mặt của viên, chống lại sự bào mòn.
- Nguyên tắc thử:
 Cân 10-20 viên nén, cho vào máy, quay với tốc độ 25 vòng/phút trong 4 phút.
52
 Lấy viên ra khỏi máy, làm sạch bụi, cân phần viên còn nguyên vẹn.
- Thiết bị: Thử theo thiết bị ERWEKA hoặc các dụng cụ tương tự
 Thiết bị bao gồm một trống quay được gắn với một mô tơ quay ở tốc độ nhất định. Cho viên đã cân
chính xác tới mg vào trống quay (10-20 viên) và quay trong khoảng thời gian nhất định (100 vòng).
Lấy viên ra, sàng sạch bột và cân lại khối lượng. Tính độ mài mòn (% khối lượng viên bị mất).
- Tiến hành:
Tiến hành theo USP 34: General Chapters: <1216> TABLET FRIABILITY
Bước 1: Lấy mẫu viên, làm sạch bụi trên bề mặt viên. Cân mẫu viên trên cân phân tích
Bước 2: Đưa viên vào trống và lắp thiết bị
Bước 3: Đặt thông số cho máy và tiến hành đo
Bước 4: Hết thời gian đo, làm sạch bụi trên bề mặt viên và cân lại mẫu viên trên cân phân tích
Bước 5: Tắt máy và làm vệ sinh máy
Bước 6: Tính kết quả
- Tiêu chuẩn chất lượng:
• Nếu không có quy định riêng, độ mài mòn không được quá 3%.
• Đối với viên nén thông thường, nếu không có quy định đặc biệt, độ bào mòn phải ≤ 3%. Thông số này
nhằm đánh giá độ bền của thuốc viên nén chịu va đập trong vận chuyển và bảo quản. Riêng viên nén
để bao đường, bao film thông số này nên đạt ≤ 0,5%
BÀI TẬP 4.5:SO SÁNH TRONG PHÂN TÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO
*Giống nhau:
- HPLC và sắc ký khí đều là 2 phương pháp quan trọng trong phương pháp phân tích
- Đều được sử dụng với các mục đích: định tính, định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác định các
hằng số hoá lý, nghiên cứu các quá trình nghiên cứu và tác động...
- Đều được ứng dụng trong:
+ Kiểm tra sự có mặt của một chất trong mẫu thử
+ Phân tích môi trường
+ Phân tích thực phẩm
+ Phân tích và kiểm nghiệm tinh dầu
+ Phân tích dược phẩm
+ Phân tích tồn dư dung môi
+ Phân tích tồn dư hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu
*Khác Nhau
- Kiểm tra sự có mặt của 1 chất trong mẫu thử
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SẮC KÝ KHÍ

HPLC được sử dụng để tách các thành Trong quá trình muốn biết sự hiện diện một hợp chất X
phần để thực hiện quá trình phân tích nào đó trong một hỗn hợp mẫu, thực hiện sắc ký khí.
sau đó. Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ, Sau đó, nếu có mẫu chuẩn X, thêm X vào trong hỗn hợp
thời gian lưu trong cùng điều kiện sắc mẫu và thực hiện trở lại sắc ký khí với cùng điều kiện
ký có thể xác định được sự có mặt của thí nghiệm, mũi của X xuất hiện với cường độ cao hơn
53
một chất trong mẫu phân tích. nhiều so với lần đầu.
- Ứng dụng trong phân tích môi trường

- Phát hiện các hợp chất phenol trong nước uống - Được áp dụng rộng
- Định tính diphenhydramine trong các mẫu trầm tích rãi để khảo sát vấn
- Kiểm soát sinh học đối với các chất ô nhiễm. đề về ô nhiễm môi
- Tách và định tính nhanh các hoạt chất carbonyl trường như từ bụi
- Phân tích tồn dư các loại dược phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khí thải của nhiên
khỏe trong nước, trầm tính, đất, hợp chất sinh học bằng HPLC/MS/MS liệu, xử lí các vụ
- Xác định hàm lượng 3-mercaptopropionic acid gây ô nhiễm. mùa với thuốc trừ
- Phân tích tồn dư của hóa chất bảo vệ thực vật trong các mẫu nước uống. sâu, thuốc diệt cỏ,…
- Ứng dụng trong phân tích thực phẩm
+ Việc phân tích thực phẩm bao gồm các khảo sát tìm hiểu về lipid, protein, carbohydrat, các chất bảo
quản, các chất mùi, màu, ngoài ra còn có các vitamin, steroid, thuốc chữa bệnh, dư lượng thuốc trừ sâu,
các vết kim loại…
+ Phần lớn các hợp chất nói trên đều không có tính bay hơi và ngày nay người ta thường sử dụng HPLC
để phân tích.
- Phân tích nhanh các thành phần trong - Muốn có thể phân tích bằng sắc ký khí, các loại hợp
đồ uống không chứa cồn. chất nói trên được
- Phân tích hàm lượng đường trong thực hiện phản ứng hoá học như sau:
nước hoa quả. + Các lipid, các acid béo được chuyển thành dẫn xuất
- Phân tích hợp chất đa vòng trong rau methyl ester.
củ. + Các protein được thủy giải bằng dung dịch acid, tiếp
- Phân tích hàm lượng các chất bảo theo đó được este hóa thành N-propyl ester.
quản và chất chống oxy hóa trong thực + Các carbohydrate được silyl hóa để biến thành chất
phẩm. dẫn xuất có tính bay hơi.
- Phân tích tồn dư của hóa chất bảo vệ - Nhờ việc biến đổi như thế, các công ty xí nghiệp vẫn
thực vật trong các mẫu thực phẩm. thường sử dụng GC để thường xuyên phân tích các
mẫu sản phẩm.
- Phân tích và kiểm nghiệm tinh dầu
SẮC KÝ KHÍ
+ Sắc ký khí khối phổ đang ngày càng phổ biến trong phân tích và kiểm nghiệm tinh dầu.
+ Thành phần tinh dầu chủ yếu là các terpenoid rất dễ bay hơi nên đặc biệt phù hợp để phân tích bằng sắc ký
khí. Sau khi đi qua cột sắc ký các tinh dầu phức tạp có thể cho các peak chồng lên nhau, lúc này khối phổ trở
thành công cụ hiệu quả để xác định riêng từng chất nhờ vào sự khác nhau của tỷ số m/z.
+ Sắc ký khí khối phổ có thể xác định đặc tính thực vật của tinh dầu nhờ bằng cách so sánh sự có mặt và số
lượng của mỗi thành phần trong tinh dầu.
54
+ Sắc ký khí có thể sàng lọc các thành phần không tự nhiên và bị khuyết hoặc các thành phần có biểu hiện
được pha trộn giả mạo.
+ Như vậy sắc ký khí khối phổ có thể định tính, định lượng, thử tinh khiết từng thành phần cấu thành trong
tinh dầu.
- Phân tích tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG SẮC KÝ KHÍ

CAO - Được sử dụng nhiều nhất với khả năng phân tích cùng lúc
- Phân tích tồn dư hóa chất bảo nhiều chất đáp ứng được các yêu cầu về độ đặc hiệu và độ
vệ thực vật trong dược liệu bằng chính xác. Các HCBVTV thường khá bền nhiệt và có khả
HPLC là một phương pháp phân năng bay hơi, ngoài ra các detector của sắc ký khí cũng rất
tích phổ biến được sử dụng phù hợp để phân tích các HCBVTV. Với các hợp chất cơ clo,
trong lĩnh vực phân tích hóa ECD là detector là lựa chọn hàng đầu với độ nhạy rất cao.
học. HPLC cho phép tách và Với các hợp chất cơ phospho có thể sử dụng detector NPD.
phân tích các chất phức tạp Và detector MS có thể đáp ứng toàn bộ các yêu cầu của các
trong một mẫu dược liệu. detector khác khi có thể phân tích và xác định đồng thời nhiều
hợp chất của HCBVTV ở tất cả các nhóm như: nhóm cơ clo,
nhóm cơ phospho, pytheroid (nhóm chức tổng hợp) và hợp
chất thuộc nhóm carbamate.
- Ứng dụng trong phân tích dược phẩm

