Professional Documents
Culture Documents
borzsei-rita-phd-2012
borzsei-rita-phd-2012
borzsei-rita-phd-2012
2012.
1
TARTALOMJEGYZÉK
TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................................... 2
I. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI ...................... 6
I. 1. A KAPSZAICIN TÖRTÉNETE ÉS FARMAKOLÓGIAI JELENTŐSÉGE ............................................. 6
I. 2. A KAPSZAICIN RECEPTORA .................................................................................................................. 7
I.3. A LIPID RAFTOK FELÉPÍTÉSE ............................................................................................................ 11
I.3.1. A koleszterin szerepe a lipid raftokban .............................................................................................. 13
I.3.2. A lipid raftok funkciója ...................................................................................................................... 13
I. 4. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK ÉS HÁRMAS FUNKCIÓJUK ............... 14
I. 5. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ROSTOKBÓL FELSZABADULÓ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK16
I.5.1. Fájdalom- és gyulladáskeltő hatású neuropeptidek .......................................................................... 16
I.5.2. Fájdalomcsillapító és gyulladásgátló hatású neuropeptidek ............................................................ 17
I. 6. RADIOIMMUNASSAY MÓDSZEREK JELENTŐSÉGE ...................................................................... 22
I.7. TÖMEGSPEKTROMETRIA .................................................................................................................... 24
I.8. VIZSGÁLATAINK INDOKOLTSÁGA ..................................................................................................... 25
II. CÉLKITŰZÉSEK................................................................................................................... 28
III. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ............................................ 29
III. 1. ÁLLATOK .............................................................................................................................................. 29
III.2. IN VITRO KÍSÉRLETI MODELL: SZENZOROS NEUROPEPTID-FELSZABADULÁS KIVÁLTÁSA
ÉS BEFOLYÁSOLÁSÁNAK VIZSGÁLATA IZOLÁLT PATKÁNYTRACHEA ÉRZŐIDEG-
VÉGZŐDÉSEIBŐL ......................................................................................................................................... 29
III.3. ANALITIKAI VIZSGÁLATOK .............................................................................................................. 31
III.3.1. Biológiai minták előkészítése .......................................................................................................... 31
III.3.1.1. Szenzoros neuropeptidek meghatározása perfúziós kísérlet mintáiból:............................................................ 31
III.3.1.2. Humán minták (plazma, anyatej) előkészítése RIA mérésekhez ........................................................................ 31
III.3.1.3. Humán minták (plazma, anyatej) előkészítése tömegspektrometriás mérésekhez ........................................... 32
III.3.1.4. Kérődző állatfajok mintáinak (plazma, tej, emlőbiopszia) előkészítése RIA mérésekhez................................... 32
III.3.2. SOM, CGRP, SP és PACAP RIA leírása ....................................................................................... 33
III.3.2.1. SOM RIA ............................................................................................................................................................. 33
III.3.2.2. CGRP RIA ............................................................................................................................................................ 34
III.3.2.3. SP RIA: ................................................................................................................................................................ 34
III.3.2.4. PACAP-38 RIA ..................................................................................................................................................... 35
III.3.2.5. A radioimmunassay eljárások menete ............................................................................................................... 35
III.3.3. MALDI-TOF/TOF analízis ............................................................................................................ 36
III.3.4. PAC1 receptor immunhisztokémia ................................................................................................. 37
III. 4. IN VIVO KÍSÉRLETEK ........................................................................................................................ 38
III.4.1. Mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata patkány lábháti bőrében ................. 38
III.4.2. Mustárolajjal kiváltott neurogén ödéma vizsgálata egérfülön ...................................................... 39
III.4.3. Mustárolajjal kiváltott nem neurogén gyulladás vizsgálata egér fülön ........................................ 40
III.5. STATISZTIKA: ...................................................................................................................................... 41
IV. EREDMÉNYEK .................................................................................................................... 42
IV.1. LIPID RAFTOK: AZ MCD KEZELÉS HATÁSA A SZENZOROS NEUROPEPTID
FELSZABADULÁSRA IZOLÁLT PATKÁNY TRACHEÁN ......................................................................... 42
IV.2. AZ ENDOMORFIN-1 HATÁSA SZENZOROS NEUROPEPTIDEK FELSZABADULÁSÁRA IN VITRO
ÉS AKUT GYULLADÁSOS FOLYAMATOKRA IN VIVO ............................................................................ 45
IV.2.1. Az EM-1 hatása az elektromos téringerléssel kiváltott SP és CGRP felszabadulásra................... 45
IV.2.2. Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladásra patkányban ...................... 47
IV.2.3. Az EM-1 hatása a mustárolajjal kiváltott akut neurogén fülduzzadásra egérben ........................ 48
IV.2.4. Az EM-1 hatástalansága a mustárolajjal kiváltott késői gyulladásos reakciókra ......................... 49
IV.3. A PACAP6-38 AGONISTA HATÁSAI AZ ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEKEN....................................... 52
2
IV.3.1. A PACAP1-38 és PACAP6-38 hatásai az elektromos téringerléssel és kapszaicin ingerléssel kiváltott
szenzoros neuropeptidek felszabadulására izolált patkány tracheán......................................................... 52
IV.4. A PACAP-38 KIMUTATÁSA KÜLÖNBÖZŐ FAJOK PLAZMÁJÁBAN ÉS ANYATEJÉBEN .......... 55
IV.4.1. PACAP-38 kimutatása humán mintákban ..................................................................................... 55
IV.4.1.1. A PACAP-38 kimutatása anyatejben és emberi plazmában tömegspektrometriás módszerrel ......................... 55
IV.4.1.2. PACAP-38-LI kimutatása anyatejből és emberi plazmából RIA módszerrel ....................................................... 56
IV.4.2. PACAP-38 kimutatása kérődző állatfajokban ................................................................................ 59
IV.4.2.1. PACAP-38 kimutatása RIA módszerrel kérődző állatok plazmájában és tejében ............................................... 59
IV.4.2.2. PACAP-38-LI meghatározása homgenizált juh tőgy biopsziából ........................................................................ 61
IV.4.2.3. PAC1 receptor immunlokalizációja juh emlőmirigyben ..................................................................................... 62
3
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
12-HPETE: 12-hidroperoxi-eikozatetraénsav
Ab: antitest (Antibody)
ACTH: adrenocorticotrop hormon
AEA: N-arachidonoil-etanolamin (anandamid)
AMPA: 2-amino-3-metil-(3-hidroxi-5-metil-izoxazol-4-il)-propionsav
ATP: adenozin-trifoszfát
BSA: borjú szérum albumin (Bovine Serum Albumin)
cAMP: ciklikus adenozin-monofoszfát
CB: kannabinoid
CGRP: kalcitonin gén-rokon peptid (Calcitonin Gene-Related Peptide)
CID: ütközés indukálta fragmentálás (Collision Induced Decay)
CRLR: kalcitonin receptorszerű receptor (Calcitonin Receptor-Like Receptor)
Da: Dalton
DIG: detergens oldhatatlan glikolipid gazdag komplex
EDTA: etilén-diamin-tetraacetát
EFS: elektromos téringerlés (Electrical Field Stimulation)
EGF: epidermális növekedési faktor (Epidermal Growht Factor)
EM: endomorfin
GABA: -amino-vajsav (Gamma-Aminobutyric-Acid)
GH: növekedési hormon (Growth Hormone)
GHRH: növekedési hormon elválasztását serkentő hormon (Growth Hormone Releasing
Hormone)
GnRH: gonadotropin elválasztást serkentő hormon (Gonadotropin Releasing Hormone)
GPI: glikozil-foszfatidil-inozitol (Glykosyl-Phosphatidylinositol)
HPLC: nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia (High Performance Liquid Chromatography)
i.m.: intramuszkuláris
i.p.: intraperitoneális
i.v.: intravénás
IFN-: interferon
Ig: immunglobulin
IGF: inzulinszerű növekedési faktor (Insulin-like Growth Factor)
IL: interleukin
m: tömeg
MALDI: mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizáció (Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization)
MCD: metil--ciklodextrin
MPO: mieloperoxidáz
MS: tömegspektrometria (Mass Spektrometry)
NADA: N-arachidonoil-dopamin
NAL: naloxon
NANC: nem-adrenerg, nem-kolinerg
NK: neurokinin
NK-sejt: természetes ölősejt (Natural Killer Cell)
NMLW: névleges molekulatömeg határérték (Nominal Molecular Weight Limit)
OD: optikai denzitás
PAC1: a PACAP specifikus receptora
PACAP: hipofízis adenilát cikláz-aktiváló polipeptid (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating
Polypeptide)
4
PACAP-LI: PACAP-szerű immunreaktivitás (PACAP-Like-Immunoreaktivity)
PBS: foszfát-pufferelt sóoldat (Phosphate-Buffered Saline)
PFA: paraformaldehid
PK: protein kináz
PMF: „ujjlenyomat” keresési technika (Peptide Mass Fingerprintig)
PSD: ionforrás utáni fragmentálás (Post Source Decay)
PTH: parathormon
RAMP: receptor aktiválást módosító fehérje (Receptor Activation Modifier Protein)
RIA: radioimmunassay
RTX: reziniferatoxin
s.c.: szubkután alkalmazás
SEM: átlag standard hibája (Standard Error of Mean)
SOM: szomatosztatin
SP: P-anyag (Substance P)
SRIF: szomatotropin felszabadulást gátló faktor (Somatotropine Release Inhibitory Factor)
sst: szomatosztatin receptor
TFA: trifluor-ecetsav (Trifluoroacetic Acid)
TOF: time of flight
TRH: thyreotrop hormon (Thyrotropin-Releasing Hormone)
TRP: tranziens receptor potenciál
TRPV1: tranziens receptor potenciál vanilloid 1
TSH: pajzsmirigy stimuláló hormon (Thyroid-Stimulating Hormone)
VIP: vazoaktív intesztinális peptid (Vasoactive Intestinal Peptide)
VPAC1 és VPAC2: a VIP és PACAP közös receptorai
VR1: vanilloid receptor 1
z: töltés
5
I. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS, A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI
6
tisztázatlanok maradtak. Ezekből az adatokból kiindulva a későbbiekben elektrofiziológiai
vizsgálatokkal világossá vált, hogy a fájdalomérző idegvégződések forró ingerekkel izgatható
csoportja az, amely a kapszaicinnel szelektíven aktiválható, illetve nagy dózisok ismételt adása
után ezek működése szelektíven károsítható (Jancsó 1960).
Jancsó Professzor 1966-ban bekövetkezett korai halála után tanítványa, Szolcsányi János
folytatta a kapszaicinnel kapcsolatos kutatásokat a professzor feleségével, Jancsó-Gábor
Arankával együttműködve. 1967-ben leírták, hogy patkány n. saphenusának és n. trigeminusának
izgatása arteriolás vazodilatációt, vaszkuláris permeabilitás-növekedést és plazmaproteinek
extravazációját eredményezi a bőrben a megfelelő beidegzési területeken. Nagy dózisú
kapszaicinnel történő előkezelést (deszenzibilizáció) követően ezen idegek sem ortodrómos
kémiai, sem antidrómos elektromos ingerlése után nem alakult ki gyulladásos reakció. E válaszok
hiányának alapján feltételezték, hogy a gyulladáskeltő mediátorok a kapszaicin-érzékeny
fájdalomérző idegvégződésekből, a nociceptorokból szabadulnak fel (Jancsó és mtsai. 1967).
A kapszaicin, mint potenciális farmakológiai eszköz a perifériás idegrendszer kutatásában,
elsősorban akkor került az érdeklődés középpontjába, amikor Jessell és munkatársai 1978-ban
publikálták, hogy a kapszaicin P-anyag (substance P: SP) kiáramlását okozza a primér szenzoros
idegvégződésekből anélkül, hogy befolyásolná e peptid felszabadulását az enterális és központi
idegrendszeri neuronokból (Jessell és mtsai. 1978). Egy évvel később Lembeck és Holzer
kimutatták, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződésekből felszabaduló SP közvetíti a neurogén
plazmaprotein-extravazációt (Lembeck és Holzer 1979).
Napjainkban világszerte számos kutatócsoport foglalkozik a kapszaicinnel, a kapszaicin-
érzékeny elsődleges érzőneuronokkal és a velük kapcsolatba hozható neuropeptidekkel.
I. 2. A KAPSZAICIN RECEPTORA
Azt az elméletet, hogy létezik „kapszaicin receptor”, azaz hogy ez a csípős anyag egy
speciális molekulához kötötten fejti ki szelektív hatásait a szenzoros neuronokon, először
Szolcsányi János és Jancsó-Gábor Aranka vetették fel egy 1975-ös közleményükben. Ebben a
munkában a kapszaicin és más vanilloid struktúrájú vegyület nociceptív hatásait vizsgálták
patkányban, és a szerkezet-hatás összefüggések alapján arra a következtetésre jutottak, hogy a
kapszaicin receptoriális úton hat (Szolcsányi és Jancsó-Gábor 1975, 1976). Később patch clamp
vizsgálatokkal sikerült bizonyítani, hogy a kapszaicin és egy másik vanilloid struktúrájú növényi
eredetű vegyület, a reziniferatoxin (RTX), ugyanazt a kation csatornát nyitja az érzőneuronok
7
plazmamembránján (Bevan és Szolcsányi 1990). A kapszaicin receptort expresszáló gén
azonosítása és a receptor szerkezetének megismerése 1997-ben Julius és munkacsoportja nevéhez
fűződik, akik klónozták a patkány Vanilloid 1 Receptort (VR1). Ezt az első elnevezést az
indokolta, hogy nemcsak kapszaicinnel, hanem más vanilloidokkal is aktiválható volt (Caterina
és mtsai. 1997). Később a receptorok szerkezetén alapuló nemzetközi nomenklatúra szerint ezt a
nevet megváltoztatták, e ligand-függő kation csatornát a Tranziens Receptor Potenciál (TRP)
nagycsaládba sorolták és a vanilloid család 1-es számú tagjaként Tranziens Receptor Potenciál
Vanilloid 1-nek (TRPV1) nevezték (Gunthorpe és mtsai. 2002). A később klónozott emberi
TRPV1 receptor 92%-os hasonlóságot mutat a patkány receptor szerkezetével (Hayes és mtsai.
2000; McIntyre és mtsai. 2001) (1. ábra).
A TRPV1 polimodális szenzor funkciójú ioncsatorna, többféle módon, fizikai vagy
kémiai ingerekkel aktiválható intra- és extracellulárisan is. A TRPV1 fájdalmas, 43ºC feletti
hőingerrel (Tominaga és mtsai. 1998) és pH 6 alatti proton-koncentrációval aktiválható (Nilius
2007). A kapszaicinen kívül számos növényi eredetű vanilloid struktúrájú vegyület, pl. egy
marokkói kutyatejfélében (Euphorbia resinifera) található reziniferatoxin (2. ábra), a
feketeborsban (Piper nigrum) lévő piperin, a gyömbérből (Zingiber officinale) kivonható
zingeron vagy a szegfűszeg (Syzygium aromaticum) egyik anyaga, az eugenol, is képes receptor
stimulációt okozni. Érdekes módon a kapszaicin, lipofil jellegéből adódóan átjut a
sejtmembránon, az intracellulár régióban kötődik a receptorhoz és így nyitja meg a csatornát (Oh
és mtsai. 1996).
Ezen kívül léteznek a receptornak endogén ligandjai is, mint az endokannabinoid N-
arachidonoil-etanol-amin (AEA) vagy más néven anandamid (Caterina és mtsai. 1997), a 12-
hidroperoxi-eikozatetraénsav (12-HPETE), az N-arachidonoil-dopamin (NADA), valamint a
protonok. A csatorna működését jelentős mértékben fokozzák a prosztaglandinok, pl. a
gyulladásos folyamatokban kulcsfontosságú prosztaglandin E2, vagy a prosztaciklin néven ismert
prosztaglandin I2 (Szállási és Blumberg 1999; Chuang és mtsai. 2001).
8
1. ábra: A TRPV1 receptor szerkezete
A receptor aktiválására képes ingerek a fehérje eltérő pontjain hoznak létre
konformáció változást, amely a kation csatorna megnyílásához vezet. A szürke
pontokkal jelölt helyek a protein kinázok támadáspontjai, amelyek foszforilációja
a receptor érzékenységének fokozódásához vezet.
9
A receptor aktiválódásakor a sejtbe Na+- és Ca2+a-ionok áramlanak, melyet K+fion sejtből
való kiáramlása követ. A Na+-ion beáramlás elsősorban az akciós potenciál kialakulásáért felelős,
melynek következményeképpen kialakul a nocicepció, fájdalomérzet. A Ca2+-ionok beáramlása
pedig a szenzoros neuropeptidek idegvégződésekből való felszabadulásához vezet. Tartós vagy
ismételt aktiváció hatására a sejtben felhalmozódó magas kation koncentráció a citoplazma és a
mitokondriumok duzzadását okozza, ennek hosszú távú következményeként a sejtek
energiaforgalma csökken, az idegvégződés működésképtelenné válik. Ez a folyamat adja a
molekuláris hátterét a nagy dózisú kapszaicinnel történő előkezelés hatására kialakuló
deszenzitizációnak (3. ábra), melynek következtében az érzőideg-végződések kémiai ingerekkel
szemben érzéketlenekké válnak anélkül, hogy fizikai ingerekkel szemben változna
válaszkészségük (Bevan és Szolcsányi 1990; Szolcsányi 1993; Helyes és mtsai. 2003).