- Nghiên cứu sinh khả dụng, độ hòa tan của các - Sử dụng GC để phân tích thuốc uống
dạng bào chế. cũng là một phương tiện bên cạnh việc sử
- Kiểm soát độ ổn định và tuổi thọ của thuốc. dụng HPLC. Tùy theo tính chất bay hơi
- Định tính, định lượng hoạt chất. của mẫu cần phân tích, một số mẫu thuốc
- Kiểm soát chất lượng dược phẩm. có thể được phân tích trực tiếp bằng GC
- Phân tích thành phần và cấu trúc các tạp trong ngay sau công đoạn chiết tách, hoặc hoà
thuốc và nguyên liệu. tan mẫu thuốc vào dung môi phù hợp,
- Phát triển phương pháp phân tích với thời gian hoặc phải điều chế chất dẫn xuất trước khi
ngắn độ chính xác cao (UPLC) phân tích GC.
- Ứng dụng trong tương đương sinh học.
*Phổ biến, được sử dụng để xác định hàm lượng * Được sử dụng rộng rãi. Detector chính
dung môi còn lại trong mẫu sau quá trình phân tích. hay được sử dụng là detector ion hóa ngọn
Tối ưu hóa các thông số của HPLC như lưu lượng lựa (FID) hoặc detector khối phổ (MS).
dung môi, độ nhạy của detector, thời gian giữ mẫu Hầu hết các mẫu phân tích được đưa vào
và điều kiện nhiệt độ. Điều này giúp đảm bảo sự hệ thống phân tích bằng bộ phân tiêm mẫu
tách biệt tốt nhất giữa dung môi và các thành phần không gian hơi (headspace). Một số
khác trong mẫu. Tiến hành chạy mẫu trên HPLC trường hợp sử dụng bộ vi chiết pha rắn
bằng cách tiêm mẫu vào hệ thống. Khi mẫu chạy hoặc tiêm trực tiếp mẫu dung dịch chứa
qua cột sắc ký, dung môi sẽ được tách biệt và thu hoạt chất. Phương pháp thường được áp
thập dữ liệu từ detector. Dữ liệu này bao gồm thời dụng cho các mẫu dược phẩm tan trong
55
gian xuất hiện và cường độ dòng ra của dung môi. các dung môi như nước, DMSO, DMA,
Sử dụng đường chuẩn hoặc phương pháp so sánh, DMF, DMI hoặc benzyl alcol. Kỹ thuật
so sánh dữ liệu thu được từ mẫu với dữ liệu dung tiêm mẫu không gian hơi là kỹ thuật được
môi đã được chuẩn bị sẵn để xác định hàm lượng sử dụng rộng rãi nhất khi phân tích tồn dư
dung môi trong mẫu. dung môi các chế phẩm được phẩm
BÀI TẬP 4.6: TÓM TẮT PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÍ KHÍ. (TRANG 70)
Tạo dẫn xuất là quá trình thay đổi thuộc tính khoa học của hợp chất tạo ra một hợp chất mới với thuộc tính
phù hợp cho việc phân tích bằng sắc kí khí.
VD: Phân tích sắc ký khí của đường acyl hóa
Đặt vấn đề: Đường phải được tạo dẫn xuất thành dạng dễ bay hơi để phân tích bằng sắc ký khí (GC). Thuốc
thử tạo dẫn xuất thường được sử dụng, N-Methyl-bis (trifluoroacetamide)(MBTFA) được sử dụng để chuyển
đổi đường thành dạng dễ bay hơi. Để tách được các dẫn xuất đường TFA như fructose và glucoseanomers, pha
GC 14% cyanopropylphenyl polysiloxan ở giữa cực cột đã được sử dụng.
III. PHƯƠNG PHÁP TẠO DẪN XUẤT
2. Giới thiệu
Các loại đường như glucose và fructose rất khó phân tích bởi GC, khi chúng phân hủy trong cổng kim phun và
"đâm" ra trên cột. Cực cao và bản chất không bay hơi của đường làm giảm hiệu quả của phát hiện các phân tử
này. Để khắc phục những vấn đề này đường có thể được tạo dẫn xuất để loại bỏ hoạt chất hydro như -OH, do
đó làm tăng tính bay hơi và cải thiện khả năng phát hiện, được sử dụng phổ biến nhất.
Phương pháp tạo dẫn xuất để phân tích đường là một phản ứng acyl hóa. Quá trình acyl hóa khoa học nhiệt
thuốc thử MBTFA được sử dụng để tạo dẫn xuất đường và nó là được sản xuất để đáp ứng nhu cầu chính xác
của nhạy cảm các phản ứng tạo dẫn xuất. Điều này liên quan đến việc chuyển đổi các hydro hoạt tính thành
trifluroeste thông qua một carboxylic phát sinh. Este trong đường dẫn xuất cải thiện biến động, giúp phân tích
bằng GC/FID dễ dàng hơn MBTFA, giống như phần lớn các thuốc thử tạo dẫn xuất, tạo ra một sản phẩm phụ.
Trong trường hợp này, sự hình thành của sản phẩm phụ N-methyltrifluoroacetamide không can thiệp với phân
tích khi nó rửa giải sớm hơn trong sắc ký đồ. Để tách được fructozơ và glucozơ các đồng phân phát sinh khi
tạo dẫn xuất, một phân cực giữa 14% cyanophenyl polysiloxane Thermo khoa học TRACE Cột TR-1701 đã
được sử dụng.
III. PHƯƠNG PHÁP TẠO DẪN XUẤT
3. Chuẩn bị mẫu
• 5mg mỗi loại glucose và fructose được cân thành một lọ phản ứng có chứa máy khuấy từ.
Đối với lọ phản ứng, 0,5 ml, MBTFA đã được thêm vào sau đó là 0.5ml dung môi pyridin cấp silyl hóa.
• Các lọ phản ứng sau đó được đậy nắp và đặt trong lò phản ứng nhiệt
Hệ thống ủ mẫu và khuấy trong 1 giờ ở 65 độ C.
• Một lần hòa tan phản ứng đã hoàn thành.
Mẫu cuối cùng sau đó được chuyển vào lọ lấy mẫu tự động 2 mL và 1 μL được tiêm vào GC/FID
BÀI TẬP 5.1: SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN MỘT CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐANG
ĐƯỢC LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG. VIẾT QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN
HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC. (TRANG 87, 91)
Đại tràng tâm bình - hỗ trợ giảm triệu chứng viêm đại tràng
Công dụng: giảm triệu chứng viêm đại tràng co thắt, hỗ trợ kích thích tiêu hóa.
56
Thành phần
Mỗi viên nang cứng chứa: cao khô 190mg tương đương với:
Bạch truật 200mg, bạch linh 150mg, đảng sâm 100mg, trần bì 100mg, mộc hương bắc 150mg, hoài sơn
100mg, nhục đậu khấu 80mg, mạch nha 100mg, cam thảo 80mg, bột sơn tra 150mg, bột sa nhân 80mg, bột
hoàng liên 80mg.
 Quy trình xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
 Yêu cầu chung (Trang 87)
 Nguyên tắc (Trang 91)
 Chuẩn bị dụng cụ môi trường, hóa chất:
Môi trường sử dụng plate count agar (PCA), ph = 7.0 ± 0.2
-Casein peptone: 5.0g
-Cao nấm men: 2,5g
-Dextrose: 1.0g
-Agar: 15.0g
-Nước cất đủ 1000ml
Môi trường được nấu sôi cho tan agar, phân phối vào bình tam giác, hấp tiệt trùng ở 121 độ C 20 phút, để ấm
(45 – 50độ C) phân phối với các đĩa petri.
Viên nang ĐTTB
Nước cất vô trùng.
Nước muối sinh lý 0,9%
Cồn 90 độ
Thiết bị dụng cụ bao gồm: nổi hấp,tủ sấy máy đo ph, tủ ấm, bể điều nhiệt, pipet, đĩa petri vô trùng
 Tiến hành thử nghiệm:
1. Lấy mẫu:
- Chế phẩm là viên nang nên cắt vỏ nang lấy chế phẩm bên trong
- Lấy một lượng vừa đủ để phân tích
- Sau khi lấy mẫu phải phân tích luôn trong 24h.
- Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu.
2. Đồng nhất và pha loãng mẫu
- Cân 10g TPCN đã được chuẩn bị cho vào bình tam giác có chứa 90ml đệm pepton. Sau đó lắc đều 2-3
phút thu được dung dịch mẫu thử ở 10-1
- Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước pepton muối,
lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng
tiếp theo.
Với sp này không có quy định riêng nên sử dụng dung dịch pha loãng là dịch muối pepton.
Thành phần:
-pepton từ casein: 1,0 g
-natriclorua : 8,5 g
-nước :1000 ml
Ít nhất phải pha loãng 2 đậm độ, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa petri.
3. Quy trình đổ đĩa và ủ ấm
57
- Đổ đĩa: đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất hai đậm độ, mỗi đậm độ dùng hai đĩa petri
và một pipet đã tiệt khuẩn riêng.
+ Lấy 1 ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa
petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào hai đĩa petri.
+ Thạch PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến khoảng 45°C trong điều kiện vô khuẩn. Rót vào từng đĩa
12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc sang phải và sang
trái mỗi chiều ba lần.
+ Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
+ Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
+ Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã
đông đó tiếp 4 ml thạch mảng lên trên bề mặt.
- Ủ ấm: khi thạch đã đông, lật sắp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 72 ± 3 giờ.
4. Đọc kết quả:
Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ
tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng cảng cao thì số khuẩn lạc càng
ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy.
Tính kết quả dựa trên số lượng khuẩn lạc thu được theo các trường hợp từ 1 đến 7 trình bày trong mục
tính kết quả của kỹ thuật đổ đĩa giáo trình KNTPCN trang 88.
- Đếm thủ công hoặc dùng các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc. Cách đếm thủ công:
+Lấy bút chì kẻ vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I,II, III,IV.
+Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm.
- Công thức tính
Trong đó:
N: số tế bào đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu (cfu: colony forming units)
C: số khuẩn lạc trên đĩa đã chọn
V: thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa(ml)
D: hệ số pha loãng của độ pha loãng đã chọn thứ 1
5. Chỉ tiêu
Tổng số VSV hiếu khí ≤ 5 x 104 CFU/g ( CFU/mL)
Kết luận:
- Nếu tổng số VSV hiếu khí đếm được nhỏ hơn hoặc bằng 5 x 104 CFU/g ( CFU/mL) thì chế phẩm đạt
yêu cầu về thử giới hạn vi sinh vật theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.
58
- Nếu tổng số VSV hiếu khí đếm được lớn hơn 5 x 104 CFU/g ( CFU/mL) thì chế phẩm không đạt yêu
cầu về thử giới hạn vi sinh vật theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.
Ưu điểm: thể tích mẫu cấy lớn, mật độ vi sinh vật cao, thao tác nhanh, dễ dàng.
Nhược điểm:
• Dễ làm vi sinh vật chết nếu môi trường chưa hạ xuống nhiệt độ 45 độ C.
• Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định.
• Khó đếm do khuẩn lạc chồng lặp
BÀI TẬP 5.2: SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 01 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐANG ĐƯỢC
LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG. VIẾT QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E.COLI VÀ
SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN. (TRANG 97)
1. Thành phần của Nano Curcumin Tam Thất - xạ đen
Trong mỗi viên Nano Curcumin - Tam thất Xạ Đen có chứa:
Nano Curcumin: 200 mg , Vitamin E: 6 IU, Cao Xạ Đen: 50 mg, Cao tam thất: 50 mg ,Collagen Peptide: 50
mg, Bioperine: 0,5 mg . Một số thành phần khác như: (gelatin, magnesi stearat) vừa đủ 01 viên.
Công dụng: Giúp làm giảm các triệu chứng đau dạ dày, hành tá tràng , Tăng cường miễn dịch, giảm tác dụng
phụ của hoá trị, xạ trị, Hỗ trợ điều trị ung thư, tăng đề kháng cho người bị ung thư , Bảo vệ gan, tăng cường
chức năng gan mật ,Ngăn ngừa lão hóa, giảm thâm nám, nhãn da và giúp đẹp da…
2. Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn)
- Là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số mẫu.
 Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác xuất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng
khác nhau của mẫu.
 Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần (3 lần).
 Các độ pha loãng đươc chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số
lần âm tính.
 Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê
→ Giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu
- Hai hệ thống MPN:
+ Hệ thống 9 ống (3×3): thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (dãy 3 ống).
+ Hệ thống 15 ống: thực hiện lặp lại mỗi nồng độ 5 ống nghiệm ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (dãy 5 ống).
- Đặc điểm:
+ Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như:
 Sự tạo hơi: Coliforms…
59
 Sự đổi màu: S. aureus…
+ Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn
- Cách tiến hành
+ 1: Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV
cần định lượng
+ 2: Cấy 1 thể tích chính xác dd mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp
+ 3: Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp
+ 4: Quan sát các biểu hiện chứng minh sự pt của VSV cần kiểm định: sự đổi màu của MT
+ 5: Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng
+ 6: Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV
Kết quả: Số VSV (MPN/ ml) = kết qủa tra bảng x (f/10)
Trong đó: f là độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n ( n là số mũ thích hợp của
10)
3. Quy trình xác định vi khuẩn E.Coli bằng phương pháp MPN
a) Nguyên tắc
Phương pháp này tiến hành theo kỹ thuật MPN và sử dụng bảng chỉ số MPN để tính số lượng vi khuẩn
E. Coli giả định ( lên men lactose có sinh khí ở 44 độ C và sinh indol của trytophan ở 44 độ C) trên mililit
hoặc gam mẫu thử.
b) Phát hiện E.coli giả định
- Cấy một lượng quy định huyền phù ban đầu của mẫu thử vào môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc lauryl
sulfat.
- Ủ ống nghiệm ở 37°C từ 24 giờ đến 48 giờ. Sau 24 giờ và 48 giờ kiểm tra ống về sự sinh khí.
*Kết quả:
-Nếu thấy ống nghiệm mờ, đục, hoặc sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa môi trường lỏng
chọn lọc (canh thang EC). Ủ ống nghiệm thu được trong ở 44°C đến 48 giờ. Sau 24 giờ và 48 giờ, kiểm tra các
ống về sự sinh khí.
-Các ống EC sinh khí thì cần cấy truyền sang ống nghiệm có chứa nước pepton không chứa indol. Ủ ở 44°C
trong 48 giờ. Kiểm tra ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân hủy của tryptophan trong pepton.
-Các ống nghiệm cho thấy mờ đục hoặc sinh khí trong môi trường tăng sinh lỏng lauryl sulfat và khi được cấy
truyền có sinh khí trong canh thang EC và sinh indol trong nước pepton ở 44°C được coi là các ống có chứa
E.coli giả định.
c) Phương pháp định lượng E. Coli
- Cấy một lượng quy định huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc
lauryl sulfat nồng độ kép.
- Cấy một lượng quy định huyền phù ban đầu vào ba ống nghiệm dựng môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc
lauryl sulfat nồng độ đơn. Sau đó, trong cùng điều kiện, cấy một lượng quy định của các dung dịch pha loãng
thập phân của huyền phủ ban đầu vào ba ống nghiệm khác đựng môi trường nồng độ đơn.
- Ủ ấm các ống môi trường lauryl sulfat nồng độ đơn và nồng độ kép ở 37°C đến 48 giờ.
- Sau 24 giờ đến 48 giờ kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.
* Kết quả
- Sau 24 giờ đến 48 giờ kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.
60
- Từ mỗi ống môi trường lauryl nồng độ kép cho thấy mờ, đục hoặc sinh khí, từ mỗi ống đựng môi trường
nồng độ đơn cho thấy sinh khí, được cấy truyền vào ống nghiệm đựng môi trường lỏng chọn lọc (canh thang
EC). Ủ các ống thu ở 44°C trong 48 giờ. Sau 24 giờ đến 48 giờ, kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh khí.
- Mỗi ống canh thang EC sinh khí được cấy truyền sang ống nghiệm chứa nước peptone, không chứa indole.
Ủ ở 44°C đến 48 giờ. Kiểm tra các ống nghiệm về sự sinh indol do sự phân huỷ của tryptophan trong pepton.
- Xác định số có xác suất lớn nhất của E. coli giả định theo bảng MPN ứng với số lượng ống đựng môi
trường lauryl sulfat nồng độ đơn và nồng độ kép sau khi cấy truyền - có sinh khí trong môi trường (EC) và
sinh indol trong nước pepton ở 44°C.
* Chỉ tiêu cho phép của E.Coli. trong chế phẩm: 0 CFU/g.
4. Quy trình xác định vi khuẩn salmonella bằng phương pháp MPN
Salmonella
Salmonella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men
glucose và mannitol, sinh axit nhưng không lên men sacharose và mantose, không sinh indol, không phân giải
ure, không có khả năng tách nhóm amin từ tritophan, hầu hết đều sinh H2S
Các vi sinh vật hình thành các khuẩn lạc điển hình hoặc ít điển hình trên môi trường đặc chọn lọc và có các
đặc điểm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng
Lưu ý: Các phép thử thích hợp về các đặc tính sinh hóa và huyết thanh đặc trưng được quy định trong tiêu
chuẩn này.
Số lượng Salmonella spp. tìm thấy có trong 1ml hoặc một gam mẫu thử hoặc một diện tích bề mặt hoặc trên
một vật thể (ví dụ bao gạc bọc ủng).
Định lượng Salmonella spp. bằng kỹ thuật MPN cần qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau:
* Giai đoạn 1: Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc
- Chuẩn bị dung dịch pha loãng ở độ pha loãng 10-1 của các mẫu trong nước đệm pepton (BPW) (huyền phù
ban đầu).
- Cho huyền phù ban đầu vào hàng ba giếng (rỗng) thứ nhất của đĩa 12 giếng.
- Cấy một lượng xác định thu được từ hàng thứ nhất trong đĩa 12 giếng vào hàng thứ hai gồm ba giếng chứa
canh thang tăng sinh sơ bộ không chọn lọc (BPW).
- Cấy vào ba giếng của hàng thứ ba, thứ tư và nếu cần cấy vào nhiều hơn hàng ba giếng chứa BPW.
- Ủ đĩa 12 giếng đã cấy ở 37 OC trong 18 giờ.
* Giai đoạn 2: Tăng sinh trên môi trường nửa đặc chọn lọc
- Cấy truyền từng giếng thu được trong giai đoạn 1 vào giếng chứa thạch nửa đặc (MSRV).
- Ủ ở 41,5 OC (MSRV) trong 24 giờ. Nếu MSRV là âm tính sau 24 giờ thì ủ đĩa tiếp 24 giờ.
* Giai đoạn 3: Cấy đĩa chọn lọc và nhận biết
- Từ các dịch cấy (nghi ngờ) (các dung dịch pha loãng nhất) thu được trong giai đoạn 2, cấy vào thạch
deoxycholat lysin xylose (XLD) môi trường đặc chọn lọc và ủ ở 37 OC trong 24 giờ.
* Giai đoạn 4: Khẳng định
- Khẳng định các khuẩn lạc Salmonella giả định thu được trong giai đoạn 3 bằng các thử nghiệm sinh hóa và
huyết thanh thích hợp như KIA/TSI, indol, LCD, OCD, lên men mannitol, sorbitol,…
* Chỉ tiêu cho phép của Salmonella spp. trong chế phẩm: 0 CFU/25g
61
BÀI TẬP 5.3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI TRONG THỰC
PHẨM CHỨC NĂNG. NÊU ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP. (TRANG 86,97,107)
1. E.coli
E.coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là căn nguyên của
nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu. Ecoli đã được sử dụng làm mô
hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực và sinh học nói riêng và sinh học nói chung.
2 Phương pháp truyền thống
a) Phương pháp MPN
Định nghĩa: Phương pháp pha loãng tới hạn :MPN(Most Probable Number) là phương pháp dùng để
đánh giá số lượng vi sinh vật theo số mẫu. Phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loại
thí nghiệm được lặp lại ở một số pha loãng khác nhau
Mục đích: Phương pháp MPN dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy. Trong
môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả thích hợp.
Ví dụ: sử dụng môi trường mật lactose lục sáng ở 37 độ C. Có thể định lượng nhóm nhóm coliform, hoặc
cho phép định lượng E.coli giả định có trong thực phẩm ở 44°C trong môi trường lỏng EC.
Phạm vi áp dụng:
- Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn chăn nuôi
- Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm
Nguyên lý: E.coli định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí và tạo thành Indol từ tryptophan khi
nuôi cấy trong kênh thang tăng sinh. Họ chọn lọc ở 44°C bằng phương pháp tính số có xác suất lớn
nhất(Most Probaple Number-MPN)
Nguyên tắc:
- Xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu
- Mỗi độ pha loãng được lặp lại nhiều lần (3 lần)
- Các độ pha loãng được lựa chọn sao cho trong các lần lặp lại có số dương tính và âm tính
- Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng VSV trong
mẫu
Đặc điểm:
- VSV nuôi cấy phải có các đặc trưng trong môi trường nuôi cấy: sinh khí, đổi màu môi trường…
- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn
Hệ thống MPN
62
- Hệ thống 9 ống
- Hệ thống 15 ống
 Cần chính xác một lượng mẫu thực phẩm đã chuẩn bị ( hoặc hút một thể tích chế phẩm lỏng) cho vào
bình nón có thể tích chứa gấp 9 lần khối lượng mẫu đã cân thể tích nước pepton muối, lắc đều 2-3p để
thu được dung dịch mẫu thử 10-1
 Cách tiến hành:
- Bước 1: Chuẩn bị ống nghiệm có môi trường thích hợp
- Bước 2: Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp
 Định tính:
Lấy 1-10ml mẫu thử chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc
Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển VSV cần kiểm định bằng sự đổi màu của môi trường
 Ghi nhận số ống dương tính ở từng độ pha loãng
2. Định lượng: Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV
Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN
- Nguyên tắc: Phương pháp này tiến hành theo kỹ thuật MPN và sử dụng bảng chỉ số MPN để tính số
lượng vi khuẩn E. coli giả định (lên men lactose có sinh khí ở 44°C và sinh indol của tryptophan ở
44°C) trên mililit hoặc gam mẫu thử.
• Huyền phù của mẫu thử + môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc lauryl sulfat
• Nước pepton không chứa Indol
• Môi trường lỏng chọn lọc (canh thang EC)
- Cấy huyền phù ban đầu 2 môi trường:
• Môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc lauryl sulfat nồng độ kép
• Môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc lauryl sulfat nồng độ đơn.
- Sau đó, trong cùng điều kiện, cấy một lượng quy định của các dung dịch pha loãng thập phân của
huyền phủ ban đầu vào ba ống nghiệm khác dựng môi trường nồng độ đơn
- Phát hiện E. coli giả định trong mỗi ống nghiệm
- Xác định số có xác suất lớn nhất của E. coli giả định theo bảng MPN ứng với số lượng ống đựng môi
trường lauryl sulfat nồng độ đơn và nồng độ kép sau khi cấy truyền-có sinh khí trong môi trường (EC)
và sinh indol trong nước pepton ở 44°C.
Ưu điểm: + Cho phép chúng ta định lượng được vi sinh vật có nồng độ thấp (nhỏ hơn 100 tế bào/ml
hoặc g)
+ Khắc phục được nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp
Nhược điểm: dễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật
độ thấp
b) Phương pháp đếm khuẩn lạc:
 Phạm vi áp dụng
63
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm PetrifilmTM để định lượng coliform và
Escherichia coli trong thực phẩm. Phương pháp này đã được đánh giá liên phòng thử nghiệm, các kết quả
được nêu trong Phụ lục A và Tài liệu tham khảo
 Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong
nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng
1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2. Chất tạo đông có trong thành
phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh. Đĩa được ủ ấm ở 35 °C ± 1 °C trong thời
gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc.
 Thuốc thử và môi trường
Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có
quy định khác.
 Nước dùng để pha loãng (dung dịch nước đệm phosphat). Hòa tan 34g kali dihydro phosphat (KH2PO4)
vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175ml dung dịch natri
hydroxit 1M và thêm nước đến vạch. Pha loãng 1,25 ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã đun sôi và
để nguội, rồi hấp áp lực 15 min ở 121°C. Nước dùng để pha loãng không được chứa xitrat, bisulfit hoặc
thiosulfat vì có thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật.
 Đĩa đếm E. coli/coliform PetrifilmTM 2). Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (3.4), chất tạo
đông tan được trong nước lạnh (3.5), chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua(3.2) và chất chỉ thị
hoạt độ glucuronidase là 5-brom-4-clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid (3.3), có thể đếm coliform và E. coli
trên cùng một đĩa. Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông,
mỗi ô có diện tích 1cm2 trên màng nền.
 Cách tiến hành
Đếm E. coli Sử dụng đĩa đếm E. coli/coliform PetrifilmTM (4.2) và tiến hành theo 7.1, nhưng thời gian ủ là 48
h ± 4 h. Trường hợp đếm E. coli và coliform trên cùng một đĩa thì ngay sau khi đếm coliform, tiếp tục ủ ấm
đĩa ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h (tổng thời gian là 48 h ± 4 h). Các khuẩn lạc E. coli có màu xanh
kèm theo các bọt khí, các vi khuẩn coliform khác có màu đỏ kèm theo bọt khí.
Nhược điểm
Độ chính xác của việc tính mật độ vi khuẩn từ số khuẩn lạc thực sự có một số hạn chế. Các đơn vị hình
thành khuẩn lạc có thể là một tế bào đơn, một chuỗi tế bào hoặc cả một cụm tế bào. Giả thiết rằng một khuẩn
lạc đại diện cho một tế bào, như vậy mật độ tính toán được có thể thấp. Các vi khuẩn khác nhau cần các điều
kiện sinh trưởng khác nhau, và khuẩn lạc trên đĩa chỉ thể hiện những vi khuẩn mà phát triển trên môi trường
cấy dưới những điều kiện ủ đó. Hơn nữa, đếm khuẩn lạc không tính được tế bào chết, cần phải cân nhắc kỹ khi
bạn cần mật độ tế bào trong mẫu ban đầu. Mất nhiều thời gian, hóa chất và công sức.
Ưu điểm:
• Cho phép xác định số tế bào sống
• Định lượng chọn lọc VSV
• Có thể xác định vi sinh vật ở mật độ thấp.
64
c) Phương pháp màng lọc
_ Phương pháp màng lọc dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm
môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp. Bản chất của phương pháp này là tập trung số vi sinh vật
ít ỏi trong một mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc
đếm được sau khi đặt mảng lọc lên một môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh
vật cần kiểm. Dựa trên mẫu nước ban đầu và quy ước coi mỗi lạc khuẩn được hình thành từ một vi khuẩn mà
người ta quy ra số lượng vi sinh vật cả trong một đơn vị thể tích nước.
_Về thực chất đây là sự kết hợp của phương pháp lọc vô khuẩn (thường dùng để lọc thanh trùng một số dung
dịch kém chịu nhiệt, dễ bị biến chất hoặc phân hủy khi khử trùng ở nhiệt độ cao) và phương pháp đếm khuẩn
lạc trên đĩa. Màng lọc có kích thước lỗ vào khoảng 0,2-1micromet. Những vật liệu thường được dùng để chế
tạo mảng lọc khuẩn là sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi aminte, sợi polypropylen... là những vật liệu có khả năng
chịu được nhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng. Màng lọc loại này thường được cung cấp trong trạng
thái vô trùng
_Ngoài màng lọc bình thường thì người ta còn sử dụng màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in các ô vuông bằng
vật liệu kỵ nước. Các vạch chia ô bằng vật liệu này ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc và như vậy chia bề
mặt mảng lọc thành những ô đều nhau có kích thuốc xác định. Số ô vuông có khuẩn lạc mọc được đếm và quy
về số có xác suất lớn nhất ( MPN) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo công thức:
MPN=N.In (N/N-x)
Trong đó :
- N là tổng số các ô vuông
- x là số ô có khuẩn lạc mọc
Ưu điểm: Xác định được mặt đệ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml...
Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn.
3. Phương pháp hiện đại
a) Phương pháp ELISA (Enzym-Linked Imuno Sorbent Assay)
_ Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử
dụng kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngoài những giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ
những kháng nguyên mục tiêu. Những kháng nguyên mục tiêu thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng
kháng thể thứ hai có gắn với enzyme có phát tín hiệu ( thường là horseradish peroxidase hay alkaline
phosphatase). Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo ra các
sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Như vậy chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên.
_Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi và phân tích Salmonella. E.coli gây bệnh EHEC, STEC, IEHEC,...),
Listeria, độc tố Staphylococus, thuốc trừ sâu, dư lượng kháng sinh... đối với vi sinh vật, phương pháp ELISA
có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của
phương pháp.
Ưu điểm: Độ nhạy cao.Cho kết quả nhanh
Nhược điểm: Không phân biệt được tế bào sống và chết.
b) Phương pháp PCR ( Plymerase Chain Reaction)
65
_ Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA
ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mỗi đặc hiệu cho đoạn DNA này.
_ Phương pháp này cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Đây thực sự là
phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính
xác cao.
Ưu điểm:
+ Thời gian cho kết quả nhanh
+ Có thể nhận diện những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi
không cần thiết
+ Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh lọc.
+ Không cần dụng cụ và môi trường chuẩn đoán phức tạp.
+ Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm.
Nhược điểm:
+ Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase
+ Mật độ vi sinh vật trong mẫu thường thấp, đôi khi cần tăng sinh
+ Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, có thể dẫn đến dương tính gia do DNA từ tế bào
chết (tuy vậy có thể phát hiện bào tử, tế bảo đã chết của vi sinh vật gây độc)
BÀI TẬP 6.1. SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 1 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA
CHẤT XƠ HÒA TAN (TRANG 130)
TRÌNH BÀY CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT NÀY TRONG SẢN PHẨM.
Inufibe Hộp 20 Ống với công dụng hỗ trợ bổ sung chất xơ hòa tan, tăng khả năng tiêu hóa, giúp nhuận tràng,
giảm táo bón,…
Công Dụng Inufibe:
• Bổ sung chất xơ hòa tan
• Hỗ trợ vi khuẩn có ích đường ruột
• Hỗ trợ tăng khả năng tiêu hóa, giúp nhuận tràng
• Hỗ trợ giảm táo bón
Phương pháp enzym - khối lượng
- Các phương pháp chính thức được AOAC đưa ra từ liệu pháp mô phỏng quá trình tiêu hóa trong ruột người
đến khi thu được khối cặn bã không thể tiêu hóa được để định lượng chất xơ. Khối cặn bã này sau đó trừ đi
lượng protein và tro.
- Khi không có dung môi KOH hay DMSO, tinh bột cần có enzym amylase trong quá trình phân tích.
- Mẫu được nghiền và thủy phân bằng enzym amylase ở nhiệt độ ổn định 100C.
- Hai dạng kháng tinh bột chính RS1 (tinh bột được bọc bên trong các cấu trúc tế bào) và RS2 (hạt tinh bột
thổ) không đòi hỏi điều này trong khi RS3 (amylose thoái hóa) cần tới amylose.
- Lignin, một thành tố không phải carbohydrat của vách tế bào cũng có thể đi kèm theo với một vải tanin
nhưng với tỷ lệ rất nhỏ khó phát hiện (Theo nghiên cứu của Cho, Prosky, Dreher (1999), FAO (1998)).
Phương pháp hóa enzym của Englyst và cộng sự (Enzymatic-chemical method)
- Các phương pháp này dùng định lượng một loại NSP riêng biệt nào đó ở dạng monome bằng cách kết hợp
với phương pháp HPLC hay GC hay tổng lượng NSP sử dụng phương pháp so màu.
66
- Dung môi DMSO được sử dụng trong giai đoạn đầu tiên để loại bỏ toàn bộ tinh bột và lignin trước khi phân
tích. Sự khác biệt giữa phương pháp này với phương pháp được thông qua bởi AOAC chính ở chỗ dung môi
DMSO được sử dụng để loại bỏ sai số thừa do kháng tinh bột và lignin.
Phương pháp hóa enzym của Theander và cộng sự (Phương pháp Uppsala)
- Điều kiện thủy phân và việc xác định các monone bằng kỹ thuật GC cũng tương tự như phương pháp của
Englyst. Điểm khác biệt ở chỗ phương pháp này không sử dụng DMSO mà chi ước tính trọng lượng của lignin
để loại bỏ sai số. Kết quả thu được gần tương đồng với phương pháp enzym trọng lượng.
- Hai phần mẫu thử lặp lại được ủ với a-amylase tuyến tụy và amyloglucosidase (AMG) 16 giờ ở 37 °C trong
bình 250 ml đậy kín, lắc trộn đủ mạnh để duy tri huyền phù liên tục.
- Tinh bột không bền được hòa tan và thủy phân thành glucose và maltose do hoạt động kết hợp của hai
enzym. Phản ứng được tạm dừng bằng cách chính pH và làm nóng nhẹ.
Protein trong mẫu được phân hủy bởi protease.
- Để xác định xơ hòa tan trong nước, nhưng không hòa tan trong hỗn hợp của nước: alcol (SDFP) thì thêm
etanol vào dịch lọc IDF; lọc để giữ lại SDFP kết tủa và xác định
bằng phương pháp khối lượng sau khi hiệu chỉnh protein hoặc tro có trong kết tủa.
• Xơ hòa tan trong nước: alcol (SDFS) không tạo kết tủa có trong dịch lọc thu được bằng cách cô đặc dịch lọc,
khử ion bằng nhựa trao đổi ion, cô đặc và định lượng bằng sắc ký lỏng (LC), hoặc bằng cách cô đặc dịch lọc
sau đó đồng thời khử ion và định lượng bằng LC
BÀI TẬP 6.2. SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 01 CHẾ PHẨM PHẨM THỰC PHẨM CHỨC
NĂNG CÓ CHỨA OLIGOSACCHARIDE:TRÌNH BÀY PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
HOẠT CHẤT NÀY TRONG SẢN PHẨM
Sản phẩm: Viên uống Champignon 4000mg Aqua Nhật Bản
* Thành phần viên uống Champignon 4000mg Aqua Nhật Bản:
Kẹo nước maltose khử (sản xuất trong nước), maltose, dextrin khó tiêu, chiết xuất champignon
(nấm, dextrin), chiết xuất hạt cà phê, bột chiết xuất gừng, oligosaccharide (bao gồm cả thành
phần sữa), bột chùm ngây, vi khuẩn axit lactic hình thành bào tử, Chiết xuất quả hồng, mầm
gạo / sản phẩm lên men đậu tương / cellulose, oxit silic mịn, chiết xuất trà xanh, Ca stearat,
DL-maltose.
* Khái niệm oligosaccharide: là những cacbohydrat khi thuỷ phân cho 3-9 đường đơn.
Oligosaccharide chủ yếu là các sản phẩm thuỷ phân của tinh bột như: malto-
oligosaccharide(MOS), Fructo- oligosaccharide(inulin), FOS,…
* Phương pháp phân tích oligosaccharide: Có thể phân tích oligosaccharide đơn lẻ hay trong
hônc hợp nhiều oligosaccharide.
- Dùng dung môi ethanol 80% để chiết oligosaccharide từ thực phẩm chức năng
- Định lượng bằng các cách sau:
67
+ Thuỷ phân oligosaccharide(nếu cần) bằng enzym thuỷ phân phù hợp hoặc acid để tạo ra các
monosaccharide rồi tiếp tục phân tích bằng các pp như GC, HPLC
+ Dùng sắc lí loại trừ kích thước, như là sắc lí loại trừ kích thước hiệu năng cao hoặc sắc kí lọc
gel để tách các oligosaccharide trong một hỗn hượp dựa vào sự khác nhau về kích thước các
chất
- Phương pháp:
+ HPAEC-PAD
 Pha động thường dùng là NaOH, NaOOCCH3 để tăng khả năng ion hoá giúp đẩy các
oligosaccharide ra khỏi cột khi phân tích
 Nhược điểm: Khó tìm chất chuẩn với một số loại oligosaccharide từ beta-glucan, malto-
oligosaccharide có điểm trùng hợp lớn hơn 7. Đáp ứng của detector PAD cũng giảm dần khi
điểm trùng hợp tăng Cần chất chuẩn tinh khiết
+ Phương pháp enzym: Thuỷ phân oligosaccharide bằng enzym kết hợp với sắc kí HPAEC-
PAD
Bài tập 6.4.SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 1 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHƯA
TÍNH BỘT.TRÌNH BÀY CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT NÀY TRONG
SẢN PHẨM.
Lưu ý khi phân tích tinh bột trong TPCN
● Chuẩn bị mẫu phân tích: tinh bột hoà lẫn trong các chất khác => tách riêng tinh bột để loại bỏ tạp chất
béo, protein, vitamin…
● Khả năng bay hơi kém => GC, CE cần dẫn xuất hóa mẫu
● Trong thực phẩm hỗn tạp: Dùng enzym thích hợp để giải phóng các monosaccharide sau đó định lượng
tổng glucose bằng HPLC hay GC.
1.Chuẩn bị mẫu phân tích
a. Tách chiết carbonhydrat
- Phương pháp truyền thống:
+ Chiết lỏng lỏng (LLE):Dựa trên sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn
được vào nhau (trong 2 dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng
cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết
+Chiết pha rắn (SPE) :Quá trình phân bố của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất mẫu ở dạng lỏng/ hơi,
còn chất chiết ở dạng rắn, hạt nhỏ, xốp
-Phương pháp sắc ký
68
+Sắc ký loại trừ kích thước (SEC):Dựa các chất trong mẫu có KTPT khác nhau được phân bố khác nhau vào
trong các lỗ xốp của pha tĩnh. Phân tử kích thước nhỏ rửa giải ra sau. Phân tử kích thước lớn rửa giải ra trước
+Sắc ký trao đổi ion (IEC):Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh .
- Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích dương trên pha tĩnh hút anion chất tan
- Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm sẽ hút cation chất tan
-Phương pháp khác
+Chiết xuất siêu tới hạn (SFE):Hình thành khi nhiệt độ và áp suất vượt quá điểm tới hạn (critical point) tại
điểm cân bằng lỏng hơi
+Chiết xuất dưới áp suất cao (PLE):DM chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn
+Phương pháp phân đoạn dòng chảy trường (FFF):Các thành phần trong mẫu được bơm thành dòng chảy tách
lớp do sự khác nhau về độ chảy
Tách riêng tinh bột: Quá trình chuẩn bị mẫu cần phải sấy khô, nghiền và phân tán trong dung môi ethanol
nóng 80 %. Các monosaccharide và oligosaccharide tan trong dung dịch etanol trong khi tinh bột không tan
=> tách riêng được tinh bột
2. Xử lý mẫu bằng hóa chất
Mục đích:Làm cho tinh bột dễ dàng được phân tích bởi các thiết bị hơn.
Thủy phân :
- Carbohydrat phân tử lớn -> monosaccharid/oligosaccharid đơn giản
- Oligosaccharid, polysaccharid
Lưu ý :
- Cần chọn acid có nồng độ thích hợp và đun nóng ở nhiệt độ phù hợp.
- Để giảm bớt thời gian thủy phân carbohydrat, có thể dùng lò vi sóng chiếu xạ -MWI
Tạo dẫn chất :
- Phân tích bằng sắc ký khí: cần dẫn xuất hóa làm tăng tính bay hơi
- Phân tích bằng phương pháp điện di mao quản hay HPLC
 Tạo dẫn xuất
- Với các polysaccharid tự nhiên
+Thủy phân bằng TFA→ monosaccharid→ loại bỏ acid→ dẫn xuất hóa thành alditol acetat
69
 Tạo dẫn xuất với đường acid: Acid uronic
Hydroxyl của carbon Acid carboxylic
Aldehyl Oxi hóa Acid aldonic
Hydroxyl và Aldehyl Acid aldaric
Thủy phân và làm khô ->Mẫu(10mg) được hòa tan trong natri carbonat, sau đó là borohydrid->Loại bỏ
borohydird (nhờ acid acetic) và ion borat (nhờ methanol)
->Aldose và acid aldonic ->Dẫn xuất TMS(Tạo dẫn xuất TMS nhờ xử lý hỗn hợp khô còn lại với hỗn hợp
pyridin, hexamethyldisilazan và TFA. Chất chuẩn nội được dùng là docosan)
3. Phương pháp phân tích
- Các phương pháp phân tích phổ là kỹ thuật được ứng dụng sớm nhất trong phân tích thực phẩm:
+Phổ hồng ngoại gần-NIR: được ứng dụng rộng rãi trong phân tích nhanh thực phẩm về độ ẩm, protein, chất
béo, acid béo acid hữu cơ và cả đường
Ưu điểm: đơn giản, linh hoạt
+Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Để xác định cấu trúc của carbohydrat(tự nhiên và nhân tạo), NMR là kỹ thuật
đo phổ quyết định và chính xác nhất cho biết cấu trúc, độ sạch và độ an toàn của các mẫu.
+ Phổ khối lượng-MS: là một kỹ thuật phân tích mạnh để phân tích cấu trúc các chất dựa trên sự khác nhau về
tỷ số khối lượng trên điện tích ion (m/z) của các chất
+ Kỹ thuật ion hoá học-CI: khó áp dụng với các chất không bay hơi nên ít được dùng so với hoá tia điện-ESI
có thể phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn như cacbohydrat nhưng không thể phân tích nhiều thành
phần, độ tinh khiết cao
Ưu điểm: tìm thấy cấu tạo không gian cả phân tử, độ nhạy cực cao (10-6 đến 10-12 gam) => phân tích nhanh
về cấu trúc và chức năng của phân tử lớn.
SẮC KÝ KHÍ (GC)
*Trường hợp áp dụng
Dùng rộng rãi để phân tích carbohydrat. Do sự đa dạng trong cấu trúc, kích thước và chức năng cùng với
khả năng bay hơi kém của carbohydrat.
70
=> GC chủ yếu dùng để xác định các mono-, di- và trisaccharid sau khi đã được dẫn xuất hoá.
+ Các oligosaccharid với điểm trùng hợp trong phạm vi 7 cũng được xác định bằng phương pháp này với nhiệt
độ tối đa 360oC.
+ Các dẫn xuất của trimethylsilyl oxim và ether dùng nhiều nhất trong GC khi phân tích carbohydrat. Ngoài
ra, các dẫn xuất acyl hoá cũng được ưu tiên phân tích vì gần với nhu cầu thực tế đó là các aldohexose như
mannnose, galactose, trong glucose hay các rượu đường như mannitol, galactilol, sorbitol.
Điều kiện tiến hành:
- Pha tĩnh: dimethylpolysiloxane
- Nhiệt độ: 300 – 320 LC
- Detector: ion hoá ngọn lửa – FID (Flame Ionization Detector)
Ưu điểm:Độ nhạy cao, lượng mẫu yêu cầu nhỏ
Nhược điểm (so với HPLC, CE):