10
dózisú kapszaicin- vagy RTX-előkezeléssel kiváltott szenzoros neuron blokkolás, azaz
„deszenzibilizáció”, az egész végződés hosszantartó válaszképtelenségéhez vezet. A nociceptor
semmilyen kémiai stimulusra nem reagál, a többi afferens rost működése azonban nem változik,
az egyéb érzőfunkciók nem károsodnak (Szolcsányi 1977). A kapszaicin-érzékeny
idegvégződések fiziológiai/patofiziológiai folyamatokban betöltött szerepének vizsgálatára tehát
a „deszenzibilizáció” alkalmas, ezzel a módszerrel azonban a teljes idegvégződést inaktiváljuk
(Bevan és Szolcsányi 1990; Szolcsányi 1993; Helyes és mtsai. 2003), nemcsak izoláltan a
TRPV1 csatorna funkcióját.
Extracelluláris tér
Glikoszfingolipid
Koleszterin
Intracelluláris tér
11
Sejttípusonként különböző arányban fordulnak elő a raft komponensek, ám mindegyikre
egyaránt jellemző, hogy koleszterinben és szfingolipidekben gazdag. A lipid kettősréteg a lipid
raftokon belül aszimmetrikus. Az extracelluláris tér felé szfingomielinben és glikoszfingolipidben
gazdag, míg az intracelluláris tér felé glicerolipidek fordulnak elő nagyobb számban. A
koleszterin mind az intra-, mind az extracelluláris tér irányából beépül a membránba, az
egymáshoz kapcsolódó szfingolipidek farki régiója közti hiányokat tölti ki, és interakcióba lép
velük (Simons és Ikohen 1997; Kobayaski és mtsai. 2006).
A fehérjék többféle módon kapcsolódhatnak a lipid raft komponensekhez: lehetnek
transzmembrán proteinek, glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI)-kapcsolt proteinek, vagy
intracelluláris polipeptidláncok, mint például a tirozin-kinázok. Ezen proteinek közül számos
receptorként, vagy intracelluláris szignál mediátorként funkcionál. (Simons és Ikohen 1997;
Mishra és Joshi 2007). A lipid raftok a transzmembrán proteinek révén kapcsolatot létesítenek a
citoszkeletonnal.
Vizsgálatok során megfigyelték, hogy a lipid raftok 4 oC-on, Triton X-100 detergenssel
szemben oldhatatlanok, emiatt és a magas glikolipid tartalmuk miatt nevezték el a lipid raftokat
detergens oldhatatlan glikolipid gazdag komplexeknek (DIGs) (Simons és Ikohen 1997; Mishra
és Joshi 2007). Az oldhatatlanságért a koleszterin a felelős, melynek eltávolításával, a lipid raftok
kioldhatók a plazma membrán non-raft régiói közül Triton X-100 detergenssel. Ezzel a lipid
raftokban lévő fehérjék és lipidek különböző protein és lipid próbákkal azonosíthatók. Több
sejttípus esetén megfigyelték, hogy a lipid raftokban egy biokémiailag elkülöníthető hajtű-hurok
vagy palack alakú régió is megtalálható, amit caveolának neveztek el. Ezek a struktúrák szintén
gazdagok koleszterinben és szfingolipidekben, de emellett számos caveolin proteint is
tartalmaznak, amik egymással összekapcsoltan találhatók a plazma membránban. Ahogy a lipid
raftok, a caveolák sem oldhatók detergensekkel. Különböző élettani folyamatokban a caveolák és
a lipid raftok összekapcsolódnak és együttesen generálnak intracelluláris jelátviteli utakat.
(Simons és Ikohen 1997; Burger és mtsai. 2000; Tsui-Pierchalla és mtsai. 2002; Hanzal-Bayer és
Hancock 2007). A caveolák fontos szerepet játszanak az endocitózisban, a transzcitózisban és
feltételezik, hogy részt vesznek az onkogenezisben illetve a patogén baktériumok és bizonyos
vírusok felvételében. Több patogénről bebizonyosodott, például a Coxachie vírus A9-ről, illetve a
Plasmodium falciparumról (Samuel és mtsai. 2001), hogy az intracelluláris térbe való jutásukhoz
lipid raftokat, vagy caveolákat igényelnek.
Több tanulmány is rámutatott, hogy a TRP receptorcsalád számos tagjának működésében
szerepet kapnak a lipid raftok, melyekkel úgynevezett jelátviteli komplexet képeznek (Lockwich
és mtsai. 2000; Liu és mtsai. 2006). Részt vesznek még több ligandfüggő ioncsatorna, köztük az
12
acetilkolin nikotin receptor (Zhu és mtsai. 2006), a 2-amino-3-metil-(3-hidroxi-5-metil-izoxazol-
4-il)-propionsav (AMPA) típusú glutamát receptor és a -amino-vajsav (GABA) receptor
működésében is. Emellett több G-proteinhez kapcsolt receptorról, mint például a kannabinoid 1
receptorról (CB1R), is bebizonyosodott a lipid raftokkal való szoros kapcsolata (Bari és mtsai.
2005).
13
Kísérletsorozatok során kiderült, hogy a raftok károsítása az apoptotikus hatást csökkenti (Bari és
mtsai. 2005).
A raftokban elhelyezkedő proteinek közül több receptorként funkcionál. E molekulák
megfelelő működéséhez és így a receptoriális hatásokhoz a lipid raftok megfelelő integritása
szükséges. Számunkra a lipid raftok vizsgálatának legfontosabb aspektusa a TRPV1 receptorral
való kapcsolatának és ezen keresztül a gyulladásos útvonalra kifejtett hatásának felderítése volt.
14
szembetegségek patomechanizmusában (Maggi 1995; Szolcsányi 1996). Jelenleg egyetlen olyan
gyógyszercsoport sem áll rendelkezésre, amely hatékonyan gátolná e betegségek neurogén
gyulladásos komponensét (Helyes és mtsai. 2003).
Ugyanezen aktivált szenzoros idegvégződésekből a gyulladáskeltő neuropeptideken kívül
szomatosztatin (SOM) is felszabadul, amely a keringésbe jutva szisztémás gyulladásgátló és
fájdalomcsillapító hatásokkal rendelkezik. Ez az érzőideg-végződések harmadik, szisztémás
efferens funkciója (Szolcsányi és mtsai 1998a,b; Helyes és mtsai. 2000, 2004), amit a
szomatosztatin endokrin és parakrin hatásainak mintájára Szolcsányi professzor szenzokrin
hatásnak nevezett el (Szolcsányi és mtsai. 2004) (5. ábra).
Neurogén gyulladás
Vazodilatáció
2. Lokális efferens
funkció
Plazma
1. Afferens fehérje
funkció CGRP kiáramlás
Neurokinin A
Kapszaicin - P-anyag Gyulladásos
érzékeny
érző
érző- sejtek
idegvégződ
idegvégződésés akkumulációja
SZOMATOSZTATIN
15
I. 5. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ROSTOKBÓL FELSZABADULÓ SZENZOROS
NEUROPEPTIDEK
16
mutatja- egy családba sorolható a kalcitoninnal, az amilinnal és az adrenomedullinnal (Poyner és
mtsai. 2002). Erős vazodilatátor hatással rendelkezik, amely főképp a CGRP1 receptoron
keresztül valósul meg. A CGRP fokozza az adenilát-cikláz aktivitást, amelynek következtében
intracellulárisan megnő a cAMP mennyisége. Ez aktiválja a protein kináz A-t (PKA), a
foszforiláció hatására megnyílnak az ATP-függő K+-csatornák. A folyamat eredménye az érfali
simaizom relaxációja és erőteljes értágulat (Edvinsson és mtsai. 1985; Han és mtsai. 1990;
Hughes és Brain 1994). A CGRP érpermeabilitást fokozó hatását nem közvetlenül, hanem a SP
hatásának potencírozásával fejti ki (Cao és mtsai. 2000), amelyben az játszik elsődleges szerepet,
hogy gátolja a SP degradációjáért felelős neutrális endopeptidáz enzimet (Holzer 1988).
Mindemellett a CGRP komplex immunmodulátor funkciókkal is rendelkezik: csökkenti a
proinflammatorikus citokinek termelődését és fokozza az antinociceptív interleukin-10 (IL-10)
felszabadulását a makrofágból, azonban stimulálja a granulocita-akkumulációt (Barnes 2001).
17
emberi szinoviális szövetmintából történő felszabadulását (Jessop és mtsai. 2010). Mások azt
találták, hogy carrageninnel kiváltott ízületi gyulladásban az EM-1 dózisfüggő módon
csökkentette a hiperalgéziát és 300 g/kg-os dózisban már elhúzódó hatást biztosított (Mécs és
mtsai. 2009). Mivel az endomorfinok hidrofilitásuknak köszönhetően nem jutnak át a vér-agy
gáton (Perlikowska és mtsai. 2009), a periférián szintetizálódó peptidek közvetlenül az érzőideg-
végződésekre kifejtett hatásainak vizsgálata különösen érdekes. Az EM-2 elsősorban a
gerincvelőben és számos agyterületen található, a periférián a szenzoros rostokban és az
immunsejtekben az EM-1 dominál (Jessop és mtsai. 2002). A perifériás gyulladásos és nociceptív
folyamatokban ezért elsősorban az EM-1 szerepe valószínűsíthető (Zadina és mtsai. 2002;
McDougall és mtsai. 2003; Jessop 2006; Fichna és mtsai. 2007).
18
1998) is expresszálódik. Szenzoros neuropeptidként tartják számon, mivel megtalálható a
gerincvelő hátsó szarvában (Dickinson és Fleetwood-Walker 1999; Dickinson és mtsai. 1999), a
hátsó gyöki ganglionokban (Moller és mtsai. 1993, 1994; Dun és mtsai. 1996; Parsons és mtsai.
2000), a kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok perifériás végződéseiben (Zhang és mtsai.
1996; Fahrenkrug és Hannibal 1998), pl. az ízületi tokot ellátó afferensekben (Uddmann és mtsai.
1998), de a központi idegrendszer számos területén is (Mulder és mtsai. 1994).
19
nevezték el (Harmar és mtsai. 1998). Mindhárom receptor neuronokon, simaizom sejteken és
számos gyulladásos sejten megtalálható, stimulációjuk Gs/q-proteinhez kapcsolt
mechanizmusokat indít el, ezen keresztül aktiválódik az adenilát-cikláz, illetve foszfolipáz C
rendszer (Dickinson és Fleetwood-Walker 1999; Vaudry és mtsai. 2000; Zhou és mtsai. 2002;
Somogyvári-Vígh és Reglődi 2004).
20
szomatosztatin a keringésbe jut, ahol szisztémás gyulladáscsökkentő és antinociceptív hatást fejt
ki (Szolcsányi és mtsai. 1998a, b; Thán és mtsai. 2000; Helyes és mtsai. 2000, 2001, 2004).
A SOM hatásait saját receptoraihoz kötve fejti ki. Eddig öt Gi-proteinhez kapcsolt
szomatosztatin receptort klónoztak egérben, patkányban, illetve emberben, melyeket sst1, sst2,
sst3, sst4 és sst5 névvel illettek (Patel és mtsai. 1995). Ez az öt sst receptor szintetikus
szomatosztatin analóg-kötő képességük alapján két csoportra osztható. A SRIF1 csoporthoz
tartoznak az sst2, sst3 és sst5 receptorok, amelyek nagy affinitással kötnek oktapeptid analógokat
(pl. az oktreotidot), míg a SRIF2 csoportba sorolt sst1 és sst4 receptorok alacsony oktapeptid
analóg-kötő képességgel rendelkeznek (Hoyer és mtsai. 1995; Pintér és mtsai. 2006). Számos
irodalmi adat bizonyítja, hogy az endokrin hatásokat a SRIF1 csoportba tartozó receptorok
közvetítik (Raynor és Reisine 1992). Elsősorban munkacsoportunk eredményei mutatják, hogy a
fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő hatás a másik csoporthoz, vagyis az sst 1 és sst4
receptorokhoz köthető (Helyes és mtsai. 2001; Pintér és mtsai. 2002; Szolcsányi és mtsai. 2004;
Pintér és mtsai. 2006).
Az endogén szomatosztatin terápiás alkalmazását akadályozza annak rendkívül sokrétű
előfordulása a szervezetben, széles hatásspektruma és nagyon rövid (3 percnél kevesebb) plazma
eliminációs féléletideje (ten Bokum és mtsai. 2000). Stabil, szelektív sst4 agonisták azonban új
terápiás lehetőséget nyújthatnak a gyulladáscsökkentésben és a fájdalomcsillapításban. E
21
vegyületek nagy előnye, hogy nem rendelkeznek a szomatosztatin sst2, sst3 és sst5 receptorai által
közvetített endokrin hatásokkal.
22
koncentrációjú minták segítségével. A kapott kalibrációs görbe a kötött frakció mérése esetén
szigorúan monoton csökkenő, a szabad frakció mérése esetén szigorúan monoton növekvő lesz.
A kalibrációs görbe segítségével minden egyes ismeretlen minta beütésszámához megkeressük a
hozzá tartozó koncentrációt.
A mérésekhez használt jelölt antigének előállítása a SP kivételével intézetünkben történt.
125
A I a leggyakrabban használt gammasugárzó izotóp (így könnyen mérhető) a peptidhormonok
125 - 125 +
jelölésére. Az eljárás lényege egy oxidációs folyamat, mely során a I→ I átalakulást
oxidálószer hozzáadásával idézzük elő. A legszélesebb körben alkalmazott oxidáló ágensek a
következők: klóramin-T, hidrogén-peroxid és iodogén. A iodogént (1,3,4,6-tetrakloro-3α,6α-
difenil glikoluril) Fraker és Speck (1978) használta először oxidálószerként, és segítségével nyúl
125 +
immunglobulin G-t és csirke lizozimot jelölt. A keletkezett I izotóp iont már az adott
neuropeptidhez tudjuk kapcsolni, mivel az könnyen szubsztituálódik a fehérje vagy polipeptid
lánc tirozin, hisztidin aminosavaira. A reakció feltétele tehát e két aminosav jelenléte a peptidben.
A tirozin aromás gyűrűjéhez kapcsolódó orto helyzetű hidroxil csoport elektronszívó jellege miatt
a két szomszédos szénatom egyike, vagy akár mindkettő elektrondonor tulajdonságú lehet pH 7-8
kémhatású oldatban. Ilyen körülmények között ezek az atomok elektronleadással aktiválódnak, és
alkalmassá válnak arra, hogy részt vegyenek elektrofil szubsztitúciós reakciókban. Így
egyesíthetjük a 125I+ izotóp iont a tirozinnal, vagyis a tirozin-tartalmú peptiddel. Hasonló módon a
hisztidin imidazol gyűrűjében lévő két nitrogénatom tulajdonságaiból adódóan a közös C 2-es
szénatom is lehet elektrondonor 9-es pH-n. Utolsó lépésként a monojódozott, RIA méréshez
alkalmas peptidet el kell választani a többi komponenstől (a di-jódozott peptidtől, a jelöletlentől,
a be nem épült jód ionoktól (125I-, 125 +
I ), az oxidatívan károsodott termékektől). A szeparáció
reverz fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszer segítségével
valósítható meg a legoptimálisabban (Németh és mtsai., 2002).
A perfúziós kísérletek során a szervfürdőkből kapott minták SOM, SP, CGRP és PACAP-
38 koncentrációinak meghatározását végeztük az intézetben kifejlesztett specifikus és érzékeny
RIA módszerekkel (Lsd. Módszerek fejezet).
23
I.7. TÖMEGSPEKTROMETRIA
24
meghatározását teszik lehetővé, közel fmol, néha attomol (10-18 mol) kimutatási határig. A
korábbi eljárásoktól eltérően tehát a MALDI MS elég érzékeny, és elég széles molekulatömeg-
tartományban mér ahhoz, hogy akár célfehérjékkel kölcsönható kofaktorok, inhibitorok,
poliszacharidok, oligonukleotidok és különböző bimolekuláris komplexek is vizsgálhatóvá
váljanak. Napjainkban a tömegspektrométerek méretének és árának jelentős csökkenése nagyban
elősegíti e technika elterjedését, így jelenleg ez az egyik legtöbbször alkalmazott analitikai eljárás
a fizikai, kémiai, biológiai és orvosi kutatások fejlesztésében.
A MALDI módszer egy olyan “fotoionizációs” megoldás, mely kiválóan szabályozható
ionizációt biztosít a műszerben, és lehetővé teszi a termikusan igen érzékeny anyagok, pl.
enzimek, hormonok, vagy akár több százezer dalton (Da) tömegű biomolekulák, fehérje
szekvenciák, stb. MS vizsgálatát. A könnyen irányítható lézerforrásból származó gerjesztő
energiát egy mátrix veszi fel és közvetíti a vizsgálandó molekulák felé. A mátrix megfelelő
megválasztásával kíméletes energia átadás érhető el a kondenzált fázisban lévő molekulára nézve.
A keletkezett ionokat azután egy nagy térerejű gyorsító rendszer (60-100 kV) kiszívja,
deszorbeálja a kondenzált fázisból, s többnyire egy gyors analizátorhoz illesztve (pl.: time-of-
flight, TOF) mérhetővé válnak az egészen nagy tömegű (akár 105-106 Da) ionok is. Ez a
kombináció a MALDI TOF (Burger 1999; Debreczeni és Kovács 2008). Az elektrotechnika
fejlődésével lehetővé vált igen kicsiny időkülönbségek pontos észlelése is, amely a repülési időn
alapuló elválasztás alapját képezi. A TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség és
széles mérési tartomány érhető el. Viszonylag egyszerűek és olcsók; megfelelő ionforrással
(MALDI) kombinálva a nagyobb biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek.
25
gátló neuropeptiderg mechanizmusokról, érdekesnek tűnt megvizsgálni az endomorfin-1 hatásait
azokban a kísérleti elrendezésekben, amelyekben a szomatosztatinra és az sst4 receptor
agonistákra vonatkozóan már voltak korábbi adataink.
A PACAP jelenlétét morfológiai és molekuláris biológiai módszerekkel leírták különféle
fajok kapszaicin-érzékeny neuronjaiban (Moller és mtsai. 1993; Mulder és mtsai. 1994), a
felszabadulására és funkcióira vonatkozóan azonban nagyon kevés adat áll rendelkezésre. Az
irodalomban PACAP felszabadulást írtak le 10-5 M kapszaicin hatására sertés antrumból (Tornoe
és mtsai. 2001), valamint elektromos idegingerlésre nyúl szemben (Wang és mtsai. 1995, 1997).
In vivo kapszaicinnel kiváltott PACAP felszabadulást találtak a gerincvelőben (Zhang és mtsai.
1997), azonban nem vizsgálták a felszabadulását a szisztémás keringésben.
A PACAP nem-neurogén gyulladásos komponensekre kifejtett hatásaira több irodalmi
adat is rendelkezésre áll, amelyek gyulladásgátló hatásokat bizonyítanak (Ganea és Delgado
2002; Abad és mtsai. 2006), azonban elsősorban krónikus modellekben és a gyulladásos sejtek
funkcióira vonatkozóan. A PACAP i.p. injekciója egér kollagén-arthritis modellben csökkentette
a gyulladásos tüneteket (lábduzzadás, bőrpír, sejtes akkumuláció) a citokinszintézis/felszabadulás
gátlásán keresztül (Abad és mtsai. 2001), valamint az autoimmun enkefalitisz súlyosságát az
antigén-prezentáló sejtek funkciójának gátlásával (Kato és mtsai. 2004). Pszoriázisos betegek
bőrmintáin nyert eredmények is arra utalnak, hogy a PACAP szerepet játszik gyulladásos és
immun-mediált folyamatokban (Steinhoff és mtsai. 1999). Ezekkel az eredményekkel ellentétben
azonban arra is vannak adatok, hogy lokálisan alkalmazott PACAP gyulladáskeltő hatásokat,
értágulatot és plazmafehérje-kiáramlást okoz nyúl szemben (Wang és mtsai. 1997). Intradermális
PACAP injekció (10-14-10-9 M) hasonló akut gyulladásos válaszokat okozott patkány és nyúl
bőrében a hízósejtekből történő hisztamin-felszabadításon keresztül (Warren és mtsai. 1993;
Cardell és mtsai. 1997). A PACAP a trachea és a bronchusok területén simaizom relaxációt okoz
(Foda és mtsai. 1995; Shigyo és mtsai. 1998), de a nyáktermelésre és a plazmafehérje-
kiáramlásra kifejtett gátló hatásairól is beszámoltak (Shigyo és mtsai. 1998; Khawaja és mtsai.
1999). Shigyo és munkatársai több mint 10 éve leírták, hogy a PACAP csökkenti a n. vagus
ingerlésével kiváltott nem-adrenerg nem-kolinerg tracheakontrakciókat, de a kívülről beadott SP
hatását nem befolyásolja (Shigyo és mtsai. 1998). E megfigyelés alapján a szerzők feltételezték,
hogy a PACAP gátolja az idegvégződésekből történő SP felszabadulást, konkrét kísérleti adataik
azonban nem voltak erre vonatkozóan.
Különféle exogén opioid receptor agonisták neurogén gyulladást gátló hatásairól
évtizedekkel ezelőtt beszámoltak (Barthó és Szolcsányi 1981). Az endomorfinok olyan endogén
opioid peptidek, amelyek nagyfokú szelektivitást mutatnak a opioid receptorokhoz (Zadina és
26
mtsai. 1997; Przewlocki és Przewlocka 2001). Az EM-1 a központi idegrendszerben főként az
agyban található, míg az EM-2 lokalizációját és primér afferens rostokból való felszabadulását
elsősorban a gerincvelőben írták le, és egyik fontos szerepének ezért a fájdalomtranszmisszió
centrális gátlását tartották (Martin-Schild és mtsai. 1997; Horváth 2000). Mivel az EM-1
intraplantáris adás után dózisfüggően, naloxonnal kivédhető módon gátolta a carrageninnel
kiváltott gerincvelői c-Fos expressziót, hatásaiban perifériás -opioid receptor-közvetítette
antinociceptív folyamatok is jelentős szerepet játszhatnak (Jin és mtsai. 1999). Arra is vannak
azonban adatok, hogy az EM-ok neuronokon kívül immunsejtekben is termelődnek, és
immunmodulátor, valamint gyulladásgátló hatásokkal rendelkeznek (Jessop 2006). Morfológiai,
molekuláris biológiai és elektrofiziológiai módszerekkel mindhárom opioid receptor (, és )
jelenlétét kimutatták a primér szenzoros neuronok sejttestjén és perifériás végződésein (Stein és
mtsai. 1990). A bőrben kiváltott gyulladás hatására a -opioid receptorok száma megnő a
peptiderg afferenseken, azonban a neuronális EM koncentráció nem változik. Ez az eredmény
elsősorban a gyulladásos sejtekből felszabaduló endomorfinok nocicepcióban és neurogén
gyulladásban betöltött jelentőségére utal (Mousa és mtsai. 2002). Az EM-1 lokális alkalmazása
csökkentette akut térdízületi gyulladásban a szinoviális vérátáramlást és a plazmafehérje-
extravazációt patkányban (Barin és McDougall 2003; McDougall és mtsai. 2004). Arra is vannak
irodalmi adatok, hogy az EM-1 gátolja a n. ischiadicus antidrómos elektromos ingerlésével és az
intradermális SP-vel kiváltott plazmafehérje-kiáramlást patkány lábháti bőrében. Mivel a
gyulladáscsökkentő hatás mértéke jelentősen kisebb volt az utóbbi esetben, a hatásban szenzoros
idegvégződéseken kifejtett prejunkcionális gátló mechanizmusokat is feltételeztek (Khalil és
mtsai. 1999). Az EM-1 gyulladásgátló hatásait tehát valószínűleg több támadásponton fejti ki, ezt
az elméletet azonban csak kevés, indirekt adat támasztotta alá (Przewlocki és Przewlocka 2001).
27
II. CÉLKITŰZÉSEK
4. Kísérleteink célja volt továbbá, hogy a PACAP-38 jelenlétét kimutassuk humán, valamint
néhány kérődző állatfaj plazmájában és anyatejében egyaránt. Vizsgálni kívántuk, hogy a
terhesség, a szülés, a laktációs periódus milyen hatással vannak a plazmában, illetve a tejben
lévő PACAP-38 koncentrációkra.
28
III. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK
III. 1. ÁLLATOK
29
alkalmazása során viszont csak a TRPV1 receptorok aktiválásával szabadulnak fel a
neuropeptidek. A harmadik periódusban (ingerlés utáni frakció) már nem történt stimuláció,
ebből a frakcióból az ingerlés utóhatásaként jelentkező peptidfelszabadulást mértük.
A vizsgált anyagokat (EM-1, naloxon, PACAP1-38, PACAP6-38) minden periódus elején
adtuk az inkubációs médiumhoz. A szervfürdőkből vett, majd jégbe hűtött mintákból a SP,
CGRP, SOM koncentrációkat RIA módszerek segítségével határoztuk meg, a peptidek
mennyiségét fmol/mg nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fejeztük ki (Németh és mtsai. 1996,
Helyes és mtsai. 1997; Németh és mtsai. 1998; Helyes és mtsai. 2001). Az MCD-vel történt
előkezelések esetén kiszámoltuk az ingerlés hatására felszabadult teljes peptidmennyiséget is,
amit úgy kaptunk, hogy a stimuláció alatt és után felszabadult CGRP mennyiségéből levontuk a
stimuláció előtti, bazális peptidmennyiséget és a két értéket összeadtuk. (9. ábra).
-6
Elektromos Kapszaicin (10 M)
téringerlés: RTX (10 nM) 95% O2
40 V, 0.1 ms,
5% CO2
10 Hz, 120
sec, 1200 imp.
Krebs oldat
Izolált trachea
Perisztaltikus pumpa
o
(1 ml/perc)
37 C vízfürdő
30
III.3. ANALITIKAI VIZSGÁLATOK
A RIA vizsgálatokhoz a bemérés közvetlenül történt: SOM, SP, és CGRP esetén 200-200
l mintánként.
31
fehérjék. A leszívott, ám még mindig zavaros savót ismét centrifugáltuk (10 0000 rpm, 10 perc,
4°C), majd a felülúszót használtuk a RIA meghatározásokhoz.
III.3.1.4. Kérődző állatfajok mintáinak (plazma, tej, emlőbiopszia) előkészítése RIA mérésekhez
32
15 mm penetrációs mélységű biopsziás tűkkel). Mintavétel előtt az állatot stabilan rögzítettük, a
tőgyét megtisztítottuk és lidocainnal helyi érzéstelenítést alkalmaztunk. Minden állat mintájának
egyik részét azonnal folyékony nitrogénbe helyeztük, a laboratóriumba szállítottuk és -80°C-on
tároltuk, míg a másik részét 4% (v/v) formalintartalmú foszfát pufferben fixáltuk.
33
A SOM és CGRP RIA méréseket 1 ml végtérfogatú 0,02 mol/l koncentrációjú (pH 7,4)
foszfát pufferben végeztük. Az assay puffer 0,75 % (v/v) marha szérum albumin-t (BSA) (22%-
os oldatból (Ortho)), 0.1 mol/l nátrium-kloridot (NaCl), 0,1 % EDTA-t és 0,05 % nátrium-azidot
(NaN3) tartalmazott (Németh és mtsai. 1996; 1998).
III.3.2.3. SP RIA:
34
III.3.2.4. PACAP-38 RIA
A polipropilén RIA csövekbe (Merck) duplikációban mértünk standardot (100 μl) vagy a
mérni kívánt/ismeretlen mintát (200 l), 100 μl antiszérumot, 100 μl (kb. 5000cpm) 125I izotóppal
jelölt antigént, majd az inkubációs elegyet a megfelelő assay pufferrel 1 ml térfogatra
egészítettük ki.
A mintákat az összekeverést követően 4°C-on 48-72 óráig inkubáltuk. Ezután az
antitesthez kötött jelölt antigén frakciót elválasztottuk a szabad jelölt peptidektől oly módon,
hogy csövenként 100 μl szeparáló oldatot (100 g mosott szén (Norit A, Serva), 1g dextrán (Serva,
molekulasúly: 50000-75000), 0,2 g zsírmentes tejpor, 100 ml desztillált víz) mértünk hozzá. A
mintákat 4°C-on 20 percig 3000 rpm-en centrifugáltuk, majd a felülúszót leöntöttük. A szénhez
kötött szabad peptidfrakció radioaktivitását gamma számlálóval mértük NZ310 típusú
spektrométeren. Ebből következtettünk az ellenanyaghoz kötött radioaktivitás értékére, majd a
kalibrációs görbéről leolvastuk az ismeretlen minta neuropeptid koncentrációját.
35
III.3.3. MALDI-TOF/TOF analízis
A széles tömegtartomány mérésére kiválóan alkalmas Bruker Autoflex II. típusú MALDI
TOF/TOF tömegspektrométer segítségével végeztük méréseinket. A készülékkel megvalósítható
a tandem tömegspektrometria (TOF/TOF), mely során az ionforrásból kilépő részecskéket két
módon tudjuk fragmentálni: közvetlenül az ionforrás után (post source decay, PSD) vagy
argongáz segítségével az erre a célra kialakított ütközési cellában (collision induced decay, CID).
A műszerben két detektort alkalmazunk: a kis tömegű ionokat a nagyobb úthosszt biztosító
iontükrös (reflektoros) detektorban, míg a nagyobb tömegűeket lineáris módban mérjük. A
műszer kimutatási tartományának alsó határa fmol nagyságrendű (10. ábra).
36
fent említett Bruker Daltonics Autoflex II típusú MALDI TOF/TOF tömegspektrométerrel
reflektor detektálási módban végeztük el. Az ionizáláshoz 337 nm-es nitrogén lézert
alkalmaztunk (MNL-205MC model; LBT- Lasertechnick Berlin GmbH.; Berlin; Németország),
ennek frekvenciája 50 Hz, a gyorsító feszültség 20 kV és a késleltetési idő pedig 120 ns volt. A
tömegspektrumokat pozitív ionizációs módban 1000 és 10000 m/z tartomány között regisztráltuk.
Minden minta esetében a peptidkeverékre jellemző tömegspektrumokat (1000 lövés/minta)
összesítettük. A műszer ellenőrzését Bruker FlexContol 2.4 szoftverrel, az értékelést pedig
Bruker FlexAnalysis 2.4 szoftverrel végeztük. A megfelelő matematikai átalakítások után, az
eredményeinket fehérje szekvenciát tartalmazó adatbázisokba küldtük (Mascot kereső szoftver és
NCBInr, SwissProt és MSDB adatbázisok). Az adatbázisokból úgynevezett ujjlenyomat-keresési
technika (Peptide Mass Fingerprinting, PMF) segítségével kaptuk meg az adott tömegspektrum
által meghatározott fehérjéket.
37
inkubáltuk a mintákat. Ezt 3x5 perces 0,2 M-os PBS-es mosás követte, majd a metszeteket
Fluoromount-G (Southern Biotech) géllel fedtük.
A metszetek specifikus jeleit megfelelő hullámhosszon (568 nm) Nikon Eclipse 80i
mikroszkóppal detektáltuk, SPOT Basic 4.04 program segítségével. Valamennyi antitest
alkalmazásakor készítettünk ún. negatív kontrollokat is, amelyekkel ellenőriztük, hogy
önmagában a primer, és szekunder antitestek adnak-e aspecifikus jelet.
A standardizálás érdekében minden egyes marker vizsgálata során a metszetvastagság, az
inkubációs idők, valamint az alkalmazott koncentrációk azonosak voltak valamennyi vizsgált
csoport esetében. Valamennyi csoportból származó mintákat párhuzamosan reagáltattuk a korrekt
összehasonlítás érdekében. Ugyanez elmondható a fényképezés folyamatáról is, a különböző
kísérleti csoportok metszeteinek kiértékelésekor a SPOT Basic program teljesen azonos
beállításai mellett készültek a fotók, így az egyes csoportok közötti eltérések valódi
különbségeknek tudhatók be.
A bemutatott fotók szerkesztése Adobe Photoshop 7.01 programmal történt.
III.4.1. Mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladás vizsgálata patkány lábháti bőrében
38
extraháltuk 72 órán keresztül. Az oldat optikai denzitását, amely a gyulladás intenzitásával
egyenesen arányos, spektrofotométerrel (Labsystem Multiskan RC, InterLabsystem Kft.,
Magyarország) határoztuk meg 620 nm-en. A kapott értékekből kalibrációs görbe segítségével
határoztuk meg a festék mennyiségét (g) 1 g nedves szövetre vonatkoztatva. A mustárolajjal
bekent lábak eredményeiből az ellenoldali lábak eredményeit levontuk. Az EM-1-et (1, 10 és 100
g/kg i.p.) 10 perccel a gyulladás kiváltása előtt adtuk. Az egyik vizsgálati csoportban az
állatokat 15 perccel az EM-1 adás előtt -opioid receptor antagonista naloxonnal (3 mg/kg s.c.,
Campos és mtsai. 2000) előkezeltük. A kontroll csoportban az EM-1 oldószerét, fiziológiás
sóoldatot használtunk a naloxon előkezelést követően. A vizsgálatokat 14-15-ös elemszámú
csoportokkal végeztük.
Megvizsgáltuk, hogy az EM-1 okoz-e toleranciát ebben a modellben. 10 napon át naponta
háromszor 10 g/kg i.p. dózisban adtuk az opioid receptor agonistát, majd megismételtük a
gyulladásos kísérletet.