- Chỉ phân tích được các carbohydrat nhỏ
- Chuẩn bị mẫu phức tạp => Hao hụt chất phân tích
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
● Trường hợp áp dụng
So với GC thì HPLC phổ biến hơn. Đặc biệt là kỹ thuật trao đổi anion hiệu năng cao, detector xung
điện. Trong khi HPLC detector chỉ số khúc xạ-RI chỉ được sử dụng hạn chế để phân tích carbohydrat phức
tạp trong thực phẩm.
Bên cạnh mono- và disaccharid, các oligosaccharid cũng có thể phân tích nhờ HPAEC.
● Điều kiện tiến hành
- Loại sắc ký phù hợp khi phân tích carbohydrat bằng HPLC sắc ký:
+ Phương pháp HPAEC-PAD dựa trên tính acid yếu (Pkₐ từ 12-14) của carbohydrat.
+ Sắc ký loại trừ kích thước dựa trên sự khác nhau về kích thước các chất carbohydrat.
- Nhựa trao đổi amoni bậc/ mtr kiềm: ion hoá các carbohydrat.
- Pha động cần lựa chọn cẩn thận vì có ảnh hưởng mạnh đến độ chọn lọc của các chất phân tích cũng
như tổng thời gian phân tích.
Ưu điểm
- Cho kết quả nhanh hơn GC,
- Không đòi hỏi sự dẫn xuất hóa carbohydrat
- Có nhiều detector phù hợp với việc tách các chất (PAD, RID).
- Detector PAD: chất rửa giải NaOH khá rẻ, an toàn; thích hợp với việc rửa giải với gradien nồng độ.
Nhược điểm
So với GC, độ nhạy của HPLC thấp hơn.
ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE)
Trường hợp áp dụng: Việc sử dụng mao quản để làm kênh di chuyển cho phép thực hiện quá trình tách điện
di trên một thiết bị có thể so sánh với thiết bị của sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tuy nhiên do một số nhược điểm,
phương pháp này được áp dụng hạn chế hơn so với HPLC.
Điều kiện tiến hành:
-Detector: thường là UV hoặc huỳnh quang bước sóng 195nm.