Balb/c egerek fülére altatásban (ketamin 100 mg/kg i.p. és xylazin 10 mg/kg i.m.) 10 μl
1%-os mustárolajat kentünk és 3 órán keresztül mikrométerrel mértük a fülvastagságot (12.
ábra). A kialakult fülödémát a kezdeti értékhez viszonyított százalékban adtuk meg. Az EM-1-et
15 perccel a mustárolajjal történő kezelés előtt adtuk 1, 10 és 100 g/kg i.p. dózisban. A kontroll
csoportban az EM-1 oldószerét, fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk. Megvizsgáltuk, hogy ebben a
modellben a -opioid antagonista naloxon kivédi-e az EM-1 fülduzzadásra gyakorolt hatását,
ezért az egyik vizsgálati csoportban az egereket 15 perccel az EM-1 adás előtt naloxonnal
39
kezeltük. A kontroll csoportban az EM-1 oldószerét, fiziológiás sóoldatot használtunk a naloxon
előkezelést követően. A vizsgálatokat 8-10-es elemszámú csoportokkal végeztük.
40
III.5. STATISZTIKA:
41
IV. EREDMÉNYEK
Teljes CGRP
CGRP mennyisége (fmol/mg nedves szövet)
felszabadulás az MCD %-os gátlása a
ingerlés alatt és teljes CGRP
után (fmol/mg felszabadulásra
ingerlés előtt ingerlés alatt ingerlés után
nedves szövet
kontroll 0,93 ± 0,19 10,26 ± 1,39 5,45 ± 0,50 13,85 ± 0,75
10 M 0,54 ± 0,08 7,39 ± 0,59 2,96 ± 0,34 * 9,27 ± 0,32 66,96
100 M 0,67 ± 0,03 3,81 ± 0,88 * 3,15 ± 0,84 5,62 ± 0,57 40,54 *
1 mM 0,47 ± 0,50 8,43 ± 1,06 2,83 ± 0,38 * 10,32 ± 0,59 74,49
10 mM 0,41 ± 0,06 7,06 ± 2,46 4,04 ± 0,70 10,28 ± 1,07 74,23
42
ingerlés elõtt
15
ingerlés alatt
14
ingerlés után
13
12 Kapszaicin 1 M
11
CGRP-LI (fmol/mg)
10
9
8
7
6
5 *
4 * *
3
2
1
0
kontroll MCD MCD MCD MCD
10 M 100 M 1 mM 10 mM
43
2. táblázat: MCD hatása az RTX ingerléssel kiváltott CGRP felszabadulásra
Teljes CGRP
CGRP mennyisége (fmol/mg nedves szövet)
felszabadulás az MCD %-os gátlása a
ingerlés alatt és teljes CGRP
után (fmol/mg felszabadulásra
ingerlés előtt ingerlés alatt ingerlés után
nedves szövet)
kontroll 0,37 ± 0,037 2,86 ± 0,566 9,46 ± 2,237 11,58 ± 1,035
100 M 0,08 ± 0,007 * 0,77 ± 0,194 * 2,81 ± 0,642 * 3,42 ± 0,315 29,52 *
1 mM 0,39 ± 0,058 5,58 ± 1,338 7,18 ± 0,769 11,97 ± 0,752 103,39
15 ingerlés elõtt
14 ingerlés alatt
13
CGRP-LI (fmol/mg)
ingerlés után
12 RTX 10 nM
11
10
9
8
7
6
5
4 *
3
2 *
1
0
* MCD 100M
kontroll MCD 1 mM
44
IV.2. AZ ENDOMORFIN-1 HATÁSA SZENZOROS NEUROPEPTIDEK FELSZABADULÁSÁRA IN
VITRO ÉS AKUT GYULLADÁSOS FOLYAMATOKRA IN VIVO
CGRP-LI (fmol/mg)
Kezelés
Frakció
Kontroll EM-1 Naloxon Naloxon+EM-1
Ingerlés előtti 0,14±0,01 0,15±0,009 0,11±0,01 0,17±0,03
Ingerelt 0,29±0,02** 0,18±0,009## 0,38±0,02 0,40±0,05
Ingerlés utáni 0,21±0,02 0,15±0,008 0,20±0,04 0,23±0,02
45
Ingerlés elõtt
Ingerlés alatt
7,50 Ingerlés után
Substance P- LI (fmol/mg)
6,25
*
5,00
3,75
2,50
1,25
0,00
Kontroll 5 20 100 2000
EM-1 koncentráció (nM)
Ingerlés elõtt
0,35 **
** Ingerlés alatt
Ingerlés után
0,30
0,25
CGRP-LI (fmol/mg)
##
0,20 ##
0,15
0,10
0,05
0,00
Kontroll 5 20 100 2000
EM-1 koncentráció (nM)
46
SP
Felszabadulás gátlása (%)
90 CGRP
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10 -9 -8 -7 -6 -5
EM-1 koncentráció (M)
Az EM-1 (1, 10 és 100 g/kg, i.p.) dózisfüggően gátolta az 1%-os mustárolajjal kiváltott
plazmafehérje-kiáramlást patkány lábháti bőrében. A két nagyobb dózis esetén 49,1%-os és
55,4%-os csökkenést tapasztaltunk. A naloxon előkezelés (3 mg/kg s.c.) teljesen kivédte a 100
g/kg EM-1 gátló hatását, de önmagában nem befolyásolta a gyulladást (17. ábra). A szigmoid
dózis-hatás görbe analízisével nyert maximális gátlás 58,4%, az ED50 érték 1,13 g/kg volt, tehát
az EM-1 jelentős hatékonysággal és nagy hatáserősséggel rendelkezik ebben a modellben.
A 10 g/kg dózis 10 napon keresztül napi 3-szor történő i.p. injekciója a gyulladás
kiváltása előtt nem csökkentette a gátló hatást az egyszeri alkalmazáskor tapasztalthoz
viszonyítva, az EM-1 tehát nem okoz deszenzibilizációt ebben a kísérleti elrendezésben.
47
Oldószer (NaCl)
EM-1 (g/kg)
NAL + NaCl (1g/kg)
450 NAL (1g/kg) + EM-1 (100g/kg)
g Evans kék/g nedves szövet
400
350
300
**
250
**
200
150
100
50
0
1 10 100
48
Oldószer (NaCl)
EM-1 (1 g/kg)
EM-1 (10 g/kg)
EM-1 (100 g/kg)
50
NAL + NaCl
Fülduzzadás mértéke (%)
30
20
*
10
* *
*
0 ***
0 1 2 3
Idõ (óra)
49
gyulladásos mechanizmusokat: a kötőszövetben lévő granulociták száma közel megegyező. A
duzzadás mértéke ekkor már csökken a korábbi időpontokhoz viszonyítva, és azonos az EM-nal
és oldószerrel kezelt egerek fülmintáinak szövettani metszetein is (20. ábra).
50
P
____
200 m
P P
→
→
→
→
____ ____
200 m 200 m
51
IV.3. A PACAP6-38 AGONISTA HATÁSAI AZ ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEKEN
Kapszaicin ingerlés (10-6 M) hatására a bazális, ingerlés előtti értékekhez viszonyítva 2,5-
szeres, 11-szeres és 3-szoros SP, CGRP és SOM felszabadulást mértünk izolált patkány tracheán.
Elektromos téringerléssel (1200 impulzus) szintén 3-szoros, 3,5-szeres és 2,5- szeres neuropeptid
kiáramlás érhető el. A PACAP1-38, melyet 400 és 2000 nM koncentrációban adtunk a szervfürdő
mindhárom frakciójához, szignifikánsan gátolta mind a kémiai, mind az elektromos téringerléssel
kiváltott neuropeptid felszabadulást. A PACAP6-38 2000 nM-os dózisban szintén gátolta a SP és
a CGRP felszabadulását, bár kisebb mértékben, mint a PACAP1-38. A szomatosztatin
felszabadulás során is hasonló eredményeket kaptunk, de az elektromos téringerléssel kiváltott
SOM kiáramlást a PACAP6-38 még a PACAP1-38-nál is nagyobb mértékben gátolta. Sem a
PACAP1-38 sem a PACAP6-38 nem volt hatással a szenzoros neuropeptidek bazális szintjeire.
Amikor a két vegyületet együtt adtuk az inkubációs médiumhoz, a PACAP1-38 által kiváltott
gátló hatás nem változott, vagy még kifejezettebb lett (21-22. ábra).
52
Ingerlés elõtt
7 Ingerlés alatt
Kapszaicin (10 M)
-6 Ingerlés után
6
EFS (1200 imp.)
Substance P -LI (fmol/mg)
5
***
4 **
*** *** ***
3 *** *** ***
2
Ingerlés elõtt
3 Ingerlés alatt
Ingerlés után
-6
Kapszaicin (10 M)
**
CGRP-LI (fmol/mg)
1
*** *** ***
53
Ingerlés elõtt
0,7 Ingerlés alatt
-6
Kapszaicin (10 M) Ingerlés után
0,6
* EFS (1200 imp.)
0,5
SOM-LI (fmol/mg)
0,4
*** *** *** ***
0,3 *** ***
***
0,2
0,1
54
IV.4. A PACAP-38 KIMUTATÁSA KÜLÖNBÖZŐ FAJOK PLAZMÁJÁBAN ÉS ANYATEJÉBEN
EREDETI KÖZLEMÉNYEK:
Börzsei R, Márk L, Tamás A, Bagoly T, Bay C, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth G,
Németh J, Szauer E, Helyes Z, Reglődi D.: Presence of pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide-38 in human plasma and milk. Eur J Endocrinol. 2009 Apr;160 (4):561-565. 2009.
Reglődi D, Gyarmati J, Ertl T, Börzsei R, Bodis J, Tamás A, Kiss P, Csanaky K, Bánki E, Bay C,
Németh J, Helyes Zs: Alterations of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like
immunoreactivity in the human plasma during pregnancy and after birth. J Endocrinol
Invest.;33(7):443-445 2010.
55
23. ábra: A PACAP-38 tömegspektruma
A PACAP-38 protonált kvázi molekula ionját (M+H+) láthatjuk a (A) standardban, (C) humán
szérumban és (E) humán anyatejben. Ezt követően MALDI TOF/TOF mérés eredményeként
megkaptuk ezek fragmenseit és azok aminosav szekvenciáját (B, D, F)
56
4500 Egészséges önkéntesek plazmája
4000 Szoptatós kismamák plazmája
3500 Anyatej savó
PACAP-38-LI (fmol/ml)
800
600
400
*
200
0
plazmák anyatej
57
* *
500
PACAP-LI (fmol/ml plazma)
450
400
350
300
250
200 **
150
100
50
0
egészséges 1. 2. 3. szülés szülés után
önkéntesek trimeszter alatt (1-3 nap)
58
450
400
350 **
#
PACAP-38-LI
300
250 **
200
150
100
50
0
újszülött arteria vena
perifériás vér umbilicalis umbilicalis
59
Plazma
Tej *** ***
6000
***
5000 ***
PACAP-LI (fmol/ml)
***
4000 ***
3000
2000
1000
0
7 30 90 7 30 90
Kecske Juh
60
Plazma
Plazma
Tej
61
26
Szöveti PACAP-LI (fmol/ml) 24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
ellés után ellés után
7 nappal 30 nappal
62
hámsejtek
kivezetőcsövek
63
V. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK
64
csökkentette a koleszterin-depléció, de koncentráció-hatás összefüggést nem találtunk. Mind a
kapszaicin, mind az RTX esetében csak a 100 M MCD koncentráció okozott szignifikáns gátló
hatást. Egy másik kísérleti elrendezésünkben, amelyben izolált patkány trigeminus
ganglionsejteken lévő natív TRPV1 receptorokat vizsgáltunk, megfigyeltük, hogy mind az RTX-
szel, mind a kapszaicinnel kiváltott kalcium-beáramlásban ugyancsak szignifikáns gátló hatása
volt az MCD kezelésnek. A koleszterin depléció és a lipid raftok integritásának megbomlása
tehát nemcsak az érzőneuronok perifériás végződésein, hanem a sejttesten is szignifikánsan
gátolja a TRPV1 kémiai aktivációját (Szőke és mtsai. 2010).
Kísérletsorozatunkban megfigyeltük, hogy mind a kapszaicin, mind az RTX által kiváltott
CGRP felszabadulást gátolta a 100 M koncentrációban alkalmazott MCD előkezelés. Ezzel
szemben a kisebb, illetve a nagyobb koncentrációk érdekes módon már nem befolyásolták a
neuropeptid felszabadulást. A CGRP felszabadulás kinetikája eltérő volt a kapszaicin és az RTX
indukálta receptor aktiváció során. Azon megfigyelésünk, miszerint az RTX alkalmazásakor az
ingerlés utáni frakcióban mért CGRP mennyiség nagyobb volt, mint a stimuláció alattiban,
szintén megerősítheti a feltevést, miszerint az RTX és a kapszaicin a TRPV1 receptoron más-más
helyhez kötődve fejti ki hatását.
65
nM és 2000 nM koncentrációban jelentősen gátolta a CGRP felszabadulást, és a bazális, ingerlés
előtti frakcióhoz viszonyítva még a legkisebb, 20 nM-os koncentráció hatására sem alakult ki
szignifikáns neuropeptid felszabadulás. A különbség, mely az EM-1 SP-re és CGRP-re gyakorolt
gátló hatásában megnyilvánul azzal magyarázható, hogy a szenzoros idegvégződésekben a
neuropeptidek ko-lokalizációja nem teljesen egyforma. Számos kísérleti eredmény számol be
arról, hogy a szenzoros ganglionokban a neuronok jelentős része csak CGRP-t tartalmaz (Ju és
mtsai. 1987). Nem áll rendelkezésünkre adat arra vonatkozólag, hogy a különböző neuronális
elemeken a -opioid receptorok milyen eloszlást mutatnak, de vizsgálataink azt jelzik, hogy a
receptorok nagyobb számban találhatók meg azon idegvégződéseken, melyek csak CGRP-t
tartalmaznak.
A maximális gátló hatás a SP és a CGRP estében is 80-85%, az EC50 érték pedig nagyon
alacsony, nanomólos koncentrációtartományban volt. Az EM-1 100 nM-os koncentrációja
80,1%-os gátlást fejtett ki a SP és 82,3%-ost a CGRP felszabadulásra, míg ugyanez a nociceptin
koncentráció csak 63,1%-os és 44,1%-os csökkenést eredményezett (Helyes és mtsai. 1997), az
EM-1 tehát a nociceptinnél hatékonyabbnak bizonyult.
Az EM-1 akut neurogén gyulladást gátló hatásait patkányban és egérben ugyancsak
sikerült igazolnunk in vivo. Érdemes kihangsúlyozni, hogy 10 napig történő, ismételt adás után
sem csökkent ez a hatás az egyszeri alkalmazáskor tapasztalttal összehasonlítva, tehát ebben a
modellben az EM-1 tartós alkalmazása nem okoz toleranciát. Mindkét fajban a mustárolajjal
kiváltott neurogén gyulladást gátló hatás maximuma 55-60%, az ED50 megközelítőleg az 1 g/kg
i.p. dózis volt. Mivel ugyanazok a patológiai folyamatok állnak mind az egér fülön kiváltott
ödéma, mind a patkány bőrön indukált plazmaprotein-kiáramlás hátterében, ezért két rágcsáló
fajon végzett, ám egyenértékű neurogén gyulladásos modellnek tekinthetők. Az egérfülduzzadás
mérése gyors, megbízható, technikailag egyszerű és széles körben használt neurogén gyulladásos
modell, mely jól reprodukálható eredményeket biztosít és kismértékű hibalehetőséggel jár (Inoue
és mtsai. 1997; Gabor 2003; Bánvölgyi és mtsai. 2004; Helyes és mtsai. 2006). Patkány esetén a
fülduzzadás mérése nem alkalmazható a fül nagy mérete miatt, de a lábháti bőrön mustárolajjal
kiváltott plazmaprotein-kiáramlást Evans-kék akkumulációs módszerrel rutinszerűen használják
mint tisztán neurogén gyulladásos modellt (Donnerer és mtsai. 1991; Amann és mtsai. 2000;
Helyes és mtsai. 1997, 2001). A mustárolaj 5%-os koncentráció alatt hízósejtkiáramlás nélküli
(Inoue és mtsai. 1997; Szolcsányi és mtsai. 1998b), tiszta neurogén gyulladást okoz azáltal, hogy
szelektíven a kapszaicin érzékeny szenzoros idegvégződéseket stimulálja (Jancsó és mtsai. 1967).
Az EM-1 gyulladásgátló hatásában feltételezett prejunkcionális mechanizmusokra (Khalil
és mtsai. 1999), vagyis az érzőideg-végződéseken történő gátló hatásra, eredményeink
66
egyértelmű, közvetlen bizonyítékokat szolgáltattak. Mivel a naloxon mindhárom modellben
kivédte az EM-1 gátló hatásait, e tetrapeptid ismert -opioid receptor agonista hatása (Fischer és
Undem 1999; Patel 1999; Lippl és mtsai. 2001; Fichna és mtsai. 2007) jól magyarázza
eredményeinket, más, nem specifikus mechanizmusok nem játszanak benne szerepet.
Vizsgálataink tehát bizonyították, hogy a szenzoros idegvégződéseken lévő -opioid receptorok
aktivációja felelős -legalábbis részben- az EM-1 neurogén gyulladást csökkentő hatásaiért, amit
SP és CGRP felszabadulás gátlásával ér el.
Korábbi adataink alapján ismert, hogy a mustárolaj az alkalmazását követően 6 órával
granulociták beáramlását is kiváltja, ebben a késői gyulladásos reakcióban azonban nem-
neurogén, szenzoros neuropeptidektől független mechanizmusok játszanak szerepet (Bánvölgyi
és mtsai. 2004). Az EM-1 hatékony ödémagátló hatásával ellentétben nem csökkentette a
mustárolajjal kiváltott gyulladás késői, sejtes fázisát, a granulocitákra tehát nincs hatása. Számos
mechanizmust részletesen leírtak, amelyekkel perifériás gyulladásos körülmények között az
opioidok hatásai fokozódnak. A primér szenzoros neuronok perifériás végződésein az opioid
receptorok száma megnövekszik (Zhang és mtsai. 1998; Pol és Puig 2004), fokozódik az opioid
receptorok Gi-protein aktiváló képessége, amely csökkenő intracelluláris cAMP-koncentrációhoz
vezet (Zöllner és mtsai. 2003). Fokozódik továbbá az opioid peptidek felszabadulása a gyulladt
területre beáramló gyulladásos és immunsejtekből (Stein és mtsai. 1990; Stein és Yassouridis
1997; Stein és mtsai. 2001; Machelska és mtsai. 2002; Mousa és mtsai. 2002). A gyulladásos
stimulusok serkentik a -opioid receptorok szintézisét a primér szenzoros neuronok sejttestjeiben
a hátsó gyöki ganglionokban, valamint fokozódik e receptorok perifériás végződés felé történő
axonális transzportja (Stein és mtsai. 1990; Cain és mtsai. 1997; Stein és Yassouridis 1997; Stein
és mtsai. 2001; Mousa és mtsai. 2002; Nagakura és mtsai. 2003; Puehler és mtsai. 2004). E
folyamatok következtében megnövekedik a opioid receptorok expressziója a perifériás
érzőideg-végződéseken, ami jelentős szerepet játszik a gyulladásos körülmények között nagy
mennyiségben -elsősorban a leukocitákból- felszabaduló opioid peptidek fokozott endogén
analgetikus és gyulladásgátló hatásaiban, de az exogén opioid receptor agonisták terápiás
hatásaiban is (Mousa és mtsai. 2002; Ballet és mtsai. 2003; Puehler és mtsai. 2004; Shaqura és
mtsai. 2004). A -opioid receptorok perifériás idegvégződéseken történő stimulációja tehát
ugyancsak ígéretes új perspektívákat jelenthet a neurogén gyulladás gátlására tolerancia
kialakulásának veszélye nélkül.
67
V.3. PACAP1-38 ÉS PACAP6-38 HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KAPSZAICINNEL, ÉS
ELEKTROMOS TÉRINGERLÉSSEL KIVÁLTOTT SZENZOROS NEUROPEPTID
FELSZABADULÁSRA IZOLÁLT PATKÁNY TRACHEÁN
68
PACAP6-38 által kifejtett gátló hatás kisebb mértékű volt a legtöbb esetben, amiből arra
következtethetünk, hogy a fragmentum parciális agonista. Ugyanakkor a két peptid együttes
adása nagyobb gátló hatást eredményezett a kapszaicin ingerléssel kiváltott szomatosztatin, és az
elektromos téringerléssel kiváltott SP felszabadulásra, mint amikor a PACAP1-38-at önmagában
alkalmaztuk. Mindez azonban nem támasztja alá, hogy a PACAP6-38 parciális agonista lenne.
Azt mondhatjuk tehát, hogy ebben a modellben a PACAP6-38 tiszta agonistaként viselkedik.
Korábbi közlemények és jelen eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a PACAP6-38
hatása szövet-és célsejt specifikus.
69
metionin (Grosvernor és mtsai. 1992; Koldovszky 1996). A tejben található gasztrointesztinális
peptidek feltételezhetően szerepet játszanak a növekedés szabályozásában és az újszülöttek
gyomor-bél rendszerének érésében is (Berseth és mtsai 1990). Néhány növekedési faktor
nagyobb koncentrációban található az anyatejben, mint a plazmában. Ilyen például a
gonadotropin elválasztást serkentő hormon (GnRH), a thyreotrop hormon (TRH), a VIP, a
szomatosztatin, a növekedési hormon elválasztást serkentő hormon (GHRH), a relaxin, az
inzulinszerű növekedési faktor-1 (IGF-1), az epidermális növekedési faktor (EGF) és a
prosztaglandinok (Grosvernor és mtsai. 1992). Ezen bioaktív vegyületek valószínűleg szerepet
játszanak az emlőmirigyek növekedésében, a különböző tápanyagok szállításában valamint az
újszülött szöveteinek differenciálódásában és fejlődésében.
A PACAP anyatejben betöltött szerepéről egyenlőre csak feltételezéseink vannak. Az a
tény, hogy ilyen magas koncentrációban van jelen az anyatejben, arra utal, hogy a PACAP
elengedhetetlenül szükséges az újszülött egészséges növekedése és fejlődése szempontjából.
Kimutatták, hogy a PACAP fontos szerepet játszik a különböző szervek fejlődésében, különös
tekintettel az idegrendszerre (Vaudry és mtsai. 2000; Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). A
PACAP, mint neurotrofikus faktor befolyásolja az idegrendszer fejlődésének korai szakaszát, a
neurogenezist, majd a születés után az asztrocitogenezisre, mielinizálódásra, az agy fejlődésére és
a neuronális migrációra van nagy hatással. Az anyatej multifunkcionális összetevői védelmet
nyújtanak különböző patogénekkel szemben és serkentik a természetes immunmechanizmusok
kialakulását (Grosvernor és mtsai. 1992; Koldovsky 1996). A PACAP bizonyos immunmoduláns
hatással is rendelkezik, szabályozza az immunrendszer fejlődését, valamint a limfociták és
makrofágok érését (Ganea és Delgado 2002).
Az emlőmirigyek fejlődésében és növekedésében is fontos szerepet játszhat. A PACAP
antiapoptotikus és sejtciklus szabályozó hatásai régóta ismertek (Vaudry és mtsai. 2000;
Somogyvári-Vigh és Reglődi 2004). Az apoptózis komoly jelentőséggel bír a emlőmirigyek
fejlődésében (Green és Streuli 2004). A növekedési faktorok és antiapoptotikus molekulák
expressziója szabályozza a laktáció során az emlőmirigyek növekedését és fejlődését, majd az ezt
követő nagymértékű sejtpusztulásban az apoptózis jut komoly szerephez.
Felmerül a kérdés, hogy a tejből származó PACAP milyen orális biohasznosulással
rendelkezhet. A PACAP lebontásáért a dipeptidil peptidáz IV a felelős, mely a biológiailag aktív
peptidek féléletidejét döntően befolyásoló faktor (Bourgault és mtsai. 2008). Kimutatták, hogy a
PACAP és a hozzá hasonló peptidek féléletideje a testnedvekben viszonylag rövid, percekben
mérhető csupán (Bourgault és mtsai. 2008). Az emlőmirigyek termelnek proteáz inhibitorokat,
melyek a tejben lévő különböző fehérjék és peptidek stabilitásáért felelősek. Az újszülöttekben
70
emellett a proteolitikus aktivitás kisebb mértékű, a dipeptidil peptidáz IV enzimük még éretlen, és
a bélhámsejtek makromolekulákkal szemben nagyobb permeábilitást mutatnak, ami lehetővé
teszi fehérjék és peptidek nagyobb arányú felszívódását (Grosvernor és mtsai. 1992).
Egészséges kismamák körében végzett vizsgálataink elsőként mutatták ki, hogy a
PACAP-38 plazmaszintje a terhesség második és harmadik trimeszterében folyamatosan
növekszik, a szülés alatt jelentősen csökkent, és a szülést követő harmadik napon újra normál
értékek mérhetők. Újszülöttekben a PACAP-38 koncentrációja a periférián hasonló, mint
felnőttekben, azonban az umbilicalis erekből nyert vér alacsonyabb PACAP koncertrációt
tartalmazott. A vena umbilicalisban szignifikánsan kevesebb PACAP volt mérhető, mint az
artériás oldalon. Ezen adatok alapján ugyan nem vonható le messzemenő következtetés a PACAP
fiziológiai folyamatokban betöltött szerepére vonatkozóan, azonban méréseink bizonyítják, hogy
az endogén PACAP szintek érzékenyen reagálnak olyan hormonális változásokra, mint a
terhesség, szülés, szoptatás. Érdekes az az eredmény, miszerint az arteria umbilicalisban mérhető
PACAP koncentráció magasabb, mint a vénában, ami arra utal, hogy a magzati szervekben aktív
peptidszintézis zajlik. A PACAP jelenléte a fejlődés nagyon korai szakaszában már kimutatható
egérben és zebrahalban is. PACAP hiányos egerekben igazolták, hogy a peptid hatással van
számos fejlődési folyamatra a kisagy fejlődésétől a viselkedési mintázatok kialakulásáig (Vaudry
és mtsai. 2009).
A PACAP egy pleiotropikus és többfunkciós neuropeptid, melyről ma már több
bizonyíték is rendelkezésre áll, hogy fontos szerepet játszik a női hormonháztartás
szabályozásában, tehát hatással van a terhességre, a fertilitásra ugyanúgy, mint a méhizomzat
kontraktilitására és ezáltal a keringésére is (Huang és Pan 1996; Steenstrup és mtsai. 1996; Lee és
mtsai. 1999; Murck és mtsai. 2007; Isaac és Sherwood 2008; Tohei és mtsai. 2009; Levy és
mtsai. 2010). A terhesség késői szakaszában (második trimeszter után) mért PACAP
koncentráció magasabb volt, ami azt mutatja, hogy a placentában és/vagy más anyai szervekben
az átlagosnál nagyobb mértékű peptidszintézis folyik. Mindez összhangban van azzal a
megállapítással, hogy a placenta PACAP tartalma a terhesség során folyamatosan növekszik
(Brubel és mtsai 2010). Ezen eredmények alapján feltételezhetjük, hogy a PACAP komoly
fiziológiai szerepet játszik a terhességben, de a különböző folyamatok és mechanizmusok
pontosabb megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek.
Ma már számos kísérleti bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozólag, hogy a PACAP
fontos szabályozó faktor a terhesség során. Például PACAP hiányos egerekben csökkent a
fertilitás, ami főleg az elégtelen decidualizációnak köszönhető (Isaac és Sherwood 2008). Egy
másik vizsgálat kimutatta, hogy a PACAP mRNS átmenetileg expresszálódik a decidualizáció és
71
a terhesség alatt az anyai föto-placentális egységben, amely az emlősök terhességében betöltött
szerepére utal (Spencer és mtsai. 2001). A peptid mindkét formája (PACAP-27 és PACAP-38)
relaxálja a méhizomzatban lévő artériákat (Steenstrup és mtsai. 1996). A PACAP utero-
placentális egységben betöltött vazokonstrikciót szabályozó szerepe magyarázatot adhat a szülés
során tapasztalt hirtelen PACAP szint csökkenésre.
Bár további vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy pontosan ismerjük a PACAP emberi
prenatális és postnatális fejlődésben betöltött funkcionális jelentőségét, jelen eredmények
alapvetően fontosak, hogy e területen további kutatások induljanak.
72
VI. ÚJ EREDMÉNYEIM ÖSSZEFOGLALÁSA
73
VII. IRODALOMJEGYZÉK
1. Abad C, Gomariz RP, Waschek JA (2006). Neuropeptide mimetics and antagonists in the
treatment of inflammatory disease: focus on VIP and PACAP. Curr. Top. Med. Chem. 6:
151-163.
2. Abad C, Martinez C, Leceta J, Gomariz RP, Delgado M (2001). Pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide inhibits collagen-induced arthritis: an experimental
immunomodulatory therapy. J. Immunol. 167: 3182-3189.
3. Amann R, Egger T, Schuligoi R (2000) The tachykinin NK1 receptor antagonist
SR140333 prevents the increase of nerve growth factor in rat paw skin induced by
substance P or neurogenic inflammation. Neuroscience 100:611–615.
4. Amara SG, Jonas V, Rosenfeld MG, Ong ES, Evans RM (1982). Alternative RNA
processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different
polypeptide products. Nature 298: 240-244.
5. Arimura A, Somogyvári-Vígh A, Miyata A, Mizuno K, Coy DH, Kitada C (1991). Tissue
distribution of PACAP as determined by RIA: Highly abundant in the rat brain and testes.
Endocrinology 129: 2787–2789.
6. Ballet S, Conrath M, Fischer J, Kaneko T, Hamon T, Cesselin F (2003). Expression and
G-protein coupling of mu-opioid receptors in the spinal cord and dorsal root ganglia of
polyarthritic rats. Neuropeptides 37: 211-219.
7. Bánvölgyi Á, Pozsgai G, Brain SD, Helyes Zs, Szolcsányi J, Ghosh M, Melegh B, Pintér
E (2004). Mustard oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-
independent neurogenic inflammation and a non-neurogenic cellular inflammatory
component in mice. Neuroscience 125: 449-459.
8. Bari M, Battista N, Fezza F, Finazzi-Agrò A, Maccarrone M (2005). Lipid rafts control
signaling of type-1 cannabinoid receptors in neuronal cells: implications for anandamide-
induced apoptosis. J. Biol. Chem. 280, 12212-12220.
9. Barin AK, McDougall JJ (2003). Endomorphin-1 causes synovial hypoaemia in rat knee
joints via a capsaicin-sensitive neural pathway. Neurosci. Lett. 344: 21-24.
10. Barnes PJ (2001). Potential novel therapies for chronic obstructive pulmonary disease.
Novartis Found. Symp. 234: 255-267.
11. Barthó L, Szolcsányi J (1981). Opiate agonists inhibit neurogenic plasma extravasation in
the rat. Eur. J. Pharmacol. 73: 101-104.
74
12. Berseth CL, Michener SR, Nordyke CK, Go VL (1990). Postpartum changes in pattern of
gastrointestinal regulatory peptides in human milk. Am. J. Clin. Nutr. 51, 985-990.
13. Bevan S, Szolcsányi J (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms
and applications. Trends Pharmacol. Sci. 11: 330-333.
14. Birmingham AT, Wilson AB (1963). Preganglionic and postganglionic stimulation of the
guinea pig isolated vas deferens preparation. Br. J. Pharmacol. 21: 569-580.
15. Bourgault S, Vaudry D, Botia B, Couvineau A, Laburthe M, Vaudry H, Fournier A
(2008).Novel stable PACAP analogs with potent activity towards the PAC1 receptor.
Peptides 29: 919-32.
16. Brazeau P (1986). Somatostatin: a peptide with unexpected physiologic activities. Am. J.
Med. 81: 8-13.
17. Brubel R, Boronkai A, Reglődi D, Racz B, Nemeth J, Kiss P, Lubics A, Toth G, Horvath
G, Varga T, Szogyi D, Fonagy E, Farkas J, Barakonyi A, Bellyei S, Szereday L, Koppan
M, Tamas A (2010). Changes in the expression of pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide in the human placenta during pregnancy and its effects on survival of JAR
choriocarcinoma cells. J. Mol. Neurosci. 42: 450-8.
18. Burger K (1999). A mennyiségi analízis alapjai: Kémiai és műszeres elemzés.
Semmelweis Kiadó, Budapest
19. Burger K, Gimpl G, Fahrenholz F (2000). Regulation of receptor function by cholesterol.
Cell. Mol. Life Sci. 11: 1577-92.
20. Cain CK, Francis JM, Plone MA, Emerich DF, Lindner MD (1997). Pain-related
disability and effects of chronic morphine in the adjuvant-induced arthritis model of
chronic pain. Physiol. Behav. 62: 199-205.
21. Campos ML, Casalino-Matsuda SM, Linares JA, Goldraij A (2000). Effects of morphine
and naloxone on glucose metabolism in uterine strips from ovariectomized and non-
ovariectomized restricted diet rats. Arch. Physiol. Biochem. 108: 422–428.
22. Cao T, Gerard NP, Brain SD (1999). Use of NK1 knockout mice to analyze substance P-
induced edema formation. Am. J.Physiol. 277: 476-481.
23. Cao T, Pintér E, Al-Rashed S, Gerard NP, Hoult R, Brain S (2000). Neurokinin-1 receptor
agonists are involved in mediating neutrophil accumulation in the inflamed, but not
normal, cutaneous microvasculature: an in vivo study using neurokinin-1 receptor
knockout mice. J. Immunol. 164: 5424-5429.
24. Cardell LO, Stjärne P, Wagstaff SJ, Agustí C, Nadel JA (1997). PACAP-induced plasma
extravasation in rat skin. Regul Pept. 71:67-71.