 Do carbohydrat trung hòa, phân cực và thiếu nhóm mang màu , phương pháp CE chỉ thực hiện được
trực tiếp với detector UV bước sóng 195nm.
71
-Với các chất ít đáp ứng ở bước sóng này, việc sử dụng detector gián tiếp có tác dụng nhất định như : fructose,
glucose, maltose, maltotriose, galactose, lactose, sucrose. Bằng cách dẫn xuất hóa các carbohydrat, phương
pháp CE được cải thiện cả về độ nhạy, độ chọn lọc. Các chất hay được tạo ra để phân tích bằng CE là:
phenylethylamin (200 nm), 4-amino-benzoic acid ethyl ester (306 nm) hoặc 6-aminoquinolon (245 nm).
- Thuốc thử p-nitroanilin được thêm vào khi phân tích các hexose khác nhau trong sữa bột, gạo, siro có thể
nâng bước sóng lên 406 nm.
Ưu điểm :
- Là phương pháp phân tích hiện đại.
- Kỹ thuật CE kết hợp mạch vi xử lý có nhiều ưu điểm: tốn ít mẫu thử, thuốc thử, tốc độ phân tích nhanh
Nhược điểm:
- Nhiều chất cần phải chuẩn bị mẫu bằng cách dẫn xuất hóa để thích ứng với detector
- Cần có nhiều nghiên cứu chip xử lý thông minh để áp dụng rộng rãi với các carbohydrat.
PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP

- Được ứng dụng khi phân tích carbohydrat nói chung và trong glycomic nói riêng.
- Với các mẫu phức tạp phối hợp các phương pháp là cần thiết.
Một số kỹ thuật đã được triển khai như:
+ HPAEC-IPED-MS dùng xác định các oligosaccharid trong quá trình kiểm tra online sự thủy phân tinh bột
mỳ.
+ GCxGC-TOFMS dùng phân tích sản phẩm từ dịch chiết húng quế, bạc hà, cỏ ngọt. Kết quả cho thấy 3 loại
thực vật trên chứa nhiều acid amin, acid carboxylic, carbohydrat.
+ RP-HPLC/HILIC dùng phân tích một số mẫu khác nhau chứa đường
+ Cùng với DNA, protein và chất béo, glycans là một trong bốn đại phân tử chính cần thiết cho sự sống G.
PHƯƠNG PHÁP ENZYM
Nguyên tắc:
+ Mẫu thử hoà tan trong nước và tinh bột thủy phân thành maltodextrin bằng α-amylase bền nhiệt ở 95°C đến
100°C.
Maltosaccharid thủy phân thành glucose bằng amyloglucosidase
Glucose được xác định bằng thuốc thử glucose oxidase-peroxidase có độ tinh khiết cao. Sử dụng kit enzym
amyloglucosidase và đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm.
Sản phẩm có amylose hoặc kháng tinh bột cao được xử lý trước bằng dimetyl sulfoxid ở 95 °C trước khi xử lí
bằng α-amylase
- Định lượng được từng thành phần trong tinh bột.
- Độ chính xác và độ tin cậy cao. Độ tái lập đạt yêu cầu, có thể chấp nhận được (dao động từ 2,9% - 4,9%).
- Ưu điểm so với phương pháp hóa học: độ chính xác và hiệu quả cao hơn. Có thể triển khai áp dụng trên thực
tế sẽ cho hiệu quả tốt hơn.
BÀI 7.1. SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 01 CHẾ PHẨM TPCN CHỨA QUERCETIN: TRÌNH BÀY
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT NÀY TRONG SẢN PHẨM. VIẾT QUY TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PP QUANG PHỔ. (TRANG 139)
 Viên uống Doctor's Best Quercetin Bromelain
72
Sản phẩm nhập khẩu chính hãng từ Mỹ, được nghiên cứu và sản xuất bởi Doctor's Best, bảng thành phần có
nguồn gốc tự nhiên. Cụ thể thành phần Quercetin được chiết xuất từ vỏ hạt của cây thân mềm Dimorphandra,
hỗ trợ tốt cho tim mạch và hô hấp; Bromelain là một phức hợp enzyme phân giải protein có nguồn gốc từ thân
dứa, hỗ trợ sự thoải mái của mô và có thể tăng cường hấp thụ Quercetin.
Sản phẩm điều chế dưới dạng viên nén, dễ uống, thuận tiện mang theo bên người.
Doctor's Best Quercetin Bromelain với thành phần chiết xuất từ thiên nhiên hỗ trợ giảm các cơn đau, sưng
viêm do gút.
 Công dụng
 Viên uống tạo cảm giác thoải mái khi di chuyển.
 Hỗ trợ giảm lượng axit uric trong cơ thể, giúp giảm đau.
 Hỗ trợ tốt cho tim mạch.
 Hỗ trợ tốt cho hệ vận động, giúp đi lại thoải mái, tự nhiên. Hỗ trợ tốt các vấn đề về đường hô hấp.
 Hỗ trợ tăng cường miễn dịch, nâng cao sức khỏe.
 TP chính: Quercetin 500mg. Boromelain 250mg.
 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
 PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ UV-VIS
 Dựa trên sự hấp thụ của quercetin trong khoảng UV-VIS.
 Được sử dụng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp
 Đo hấp thụ của quercetin ở bước sóng tối ưu (250 đến 400nm) cho phép xác định nồng độ quercetin
trong mẫu
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ (GC)
 Sử dụng để phân tích quercetin sau khi nó đã được chuyển đổi thành dạng dẫn xuất hợp chất hữu cơ
thích hợp. Quercetin được tách riêng và định lượng bằng cách sử dụng pha tĩnh và pha động trong hệ
thống GC.
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
 Phổ biến.
 Nó sử dụng một cột pha đảo và một pha động (hỗn hợp dung môi) để tách quercetin khỏi các chất khác
trong mẫu.
 Sau đó, quercetin được phát hiện và định lượng dựa trên thời gian lưu và độ hấp thụ.
 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN HÓA
 Dựa trên sự tương tác giữa quercetin và điện cực, và đo dòng điện được tạo ra trong quá trình phân
tích.
 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁC
Ngoài các phương pháp trên, còn có một số phương pháp khác như phân tích phổ cộng hưởng từ (ICP),
phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) và phân tích sắc ký khối (LC- MS) cũng được sử dụng trong
việc định lượng quercetin trong thực phẩm chức năng.
Khi chọn phương pháp phân tích, cần xem xét yêu cầu của mẫu, độ nhạy, độ chính xác, độ lặp lại, chi
phí và thiết bị phân tích có sẵn để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất.
 PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ
 NGUYÊN TẮC: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch phức
tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được
chiếu bởi chùm sáng.
 Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định luật Lamber- Beer:
A = K.C
73
Trong đó:
A là độ hấp thụ quang
K là hằng số thực nghiệm
 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và dung dịch chuẩn
- Mẫu thử: Nghiền viên uống thành bột mịn, cân chính xác khoảng 10mg bột cho vào bình định mức 10,0ml.
hòa tan bằng methanol đến vạch định mức, lắc đều, đem dung dịch đi lọc. Lấy 1ml dịch lọc đã pha loãng ở
nồng độ thích hợp trộn với 1ml AlCl3, lắc đều.
- Mẫu chuẩn:
+ Chuẩn bị một lượng nhỏ quercetin tinh khiết để làm dung dịch chuẩn. Tạo dung dịch chuẩn quercetin có
nồng độ xác định bằng cách hòa tan quercetin tinh khiết trong Methanol.
+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có các nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn:
Cân chính xác khoảng 10,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình định mức dung tích 10 ml, hòa tan bằng dung
môi MeOH và định mức đến vạch để được dung dịch Quercetin chuẩn nồng độ C = 1 mg/ml.
Hút chính xác 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức 10 ml và pha loãng đến vạch bằng MeOH, thu được
dung dịch Quercetin chuẩn có nồng độ C = 100 μg/ml. Tiếp tục pha loãng dung dịch này với MeOH thành dãy
các dung dịch chuẩn C1– C6, nồng độ lần lượt là 20,0; 27,5; 35,0; 42,5; 50,0; 57,5 μg/ml.
Xây dựng đường chuẩn: Cho vào các ống nghiệm 2 ml mỗi dung dịch chuẩn đã pha loãng (C1 – C6) và 2 ml
AlCl3 2%, lắc đều. Để phản ứng diễn ra trong tối 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Mẫu trắng: Dung dịch tương tự mẫu chuẩn nhưng không có AlCl3
Bước 2: Đo phổ hấp thụ và xây dựng đường chuẩn Quercetin
Sử dụng một máy quang phổ UV-Vis để đo hấp thụ của quercetin trong mẫu chuẩn.
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 430nm. Xây dựng đường chuẩn Quercetin dựa vào giá trị mật độ quang thu được
Bước 3: Định lượng Quercetin trong mẫu
Đo hấp thụ của mẫu tại bước sóng tương tự và sử dụng đường chuẩn để xác định nồng độ quercetin trong mẫu.
Từ giá trị mật độ quang thu được và kết quả khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch
chuẩn Quercetin, xác định hàm lượng hoạt chất Quercetin.
Bước 4: Tính toán kết quả
BÀI TẬP 7.3. SINH VIÊN TỰ LỰA CHỌN 01 CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA
FLAVONOID: TRÌNH BÀY CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT NÀY TRONG SẢN
PHẨM. (TRANG 139)
1. Thành phần:
Trong 1 viên Rutin – vitamin C gồm: Rutin 50mg, Vitamin C 50mg. Tá dược vừa đủ cho 1 viên.
Quy cách đóng gói: Hộp 10 vỉ x 10 viên bao đường.
Thành phần Rutin trong thuốc: Rutin là hợp chất Glycosid thuộc nhóm Flavonoid Aglycon được chiết
xuất từ hoa Hoè.
Công dụng: Tăng sức bền thành mao mạch. Phòng và trị xuất huyết, viêm mao mạch, huyết áp cao.
2. Đặc điểm của Flavonoid:
74
Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6. Khung cơ bản gồm 2 vòng
benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon.
Đây là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là ngành hạt
kín, lớp 2 lá mầm.
- Màu sắc: Không màu, vàng nhạt, vàng đậm, đỏ cam, tím tùy loại
- Độ tan: Độ tan của các flavonoid không giống nhau. Các flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là
những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan trong nước, tốt nhất là cồn
nước. Các flavonoid có nhiều nhóm đường tan tốt trong nước nóng, khó kết tinh. Các dẫn chất flavonoid
có nhóm 7-hydroxy: dễ tan trong dung dịch kiềm loãng (NaOH, Na2CO3, NaHCO3) do có tính acid.
- Tính chất khác:
+ Dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm
+ Nhạy cảm với ánh sáng, pH và nhiệt độ Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có màu
đặc trưng.
+ Hấp thụ UV do giàu hệ thống nối đôi liên hợp. Thường có 2 dải hấp thụ cực đại là Amax = 320 – 380
nm và Amax = 240 – 280 nm.
3. Flavonoid trong thực phẩm chức năng và vai trò với sức khỏe con người:
- Flavonoid trong thực phẩm, thực phẩm chức năng được quan tâm nhiều nhất so với các hoạt chất khác
có nguồn gốc từ dược liệu vì có nhiều tác dụng vượt trội như chống lão hóa, ung thư, nhiễm trùng và
các bệnh mãn tính khác.
- Có thể chia các hoạt tính sinh học và cơ chế tác dụng đối với cơ thể người của flavonoid thành 3 nhóm
như sau:
1. Tác dụng chống oxy hóa: Flavonoid tạo ra những gốc tự do bền vững Aryl thay thế các gốc tự do kém
bền vững trong phản ứng peroxy hóa lipid màng tế bào, vì thế dây chuyền sẽ bị cắt đứt. Ngoài ra flavonoid
ngăn chặn hình thành gốc tự do bằng cách kết hợp với các ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là những tác
nhân xúc tác nhiều quá trình sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do.
2. Tác dụng đối với các enzym sinh học: Các flavonoid có thể làm kìm hãm hoạt tính của một số enzym
xúc tác cho các quá trình bất lợi cho cơ thể, nhờ thế có thể hỗ trợ chữa một số bệnh như:
Đái tháo đường (aldo reductase khử đường glucose),
Dị ứng hen phế quản (proton-ATPase tạo tác nhân histamin và serotonin),
Nhiễm siêu vi trùng,
Kháng viêm (prostaglandin gây cảm giác đau, sốt),
Thấp khớp....
3. Khả năng chống peroxy hóa lipid màng tế bào:
75
Sự peroxy hóa lipid sinh vật đều thông qua cơ chế của quá trình gốc tự do. Những gốc tự do sinh ra từ các
quá trình chuyển hóa trong cơ thể không bền và rất dễ phản ứng. Trong khi đó những gốc tự do tạo ra từ
flavonoid tự nhiên ArO lại rất bền vững, khó phản ứng. Trong quá trình peroxy hóa lipid màng, những gốc
này sẽ loại bỏ và thay thế các gốc kém bền dẫn tới sự cắt đứt quá trình. Đó chính là cơ chế giải thích sự
chống peroxy hóa lipid của flavon.
Phương pháp phân tích hoạt chất
Chuẩn bị mẫu phân tích.
• Các flavonoid dạng glycosid có thể cần phải thủy phân trước khi phân tích. Rutin do cấu trúc là một
glycosid nên rất dễ bị thủy phân.
• Tùy trường hợp có thể dùng dung môi hoặc enzyme để thủy phân:
+ Dung môi ethanol hay metanol-nước được acid hóa hoặc thêm chất chống oxy hóa.
+ Dung môi kiềm hay ethanol được acid hóa.
+ Enzym: Cellulase, alpha – amylase, pectinolitic, beta – glucosidase, beta – glucuronidase.
1. Đo phổ
Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch phức tạo
thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu
bởi chùm sáng. Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định luật Lambert-Beer: A=K.C.
Trong đó: A là độ hấp thụ quang
K là hằng số thực nghiệm
C là nồng độ chất phân tích
Trường hợp áp dụng:
 Là phản ứng tạo màu phổ biến nhất được sử dụng khi định lượng các proanthocyanidin hoặc định tính
các flavonoid có cấu trúc polyme.
 Định lượng các flavanol, proanthocyanidin.
 Ưu điểm:
• Độ nhạy khá cao
• Chọn lọc
• Thao tác đơn giản, nhanh chóng. Thiết bị rẻ tiền, phù hợp với phân tích nhiều chất có hàm lượng nhỏ.
 Nhược điểm:
• Độ chọn lọc kém
• Thuốc thử để tạo phức hay hợp chất có các cực đại hấp thu gần nhau, trùng nhau không xác định được.
76
2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Đây là phương pháp hay dùng và hữu hiệu nhất trong phân tích flavonoid bao gồm cả các aglycon và
glycosid. Mà Rutin là một glycosid gồm 2 phần là quercetin (aglycon) thuộc flavonol và phần đường
•  phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định Rutin.
 Ưu điểm:
- Giới hạn phát hiện thấp hơn, có thể phân tích được nhiều loại hợp chất khác nhau, độ chọn lọc và tính
đặc hiệu cao.
- Độ nhạy cảm cao, có khả năng định lượng tốt, mức độ chính xác cao, đặc biệt thích hợp để tách các
chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt
- HPLC cho phép tách nhiều flavonoid khác nhau mà không đòi hỏi phải dẫn xuất hoá mẫu.
- HPLC đã được thẩm định và thử nghiệm cho kết quả chính xác và tin cậy hơn, dễ áp dụng hơn
 Nhược điểm: Thiếu chất chuẩn, đặc biệt là các flavonoid glycoside.
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
Đã được đánh dấu tiêu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP.
 Thiết bị: Hệ thống HPLC. Cân phân tích, độ chính xác d = 0,1 mg. Máy rung siêu âm. Các dụng cụ
thủy tinh cần thiết.
2.1.2. Hóa chất, chất lượng
 Chất chuẩn: Rutin chuẩn hàm lượng: 95,00 %
 Mẫu thử: Viên Rutin – vitamin C có thành phần: Rutin 50mg, Vitamin C 50mg. Tá dược vừa đủ cho 1
viên
 Dung môi, hóa chất: Acetonitril, ethanol, methanol, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC.
2. 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu
 Mẫu chuẩn và mẫu thử được chuẩn bị như sau:
+ Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc, cân rutin chuẩn vào bình định mức, thêm dung môi, siêu âm
tan hoàn toàn, bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều. Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung
dịch chuẩn có nồng độ phù hợp.
77
+ Mẫu thử: cân khối lượng bột thuốc trong 20 viên, trộn đều, tính khối lượng trung bình viên. Cân
chính xác khoảng một lượng bột thuốc tương ứng 1 viên vào bình định mức, thêm dung môi. Chiết
siêu âm 30 phút. Bổ sung dung môi chiết đến vạch, lắc đều, lọc qua màng 0,45 µm.
+ Mẫu trắng: dung môi pha mẫu.
2.2.2. Điều kiện
- Điều kiện sắc ký: Cột RP C18 (25 cm ×5µm × 4,6 mm)
- Điều kiện định lượng:
+ Bước sóng định lượng: 350 nm.
+Tốc độ: 1mL/phút.
+ Thể tích tiêm: 5µL
3. Sắc kí phân bố ngược dòng (CCC)
Sắc ký phân bố ngược dòng (countercurrent chromatography) là phương pháp sắc ký trong đó cả pha
tĩnh và pha động ở trạng thái lỏng.
 Ưu điểm:
- Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ được những khó khăn
thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu hay phân hủy mẫu.
- Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp có khả năng tách các chất phân cực như flavonoid
glycosid hiệu quả, hệ dung môi dùng cho cả pha tĩnh và pha động linh hoạt.
- Rẻ tiền và có thể tiến hành trên phân tích lượng mẫu khá lớn trong thời gian tương đối ngắn.
 Nhược điểm: Hệ thông thiết bị phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao.
4. Sắc kí lớp mỏng (TLC)
 Áp dụng với các flavonoid aglycon không phân cực hoặc phân cực kém (như các flavanol, isoflavon,
polymethoxylated flavon).
 Ưu điểm:
- Nhanh, tiện lợi, thiết bị đơn giản, rẻ tiền.
- Phù hợp với cả phân tích định tính và phân tích định lượng
- Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu một lúc, tiết kiệm thời gian và
chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
78
- Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản mỏng sắc ký, khai triển cùng
trong một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi
trường giữa các lần phân tích.
- So với các phương pháp sắc ký trên cột, TLC có khả năng phân tách kém hơn, độ nhạy thấp.
- Lượng mẫu yêu cầu lớn so với các phương pháp sắc ký trên cột.
- Khả năng phục hồi của các chất chống oxy hoá sau khi sắc ký thấp. Vì vậy, nên cân nhắc dùng TLC
nếu mẫu sau đó tiếp tục được phân tích bằng HPLC hay các kỹ thuật phân tách hiệu năng cao khác.
BÀI TẬP 8.1: TỰ CHỌN MỘT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẤT KỲ CÓ THÀNH PHẦN
CHÍNH LÀ MỘT ĐẾN VÀI ACID AMIN VÀ/HOẶC PROTEIN
a. Dựa vào đặc điểm cấu trúc, tính chất lý hóa của thành phần chính: Chỉ ra lưu ý chung khi xác
định thành phần này trong sản phẩm, liệt kê các phương pháp có thể sử dụng để xác định thành
phần đó trong sản phẩm. (TRANG 146)
b. Chọn một phương pháp ở ý a: Chỉ ra ưu nhược điểm của phương pháp đó, liệt kê các bước tiến
hành, lưu ý về phương pháp, kỹ thuật, điều kiện tiến hành.
I. Thông tin sản phẩm.
Tên sản phẩm: Bé ăn ngon Tuệ Minh Dạng bào chế: Dung dịch
Công dụng:
Bổ sung các acid amin và vitamin cần thiết cho cơ thể, giúp tăng hấp thu dưỡng chất, hỗ trợ tăng cường
tiêu hóa, giúp ăn ngon miệng, tăng cường sức đề kháng.
Đối tượng sử dụng:
Trẻ em biếng ăn, kém hấp thu, gầy yếu, còi xương, suy dinh dưỡng, chậm phát triển, đề kháng kém.
Thành phần trong 100ml gồm có:
L-Lysine HCl 2000mg, Taurin 500mg, Thymomodulin 300mg, Magie gluconate 300mg, Calci lactat
200mg, Kẽm gluconate 100mg, Vitamin PP 20mg, Vitamin B1 20mg, Vitamin B6 5mg, Amylase
10000IU, Phụ liệu khác.
II. Lưu ý khi tiến hành xác định L-lysine và các phương pháp xác định
1. Lưu ý khi tiến hành xác định L-lysine trong sản phẩm.
• L-Lysine không hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại => khi tiến hành phân tích cần tạo dẫn chất có màu.
• L-Lysine HCl dễ tan trong nước => pha mẫu chuẩn bằng nước cất.
• L- Lysine HCl tan chảy và phân huỷ ở nhiệt độ 263-264oC, độ ẩm tương đối ổn định khi dưới 60% và
hơn 60% tạo ra nước => khi tiến hành gia nhiệt cần lưu ý nhiệt độ phù hợp để tránh bị phân hủy.
79
• Ngoài ra cần tránh nhiễu đường nền, sai số trong phòng thí nghiệm, thiết bị.
2. Các phương pháp xác định L-lysine có thể tiến hành.
• Phương pháp gián tiếp: Lowry, Dumas, Biuret, Bradford, Kjeldalh.
• Phương pháp trực tiếp: Các phương pháp sắc kí lỏng.
III. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1. Ưu nhược điểm.
➢ Ưu điểm:
• Độ chính xác cao, độ lặp lại tốt
• Thiết bị tự động, tốn ít thời gian
• Có thể xác định hàm lượng AA tổng và/hoặc hàm lượng từng AA trong mẫu phân tích
• Có thể định lượng trực tiếp AA dưới dạng tự do sau khi chiết tách khỏi mẫu mà không cần thủy phân
➢ Nhược điểm:
• Chi phí cao, mẫu chứ nhiều AA cần sử dụng nhiều thiết bị chuyên dụng
• Sắc ký lỏng thông thường không phân biệt được đồng phân L hay D trong mẫu
• Sản phẩm chứ AA/protein tự do và cấu trúc peptid/không peptid trong nền
mẫu, cần thực hiện thủy phân AA trước khi đo.
2. Các bước tiến hành.
Bước 1: Tách acid amin trong mẫu chế phẩm thành acid amin ở dạng tự do băng sắc ký lỏng trao đổi ion.
➢ Chuẩn bị mẫu thử: hòa tan viên chế phẩm trong 50ml nước chất. Lấy 1ml dung dịch thu được pha loãng
đến 10,0 ml với dung dịch natri citrat. Lọc qua màng lọc 0,45 micromet. Dịch lọc này là mẫu thử của quy
trình sắc ký.
➢ Pha mẫu chuẩn: Hòa tan L-Lysine hydroclorid chuấn trong 50ml nước cất.
Lấy 1ml dung dịch thu được pha loãng đến 10ml băng dịch dịch natri citrat.
Lọc qua màng lọc 0,45 mieromet. Dịch lọc này là mẫu chuẩn của quy trình sắc ký.
̅ Tốc độ dòng: 1ml/phút
̅ Thể tích tiêm: 20 microlit
➢ Pha động: Dung dịch đệm citrat 0.2M
➢ Pha tĩnh: Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách acid amin
ra khỏi nhau và khỏi các chất khác dương tính với ninhydrin.
80
̅ Đầu dò: UV-Vis
̅ Gia nhiệt (125 – 135oC) để tăng tốc độ phân tách.
Bước 2: Tạo dần chất sau cột phân tách.
➢ Dùng thuốc thử Ninhydrin để tạo dẫn chất sau cột.
➢ Do L-Lysine hydroclorid chính trong chế phẩm acid amin bậc nhất do đó hợp chất tạo thành sau khi tác
dụng với ninhydrin sẽ hấp thụ cực đại ở bước sóng 570nm.
Bước 3: Phát hiện bằng deteetor UV-Vis.
Phát hiện các dẫn chất của AA thu được ở sau cột ở bước sóng 570nm..
Bước 4: Tính kết quả.
➢ Tính tỷ lệ phần trăm hàm lượng của một loại acid amin có trong mẫu thử.
➢ Công thức tính:
% = 100x ri/rt
Trong đó:
ri = đáp ứng (hàm lượng, nM) của AA i
rt = đáp ứng (hàm lượng, nM) của tất cả các AA thu được trên sắc kí đồ.
BÀI TẬP 8.3. GIẢI THÍCH ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ ĐẶC ĐIỂM RIÊNG CỦA CÁC ACID AMIN,
PROTEIN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LỰA CHỌN, SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID
AMIN VÀ PROTEIN. (TRANG 146)
*Các phương pháp phân tích acid amin và protein:

- Phương pháp gián tiếp:
 Phương pháp Kjeldahl
 Phương pháp: Lowry, Dumas, Bradford, Biuret,…
- Phương pháp trực tiếp:
 Phương pháp sắc ký lỏng
- Các pp định tính acid amin:
 Phản ứng tạo phức với kim loại nặng
 Phản ứng Ninhydrin
 Phản ứng Xantoprotein
 Phản ứng Millon (nhận biết Tyrozin)
 Phản ứng Adamkievic (nhận biết Tryptophan)
 Phản ứng Sakagichi (nhận biết Arginin)
Các pp định tính protein:

 Phương pháp xác định đạm formol
* Chế phẩm chứa acid amin trên thị trường
81
Các acid aimin và protein có trong chế phẩm
Thành phần L-Leucin: 15mg.
L-Lysin hydroclorid: 8mg
L-Threonin: 5mg
L-Phenyalanin: 5mg
1. Các đặc điểm chung của các loại acid amin

-Cacbon, hiđro, nitơ, oxi, là bốn yếu tố chính cấu tạo thành axit amin. Về tính chất vật lý axit amin có đặc
điểm như sau:
• Axit amin tồn tại ở trạng thái rắn, kết tinh, có vị ngọt, đôi khi có vị đắng.
• Axit amin dễ bị chị làm nóng chảy và phân hủy ở nhiệt độ cao.
• Do các amino axit ở trạng thái lưỡng cực nên axit amin dễ hòa tan trong nước.
-Về tính chất hóa học axit amin có đặc điểm như:
• Axit amin có thể tác dụng được với axit vô cơ và kiềm để tạo ra muối tương ứng, do axit amin vừa có
tính axit vừa có tính bazơ.
• Axit amin có phản ứng trùng ngưng và tạo polime.
• Axit amin có phản ứng este hóa.
=> Các acid amin và protein có trong chế phẩm có thể xác định bằng phương pháp Kjeldahl
1. Các đặc điểm riêng của các loại acid amin
 Các acid amin tồn tại ở các dạng: +Dạng tự do, Peptid, Protein, Polymer ( liên kết không phải liên
kết peptid)
 Mỗi dạng cần có phương pháp phân tích khác nhau.
 Acid amin ở dạng tự do: Các acid amin ở dạng tự do có thể chiết xuất trực tiếp từ cốt để phân
tích.Protein và peptid cần được thủy phân để tạo dạng acid amin tự do để phân tích.( Tryptophan bị
phân hủy hoàn toàn bởi quá trình thủy phân acid-> protein chứa tryptophan phải được thủy phân bởi
kiềm;
+ Glutamin và asparagin bị chuyển hoàn toàn thành acid glutamic và acid asparagic trong quá trình
thủy phân bằng acid-> kết quả định lượng Glx và Asx sẽ bao hàm cả Glu và Asp.
+ Cystein bị chuyển hóa một phần (không thuận nghịch) thành acid cysteic; methionin bị chuyển hóa
một phần (không thuận nghịch) thành methionin sulfoxyd và methionin sulfon -> các sản chuyển hóa
này sẽ ổn định hơn khi sử dụng acid performic để thủy phân)
 Hàm lượng acid amin xác định từ cốt đã thủy phân là acid amin toàn phần, bao gồm các acid amin tự do
và acid amin trong peptid hoặc protein
 Để phân tích các acid amin trong polymer với liên kết không phải liên kết peptid cần có phương pháp
phân tích đặc biệt.
 Các acid amino carboxylic có độ phân cực khác nhau, phụ thuộc vào cấu trúc của các gốc R gắn vào C.
 Đây là cơ sở để tách các amino acid ra khỏi hỗn hợp bằng phương pháp sắc kí lỏng.
 Các acid amin có tính chất lưỡng tính, khả năng proton hóa phụ thuộc vào cấu trúc của từng acid amin
và PH( L-Threonin có pH: 5.0-6.5;L-Methionine có pH: 5.4-6.1,...) , giá trị đẳng pKi khác nhau dựa
vào pKa của từng acid amin
82
 Tách các acid amin trong hỗn hợp bằng phương pháp sắc kí lỏng trao đổi ion.
Vd: trong chế phẩn Viên tăng cân TAMINO  Xác định L- Lysin và L- Threonin bằng pp sắc ký
lỏng trao đổi y ion
Chú ý:
+ Một vài acid amin hấp tụ mạnh bức xạ tử ngoại như Tyrosine và Trytophan
 Thực hiện phân tích bằng các phương pháp sắc ký.
+ Các acid amin đều không có màu và hấp thụ tử ngoại yếu, vì vậy khi thực hiện phân tích bằng các phương
pháp sắc ký. Hầu hết các AA không phát hiện được bằng detector tử ngoại – khả kiến . Tuy nhiên, các AA này
có thể tham gia phản ứng hóa học với một số thuốc thử như ninhydrin, OPA,.., tạo sản phẩm có màu hoặc hấp
thụ UV mạnh, phát huỳnh quang.
 Các dẫn chất của AA được phát hiện bằng detector UV-Vis hoặc detector huỳnh quang tương ứng.
Ví dụ: Các acid amin bậc nhất tác dụng với ninhydrin cho hợp chất màu tím, hấp thụ cực đại ở bước sóng 570
nm. Trái lại, các acid amin bậc 2 (các amino acid) như prolin, tác dụng với ninhydrin cho hợp chất màu vàng,
hấp thụ cực đại ở 440 nm.
 Các acid amin cũng có khả năng tham gia các phản ứng acetyl hóa, formyl hóa hay ester hóa
 Tạo một số dẫn chất trước hoặc trong quá trình thủy phân.
 Các kỹ thuật phân tách thông thường không thể phân biệt được 2 loại đồng phân D- và L- của các acid
min.Riêng methionin có thể sử dụng cả đồng phân D- do đồng phân này tự chuyển sang dạng L- trong
cơ thể.
 cần sử dụng các kỹ thuật đặc biệt như sắc ký đồng phân và hay phân tích enzym để phân biệt.
 Một số có biến đổi đặc biệt (phân hủy, oxy hóa, halogen hóa, …): Try, Cys, Lys, Glu, Met, His,….
( lựa chọn kỹ thuật thủy phân )
 Khi thủy phân bằng acid ,tryptophan bị phá hủy hoàn toàn ;từ 5-10% xerin ,threonine bị phá hủy.
 Khi thủy phân bằng kiềm tất cả các acid amine (trừ tryptophan )đều bị phá hủy.
 Sử dụng pp sắc ký giấy.
Vd: Định tính Tryptophan bằng pp sắc ký giấy ( với dịch thủy phân bằng base)
=> Các đặc điểm về cấu túc và tính chất lý hóa của acid amin và protein là cơ sở để phân biệt các acid
amin và protein có trong hỗn hợp thành phần của thực phẩm chức năng.
BÀI TẬP 9.1. NHÓM SV TỰ CHỌN MỘT SẢN PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẤT KỲ B CÓ
THÀNH PHẦN CHÍNH LÀ MỘT ĐẾN VÀI VITAMIN.
a. Dựa vào đặc điểm về cấu trúc, tính chất lý hóa của thành phần chính: Chỉ ra những lưu ý chung khi
xác định thành phần này trong sản phẩm; Liệt kê các phương pháp có thể sử dụng để xác định thành
phần đó trong sản phẩm B.
83
b. Chọn một phương pháp ở ý (1): Chỉ ra ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đó khi áp dụng để
xác định thành phần này trong sản phẩm B
Liệt kê các bước tiến hành, kèm theo những lưu ý nếu có về phương pháp, kỹ thuật, điều kiện tiến
hành. (TRANG 172)
THÔNG TIN SẢN PHẨM

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe: SWISS ENERGY VITAMIN C 1000 MG
Công dụng: Bổ sung vitamin C cho cơ thể giúp tăng cường khả năng miễn dịch và giảm quá trình lão hóa.
Đối tượng sử dụng: Người lớn và trẻ em trên 14 tuổi
Hướng dẫn sử dụng: Hòa tan 12 viên trong 200ml nước, mỗi ngày uống 1/2 viên. Không sử dụng quá liều
lượng khuyến cáo
Chú ý: Thực phẩm này không phải là thuộc, không có tác dụng thay thế thuốc chữa bệnh. Không sử dụng
nếu dị ứng với các thành phần của sản phẩm, không sử dụng cho trẻ em dưới 14 tuổi
Thành phần
Thành phần cho 1 viên sủi (4000mg)
- Vitamin C (L-ascorbic acid)…1000mg
- Thành phần khác: Acid citric, chất điều chỉnh độ acid (natri hydro carbonat), chất độn (dextrose, sorbitol),
chất tạo ngọt tổng hợp (aspartam), hương chanh tự nhiên, chất độn (maltodextrin), chất làm
dầy (maltodextrin, gôm arabic (INS 414), phẩm màu tự nhiên (dioxyd titan), polyetylen glycol (INS 1521),
phẩm màu tự nhiên (101(1))vừa đủ 1 viên.
1. Đặc điểm cấu trúc, tính chất lý hóa của Vitamin C

1.1. Đặc điểm cấu trúc
- CTHH: C6H8O6
- VTM C tồn tại dưới 2 dạng có hoạt tính là acid L-ascorbic (AA), một chất có tính khử mạnh, và acid L-
dehydroascorbic (DHAA), một dẫn chất bị OXH của AA. Do có tính khử mạnh, VTM C có vai trò là chất
chống OXH quan trọng cho cơ thể, dựa vào khả năng cho đi 1 hoặc 2 electoron trong cấu trúc.
=> Khi phân tích: phương pháp phân tích có thể xác định hàm lượng AA hoặc vitamin C tổng (cả DHAA).
84
1.2. Tính chất lý hóa
- Tính chất vật lý : Vitamin C ở dạng tinh thể trắng, rất dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96% khó tan
trong rượu, thực tế không tan trong ether và clorofom, không tan trong các dung môi hữu cơ.VTM C nhạy
cảm với pH kiềm, tia tử ngoại, chất oxi hóa, ion kim loại (Fe3+,Cu2+), nhiệt độ cao, oxy không khí.
- Tính chất hóa học:
+ Tính khử mạnh (phản ứng với chất oxy hóa)
+ Hấp thụ mạnh UV
1.3. Khi phân tích cần chú ý:
(1) làm trong pH acid
(2) thêm chất chống oxi hóa (b-mercaptoethanol, dithiothreitol)
(3) Sử dụng dụng cụ/bình đựng là thủy tinh tránh ánh sáng, hút chân không và/hoặc bơm khí nitơ.
(4) tránh nhiệt độ cao (chiết lạnh, nhiệt độ phòng)
(5) thực hiện qui trình phân tích dưới ánh sáng nhân tạo
(6) tránh tác động của chất oxi hóa (kim loại)
(7) thực hiện qui trình nhanh nhất có thể.
1.4 Các phương pháp có thể sử dụng để xác định vitamin C
- Tính khử mạnh (phản ứng với chất oxy hóa) => Định lượng bằng HPLC/UHPLC-Vis (254/265nm)
- Hấp thụ mạnh UV => Định lượng bằng PP chuẩn độ DCIP hoặc đo vi huỳnh quang
2. Lựa chọn phương pháp định lượng bằng HPLC/265nm

* Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin C trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC). Hàm lượng vitamin C là tổng axit ascorbic L(+) và axit ascorbic L(+) đã khử hydro.
* Nguyên tắc
Vitamin C được chiết ra khỏi mẫu phân tích bằng dung dịch axit metaphosphoric. Dùng dung dịch khử
để chuyển axit ascorbic L(+) đã khử hydro thành axit ascorbic L(+). Hàm lượng axit ascorbic L(+) tổng
số được xác định bằng HPLC có detector UV ở bước sóng 265 nm
2.1 Ưu và nhược điểm của phương pháp
* Ưu điểm:
- Là phương pháp được ưu tiên áp dụng hầu hết các mẫu phân tích phù hợp cho vtm C.
85
- Phù hợp cho vitamin C có đặc điểm dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vitamin C hấp thụ mạnh tử ngoại ở
bước sóng 265nm  Sử dụng HPLC 265nm.
- Có độ đúng, độ chính xác cao
- Quy trình thực hiện tương đối đơn giản, nhanh cho ra kết quả.
- Phát hiện lượng chất nhỏ
* Nhược điểm
- Khó làm sạch, chi phí cao
- Cần tuân thủ kỹ thuật tránh phân hủy chất phân tích với vitamin C cần tránh tác nhân ảnh hưởng đến
độ bền hoạt chất (tránh ánh sáng, kim loại, không khí) chiết lạnh cần b-mercaptoethanol , dithiothreitol, thực
hiện ở pH thấp.
2.3. Các bước tiến hành
* Yêu cầu chung:
Các dung dịch chuẩn và các dung dịch mẫu cần phân tích càng sớm càng tốt, giữ nhiệt độ dưới 25C trong
suốt quá trình phân tích và loại bỏ sau 8h.
*Chuẩn bị mẫu thử
Đồng hóa mẫu thử. Nghiền thô nguyên liệu trong máy thích hợp và trộn lại. Tiến hành phân tích ngay sau
khi đồng hóa.
Bước 1: Xử lí mẫu thử

*Chiết lạnh với acid metaphosphoric
Cân một lượng mẫu thích hợp rồi tiến hành như sau:
Lưu ý: Có thể tăng tính ổn định của dung dịch axit ascorbic bằng bằng cách bổ sung dung dịch cystein hoặc
dithitheitol (DTTA) hoặc axit phosphoric triamin diethylen (DTPA) vào dung dịch axit metaphosphoric.
*Khử dịch chiết:
Lưu ý: mẫu có chứa các chất làm đặc hoặc chất làm rắn thì làm kết tủa chúng để tránh làm tắc nghẽn cột.
Trong trường hợp này, thêm 1 ml metanol vào 4 ml dung dịch mẫu khử. Lọc qua bộ lọc màng, sử dụng dịch
lọc này để phân tích sắc ký.
86
Bước 2: Tách Vitamin C
Thực hiện song song 2 mẫu: mẫu thử, mẫu chuẩn (dung dịch acid ascorbic) sử dụng phương pháp HPLC có
detector UV ở bước sóng 265nm với các điều kiện sử dụng trong phòng thử:
+ Pha tĩnh: Lichrospher 100 RP 18, cỡ hạt 5µm, kích thước 250mm x 4,0mm.
+ Pha động: Dung dịch kalidihydrophosphat + N-cetyl-N,N,N-trimethylamoni bromua/Methanol
+ Tốc độ dòng: 0,7 ml/min
+ Thể tích bơm: 30µl
+ Detector: UV bước sóng 265 nm.
Bước 3: Xác định VITAMIN
- Nhận biết axit L-ascorbic bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic riêng rẽ trong sắc ký đồ thu được
từ dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.
- Việc nhận biết pic cũng có thể được thực hiện bằng cách thêm chuẩn vào dung dịch mẫu thử.
Bước 4: Tính kết quả
Tính theo đường chuẩn hoặc sử dụng các chương trình thích hợp của bộ tích phân hoặc sử dụng công thức
giản lược sau đây:
Tính phần khối lượng của axit ascorbic, w, bằng miligam trên 100 g (mg/100g) mẫu, theo Công thức (1) sau
đây:
(1)
Trong đó:
As là diện tích pic hoặc chiều cao pic của axit L-ascorbic thu được với dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị
chiều cao hoặc diện tích.
Ast là diện tích pic hoặc chiều cao pic của axit L-ascorbic thu được với dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng đơn vị
chiều cao hoặc diện tích;
 là nồng độ của axit L-ascorbic trong dung dịch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);
m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);
V là tổng thể tích dung dịch mẫu thử trước bước khử, tính bằng mililit (ml)
F là hệ số pha loãng của bước khử (trong trường hợp này là 2,5);
1000 là hệ số chuyển đổi miligam thành gam.
100 là hệ số để tính hàm lượng trên 100 g;
Báo cáo kết quả vitamin C bằng miligam trên 100g (mg/100g).
Nếu có bước kết tủa, thì trong Công thức (1) phải nhân với 5/4.
87
CÂU HỎI 9.2: LIỆT KÊ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC VITAMIN KHÁC NHAU TỪ MẪU
TPCN. GIẢI THÍCH NGUYÊN TẮC VÀ Ý NGHĨA CÁC BƯỚC XÀ PHÒNG HÓA (TRANG 166)
 Các phương pháp chiết các vitamin khác nhau từ mẫu TPCN
- Trước khi tiến hành định lượng, ngoại trừ một vài thử nghiệm đặc biệt, các vitamin cần được chiết tách
ra khỏi nền mẫu (matrix) của mẫu cần phân tích. Để chiết các vitamin, có thể sử dụng một vài trong số các
nhân thiệt, acid, kiềm, dung môi hay enzym.
- Nhìn chung, mỗi vitamin cần một phương pháp chiết riêng và được thiết kế nhằm đảm bảo vitamin đó
ổn định khi chiết. cũng có thể sử dụng một vài phương pháp chiết phù hợp với một hỗn hợp gồm nhiều
vitamin trong một sản phẩm.
- Dưới đây là các phương pháp chiết điển hình áp dụng cho các vitamin:
 Vitamin C ( acid ascorbic): chiết lạnh với acid metaphosphoric/acid acetic.
 Vitamin B1 và Vitamin B2: đun sôi hoặc cách thủy (hấp) trong acid (hydrocloric,tricloracetic,
sulfuric), có mặt enzym( papain, pepsin, takadiastase, claradiastase).
 Vitamin B3 (PP, niacin): cách thủy (hấp) trong acid ( đối với sản phẩm không chứa ngũ cốc), hoặc
trong kiềm( đối với sản phẩm chứa ngũ cốc).
 Vitamin B9 (folat): chiết bằng enzym amylase, protease và glutamyl hydrolase( liên hợp).
 Các vitamin tan trong dầu (A, D, E): chiết bằng dung môi hữu cơ, xà phòng hóa,sau đó chiết lại bằng
dung môi hữu cơ; thường thêm chất chống oxy hóa để ngăn phản ứng oxy hóa các vitamin.
 Nguyên tắc của bước xà phòng hóa khi chiết vitamin tan trong dầu
- Đối với các vitamin tan trong dầu, khi chiết lần đầu bằng dung môi hữu cơ kị nước, có thể chiết tất cả
thành phần tan trong dầu có trong mẫu, bao gồm tricylglycerol. Bước xà phòng hóa được thực hiện ngay sau
đó bằng cách để dịch chiết qua đêm ở nhiệt độ phòng đun nồi lưu ở 70oC, có thêm chất chống oxy hóa để bảo
quản mẫu, ngăn phản ứng oxy hóa các vitamin.
 Ý nghĩa của bước xà phòng hóa khi chiết các vitamin tan trong dầu
- Nhờ phản ứng xà phòng hóa, các acid béo từ các triacylglycerol trở nên thân nước, do đó được tách
loại khỏi mẫu khi thực hiện bước tiếp theo là chiết lại các vitamin bằng dung môi hữu cơ thân dầu.
BÀI 9.3. GIẢI THÍCH ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ ĐẶC ĐIỂM RIÊNG CỦA CÁC VITAMIN CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LỰA CHỌN, SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VITAMIN TRONG TPCN.
(TRANG 165)
Đặc điểm chung của vitamin:
 Tính tan
+ Tan trong dầu: Vitamin A, D, E, K
+ Tan trong nước: Vitamin B (Trừ vitamin B2), C
 Phương pháp chiết, phương pháp định lượng
88
 Không bền dưới tác động của nhiệt, ẩm, ánh sáng, oxy không khí, môi trường acid hoặc kiềm 🡺 Lựa
chọn phương pháp phân tích phù hợp tránh các tác nhân trên
 Đơn vị tính:
+ Đơn vị khối lượng (mg,µg)
+ Đơn vị quốc tế (IU)
+ Đơn vị phần trăm giá trị hàng ngày (%DV)
 Phương pháp vi sinh vật
 Được đưa vào cơ thể từ thực phẩm hoặc thực phẩm bổ sung, tính chất cả phân tử 🡺 Phương pháp
HPLC
Đặc điểm riêng của các vitamin:
1. Vitamin A
 Do có hệ dây nối đôi luân phiên tương đối dài nên vitamin A hấp thụ mạnh bức xạ vùng tử ngoại và
vùng trông thấy => Định lượng bằng phương pháp đo quang (λmax =326nm), Phương pháp sắc ký bằng
detector tử ngoại
2. Vitamin D
 Do cấu trúc của vitamin D có 3 dây nối đôi liên hợp nên được định lượng bằng HPLC-UV-Vis hoặc
UHPLC – MS/MS
3. Vitamin E
 Do có nhân Chroman nên hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại 🡺 Định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp
thụ tử ngoại trực tiếp hoặc sau khi tách ra bằng phương pháp sắc ký
 Do có nhóm -OH phenol nên có tính khử 🡺 Định lượng bằng phương pháp đo ceri, chỉ thị là
diphenylamin
4. Vitamin K
 Do có cấu trúc 2- methyl- 1,4 naphtoquinon nên hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại và cả bức xạ vùng trông
thấy 🡺 Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại trực tiếp hoặc sau khi phân lập
riêng bằng HPLC.
 Khử hóa bằng hydro tạo hydroquinon không màu 🡺 định lượng bằng phương pháp đo ceri, chỉ thị
ortho phenanthrolin (chỉ thị từ màu đỏ chuyển sang xanh)
5. Vitamin C
 Do có nhóm endiol nên có tính khử và tính acid
+ Tính acid: do hiệu ứng cảm ứng với nhóm carbonyl 🡺 Định lượng bằng phương đo kiềm, với chỉ thị là
phenophtalein
+ Tính khử 🡺 Định lượng bằng phương pháp đo iod, chuẩn độ bằng 2,6- dichloroindophenol
Do nhóm endiol liên hợp với nhóm carbonyl nên vitamin C hấp thụ bức xạ tử ngoại 🡺 Định lượng
bằng phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại UV-Vis hoặc phát hiện vết chất bằng phương pháp sắc ký
với detector tử ngoại
6. Vitamin B
 Vitamin B1
+ Có thể bị oxi hóa bởi kali ferricyanide ([K3Fe(CN)6] hoặc KMnO4,…) tạo ra thiocrom, hợp chất có
khả năng phát huỳnh quang 🡺 Định lượng bằng phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang,
phương pháp đo quang
+ Do có vòng pyrimidin nên có tính base 🡺 Định lượng bằng phương pháp đo acid trong môi trường
khan
89
 Vitamin B2:
+ Do có khả năng phát huỳnh quang có màu vàng xanh đặc trưng và ở pH acid nó hấp thụ cực đại ở
565nm 🡺 Định lượng bằng phương pháp đo huỳnh quang
+ Do có cấu trúc vòng isoalloxazine 🡺 Định lượng bằng phương pháp enzyme
 Vitamin B3, B5, B9, B12 🡺 Định lượng bằng phương pháp vi sinh
BÀI TẬP 10.1: NHÓM SV TỰ CHỌN MỘT CHẾ PHẨM TPCN BẤT KỲ C CÓ THÀNH PHẦN
CHÍNH LÀ MỘT ĐẾN VÀI ACID BÉO.
a. Dựa vào đặc điểm về cấu trúc, tính chất lý hóa của thành phần chính: Chỉ ra những lưu ý chung khi xác
định thành phần này trong sản phẩm; Liệt kê các phương pháp có thể sử dụng để xác định TP đó trong
sản phẩm C
b. Chọn một phương pháp ở ý (1): Chỉ ra những ưu và nhược điểm của phương pháp đó khi áp dụng để
xác định thành phần này trong sản phẩm C. Liệt kê các bước tiến hành, kèm theo những lưu ý nếu có
về phương pháp, kỹ thuật, điều kiện tiến hành. (TRANG 180)
Trả lời:
Chế phẩm lựa chọn :Dầu cá không mùi viên uống mini Blackmores Fish Oil Mini Caps Odourless của Úc 400
viên
a. Thành phần của dầu cá không mùi viên uống mini Blackmores Fish Oil Mini Caps Odourless
của Úc 400 viên:
 Dầu cá (tự nhiên): 1000mg
 Chứa 300mg omega-3 marine triglycerides, gồm có:
 Eicosapentaenoic Acid (EPA): 180mg
 Docosahexaenoic Acid (DHA): 120mg
Sản phẩm không chứa men, gluten, lúa mì, các chế phẩm từ sữa, chất bảo quản, màu nhân tạo, chất tạo hương
và đường hóa học.
1. Axit eicosapentaenoic (EPA; cũng là axit icosapentaenoic) là một axit béo omega-3. Về cấu trúc
hóa học, EPA là một axit cacboxylic có chuỗi 20 cacbon và năm liên kết đôi cis; liên kết đôi đầu tiên
nằm ở carbon thứ ba từ đầu omega
 Các tính chất đặc trưng
 Điểm nóng chảy: 53-54 °C
 Độ tan trong nước: 0.000289 mg/mL
EPA có một cấu trúc phân tử đặc biệt với nhiều liên kết đôi trong chuỗi carbon. Các liên kết đôi này
tạo nên một cấu trúc không bão hòa và làm cho EPA trở nên dễ bị oxi hóa hơn. Tuy nhiên, nhờ cấu
trúc này, EPA cũng có khả năng tương tác với các chất chống oxi hóa và các hệ thống chống oxi hóa
trong cơ thể, giúp bảo vệ nó khỏi quá trình oxi hóa quá mức.
2. Docosahexaenoic Acid (DHA) là một acid béo omega-3 có 22 nguyên tử carbon, 6 liên kết đôi không
bão hòa bắt đầu từ nguyên tử carbon thứ 3 ở đầu methyl: liên kết đôi cis ở các vị trí 4, 7, 10, 13, 16 và
19.
90
 DHA nguyên chất không màu, không mùi, lỏng ở nhiệt độ thường và tan trong chất béo. Nó dễ tan
trong dung môi hữu cơ và không tan trong nước. Ngoài ra, DHA chứa methylene hoạt động, dễ bị oxy
hóa
Trong cơ thể con người, DHA là một phần quan trọng của màng sinh học và là tiền chất chính của một
số hormone, chủ yếu tồn tại dưới dạng phospholipid và có rất ít acid béo tự do. Một khi DHA được cơ
thể hấp thụ, phần lớn nó liên kết với triglyceride. Khi các acid béo khác trong cơ thể được sử dụng và
tiêu thụ với số lượng lớn, DHA bị oxy hóa và phân hủy để cung cấp năng lượng.
 Lưu ý chung khi xác định EPA, DHA trong sản phẩm:
 Chọn phương pháp xác định phù hợp: Chọn phương pháp phù hợp với và độ nhạy cần thiết để
đảm bảo kết quả chính xác.
 Kiểm soát điều kiện lưu trữ: acid béo là một hợp chất dễ bị oxi hóa, vì vậy cần đm bảo kiểm soát
điều kiện lưu trữ ( ở nhiệt độ thấp <20oC)
3. Các phương pháp có thể sử dụng để xác định DHA trong sản phẩm C:
 Các phương pháp xác định :
 Có tính acid (COOH) => Phương pháp chuẩn độ acid-base.
Phương pháp chuẩn độ hóa học dùng để xác định tổng hàm lượng các acid béo tự do có trong
DMĐTV. Đó là số mg KOH cần thiết để trung hòa các aicd béo tự do/1g chất béo. Sử dụng kết hợp
với một số kỹ thuật phân tích khác để tăng độ chính xác và rút ngắn thời gian phân tích.
 Hấp thụ UV mạnh => nhận biết bằng detector tử ngoại – khả kiến.
 Phương pháp quang phổ: Hồng ngoại chuyển đổi Fourier
 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
 Phương pháp sắc ký khí: GC được xem là phương pháp hữu hiệu dùng để tách và xác định các acid
béo trong cách loại nền mẫu khác nhau thông qua việc chuyển acid béo thành dạng metyl
este( FAME) dễ hóa hơi.
b. Chọn phương pháp sắc ký khí
 Ưu điểm:
 Có độ chính xác cao
 Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
 Không cần làm bay hơi mẫu
 Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
 Độ nhạy cao nhờ đầu dò, độ ổn định lớn.
 Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100)L
 Chỉ có thể tách các hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt.
 Ít chọn lọc do không loại trừ hết được ảnh hưởng của nền mẫu
 Các mẫu cần phải được làm sạch trước khi tiến hành phân tách.
 Đòi hỏi người sử dụng phải có kinh nghiệm cao để có thể hoạt động một cách hiệu quả, mức độ
chính xác cao
 Xử lý phức tạp: Để định lượng acid béo bằng GC, mẫu dầu cá phải trải qua quá trình chuyển đổi
thành dạng hợp chất dễ bay hơi, thường là este metyl của dầu cá.
 Phương pháp sắc ký khí:
91
 Thiết bị, dụng cụ: Hệ thống săc kí khí (GC), được trang bị detector ion hóa ngọn lửa (FID),bình cầu
có lắp bộ phận sinh hàn hồi lưu, các thiết bị và dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm.
 Cách tiến hành:
 Bước 1: Chiết xuất
 Bước 2: Tạo dẫn chất
 Bước 3: Tiến hành định lượng