75
25. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D (1997). The
capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389: 816-824.
26. Chen YD, Zhou ZG, Wang Z, Gao HK, Yan WW, Wang C, Zhao GP, Peng XH.. (2005).
Pituitary adenylate cyclase activating peptide and its receptor antagonist in development
of acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology 11: 538–544.
27. Chrubasik J (1991). Somatostatin and chronic pain management. In: Contemporary issues
in chronic pain management (ed: Parris WCV), pp. 87-96.
28. Chuang HH, Prescott ED, Kong H, Shields S, Jordt SE, Basbaum AI, Chao MV, Julius D
(2001). Bradykinin and nerve growth factor release the capsaicin receptor from
PtdIns(4,5)P2-mediated inhibition. Nature 411: 957-962.
29. Coburn RF, Tomita T (1973) Evidence for nonadrenergic inhibitory nerves in the guinea
pig trachealis muscle. Am. J. Physiol. 224: 1072–7080.
30. De Swert KO, Joos GF (2006). Extending the understanding of sensory neuropeptides.
Eur. J. Pharmacol. 533: 171-181.
31. Debreczeni L, Kovács LG (2008). Gyakorlati laboratóriumi medicina. Literatura Medica
Kiadó, Budapest
32. Delgado M (2009). Generating tolerogenic dendritic cells with neuropeptides. Hum.
Immunol. 70: 300-307.
33. Dickinson T, Fleetwood-Walker SM (1999). VIP and PACAP: very important in pain?
Trends Pharmacol. Sci. 20: 324-329.
34. Dickinson T, Mitchell R, Robberecht P, Fleetwood-Walker SM (1999). The role of
VIP/PACAP receptor subtypes in spinal somatosensory processing in rats with an
experimental peripheral mononeuropathy. Neuropharmacology 38: 167-180.
35. Donnerer J, Amann R, Lembeck F (1991). Neurogenic and non-neurogenic inflammation
in the rat paw following chemical sympathectomy. Neuroscience 45: 761–765.
36. Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996). Pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide-immunoreactivity in human spinal cord and dorsal root ganglia. Brain Res.
721: 233–237.
37. Edvinsson L, Fredholm BB, Hamel E, Jansen I, Verrecchia C (1985). Perivascular
peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine
monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the
cat. Neurosci. Lett. 58: 213-217.
76
38. Fahrenkrug J, Hannibal J (1998). Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
immunoreactivity in capsaicin-sensitive nerve fibres supplying the rat urinary tract.
Neuroscience 83: 1261-1272.
39. Fichna J, Janecka A, Costentin J, Do Rego JC (2007). The endomorpin system and its
evolving neurophysiological role. Pharmacol. Rev. 59: 88-123.
40. Fioravanti A, Govoni M, La Montagna G, Perpignano G, Tirri G, Trotta F, Bogliolo A,
Ciocci A, Mauceri MT, Marcolongo R (1995). Somatostatin 14 and joint inflammation:
evidence for intraarticular efficacy of prolonged administration in rheumatoid arthritis.
Drugs Exp. Clin. Res. 21: 97-103.
41. Fischer A, Undem BJ (1999). Naloxone blocks endomorphin-1 but not endomorphin-2
induced inhibition of tachykinergic contractions of guinea-pig isolated bronchus. Br. J.
Pharmacol. 127: 605-608.
42. Foda HD, Sharaf HH, Absood A, Said SI (1995). Pituitary adenylate cyclase-activating
peptide (PACAP), a VIP-like peptide, has prolonged airway smooth muscle relaxant
activity. Peptides 16: 1057-1061.
43. Frossard N, Advenier C (1991). Tachykinin receptors and the airways. Life Sci. 49: 1941-
1953.
44. Gabor M (2003). Models of acute inflammation in the ear. Methods Mol. Biol. 225: 129–
137.
45. Ganea D, Delgado M. (2002). Vasoactive intestinal peptide (VIP) and pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide (PACAP) as modulators of both innate and adaptive
immunity. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 13: 229-237.
46. Gottschall PE, Tatsuno I, Miyata A, Arimura A (1990). Characterization and distribution
of binding sites for the hypothalamic peptide, pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide. Endocrinology 127: 272-277.
47. Grant A (2002). Leukocytes and neurogenic inflammation. Inflammopharmacology 9:
403-420.
48. Green KA, Streuli CH (2004). Apoptosis regulation in the mammary gland. Cell Mol Life
Sci. 61: 1867-1883.
49. Grosvernor CE, Picciano MF, Baumrucker CR (1992). Hormones and growth factors in
milk. Endocr. Rev. 14: 710-728.
50. Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB (2002). The diversity in the vanilloid
(TRPV) receptor family of ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 23: 183-191.
77
51. Hamelink C, Tjurmina O, Damadzic R, Young WS, Weihe E, Lee HW, Eiden LE (2002).
Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is a sympathoadrenal neurotransmitter
involved in catecholamine regulation and glucohomeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
99: 461-466.
52. Han SP, Naes L, Westfall TC (1990). Calcitonin gene-related peptide is the endogenous
mediator of nonadrenergic-noncholinergic vasodilation in rat mesentery. J. Pharm. Exp.
Ther. 255: 423-428.
53. Hannibal J, Ekblad E, Mulder H, Sundler F, Fahrenkrug J (1998). Pituitary adenylate
cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the gastrointestinal tract of the rat: distribution
and effects of capsaicin or denervation. Cell Tissue Res. 291: 65–79.
54. Harmar AJ, Arimura A, Gozes I, Journot L, Laburthe M, Pisegna JR, Rawlings SR,
Robberecht P, Said SI, Sreedharan SP, Wank SA, Waschek JA (1998). International
Union of Pharmacology. XVIII. Nomenclature of receptors for vasoactive intestinal
peptide and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Pharmacol. Rev. 50: 265–
270.
55. Hayes P, Meadows HJ, Gunthorpe MH, Harries MH, Duckworth DM, Cairns W, Harrison
DC, Clarke CE, Ellington K, Prinjha RK, Barton AJ, Medhurst AD, Smith GD, Topp S,
Murdock P, Sanger GJ, Terrett J, Jenkins O, Benham CD, Randall AD, Gloger IS, Davis
JB (2000). Cloning and functional expression of a human orthologue of rat vanilloid
receptor-1. Pain 88: 205-215.
56. Hazal-Bayer MF, Hancock JF (2007). Lipid rafts and membrane traffic. FEBS Lett. 11:
2098-104.
57. Helyes Zs, Németh J, Pintér E, Szolcsányi J (1997). Inhibition by nociceptin of
neurogenic inflammation and the release of SP and CGRP from sensory nerve terminals.
Br. J. Pharmacol. 121: 613-615.
58. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Thán M, Oroszi G, Horváth A, Szolcsányi J
(2001). Anti-inflammatory effect of synthetic somatostatin analogues in the rat. Br. J.
Pharmacol. 134: 1571-1579.
59. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Sándor K, Elekes K, Szabó Á, Pozsgai G, Keszthelyi D,
Kereskai L, Engström M, Würster S, Szolcsányi J (2006). Effects of the somatostatin
receptor subtype 4 selective agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and
inflammatory reactions in rodents. Br. J. Pharmacol. 149: 405-415.
78
60. Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J (2003). Pharmacological targets for the
inhibition of neurogenic inflammation. Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents in
Curr. Med. Chem. 2: 191-218.
61. Helyes Zs, Pintér E, Szolcsányi J (2009). Regulatory role of sensory neuropeptides in
inflammation. In: Neuropeptides and peptide analogs (eds.: Kovács M, Merchenthaler I),
pp. 111-141., Research Signpost, Kerala India.
62. Helyes Zs, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, Márk L, Pintér E, Tóth G, Elekes
K, Szolcsányi J, Reglődi D (2007). Inhibitory effect of PACAP38 on acute neurogenic
and non-neurogenic inflammation in the rat. Peptides 28 1847-1855.
63. Helyes Zs, Szabó Á, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi Á, Kereskai L, Kéri Gy,
Szolcsányi J (2004). Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released
from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic
arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50: 1677-1685.
64. Helyes Zs, Thán M, Oroszi G, Pintér E, Németh J, Kéri Gy, Szolcsányi J (2000). Anti-
nociceptive effect induced by somatostatin released from sensory nerve terminals and by
synthetic somatostatin analogues in the rat. Neurosci. Lett. 278: 185-188.
65. Hofland LJ, Lamberts SW (1996). Somatostatin receptors and disease: role of receptor
subtypes. Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 10: 163-176.
66. Holzer P (1988). Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve endings:
involvement of tachykinins and other neuropeptides. Neuroscience 86: 389-98.
67. Holzer P (1991). Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin
sensory neurons. Pharmacol. Rev. 43: 143-201.
68. Horváth G (2000). Endomorphin-1 and endomorphin-2: pharmacology of the selective
endogenous mu-opioid receptor agonists. Pharmacol. Ther. 88: 437-463.
69. Hoyer D, Bell GI, Berelowitz M, Epelbaum J, Feniuk W, Humphrey PP, O'Carroll AM,
Patel YC, Schonbrunn A, Taylor JE (1995). Classification and nomenclature of
somatostatin receptors. Trends Pharmacol. Sci. 16: 86-88.
70. Hőgyes A (1878). Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandteile des Capsicum
annuum. Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 9: 117-130.
71. Huang SK, Pan JT (1996). Stimulatory effects of vasoactive intestinal peptide and
pituitary adenylate cyclase activating peptide on tuberonfundibular dopaminergic neuron
activity in estrogen treated ovariectomiyed rats and their correlation with prolactin
secretion. Neuroendocrinology 64: 208-214.
79
72. Hughes SR, Brain SD (1994). Nitric oxide-dependent release of vasodilator quantities of
calcitonin gene-related peptide from capsaicin-sensitive nerves in rabbit skin. Br. J.
Pharmacol. 111: 425-430.
73. Ichinose M, Asai M, Imai K, Sawada M (1995). Enhancement of phagocytosis in mouse
macrophages by pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and related
peptides. Immunopharmacology 30: 217–224.
74. Inoue H, Asaka T, Nagata N, Koshihara Y (1997). Mechanism of mustard oil-induced
skin inflammation in mice. Eur. J. Pharmacol. 333: 231-240.
75. Isaac ER, Sherwood NM (2008). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
(PACAP) is important for embryo implantation in mice. Mol. Cell. Endocrinol. 280: 13-9.
76. Jakab B, Reglődi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Oroszi G,
Szilvássy Z, Szolcsányi J, Németh J (2004). Distribution of PACAP-38 in the central
nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem
Biophys Methods. 61:189-98.
77. Jancsó N (1960). Role of nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions.
Bull. Millard Fillmore Hosp. Buffalo N.Y. 7: 53-77.
78. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J (1967). Direct evidence for neurogenic
inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br. J.
Pharmacol. Chemother. 31: 138-151.
79. Jessell TM, Iversen LL, Cuello AC (1978). Capsaicin-induced depletion of substance P
from primary sensory neurones. Brain Res. 152: 183-188.
80. Jessop DS (2006). Endomorphins as agents for the treatment of chronic inflammatory
disease. BioDrugs 20: 161-166.
81. Jessop DS, Richards LJ, Harbuz MS (2002). Opioid peptides endomorphin-1 and
endomorphin-2 in the immune system in humans and in a rodent model of inflammation.
Ann. NY Acad. Sci. 966: 456-463.
82. Jin S, Lei L, Wang Y, Da D, Zhao Z (1999). Endomorphin-1 reduces carrageenan-induced
fos expression in the rat spinal dorsal horn. Neuropeptides 33: 281-284.
83. Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Hogestatt ED, Meng
ID, Julius D (2004). Mustard oil and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the
TRP channel ANKTM1. Nature 427: 260-265.
84. Ju G, Hökfelt T, Brodin E, Fahrenkrug J, Fischer JA, Frey P, Elde FP, Brown JC (1987).
Primary sensory neurons of the rat showing calcitonin gene-related peptide
immunoreactivity and their relation to substance P-, somatostatin-, galanin-, vasoactive
80
intestinal polypeptide- and cholecystokinin-immunoreactive ganglion cells. Cell Tissue
Res. 247: 417–431.
85. Karalis K, Mastokaros G, Chrousos GP, Tolis G (1994). Somatostatin analogues suppress
the inflammatory reaction in vivo. J. Clin. Invest. 93: 2000-6.
86. Kato H, Ito A, Kawanokuchi J, Jin S, Mizuno T, Ojika K, Ueda R, Suzumura A (2004).
Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) ameliorates experimental
autoimmune encephalomyelitis by suppressing the functions of antigen presenting cells.
Mult. Scler. 10: 651-659.
87. Khalil Z, Sanderson K, Modig M, Nyberg F (1999). Modulation of peripheral
inflammation by locally administered endomorphin-1. Inflamm. Res. 48: 550-556.
88. Khawaja AM, Liu Y, Rogers DF (1999). Effect of non-peptide tachykinin NK(1) receptor
antagonists on non-adrenergic, non-cholinergic neurogenic mucus secretion in ferret
trachea. Eur J Pharmacol. 384:173-81.
89. Kiss P, Hauser D, Tamás A, Horváth Z, Lengvári I, Reglődi D (2007). Effects of perinatal
PACAP and PACAP antagonist treatment on novelty-seeking behavior in adolescent rats.
Journal of Molecular Neuroscience 33: 340.
90. Kobayashi T, Takahashi M, Nagatsuka Y, Hirabayashi Y (2006). Lipid Rafts: New tools
and a new component. Biol. Pharm. Bull. 29: 1526-1531.
91. Koldovsky O (1996). The potential physiological significance of milk-borne hormonally
active substances for the neonate. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 1: 317-323.
92. Krantic S, Goddard I, Saveanu A, Giannetti N, Fombonne J, Cardoso A, Jaquet P,
Enjalbert A. (2004). Novel modalities of somatostatin actions. Eur. J. Endocrinol. 151:
643-655.
93. Laburthe M, Couvineau A, Tan V (2007). Class II G-protein-coupled receptors for VIP
and PACAP: structure, models of activation and pharmacology. Peptides 28: 1631-1639.
94. Lam HC, Takahashi K, Ghatei MA, Kanze SM, Polak JM, Bloom SR (1990). Binding
sites of a novel neuropeptide pituitary-adenylate-cyclase-activating polypeptide in the rat
brain and lung. Eur. J. Biochem. 193: 725–729.
95. Lee J, Park HJ, Choi HS, Kwon HB, Arimura A, Lee BJ, Choi WS, Chun SY (1999).
Gonadotropin stimulation of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)
messenger ribonucleic acid in the rat ovary and the role of PACAP as a follicle survival
factor. Endocrinology 140: 818-26.
81
96. Lembeck F, Donnerer J, Barthó L (1982). Inhibition of neurogenic vasodilation and
plasma extravasation by substance P antagonists, somatostatin and [D-Met2, Pro5]-
enkephalinamide. Eur. J. Pharmacol. 85: 171-176.
97. Lembeck F, Holzer P (1979). Substance P as neurogenic mediator of antidromic
vasodilation and neurogenic plasma extravasation. Naunyn Schmiedebergs Arch.
Pharmacol. 310: 175-183.
98. Levy G, Goldberg D, Jackson K, Degani G. (2010.) Association between pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide and reproduction in the blue gourami. Gen.
Comp. Endocrinol. 166: 83-93.
99. Lippl F, Schusdziarra V, Allescher HD (2001). Effect of endomorphin on somatostatin
secretion in the isolated perfused rat stomach. Neuropeptides 35: 303-309.
100. Liu M, Huang W, Wu D, Priestley JV (2006). TRPV1, but not P2X3, requires cholesterol
for its function and membrane expression in rat nociceptors. Eur. J. of Neurosci. 24: 1-6.
101. Lockwich TP, Liu X, Singh BB, Jadlowiec J, Weiland S, Ambudkar IS, (2000). Assembly
of TRP1 in a signaling complex associated with caveolin scaffolding lipid raft domains. J.
Biol. Chem. 275: 11934-11942.
102. Machelska H, Mousa SA, Brack A, Schopohl JK, Rittner HL, Schafer M, Stein C (2002).
Opioid control of inflammatory pain regulated by intracellular adhesion molecule-1. J.
Neurosci. 22: 5588-5596.
103. Maggi CA (1995). Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-
transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog. Neurobiol. 45: 1-
98.
104. Maggi CA, Meli A (1988). The sensory-efferent function of capsaicin-sensitive sensory
neurons. Gen. Pharmacol. 19: 1-43.
105. Martin-Schild S, Zadina JE, Gerall AA, Vigh S, Kastin AJ (1997). Localization of
endomorphin-2-like immunoreactivity in the rat medulla and spinal cord. Peptides 18:
1641-1649.
106. Massi M, Panocka I, de Garo G (2000). The psychopharmacology of tachykinin NK-3
receptors in laboratory animals. Peptides 21: 1597-1609.
107. May V, Beaudet MM, Parsons RL, Braas KM (2000). PACAP modulates rat sympathetic
neuron depolarization through IP3. Ann.N.Y. Acad. Sci. 921: 186-194.
108. McDougall JJ, Baker CL, Hermann PM (2004). Attenuation of knee joint inflammation by
peripherally administered endomorphin-1. J. Mol. Neurosci. 22: 125-137.
82
109. McDougall JJ, Barin AK, McDougall CM (2004). Loss of vasomotor responsiveness to
the mu-opioid receptor ligand endomorphin-1 in adjuvant monoarthritic rat knee joints.
Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 286:R634-41.
110. McIntyre P, McLatchie LM, Chambers A, Phillips E, Clarke M, Savidge J, Toms C,
Peacock M, Shah K, Winter J, Weerasakera N, Webb M, Rang HP, Bevan S, James IF
(2001). Pharmacological differences between the human and rat vanilloid receptor 1
(VR1). Br. J. Pharmacol. 132: 1084-1094.
111. McLatchie LM, Fraser NJ, Main MJ, Wise A, Brown J, Thompson N, Solari R, Lee MG,
Foord SM (1998). RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-
receptor-like receptor. Nature 393: 333-339.
112. Mikkelsen JD, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen PJ, Olcese J, McArdle C (1995).
Pituitary adenylate cyclase-activating peptide-38 (PACAP-38), PACAP-27, and PACAP
related peptide (PRP) in the rat median eminence and pituitary. J. Neuroendocrin. 7: 47–
55.
113. Mishra S, Joshi PG (2007). Lipid raft heterogeneity: an enigma. J. Neurochem. 103: 135-
142.
114. Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minamino N, Uehara A, Jiang L, Culler MD, Coy DH
(1989). Isolation of a novel 38 residue-hypothalamic polypeptide which stimulates
adenylate cyclase in pituitary cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 567-574.
115. Moller K, Zhang YZ, Hakanson R, Luts A, Sjölund B, Uddman R, Sundler F (1993).
Pituitary adenylate cyclase-activating peptide is a sensory neuropeptide:
Immunocytochemical and immunochemical evidence. Neuroscience 57: 725–732.
116. Monaghan TK, MacKenzie CJ, Plevin R, Lutz EM (2008). PACAP-38 induces neuronal
differentiation of human SH-SY5Y neuroblastoma cells via cAMP-mediated activation of
ERK and p38 MAP kinases. J. of Neurochemistry 104: 74–88.
117. Mousa SA, Machelska H, Schafer M, Stein C (2002). Immunohistochemical localization
of endomorphin-1 and endomorphin-2 in immune cells and spinal cord in a model of
inflammatory pain. J. Neuroimmunol. 126: 5-15.
118. Mulder H, Uddman R, Moller K, Zhang YZ, Ekblad E, Alumets J, Sundler F (1994).
Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide expression in sensory neurons.
Neuroscience 63: 307–312.
119. Murck H, Steiger A, Frieboes RM, Antonijevic IA (2007). Pituitary adenylate cyclase
activating peptide affects homeostatic sleep regulation in healthy young men. Am. J.
Physiol. Encorinol. Metab. 292: E853-857.
83
120. Nagakura Y, Okada M, Kohara A, Kiso K, Toya T, Iwai A, Wanibuchi F, Yamaguchi T
(2003). Allodynia and hyperalgesia in adjuvant-induced arthritic rats: time course of
progression and efficacy of analgesics. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306: 490-497.
121. Németh J, Görcs T, Helyes Zs, Oroszi G, Kocsy T, Pintér E, Szolcsányi J (1998).
Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological
research. Neurobiology (Bp) 6:473-475.
122. Németh J, Helyes Zs, Görcs T, Gardi J, Pintér E, Szolcsányi J (1996). Development of
somatostatin radioimmunoassay for the measurement of plasma and tissue contents of
hormone. Acta Physil. Hung. 84: 313-315.
123. Németh J, Helyes Zs, Oroszi G, Jakab B, Pintér E, Szilvássy Z, Szolcsányi J (2003). Role
of voltage-gated cation channels and axon reflexes in the release of sensory neuropeptides
by capsaicin from isolated rat trachea. Eur. J. Pharmacol. 458: 313-318.
124. Németh J, Oroszi G, Jakab B, Magyarlaki M, Szilvássy Z, Röth E, Farkas B (2002). 125I–
labelling and purification of peptide hormones and bovine serum albumin. J. of
Radioanal. and Nuclear Chem. 251: 29-133.
125. Németh J, Oroszi G, Thán M, Helyes Zs, Pintér E, Farkas B, Szolcsányi J (1999).
Subtance P radioimmunoassay for quantitative charaterisation of sensory neurotransmitter
release. Neurobiology 7: 437-444.
126. Németh J, Reglődi D, Pozsgai G, Szabó Á, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs
(2006). Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory
neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience 143:
223-230.
127. Njuki F, Nicholl CG, Howard A, Mak JC, Barnes PJ, Girgis SI, Legon S (1993). A new
calcitonin-receptor-like sequence in rat pulmonary blood vessels. Clin. Sci. (Lond.) 85:
385-388.
128. Odum L, Petersen LJ, Skov PS, Ebskov LB (1998). Pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide (PACAP) is localized in human dermal neurons and causes histamine release
from skin mast cells. Inflamm. Res. 47: 488–492.
129. Oh U, Hwang SW, Kim D (1996). Capsaicin activates a nonselective cation channel in
cultured neonatal rat dorsal root ganglion neurons. J. Neurosci. 16: 1659-1667.
130. Parsons JA, Erlandsen SL, Hegre OD, McEvoy RC, Elde RP (1976). Central and
peripheral localization of somatostatin. Immonuemzyme immunocytochemical studies. J.
Histochem. Cytochem. 24: 872-882.
84
131. Parsons RL, Rossignol TM, Calupca MA, Hardwick JC, Brass KM (2000). PACAP
peptides modulate guinea pig cardiac neuron membrane excitability and neuropeptide
expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 921: 202-210.
132. Patacchini R, Maggi CA (2001). Peripheral tachykinin receptors as targets for new drugs.
Eur. J. Pharmacol. 429: 13-21.
133. Patel YC (1999). Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol. 20: 157-
198.
134. Pintér E, Helyes Zs, Németh J, Pórszász R, Pethő G, Thán M, Kéri Gy, Horváth A, Jakab
B, Szolcsányi J (2002). Pharmacological characterisation of the somatostatin analogue
TT-232: effects on neurogenic and non-neurogenic inflammation and neuropathic
hyperalgesia. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 366: 142-150.
135. Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J (2006). Inhibitory effect of somatostatin on
inflammation and nociception. Pharmacol. Ther. 112: 440-456.
136. Pol O, Puig MM (2004). Expression of opioid receptors during peripheral inflammation.
Curr. Top. Med. Chem. 4: 51-61.
137. Poyner DR, Sexton PM, Marshall I, Smith DM, Quirion R, Born W, Muff R, Fischer JA,
Foord SM (2002). International Union of Pharmacology. XXXII. The mammalian
calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin, and calcitonin receptors.
Pharmacol. Rev. 54: 233-246.
138. Przewlocki R, Przewlocka B (2001). Opioids in chronic pain. Eur. J. Pharmacol. 429: 79-
91.
139. Puehler W, Zöllner C, Brack A, Shaqura MA, Krause H, Schafer M, Stein C (2004). rapid
upregulation of opioid receptor mRNA in dorsal root ganglia in response to peripheral
inflammation depends on neuronalé conduction. Neuroscience 129: 473-479.
140. Rácz B, Gallyas Jr F, Kiss P, Tóth G, Hegyi O, Gasz B, Borsiczky B, Ferencz A, Rőth E,
Tamás A, Lengvári I, Lubics A, Reglődi D (2006). The neuroprotective effects of PACAP
in monosodium glutamate-induced retinal lesion involves inhibition of proapoptotic
signaling pathways. Regul. Pept. 137: 20–26.
141. Raynor K, Reisine T (1992). Somatostatin receptors. Crit. Rev. Neurobiol. 6: 273-289.
142. Regoli D, Boudon A, Fauchere JL (1994). Receptors and antagonists for substance P and
related peptides. Pharmacol. Rev. 46: 551-599.
143. Reichlin S (1983). Somatostatin. N. Engl. J. Med. 309: 1495-1501.
144. Reubi JC, Laissue JA, Waser B, Steffen DL, Hipkin W, Schonbrunn A (1999).
Immunohistochemical detection of somatostatin sst2a receptors in the lymphatic, smooth
85
muscular, and peripheral nervous systems of the human gastrointestinal tract: facts and
artifacts. J. Clin. Endocrin. Metabol. 84: 2942-2950.
145. Samuel BU, Mohandas N, Harrison T, McManus H, Rosse W, Reid M, Haldar K (2001).
The role of cholesterol and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins of erythrocyte
rafts in regulating raft protein content and malarial infection. J Biol Chem. 276:29319-29.
146. Segre GV, Goldring SR (1993). Receptors for secretin, calcitonin, parathyroid hormone
(PTH)/PTH-related peptide, glucagon-like peptide 1, growth hormone releasing hormone,
and glucagon belong to a newly discovered G-protein-linked receptor family. Trends
Endocrinol. Metab. 4: 309–314.
147. Shaqura MA, Zöllner C, Mousa SA, Stein C, Schafer M (2004). Characterization of
opioid receptor binding and G protein coupling in rat hypothalamus, spinal cord, and
primary afferent neurons during inflammatory pain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308: 712-
718.
148. Sherwood NM, Krueckl SL, McRory JE (2000). The origin and function of the Pituitary
Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP)/glukagon superfamily. Endocr. Rev.
21: 619-670.
149. Shigyo M, Aizawa H, Inoue H, Matsumoto K, Takata S, Hara N (1998). Pituitary
adenylate cyclase activating peptide regulates neurally mediated airway responses. Eur.
Respir. J. 12: 64-70.
150. Shigyo M, Aizawa H, Inoue H, Matsumoto K, Takata S, Hara N (1998). Pituitary
adenylate cyclase activating peptide regulates neurally mediated airway responses. Eur
Respir J. 12:64-70.
151. Shioda S, Legradi G, Leung WC, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1994). Localization of
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its messenger ribonucleic acid in
the rat testis by light and electron microscopic immunocytochemistry and in situ
hybridization. Endocrinology. 135:818-25.
152. Shioda S, Nakai Y, Nakajo S, Nakaya K, Arimura A (1996). Localization of pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide and its type I receptors in the rat ovary:
Immunohistochemistry and in situ hybridization. Ann. N.Y. Acad. Sci. 805: 677–683.
153. Simons K, Ikonen E (1997). Functional Raft in cell membranes. Nature 387: 569-72.
154. Singer SJ, Nicolson GL. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell
membranes. Science. 175:720-31.
155. Somogyvári-Vigh A, Reglődi D (2004). Pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide: a potential neuroprotective peptide. Rev. Curr. Pharm. Des. 10: 2861-89.
86
156. Spencer F, Chi L, Zhu M (2001). Temporal relationships among uterine pituitary
adenylate cyclase activating polypeptide, decidual prolactin-related protein and
progesterone receptor mRNAs expressions during decidualization and gestation in rats.
Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 129: 25-34.
157. Steenstrup BR, Jorgensen JC, Alm P, Hannibal J, Junge J, Fahrenkrug J, Ottesen B
(1996). Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP): occurrence and
vasodilatory effect in the human uteroplacental unit. Regul. Pept. 61: 197-204.
158. Stein C, Hassan AHS, Przewlocki R., Gramsch C., Peter K., Herz A (1990). Opioids from
immunocytes interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in
inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 5935-5939.
159. Stein C, Machelska H, Binder W, Schafer M (2001). Peripheral opioid analgesia. Curr.
Opin. Pharmacol. 1: 62-65.
160. Stein C, Yassouridis A (1997). Peripheral morphine analgesia. Pain 71: 119–121.
161. Steinhoff M, McGregor GP, Radleff-Schlimme A, Steinhoff A, Jarry H, Schmidt WE
(1999). Identification of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and
PACAP type 1 receptor in human skin: expression of PACAP-38 is increased in patients
with psoriasis. Regul. Pept. 80: 49-55.
162. Suda K, Smith DM, Ghatei MA, Bloom SR (1992). Investigation of the interaction of VIP
binding sites with VIP and PACAP in human brain. Neurosci. Lett. 137: 19–23.
163. Szállási Á, Blumberg PM (1999). Vanilloid (Capsaicin) receptors and mechanisms.
Pharmacol. Rev. 51: 159-212.
164. Szolcsányi J (1977). A pharmacological approach to elucidation of the role of different
nerve fibres and receptor endings in mediation of pain. J. Physiol. (Paris) 73: 251-259.
165. Szolcsányi J (1984a). Capsaicin and neurogenic inflammation: history and early findings.
In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi
J, Lembeck F), pp. 7-26, Akadémiai Kiadó, Budapest.
166. Szolcsányi J (1984b). Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-
efferent function. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds:
Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp. 27-53, Akadémiai Kiadó, Budapest.
167. Szolcsányi J (1988). Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents
Actions 23: 4-11.
168. Szolcsányi J (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In: Capsaicin in the study
of pain (ed: Wood JN), pp. 1-26, Academic Press, London.
87
169. Szolcsányi J (1996). Neurogenic inflammation: reevaluation of axon reflex theory. In:
Neurogenic Inflammation (eds: Geppetti P, Holzer P), pp. 33-42.
170. Szolcsányi J (2004). Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and
physiology. Neuropeptides 38: 377-384.
171. Szolcsányi J, Barthó L (1982). Capsaicin-sensitive non-cholinergic excitatory innervation
of the guinea-pig tracheobronchial smooth muscle. Neurosci. Lett. 34: 247-251.
172. Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E (1998). Release of somatostatin
and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic
stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br. J. Pharmacol. 123: 936-942.
173. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A (1975). Sensory effects of capsaicin congeners I.
Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents.
Arzneimittelforschung 25: 1877-1881.
174. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A (1976). Sensory effects of capsaicin congeners II:
Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin-type
compounds. Arzneimittelforschung 26: 33-37.
175. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs (2004). Sensocrine function of capsaicin-sensitive
nociceptors mediated by somatostatin regulates against inflammation and hyperalgesia.
In: Hyperalgesia: molecular mechanisms and clinical implications (eds: Handwerker HO,
Brune K), pp.113-128, IASP Press, Seattle.
176. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J (1998b). Systemic anti-
inflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin
from nociceptors. Br. J.Pharmacol. 125: 916-922.
177. Tatsuno I, Gottschall PE, Köves K, Arimura A (1990). Demonstration of specific binding
sites for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in rat astrocytes.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1027–1033.
178. ten Bokum AM, Hofland LJ, van Hagen PM (2000). Somatostatin and somatostatin
receptors in the immune system: a review. Eur. Cytokine Netw. 11: 161-176.
179. Thán M, Németh J, Szilvássy Z, Pintér E, Helyes Zs, Szolcsányi J (2000). Systemic anti-
inflammatory effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive vagal and sciatic
sensory fibres of the rat and guinea-pig. Eur. J. Pharmacol. 399: 251-258.
180. Tohei A, Ikeda M, Hokao R, Shinoda M (2009). The different effects of i.c.v. injection of
pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on prolactin secretion in adult
male and lactating rats. Exp. Anim. 58: 489-495.
88
181. Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann
BE, Basbaum AI, Julius D (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-
producing stimuli. Neuron 21: 531-543.
182. Tornoe K, Hannibal J, Georg B, Schmidt PT, Hilsted L, Fahrenkrug J, Holst JJ (2001).
PACAP 1-38 as neurotransmitter in the porcine antrum. Regul. Pept. 101: 109-121.
183. Tsui-Pierchalla, Enchinas M, Milbrandt J, Johnson E M (2002). Lipid raft in neuronal
signaling and function. Trends Neurosci. 25: 412-7.
184. Uddman R, Grunditz T, Kato J, Sundler F (1998). Distribution and origin of nerve fibers
in the rat temporomandibular joint capsule. Anat. Embryol. 197: 273-282.
185. van Rossum D, Hanisch U, Quirion R (1997). Neuroanatomical localization,
pharmacological characterization and functions of CGRP, related peptides and their
receptors. Neurosci. Biobehav. Rev. 21: 649-678.
186. Vaudry D, Falluel-Morel A, Bourgault S, Basille M, Burel D, Wurtz O, Fournier A, Chow
BKC, Hashimoto H, Galas L, Vaudry H (2009). Pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide and its receptors: 20 years after the discovery. Pharmacol. Rev. 61: 283-357.
187. Vaudry D, Gonzalez BJ, Basille M, Yon L, Fournier A, Vaudry H. (2000). Pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions.
Pharmacol. Rev. 52: 269-324.
188. Vaudry D, Pamantung TF, Basille M, Rouselle C, Fournier A, Vaudry H, Beauvillain JC,
Gonzalez BJ (2002). PACAP protects cerebellar granule neurons against oxidative stress-
induced apoptosis. Eur. J. Neurosci. 15: 1451-1460.