Bơm 2 ul dung dịch chuẩn FAME vào cột GC. Sử dụng chuẩn hỗn hợp FAME để tối ưu hoá sắc ký  bơm
dung dịch mẫu thử.
Xác định pic acid béo trong dịch chiết mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn.
Định lượng acid béo bằng cách đo S tại thời gian lưu của 2 acid béo DHA và EPA với dung dịch nội
chuẩn.--> so sánh với t lưu của dung dịch chuẩn tương ứng.
 Bước 4: Tính kết quả
Tổng hàm lượng acid béo trong mẫu thử (tổng số acid béo từ tất cả các nguồn được biểu thị dưới dạng
triglycerid bao gồm cả dạng cis và trans của acid không bão hòa đơn, X, tính bằng phần trăm (%),
được tính bằng công thức:
92
Trong đó: Wtestportion là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam(g)
 Lưu ý về phương pháp, kỹ thuật, điều kiện tiến hành:
 Phương pháp phân tích: Chọn phương pháp phân tích GC phù hợp, bao gồm lựa chọn cột pha đảo, đầu
dò và điều kiện vận hành. Đảm bảo phương pháp được chọn đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của
kết quả.
 Chuẩn định lượng: Sử dụng chuẩn định lượng DHA chính xác và đáng tin cậy để xác định nồng độ
DHA trong mẫu. Chuẩn định lượng cần được chuẩn bị và xác thực kỹ lưỡng để đảm bảo độ chính xác
và độ tin cậy của kết quả.
 Kỹ thuật:
 Tiền xử lý mẫu: Quá trình tiền xử lý mẫu để chuyển đổi DHA thành dạng hợp chất dễ bay hơi, như
este metyl, cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất chuyển đổi tốt và mất mát DHA thấp.
 Chiết xuất: Lipid dễ bị thuỷ phân bởi enzym, các UFA (acid DPA VÀ EPA) nhạy cảm với quá trình
oxy hoá bởi enzym hoặc không bởi enzym. Vì vậy các mẫu phải được lưu giữ ở nhiệt độ thấp (20 độ C
hoặc thấp hơn) tốt nhất là trong môi trường khí trơ hoặc sử dụng màng bọc chống oxy trước khi chiết
xuất. Sau chiết acid béo cần giữ nhiệt độ dưới 20 độ C, trong khí trơ, hoà tan trong dung môi không
phân cực và thêm chất chống oxy hoá để tránh làm thay đổi thành phần acid béo trong TPCN.
 Nhiệt độ và điều kiện vận hành:
 Điều chỉnh các thông số nhiệt độ và dòng chảy khí của hệ thống GC để đảm bảo tách DHA và các
thành phần khác một cách hiệu quả và chính xác.
 Nhiệt độ cột, nhiệt độ đầu dò và nhiệt độ chương trình chạy phải được điều chỉnh sao cho phù hợp với
tính chất của DHA và các thành phần liên quan.
BÀI TẬP 10.2: GIẢI THÍCH ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC ACID BÉO LIÊN QUAN ĐẾN LỰA CHỌN, SỬ
DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BÉO TRONG TPCN. (TRANG 178)
I. Giới thiệu chung về Acid béo
 Định nghĩa
- Acid béo là acid carboxylic với một đuôi không vòng (chuỗi), và có thể là no hoặc không no. Hầu hết các
acid béo trong tự nhiên bao gồm một chuỗi các số chẵn của các nguyên tử carbon, từ 12 tới 28.
- Acid béo thường có nguồn gốc từ triglyceride hoặc phospholipid.
 Phân loại
- Căn cứ vào độ dài mạch carbon gồm: acid béo mạch ngắn, mạch vừa, mạch dài, và mạch rất dài
- Căn cứ vào số lượng nối đôi trong phân tử gồm:
+ Acid béo bão hòa
93
+ acid béo chưa bão hòa
1. Phân loại theo số lượng nối đôi trong phân tử
- Axit béo bão hòa là các axit không chứa liên kết đôi trong phân tử.
- Hầu hết các SFA trong tự nhiên có mạch cấu trúc không nhánh, số lượng nguyên tử cacbon là số chẵn,
thường có từ 4 đến 24 nguyên tử cacbon.
- Công thức chung của chúng là R –COOH (R là nhóm hydrocacbon mạch dài CH3(CH2)x hoặc CnH2n+1
- Ví dụ như: CH3(CH2)2COOH là acid butyric, CH3(CH2)10COOH là axit lauric…
1. Phân loại theo số lượng nối đôi trong phân tử
Axit béo chưa bão hòa là các axit có chứa liên kết đôi trong phân tử.
Ví dụ: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH (Axid oleic), CH3(CH2)5=CH(CH2)7COOH là (Axid palmitoleic)
…
 Acid béo có một nối đôi gọi là các axit béo không bão hòa đơn (MUFA -Monounsaturated Fatty Acid).
+ MUFA có thể có hai cấu hình cis và trans, tùy theo vị trí tương đối của các nhóm ankyl R.
+ Trong tự nhiên, hầu hết các MUFA có cấu hình cis.
+ Các axit béo có cấu hình trans (Trans Fatty Acid – TFA) không tìm thấy trong tự nhiên mà là
sản phẩm sinh ra từ các hoạt động của con người (ví dụ quá trình hyđro hóa).
 Axit béo có hơn một nối đôi trong phân tử gọi là các axit béo không bão hòa đa (PUFA -
Polyunsaturated Fatty Acid)
 Có tính axit và tính phân cực cao của nhóm chức cacboxyl trong phân tử
2. Một số phương pháp xác định hàm lượng axit béo
Ba phương pháp xác định hàm lượng axit béo trong thực phẩm được sử dụng phổ biến hiện nay
• Phương pháp chuẩn độ:
Chỉ xác định được tổng hàm lượng axit béo tự do
• Phương pháp quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier:
- Rất khó áp dụng
- Kết quả không ổn định
• Phương pháp sắc ký, đặc biệt là phương pháp sắc ký khí có nhiều ưu điểm vượt trội:
- Độ chính xác. Độ nhạy cao (khoảng ppb). Độ ổn định lớn. Phân tích được tất cả các axit béo và các
nền mẫu thực phẩm
94
 Hiện nay, phương pháp sắc ký khí được ưu tiên lựa chọn hàng đầu đối với các nhà phân tích và
quản lý
2. Một số phương pháp xác định hàm lượng axit béo
 Khi phân tích axid béo bằng GC, hai loại detector được sử dụng nhiều nhất là:
- Detector ion hóa ngọn lửa (FID)
- Detector khối phổ (MS).
 Nguyên tắc hoạt động của FID: dưới tác dụng của ngọn lửa ở nhiệt độ cao (ngọn lửa H2 - không khí)
các hợp chất hữu cơ bị ion hóa, các ion và các electron di chuyển về điện cực tạo thành dòng điện,
dòng điện được khếch đại và hiện ghi dưới dạng pic.
 Ưu điểm : Có độ nhạy cao, Chọn lọc với hợp chất hữu cơ chứa cacbon, Khoảng tuyến tính lớn và Độ
ổn định cao, Khá phổ biến và chi phí không cao.
 GC/MS hoạt động theo nguyên tắc: các phân tử hữu cơ bị ion hóa và cắt mạch bởi các electron có năng
lượng lớn (70eV) trong môi trường chân không, dưới tác dụng của từ trường các ion có m/z khác nhau
sẽ bị tách ra và phát hiện.
 Ưu điểm: Độ nhạy cao, Ổn định, Phân tích được tất cả các chất dựa trên phổ khối.
 Từ sắc ký đồ của GC-MS, các hoạt chất sẽ được xác định dựa trên thời gian lưu, công thức phân tử,
trọng lượng phân tử và tỷ lệ phần trăm nồng độ trong các dịch chiết dung môi khác nhau.
3. Kết luận
Hiệu quả của GC/MS và GC/FID đã được rất nhiều tổ chức phân tích uy tín trên thế giới công nhận,
đồng thời kỹ thuật này đã được xây dựng thành phương pháp tiêu chuẩn AOAC 996.06 để áp dụng xác
định hàm lượng axit béo (tổng số, bão hòa, chưa bão hòa) do acid béo có tính axit và tính phân cực cao
của nhóm chức trong phân tử, nên cần phải chuyển đổi chúng thành metyl este của axit béo trước khi
phân tích để làm cho chúng tương thích với pha tĩnh của cột đang được sử dụng.
BÀI TẬP 11.1. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG L. ACIDOPHILUS TRONG MỘT CHẾ
PHẨM PROBIOTICS (NHÓM TỰ CHỌN CHẾ PHẨM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRÊN ĐĨA
THẠCH.( TRANG 191)
I. ĐẠI CƯƠNG PROBIOTIC.
Probiotics thường được định nghĩa là các chủng vi khuẩn sống khi được uống đủ lượng sẽ mang lại lợi
ích sức khỏe cho người dùng. Nói một cách dễ hiểu, men vi sinh là những vi khuẩn tốt, giúp hệ tiêu
hóa dễ tiêu thụ thức ăn, duy trì sức khỏe và chống lại bệnh tật.
 Lactobacillus acidophilus là một loại vi khuẩn được sử dụng để duy trì số lượng vi khuẩn lành mạnh
trong dạ dày và ruột của con người. Nó tạo ra axit lactic, sản xuất enzyme lactase, đóng vai trò quan
trọng đối với sức khỏe con người.
95
 Người ta thường dùng Lactobacillus acidophilus để thúc đẩy sự phát triển của các vi khuẩn có lợi,
cũng như để điều trị viêm âm đạo do vi khuẩn và rối loạn tiêu hóa.
II. Đề xuất quy trình định lượng L. acidophilus trong chế phẩm Bio- Lactobacillus bằng phương
pháp đếm trên đĩa thạch.
NGUYÊN TẮC
 Phương pháp đếm trên đĩa thạch có độ chính xác cao
 Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó trộn vào môi
trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở nhiệt độ, thời gian thích hợp.
 Đếm số khuẩn lạc và tính số lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu.
 Nhược điểm:
+ Tốn thời gian gian nuôi cấy
+ Khó khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật.
CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG THẠCH
 Thạch MRS/clindamyxin/xiprofloxaxin (thạch MRS/CL/CIP)
Thạch MRS/CL/CIP gồm có thạch MRS có bổ sung 0,1 mg clindamyxin và 10,0 mg xiprofloxaxin trên
một lít môi trường.
Môi trường cơ bản: Thạch MRS
 Hòa tan các thành phần trên trong nước. Đun huyền phù đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi thu
được dung dịch hòa tan hoàn toàn. Phân phối môi trường này với các lượng 100 ml ± 1 ml vào các lọ
150 ml hoặc các phần 200 ml ± 2 ml vào các lọ dung tích 250 ml.
 Chỉnh pH để sau khi khử trùng, pH là 6,2 ± 0,2. Khử trùng 15p bằng nồi hấp ở 121 0C. Nếu môi trường
này không được sử dụng ngay thì làm nguội trên nồi cách thủy đến nhiệt độ khoảng từ 44 - 47 0C.
Không để môi trường tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời.
 Môi trường thạch MRS đã chuẩn bị có thể bền đến 6 tháng khi được bảo quản nơi tối ở 1 - 50C.
DUNG DỊCH GỐC CLINDAMYXIN
Chuẩn bị
- Hòa tan clindamyxin hydro clorua trong nước. Lọc dung dịch rồi khử trùng qua màng lọc 0,22mm
cho vào ống nghiệm vô trùng.
- Nếu dung dịch chưa được sử dụng ngay, thì phân phối các lượng nhỏ vào các ống nghiệm lạnh vô
trùng và giữ các ống này ở nhiệt độ -200C. Dung dịch đông lạnh này có thể bảo quản được đến 6 tuần.
96
DUNG DỊCH GỐC XIPROFLOXAXIN
Chuẩn bị
 Hòa tan xiprofloxaxin hydro clorua trong nước và lọc để khử trùng qua màng lọc 0,22 mm cho vào ống
nghiệm vô trùng.
 Nếu dung dịch chưa được sử dụng ngay, thì giữ ở nhiệt độ - 20 0C. Dung dịch đông lạnh này có thể bảo
quản được 8 tuần.
MÔI TRƯỜNG HOÀN CHỈNH: CHUẨN BỊ ĐĨA THẠCH
Chuẩn bị
 Ngay trước khi sử dụng, làm tan chảy thạch MRS trên nồi cách thủy. Làm nguội trên nồi cách thủy đến
nhiệt độ từ 44 - 47 0C.
 Cho 0,05ml dung dịch gốc clindamyxin và 0,5 ml dung dịch gốc xiprofloxaxin vào 100 ml thạch MRS
hoặc cho 0,1ml dung dịch gốc clindamyxin và 1,0 ml dung dịch gốc xiprofloxaxin vào 200 ml thạch
MRS và trộn thật cẩn thận. Tránh tạo bọt khí.
 Rót từ 12 - 15 ml môi trường này vào các đĩa Petri. Để môi trường nguội và đông đặc lại bằng cách đặt
các đĩa Petri này có nắp đậy trên mặt phẳng nằm ngang, mát.
 Các đĩa MRS/CL/CIP đã chuẩn bị có thể bảo quản được 10 ngày, nơi tối ở nhiệt độ từ 4 - 70C.
 Trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218).
2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
 Dụng cụ thủy tinh, Tủ ấm, Tủ kị khí, Bộ trộn, Thiết bị đếm khuẩn lạc, Nồi hấp áp lực, Nồi cách thủy,
Máy đo pH, Bình cấy hoặc chai, Pipet, Đĩa Petri, Dao trộn, Bộ lọc, Ống nghiệm, Que dàn mẫu, Tủ sấy,
Ống đông lạnh
3. LẤY MẪU VÀ XỬ LÝ MẪU
* Chuẩn bị dung dịch thử:
- Cân và xác định khối lượng trung bình của 10 gói Bio- Lactobacillus sữa non
- Cân chính xác 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thể tích tính theo
mililit bằng 9 lần khối lượng thuốc bột đã cân và vài viên bi thuỷ tinh vô trùng.
- Lắc mạnh trong 15 phút để vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha
loãng ( ).
- Lấy 1,0 ml hỗn dịch trên cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9,0 ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng
máy lắc trộn Vortex, được hỗn dịch có độ pha loãng ( ).
- Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu được hỗn dịch có nồng độ vi sinh vật , ..
97
4. CẤY VÀ NUÔI ẤM:
1. Dùng pipet vô trùng chuyển sang bề mặt hai đĩa Petri chứa thạch MRS/CL/CIP mỗi đĩa 0,1 ml dung
dịch pha loãng thích hợp.
2. Dùng que dàn mẫu dàn mẫu đều khắp bề mặt môi trường. Sử dụng một que dàn mẫu cho mỗi độ pha
loãng.
3. Để cho môi trường hấp thụ mẫu rồi lật ngược đĩa để vào tủ kị khí ở 370C trong 72h ± 3h.
4. Dùng đĩa Petri chưa cấy môi trường để kiểm chứng độ vô trùng của môi trường.
5. ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT
Sau thời gian ủ qui định đếm các khuẩn lạc có các đặc điểm của vi sinh vật đặc trưng trên đĩa thạch có
từ 10 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc. Có thể sử dụng dụng cụ đếm thích hợp để đếm.
6. TÍNH KẾT QUẢ
Số lượng vi khuẩn trong một gói chế phẩm được tính theo công thức:
A= nTB x d x MTB
Trong đó: A: số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói).
nTB : Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU).
MTB : Khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm ( g/gói).
d: độ pha lãng của dung dịch thử.
ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Yêu cầu
> 90% so với lượng ghi trên nhãn
Kết luận
Chế phẩm đạt hay không đạt theo tiêu chuẩn.
VÍ DỤ
Số đếm khuẩn lạc cho kết quả như sau (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng):
N= CFU/g : Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU).
MTB = 3 g/gói : Khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm ( g/gói).
D= : độ pha lãng của dung dịch thử.
Số lượng vi khuẩn trong một gói chế phẩm được tính như sau:
A= x3x = 9x (CFU/gói)
Theo yêu cầu trên nhãn là (CFU/gói)