189. Vécsei L, Widerlöv E (1988). Brain and CSF somatostatin concentrations in patients with
psychiatric or neurological illness. An overview. Acta Psychiatr. Scand. 78: 657-667.
190. Vígh S, Arimura A, Gottschall PE, Kitada C, Somogyvári-Vígh A, Childs GV (1993).
Cytochemical characterization of anterior pituitary target cells for the neuropeptide,
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP), using biotinylated ligands.
Peptides 14: 59–65.
191. Wang ZY, Waldeck K, Grundemar L, Hakanson R. (1997). Ocular inflammation induced
by electroconvulsive treatment: contribution of nitric oxide and neuropeptides mobilized
from C-fibres. Br. J. Pharmacol. 120: 1491-1496.
192. Warren JB, Wilson AJ, Loi RK, Coughlan ML (1993). Opposing roles of cyclic AMP in
the vascular control of edema formation. FASEB J. 7: 1394-1400.
89
193. Wray V, Kokoschke C, Nokihara K, Naruse S (1993). Solution structure of pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide by nuclear magnetic resonance spectroscopy.
Biochemistry 32: 5832–5841.
194. Wu FY, Tsao PH, Wang DC, Lin S, Wu JS, Cheng YK (2005). Factors affecting growth
factor activity in goat milk. J. Dairy. Sci. 89: 1951-1955.
195. Zadina JE (2002). Isolation and distribution of endomorphins in the central nervous
system. Jpn J Pharmacol. 89:203-8.
196. Zadina JE, Hackler L, Lin-Jun G, Kastin AJ (1997). A potent and selective endogenous
agonist for the -opiate receptor. Nature 386: 499-502.
197. Zhang Y, Danielsen N, Sundler F, Mulder H (1998). Pituitary adenylate cyclase-activating
peptide is upregulated in sensory neurons by inflammation. Neuroreport 9: 2833-2836.
198. Zhang Y, Malmberg AB, Sjolund B, Yaksh TL (1996). The effect of pituitary adenylate
cyclase activating peptide (PACAP) on the nociceptive formalin test. Neurosci. Lett. 207:
187-190.
199. Zhang Y, Malmberg AB, Yaksh TL, Sjölund B, Sundler F, Hakanson R (1997).
Capsaicin-evoked release of pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) and
calcitonin gene-related peptide (CGRP) from rat spinal cord in vivo. Regul. Pept. 69: 83-
87.
200. Zhou CJ, Shioda S, Yada T, Inagaki N, Pleasure SJ, Kikuyama S (2002). PACAP and its
receptors exert pleiotropic effects in the nervous system by activating multiple signaling
pathways. Curr. Protein Pept. Sci. 3: 423-439.
201. Zhu Dan, Xiong Wen C, Mei L (2006). Lipid rafts serve as a signaling platform for
nicotinic acetylcholine receptor clustering. J. Neurosci. 26: 4841-51.
202. Zöllner C, Shaqura MA, Bopaiah CP, Stein C, Schafer M (2003). Painful inflammation-
induced increase of -opioid receptor binding and G-protein coupling in primary afferent
neurons. Mol. Pharmacol. 64: 202-210.
203. Nilius B (2007). TRP channels in disease. BBA-Mol. Bas. Dis. 8:805-812.
90
VIII. PUBLIKÁCIÓS LISTA:
1. Börzsei R, Pozsgai G, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs: Inhibitory action of
endomorphin-1 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice.
Neuroscience 152(1):82-88, 2008. IF: 3,556; FC: 11
2. Reglődi D, Börzsei R, Bagoly T, Boronkai A, Rácz B, Tamás A, Kiss P, Horváth G, Brubel R,
Németh J, Tóth G, Helyes Zs: Agonistic behavior of PACAP6-38 on sensory nerve terminals and
cytotrophoblast cells. J. Mol. Neurosci. 36(1-3):270-278, 2008. IF: 2,061; FC: 4
3. Börzsei R, Márk L, Tamás A, Bagoly T, Bay C, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth
G, Németh J, Szauer E, Helyes Z, Reglődi D: Presence of pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide-38 in human plasma and milk. Eur J Endocrinol. 160(4):561-565. 2009.
IF: 3,539; FC: 3
4. Reglődi D, Gyarmati J, Ertl T, Börzsei R, Bodis J, Tamás A, Kiss P, Csanaky K, Bánki E, Bay C,
Németh J, Helyes Zs: Alterations of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-like
immunoreactivity in the human plasma during pregnancy and after birth. J Endocrinol Invest.
33(7):443-445 2010. IF: 1,476; FC: 2
5. Czeglédi L, Tamás A, Börzsei R, Bagoly T, Kiss P, Horváth G, Brubel R, Németh J, Szalontai B,
Szabadfi K, Jávor A, Reglődi D, Helyes Zs: Presence of pituitary adenylate cyclase-activating
polypeptide (PACAP) in the plasma and milk of ruminant animals. Gen. Comp Endocrinol.
172(1):115-119, 2011. IF: 3,108
91
VIII.2. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBA KÖZVETLENÜL NEM ILLESZKEDŐ EGYÉB
KÖZLEMÉNYEK:
92
Reglődi D, Tamás A: Hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) kimutatása vér- és
tejmintákból várandósság, szülés és szoptatás alatt. Védőnő folyóirat (közlés alatt) 2012.
Az értekezés témájába közvetlen nem illeszkedő egyéb közlemények impakt faktora: 22,226
Ezekre kapott független citációk száma: 83
1. Helyes Zs, Bölcskei K, Szabó Á, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Almási R, Börzsei R, Szűts T,
Kéri Gy, Szolcsányi J: Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in
acute pain models of the rat and the mouse and in streptozotocin-induced diabetic hyperalgesia.
European Neuropeptide Club, 14th Annual Meeting, Alicante, Spanyolország, 2004.
2. Elekes K, Németh J, Sándor K, Börzsei R, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz, Pintér E,
Szabó Á, Szolcsányi J, Helyes Zs: Role of the TRPV1 receptor in subacute airway inflammatory
model of the mouse. European Neuropeptide Club, 15th Annual Meeting, Riga, Latvia, 2005.
Absztrakt: Neuropeptides 39(6), p.625., 2005. IF: 2,155
3. Helyes Zs, Elekes K, Németh J, Sándor K, Börzsei R, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz,
Pintér E, Szabó Á, Szolcsányi J: TRPV1 receptor-mediated release of the inhibitory neuropeptide
somatostatin in murine airway inflammatory model. Summer Neuropeptide Conference, Miami
Beach, Florida, USA, 2005. Absztrakt: Neuropeptides 40(2), p.155., 2005. IF: 2,155
4. Börzsei R, Pozsgai G, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs: Inhibitory action of
Endomorphin-1, an endogenous opioid peptide, on sensory neuropeptide release and neurogenic
inflammation in rats and mice. European Neuropeptide Club Joint Meeting, Santorini,
Görögország, 2007.
5. Elekes K, Sándor K, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szolcsányi J, Quinn JP, Helyes Zs:
Involvement of the neurokinin 1 receptor and preprotachykinin A gene-encoded peptides in
endotoxin-induced murine airway inflammation. European Opioid Conference – European
Neuropeptide Club Joint Meeting, Ferrara, Olaszország, 2008.
93
6. Börzsei R, Szőke É, Tóth DM, Bagoly T, Helyes Zs, Sándor Z, Szolcsányi J: Effect of lipid raft
disruption by methyl b-cyclodextrin on TRPV1 receptor activation in distinct experimental
system. European Opioid Conference – European Neuropeptide Club Joint Meeting, Ferrara,
Olaszország, 2008.
7. Reglődi D, Németh J, Pozsgai G, Sándor K, Börzsei R, Bagoly T, Elekes K, Pintér E, Kiss P,
Szolcsányi J, Helyes Zs: Effect of PACAP-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic
inflammation in rats and mice. 7th International Conference of Neuroimmunology, Rio de
Janeiro, Brazilia, 2008.
8. Varga A, Horváth A, Seprodi J, Vantus T, Tanai H, Börzsei R, Elekes K, Helyes Zs, Pintér E,
Szolcsányi J, Miyazaki A, Okada Y, Kéri Gy: Effect of somatostatin derived peptides and
peptidomimetics on neurogenic inflammation. European Peptide Symposium, Helsinki,
Finnország, 2008. Absztrakt: J Pept Sci. 14(8): 127-127, 2008. IF:1,654
9. Tamas A, Borzsei R, Mark L, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Banki E, Kiss P, Vaczy A, Horvath
G, Nemeth J, Czegledi L, Szauer E, Helyes Zs, Reglodi D: Presence of PACAP-38 in mammalian
plasma and milk: from guinea pig to humans Satellite Symposium of the 9th International
Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Yakushima, Japan, 2009.
10. Markovics A, Sándor K, Kemény Á, Börzsei R, Bagoly T, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Zs:
Cortistatin and somatostatin: comparing their effects on inflammation in vitro and in vivo. The 7th
Joint Meeting of the European Neuropeptide Club & Summer Neuropeptide Conference, Pécs,
Magyarország, 2010. Absztrakt: Neuropeptides 44, p. 542., 2010. IF: 1,917
11. Reglodi D, Tamas A, Czegledi L, Szalontai B, Börzsei R, Bagoly T, Csanaky K, Banki E, Kiss
P, Horvath G, Szauer E, Nemeth J, Mark L, Brubel R, Helyes Zs: Presence of pituitary adenylate
cyclase activating polypeptide in the milk of domestic animals and humans. 25th Conference of
European Comparative Endocrinologists, Pécs, Magyarország, 2010.
12. Tamás A, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bagoly T, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Bodis J, Csanaky
K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: PACAP-38 in human
plasma and milk under physiological and pathological conditions: introductory measurements for
possible future clinical diagnostic application. 9th International Symposium on VIP, PACAP and
Related Peptides, Kagoshima, Japan 2009. Absztrakt: J Mol Neurosci. 42(3):293-294, 2010.
IF: 2,922
94
VIII.4. HAZAI KONFERENCIASZEREPLÉSEK, FOLYÓIRATBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK:
1. Szabó Á, Czirják L, Helyes Zs, Pintér E, László T, Sándor K, Bite A, Börzsei R, Bánvölgyi Á,
Szolcsányi J: A kapszaicin receptor (VR1/TRPV1) szerepe krónikus gyulladásos és szkleroderma
egérmodellekben. Magyar Klinikai Farmakológusok V. Kongresszusa és MFT
Immunfarmakológiai Szekció Ülése, Debrecen, 2003.
2. Helyes Zs, Bölcskei K, Szabó Á, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Almási R, Börzsei R, Szűts T, Kéri
Gy, Szolcsányi J: A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, analgetikus hatása akut és
krónikus nociceptív modellekben patkányban. Magyar Élettani Társaság LXVIIII.
Vándorgyűlése, Debrecen, 2004.
3. Szabó Á, Czirják L, Helyes Zs, Pintér E, László T, Sándor K, Bite A, Börzsei R, Bánvölgyi Á,
Szolcsányi J: A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata génhiányos egerek segítségével krónikus
ízületi gyulladásos modellben. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Siófok, 2004.
4. Helyes Zs, Bölcskei K, Szabó Á, Pintér E, Pethő G, Elekes K, Almási R, Börzsei R, Szűts T,
Kéri Gy, Szolcsányi J: A heptapeptid szomatosztatin analóg, TT-232, anti-nociceptív hatásának
vizsgálata patkány fájdalommodellekben. Magyar Fájdalom Társaság Kongresszusa, Siófok,
2004.
5. Helyes Zs, Elekes K, Németh J, Börzsei R, Sándor K, Beck A, Kereskai L, Pintér E, Szabó Á,
Szolcsányi J: A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata szubakut légúti gyulladásos
egérmodellben. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság IV. Konferenciája,
Debrecen, 2004.
6. Elekes K, Helyes Zs, Németh J, Börzsei R, Sándor K, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz,
Pintér E, Szabó Á, Szolcsányi J: A TRPV1 receptor szerepének vizsgálata egér szubakut légúti
gyulladás modellben. Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Pécs, 2005.
7. Elekes K, Németh J, Sándor K, Börzsei R, Beck A, Kereskai L, Pozsgai G, Péter Sz, Pintér E,
Szabó Á, Szolcsányi J, Helyes Zs: TRPV1 receptor-mediated release of the inhibitory
neuropeptide somatostatin in murine airway inflammatory model. Magyar Kísérletes és Klinikai
Farmakológiai Társaság, a Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma,
Budapest, 2005.
8. Szabó Á, Helyes Zs, Jakab B, Varga A, Bölcskei K, Sándor K, Elekes K, Börzsei R, Keszthelyi
D, Pintér E, Pethő G, Németh J, Szolcsányi J: A JYL1421 (SC0030) kódjelű TRPV1 receptor
antagonista vegyület farmakológiai vizsgálata in vitro és in vivo patkányban. Magyar Fájdalom
Társaság Kongresszusa, Siófok, 2005.
95
9. Elekes K, Sándor K, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szolcsányi J, Quinn JP, Helyes Zs: A
neurokinin 1 receptor és preprotachykinin A gén által kódolt peptidek szerepe endotoxinnal
kiváltott légúti gyulladásban. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság és a Magyar
Élettani Társaság LXXII. Vándorgyűlése Debrecen, 2008. Absztrakt: Acta Physiologica
Hungarica 96(1), p.71-72., 2009. IF:0,750
10. Szőke E, Börzsei R, Tóth DM, Bagoly T, Helyes Zs, Sándor Z, Szolcsányi J: Effect of lipid raft
disruption on TRPV1 receptor activation on sensory neurones, transfected cell line and sensory
nerve endings. Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológus Társaság és a Magyar Élettani
Társaság LXXII. Vándorgyűlése Debrecen, 2008. Absztrakt: Act Physiol Hun. 96(1): 137-137,
2009. IF: 0,750
11. Helyes Zs, Elekes K, Börzsei R, Sándor K, Kereskai L, Pintér E, Szolcsányi J: A kapszaicin-
érzékeny afferensekből felszabaduló szomatosztatin szerepe légúti gyulladásmodellben. Erdélyi
Múzeum-Egyesület Orvos- és Gyógyszerésztudományi Szakosztály, XIX. Tudományos ülésszak,
Marosvásárhely, 2009.
12. Börzsei R, Mark L, Tamas A, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Banki E, Kiss P, Vaczy A, Horvath
G, Nemeth J, Szauer E, Helyes Zs, Reglodi D: Presence of pituitary adenylate cyclase activating
polypeptide in human serum and milk. Magyar Idegtudományi Társaság XII. Konferenciája,
Budapest, 2009.
13. Horváth G, Börzsei R, Márk L, Tamás A, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy
A, Németh J, Szauer E, Helyes Zs, Reglődi D: Hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid
(PACAP) kimutatása vérplazma és anyatej mintákból. Magyar Anatómus Társaság XV.
Kongresszusa Budapest, 2009.
14. Váczy A, Börzsei R, Mark L, Tamas A, Bagoly T, Bay C, Csanaky K, Banki E, Kiss P, Horvath
G, Németh J, Szauer E, Helyes Zs, Reglődi D: Presnce of pituitary adenylate cyclase activating
polypeptdite in human serum and milk. 38. Membrán-transzport konferencia Sümeg, 2009.
15. Kiss P, Csanaky K, Bánki E, Tamás A, Börzsei R, Márk L, Bagoly, T, Bay Cs, Váczy A,
Horváth G, Németh J, Czeglédi L, Szauer E, Helyes Zs, Reglődi D: Presence of PACAP-38 in
mammalian plasma and milk: From guinea pig to humans. Magyar Élettani Társaság LXXIII.
Vándorgyűlése Budapest, 2009. Absztrakt: Act Physiol Hun. 97(1): 115-115, 2010. IF: 1,226
16. Tamás A, Börzsei R, Márk L, Bagoly T, Bay Cs, Csanaky K, Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth
G, Németh J, Czeglédi L, Szauer E, Helyes Zs, Redglődi D: Presence of PACAP-38 in
mammalian plasma and milk: from guinea pig to humans Kisfaludy Lajos Alapítvány előadóülést,
Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány Budapest, 2010.
96
17. Tamás A, Brubel R, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Csanaky K,
Bánki E, Kiss P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: A PACAP
koncentrációjának mérése kismamák és újszülöttek véréből. Magyar Élettani Társaság LXXIV.
Vándorgyűlése és a Magyar Kísérleti és Klinikai Farmakológiai Társaság II. Közös tudományos
konferenciája, Szeged, 2010.
18. Tamás A, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Csanaky K, Bánki E, Kiss
P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: A PACAP koncentrációjának mérése
kismamák és újszülöttek véréből. Szoptatás Világhete (Országos nyitó rendezvény) Dombóvár,
2010.
19. Tamás A, Helyes Zs, Börzsei R, Márk L, Bay Cs, Gyarmati J, Ertl T, Csanaky K, Bánki E, Kiss
P, Váczy A, Horváth G, Németh J, Szauer E, Reglődi D: A PACAP koncentrációjának mérése
kismamák és újszülöttek véréből. „AZ ANYATEJ VILÁGNAPJA” Pécs, 2010.
97
IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
98