Kết luận : chế phẩm đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn.
98
BÀI TẬP 11.3: ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG L.BULGARICUS TRONG MỘT SỐ CHẾ
PHẨM PROBIOTICS (NHÓM TỰ CHỌN CHẾ PHẨM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA. (TRANG
191)
CỐM VI SINH BIO-ACIMIN GOLD
 Công dụng: Bổ sung vi khuẩn có lợi, phòng và hỗ trợ giảm rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn.
 Đối tượng sử dụng: Người lớn và trẻ em trên 1 tuổi
 Thương hiệu: Dược phẩm Meracine (Việt Nam)
 Dạng bào chế: Cốm pha uống
 Cách đóng gói: Hộp 30 gói x 4g
1. LACTOBACILLUS BULGARICUS
- Lactobacillus bulgaricus là một loại vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình, gram dương, hình que,
không sinh bào tử, thuộc họ Lactobacillaceae trong ngành Firmicutes.
- L. bulgaricus nổi tiếng với vai trò quan trọng trong sản xuất sữa chua và các sản phẩm lên men khác.
Nó cũng được biết đến với đặc tính sinh học, mang lại lợi ích sức khỏe cho con người như cải thiện sức
khỏe đường ruột, tăng cường chức năng miễn dịch, cải thiện quá trình tiêu hóa đường sữa, đặc tính kháng
khuẩn, tác dụng chống viêm,…
2. NGUYÊN TẮC
 Phương pháp đếm trên đĩa thạch có độ chính xác cao. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha
loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuối
cây ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số lượng vi sinh
vật có trong chế phẩm ban đầu.
 Nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó khăn trong việc lựa chọn môi trường
đặc hiệu do vi sinh vật cần định lượng trong hỗn hợp nhiều vi sinh vật khác nhau.
3. MÔI TRƯỜNG
- Môi trường cơ bản: thạch MRS agar, pH sau khi tiệt trùng: 5,7 ± 0,2
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG L. BULGARICUS TRONG CHẾ PHẨM (PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
TRÊN ĐĨA THẠCH )
Chuẩn bị dung dịch thử: Cân và xác định khối lượng trung bình của 10 gói chế phẩm. Cân chính xác
10,0 g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9 lần
khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bi thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 15 phút để vi sinh vật phân
tán đều trong dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10 -1. Lấy 1,0 ml hỗn dịch trên cho vào ống
nghiệm đã chứa sẵn 9,0 ml dung môi pha loãng lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex, được hỗn dịch có độ
pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu được hỗn dịch có nồng độ vi sinh vật 10-3 , 10-4
v.v...
 Cách thử: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác 1,0 ml hỗn dịch có độ pha
loãng cuối cùng. Cấy trộn với môi trường MRS agar (đã được tiệt trùng và để nguội xuống khoảng
45°C), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và ủ ở 37 ± 1°C trong 48 - 72 giờ. Sau
thời gian ủ, đểm số lượng vi sinh vật có trong các đĩa petri mà có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 –
300.
Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công thức:
A = nTB × d × MTB
Trong đó:
99
 A: số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU / gói)
 nTB : Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU)
 MTB : Khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g / gói)
 d : độ pha loãng của dung dịch thử
BÀI 12.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE TRONG CHẾ
PHẨM NATTOENZYM. (TRANG 203, 208)
 Tổng quan về enzym nattokinase
- Nattokinase (còn được gọi là subtilisin NAT) là một serine protease thuộc họ enzym subtilisin.
-Nattokinase gồm một chuỗi polypeptid sợi đơn có 275 – 380 acid amin và có trọng lượng phân tử 26 –
42kDa. Cấu trúc gồm 2 xoắn và 7 phiến. Trình tự bảo thủ trong trung tâm hoạt động của nattokinase bao
gồm các gốc acid amin aspartate (D32), histidine (H64), serine (S221) và asparagine (N155).
-Trình tự nattokinase có mức tương đồng lớn với các enzym của họ subtilisin và đặc biệt là ở mức DNA
nó có độ tương đồng 99,5% với subtilisin E.
-Nattokinase làm tan huyết khối bằng cách phân cắt các liên kết chéo của sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu
cầu vón kết lại với nhau hình thành huyết khối).
-Nattokinase rất hữu dụng trong việc tiêu hủy huyết khối nội sinh ở người vì hoạt tính cao được duy trì ở
nội mạc trong thời gian dài bằng liều uống. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng
làm tăng nguy cơ hình thành huyết khối. Nattokinase cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể bằng cách
chuyển plasminogen thành plasmin.
-Nattokinase làm giảm huyết áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE). ACE khiến
mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. Nattokinase có khả năng ức chế ACE, ngăn cản dây nội mạc
mạch.
-Ngoài ra, nattokinase còn trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ bù trừ trong tuần hoàn. Nó cũng được
chứng minh là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch.
-Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết khối thông thường khác nhau như
Urokinase,Streptokinase và tissue Plasminogen Activator. Nó là một hoạt chất thiên nhiên làm tan huyết
khối hữu hiệu, không gây dị ứng và có độ an toàn cao.
=>Huyết khối làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ
tim, đau thắt ngực và bệnh trĩ. Nattokinase hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích tuyệt vời cho những người bệnh
này.
Cơ chế tác dụng của nattokinase
-Nattokinase phá vỡ các cục máu đông, ức chế hình thành các cục máu đông mới thông qua 5 cơ chế.
+Trực tiếp hòa tan fibrin liên kết ngang
+Tăng sự giải phóng hoạt chất plasminogen mô (t-PA) từ các tế bào, cũng phá vỡ fibrin
+Tăng nồng độ urokinase bằng cách chuyển prourokinase bên trong thành urokinase. các enzyme này làm
càng tăng lượng plasmin trong máu, là nguyên nhân gây thoái hóa fibrin.
100
+Vô hiệu hóa chất ức chế hoạt hóa plasminogen-1 (PAI-1). PAI-1 ức chế sự hình thành plasmin, làm giảm
fibrin .
+Ức chế kết tập tiểu cầu bằng cách ngăn chặn thromboxane (một chất được giải phóng từ tiểu cầu gây co
thắt máu và co thắt mạch máu)
 Tổng quan về viên uống Nattoenzym
-Viên uống Nattoenzym với thành phần chính là natto chứa hàm lượng lớn nattokinase là enzym hoạt
huyết mạnh mang lại nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người.
-Thuốc được bào chế dưới dạng viên nang, đóng vỉ 10 viên hộp 3 vỉ, đóng chai thuỷ tinh lọ 90 viên.
Thành phần
-Hoạt chất chính: Nattokinase 670 FU.
-Tá dược: Microcrystalline cellulose M112, Magnesi stearat, Lactose, Tinh bột mì, PVP K30.
1. Phương pháp chiết tách, tinh sạch và kết tinh enzym nattokinase từ Nattoenzym
a) Chiết tách enzym nattokinase
-Loại bỏ nang cứng, thu lấy phần bột. Chiết xuất phân đoạn ethanol và kết tủa nattokinase: Thêm hai lần
thể tích ethanol 50% vào phần bột, lắc ở 200 vòng/phút và 37°C trong 1 giờ. Sau khi ly tâm ở 10000
vòng/phút trong 10 phút, phần nổi phía trên được thu thập và ethanol được thêm vào phần nổi phía trên để
đạt được nồng độ cuối cùng là 75% để kết tủa nattokinase.
b) Kết tinh enzym nattokinase
-Tiến hành kết tinh enzym nattokinase trong dung dịch (NH4)2SO4 . Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ
từ kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuấn nếu muốn nhận được các tinh thể tinh khiết hơn.
-Thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch enzym nattokinase đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục nhẹ dung
dịch.Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch.
-Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch
enzym nattokinase theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm chạp dung
dịch enzym nattokinase.Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH hoặc nhiệt độ.
2. Xác định hoạt độ enzym
Phương pháp: Quang phổ hấp thụ phân tử
a) Nguyên tắc của phương pháp
-Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin không hòa tan, Nattokinase
thúc đẩy quá trình giáng hóa fibrin tạo các sản phẩm giáng hóa của fibrin (FDP).
-Phân tích gián đoạn: cho Nattokinase tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian xác định thì làm
ngừng phản ứng enzyme bằng acid tricloacetic 0,2M và sau đó đo lượng cơ chất còn lại bằng phương pháp
đo độ hấp thụ của dd ở bước sóng 275nm.
b) Cách tiến hành
-Nattokinase được hòa tan và pha loãng với dung dịch pha loãng (2mM Calci sulfat dihydrate
(CaSO4.2H2O) + 10mM NaCl và 0,005%Triton X-100). Với cả mẫu trắng và mẫu thử, ủ 1,4mL đệm Natri
borat 50mM với 0,4mL dung dịch fibrinogen 0,72% trong 5 phút.Sau đó, thêm 0,1mL thrombin 20U/mL
vào hai ống và trộn đều.
101
-Sau 10 phút, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu thử và ủ với thời gian 60 phút và nhiệt độ 40°C.
Thêm 2,0mL acid tricloacetic 0,2M để dừng phản ứng, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu trắng
và ủ thêm 20 phút. Các mẫu được li tâm với tốc độ 6000rpm trong 5 phút và độ hấp thụ của dịch nổi trên
bề mặt được đo ở bước sóng 275nm so với nước cất.
-Hoạt tính tiêu sợi huyết của nattokinase được tính theo công thức sau:
Trong đó: AT : độ hấp thụ của dung dịch mẫu

AB : độ hấp thụ của dung dịch trắng
T : thời gian phản ứng (phút)
V : thể tích dịch chiết nattokinase (mL)
m : khối lượng mẫu thử (g)
D : hệ số pha loãng
-Một đơn vị (1FU) của hoạt độ nattokinase được định nghĩa là lượng enzym làm tăng độ hấp thụ của dịch
lọc ở bước sóng 275nm thêm mỗi 0,01 phút trong các điều kiện quy định.
-Đo lượng hoạt động được thực hiện trong ba lần lặp lại. Hoạt độ được đo lường được so sánh với hoạt độ
được gắn nhãn để ước lượng chất lượng của sản phẩm.
BÀI TẬP 12.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM AMYLASE TRONG MỘT
CHẾ PHẨM MEN TIÊU HÓA CÓ AMYLASE (NHÓM TỰ CHỌN CHẾ PHẨM). (TRANG 203, 209)
Men vi sinh Úc Life Space Probiotic Digestive Enzymes
Công dụng: Giúp tiêu hóa carbohydrate, đường sữa và chất béo. Hỗ trợ tiêu hóa thức ăn thực vật có chứa
cellulose. Hỗ trợ hấp thụ chất dinh dưỡng từ thực phẩm.
Thành phần:
 Amylase = 15000 DUAA, Lactase (tilactase) = 2500 ALU, Cellulase = 2004CU, Lipase = 1504 LipU,
Gentian (Gentiana lutea) chiết xuất khô 20 đẳng. để rễ khô = 100mg, Glutamine = 50mg, Lecithin =
25mg…
Amylase là enzyme chịu trách nhiệm phân hủy đường. Nhờ vai trò là chất xúc tác, chuyển hóa các loại đường
chậm này thành các phần nhỏ để cơ thể dễ dàng tiêu hóa và đào thải ra ngoài. Ngoài ra, enzyme amylase đảm
bảo quá trình dị hóa carbohydrate như tinh bột, dextrin và glycogen. Amylase được sản xuất chủ yếu bởi tuyến
tụy và các tuyến nước bọt, cùng với một phần ở gan, niêm mạc ruột non, buồng trứng và vòi trứng.
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất: Máy lắc. Máy đo quang phổ, cuvette dày 1cm. Bể điều khiển. Bình định
mức 50ml, 100ml, 250ml. Ống nghiệm. Pipette 5ml, 1ml. Đồng hồ bấm giây. Giấy thấm. Giá để ống
nghiệm. Bình tia đựng cồn. Cồn 960. Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6. Dung dịch HCl 1N. Dung
dịch NaCl 3%. Thuốc thử Lugol. Mẫu thử
1. Chiết tách, tinh sạch và kết tinh enzym amylase
102
- Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g mẫu thử vào cối với 30ml nước cất,
giã nát dưới nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 96 0.
Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase tủa dưới dạng nùi lớn.
- Để lắng, ly tâm lấy tủa. Hòa tan tủa trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase khá tinh sạch. Đặc
biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc thử Fehling, đun cách thủy 3
phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện).
2. Xác định hoạt độ enzym
Phương pháp xác định hoạt độ enzym amylase (Theo phương pháp smith & roe)
- Phương pháp hóa học là phương pháp phổ biến dùng để xác định hoạt độ enzym amylase
- Hoạt tính α - amylase biểu thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến
dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym trong 1g mẫu. Khi phản ứng
thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod
và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước sóng 620 nm.
- Đơn vị amylase (theo Smith và Roe) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột
sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm.
- Nguyên tắc chung dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme trong dd enzyme nghiên cứu thành
các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm
thủy phân của nó với iod bằng máy so màu sẽ tính được hoạt độ của enzyme.
Tiến hành
- Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không để lấy trung bình.
- Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:
- Lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm rồi mang đi so màu ở bước sóng 620nm
- Kết quả:
+ Hoạt độ enzyme=
103
(OD0  ODt ) * C * L
(UI )
OD0 * t
Với:
OD0: mật độ quang của ống thử không
ODt : mật độ quang của ống thử thật
C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg)
T: thời gian phản ứng (phút)
L: hệ số pha loãng mẫu enzym.
A. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG B. LONGUM TRONG CHẾ PHẨM

Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên
quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định lượng B. longum trong hỗn hợp
Chuẩn bị hỗn dịch thử: Cần và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm. Cân chính xác
khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9
lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bị thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân
tán đều trong dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10 -1. Lấy 1000ul hỗn dịch trên cho vào ống
nghiệm đã chứa sẵn 9.0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex được hỗn dịch có độ pha
loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu được hỗn dịch có cỏ độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7.
Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác 1000ul hỗn dịch có độ pha
loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha loãng 10 -6 và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM
đặc (đã được tiệt trùng và để nguội xuống khoảng 45°C), để môi trường trong đĩa đồng tự nhiên. Lật ngược
đĩa petri và ù ở 37 ± 1°C trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc
trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250).
Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công thức:
A = nTB x d x MTB
104
Trong đó:
A: số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói)
nTB: số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU)
Mтв: khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói)
d: hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.
B. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A
1. Nguyên tắc chung
Kit API 20A là một hệ thống đã được tiêu chuẩn hóa của hãng BioMérieux (Pháp). Kit API 20A được
dùng cùng với môi trường API 20A để định danh vi sinh vật kị khí, trong đó có chỉ Bifidobacterium.
Kit API 20A gồm 20 giếng chứa các chất nền khác nhau. Vi sinh vật cần xác định sẽ được cấy vào
môi trường API 20A và nhỏ môi trường đã có vi sinh vật vào từng giếng, lúc này các chất nền trong giếng sẽ
được hoà tan vào trong môi trường. Trong quá trình nuôi cấy sản phẩm chuyển hóa nếu có sẽ tự làm thay đổi
màu mỗi trường hoặc thay đổi màu sau khi thêm thuốc thử.
2. Tiến hành
Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượng (A), lựa chọn một khuẩn lạc đặc trưng,
tách biệt và cây chuyển sang 5,0ml môi trường MRS lỏng, có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớp bề mặt
và ủ trong điều kiện kị khí ở 37 + 1°C trong 24 giờ.
a. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật
kính dầu có độ phóng đại 1000 lần. Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì kết luận vi sinh
vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.
b. Định danh vi sinh vật bằng kit API 20A:
Sau khi xác định vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử thì tiếp tục cấy một quai cấy
canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trường thạch máu, ủ trong điều kiện kị khí ở 37±1°C trong 18-24
giờ. Gặt vi sinh vật trên bề mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nước cất vô trùng thu
được hỗn dịch gốc.
Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml nước cất vô trùng đến
khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào
ống nghiệm trên.
Cho vào 4ml môi trường API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc
đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trường API 20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3
(so sánh độ đục bằng mắt thường).
Nhỏ môi trường API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt đầu từ giếng số 0 đến
giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ nhỏ phần tube. Riêng đối với giếng IND nhỏ dung dịch
105
dầu khoáng vô trùng lên trên bề mặt giếng để tạo điều kiện kị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối với giếng
GEL nhỏ cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2°C trong điều kiện kị khí trong vòng 24±2h.
Cách đọc kết quả: Sau 24h nuôi cấy, quan sát và đọc kết quả
 Đối với giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớp dầu khoáng phía trên, trộn đều và để 2-3 phút.
Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc kết quả trong vòng 5 phút. Kết quả là dương tính nếu xuất
hiện màu đỏ.
 Đối với các giếng có chứa các đường khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một giọt thuốc thử BCP. Kết
quả được ghi là dương tính nếu xuất hiện màu vàng hoặc vàng -xanh.
 Phản ứng CAT: Để kit tiếp xúc với không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm 2 giọt thuốc thử H 2O2, 3%
vào một giếng dương tính bất kỳ. Kết quả được ghi là dương tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.
106

đề cương kiểm nghiệm

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

đề cương kiểm nghiệm

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

đề cương kiểm nghiệm

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

MỤC LỤC

BÀI 1: ĐẠI CƯƠNG TPCN

BÀI 2: QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG TPCN

BÀI 3: LẤY MẪU VÀ XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH

BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VẬT LÝ VÀ HÓA LÝ

BÀI 6: XÁC ĐỊNH CÁC CARBOHYDRATE

BÀI 7: XÁC ĐỊNH FLAVONOID

BÀI 10: XÁC ĐỊNH ACID BÉO

Thực phẩm chức năng Thuốc

Lượng dùng Tự nguyện Theo chỉ định

Đăng ký tiêu YT-CNTC, XNTC, ATTP-XNCB, VD- , VN- , V- ,VS-....

Chỉ định Cả người khỏe và người ốm Khi ốm

Thực phẩm chức năng Thuốc

Số đăng ký sản Số đăng ký TPCN: Số Đăng ký sản phẩm Thuốc

VÍ DỤ: SO SÁNH 2 SẢN PHẨM: HERBALIFE EXTRA CAL VÀ BIOCALCIUM

 Dạng bào chế: viên nang cứng

1. YÊU CẦU KỸ THUẬT

TÊN CƠ QUAN CHỦ QUẢN TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TC

1.1. Công thức bào chế cho 1 đơn vị chế phẩm:

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Mức tối đa

4 Tổng số BTNM-NM CFU/g 102

5 Tổng số VK hiếu khí CFU/g 104

7 Bacillus cereus CFU/g 10

8 Salmonella spp. CFU/25g 0

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị Mức tối đa

1 Chì (Pb) ppm 3

2 Cadimi (Cd) ppm 1

2. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

Nhỏ hơn 300mg 10

Bằng hoặc lớn hơn 300mg 7.5

2.3. Định tính, định lượng

1.Yêu cầu kỹ thuật

1.2. Yêu cầu chất lượng:

1.2.2. Độ đồng đều khối lượng

1.2.6. Định tính

1. Nhóm các chỉ tiêu vật lý- cảm quan

2.2.2. Nguyên tố vi lượng

3. Nhóm chỉ tiêu an toàn

3.2. Chỉ tiêu vi sinh vật

Yêu cầu kỹ thuật:

2.1. Các chỉ tiêu cảm quan:

TT Chỉ tiêu Yêu cầu

2 Màu sắc Từ màu trắng sữa đến màu kem nhạt

3 Mùi Mùi thơm vani đặc trưng, không có mùi lạ

2.2. Các chỉ tiêu hóa lý

Độ ẩm % < 5% TCVN 7729:2007 (ISO 5537:2004) Sữa bột – Xác định

Hàm lượng protein sữa % TCVN 7774:2007(ISO 5542:1984), TCVN 8099-1:2009

2.3. Các chỉ tiêu vi sinh vật

1 Coliforms CFU/g 10 TCVN

3 Clostridium perfringens CFU/g 5 TCVN

4 Tổng số BTNM-NM CFU/g 102 TCVN

5 Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g 104 TCVN

6 S. aureus CFU/g 0 TCVN

7 Bacillus cereus CFU/g 10 TCVN

8 Salmonella spp. CFU/25g 0 TCVN

1.4. Hàm lượng kim loại nặng

Arsen (As) 0.3 TCVN 7601:2007

Chì (Pb) 3 TCVN 7933:2008 (ISO 6733:2006), TCVN 7929:2008 (EN

3 Thủy ngân (Hg) ppm 0.1 TCVN 7993:2008 (EN 13806:2002)