Neuroblastoma.

Molecular Mechanisms
And Therapeutic Interventions Swapan
K. Ray
Visit to download the full and correct content document:
https://ebookmass.com/product/neuroblastoma-molecular-mechanisms-and-therapeut
ic-interventions-swapan-k-ray/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Molecular Mechanisms of Nutritional Interventions and

Supplements for the Management of Sexual Dysfunction
and Benign Prostatic Hyperplasia Bilal Chughtai

https://ebookmass.com/product/molecular-mechanisms-of-
nutritional-interventions-and-supplements-for-the-management-of-
sexual-dysfunction-and-benign-prostatic-hyperplasia-bilal-
chughtai/

Oxide Electronics 1st Edition Asim K. Ray

https://ebookmass.com/product/oxide-electronics-1st-edition-asim-
k-ray/

Cellular and Molecular Immunology 10th Edition Abul K.

Abbas

https://ebookmass.com/product/cellular-and-molecular-
immunology-10th-edition-abul-k-abbas/

eTextbook 978-0124105300 Streptococcus Pneumoniae:

Molecular Mechanisms of Host-Pathogen Interactions

https://ebookmass.com/product/etextbook-978-0124105300-
streptococcus-pneumoniae-molecular-mechanisms-of-host-pathogen-
interactions/
Molecular Nutrition and Mitochondria: Metabolic
Deficits, Whole-Diet Interventions, and Targeted
Nutraceuticals Sergej M. Ostojic

https://ebookmass.com/product/molecular-nutrition-and-
mitochondria-metabolic-deficits-whole-diet-interventions-and-
targeted-nutraceuticals-sergej-m-ostojic/

The Molecular and Cellular Basis of Neurodegenerative

Diseases: Underlying Mechanisms 1st Edition Michael S.
Wolfe

https://ebookmass.com/product/the-molecular-and-cellular-basis-
of-neurodegenerative-diseases-underlying-mechanisms-1st-edition-
michael-s-wolfe/

X-Ray Fluorescence in Biological Sciences: Principles,

Instrumentation, and Applications Vivek K. Singh

https://ebookmass.com/product/x-ray-fluorescence-in-biological-
sciences-principles-instrumentation-and-applications-vivek-k-
singh/

Imunologia Celular e Molecular 9th Edition Abul K.

Abbas

https://ebookmass.com/product/imunologia-celular-e-molecular-9th-
edition-abul-k-abbas/

Introduction to Mineralogy and Petrology 2nd Edition

Swapan Kumar Haldar

https://ebookmass.com/product/introduction-to-mineralogy-and-
petrology-2nd-edition-swapan-kumar-haldar/
NEUROBLASTOMA
MOLECULAR MECHANISMS AND
THERAPEUTIC INTERVENTIONS

Edited by

SWAPAN K. RAY
Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, University of South Carolina School of
Medicine, Columbia, SC, United States
Academic Press is an imprint of Elsevier
125 London Wall, London EC2Y 5AS, United Kingdom
525 B Street, Suite 1650, San Diego, CA 92101, United States
50 Hampshire Street, 5th Floor, Cambridge, MA 02139, United States
The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, United Kingdom
Copyright © 2019 Elsevier Inc. All rights reserved.
No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or
mechanical, including photocopying, recording, or any information storage and retrieval system, without
permission in writing from the publisher. Details on how to seek permission, further information about the
Publisher’s permissions policies and our arrangements with organizations such as the Copyright Clearance
Center and the Copyright Licensing Agency, can be found at our website: www.elsevier.com/permissions.
This book and the individual contributions contained in it are protected under copyright by the Publisher
(other than as may be noted herein).
Notices
Knowledge and best practice in this field are constantly changing. As new research and experience broaden
our understanding, changes in research methods, professional practices, or medical treatment may become
necessary.
Practitioners and researchers must always rely on their own experience and knowledge in evaluating and
using any information, methods, compounds, or experiments described herein. In using such information or
methods they should be mindful of their own safety and the safety of others, including parties for whom they
have a professional responsibility.
To the fullest extent of the law, neither the Publisher nor the authors, contributors, or editors, assume any
liability for any injury and/or damage to persons or property as a matter of products liability, negligence or
otherwise, or from any use or operation of any methods, products, instructions, or ideas contained in the
material herein.

Library of Congress Cataloging-in-Publication Data

A catalog record for this book is available from the Library of Congress
British Library Cataloguing in Publication Data
A catalogue record for this book is available from the British Library
ISBN: 978-0-12-812005-7

For information on all Academic Press publications visit our website at

https://www.elsevier.com/books-and-journals

Publisher: Nikki Levy

Senior Acquisition Editor: Melanie Tucker
Editorial Project Manager: Gabriela D. Capille
Production Project Manager: Bharatwaj Varatharajan
Designer: Mark Rogers
Typeset by TNQ Technologies
 List of Contributors
Sepideh Aminzadeh-Gohari Research Program for
Receptor Biochemistry and Tumor Metabolism,
Department of Pediatrics, University Hospital of
the Paracelsus Medical University, Salzburg, Austria
Sanja Aveic Neuroblastoma Laboratory, Pediatric
Research Institute-Citt
a della Speranza, Padua,
Italy
J. Aye University of Alabama, Birmingham, AL,
United States
Duncan Ayers Centre for Molecular Medicine and
Biobanking, University of Malta, Msida, Malta;
Faculty of Biology, Medicine and Health, Univer-
sity of Manchester, Manchester, United Kingdom
E.A. Beierle University of Alabama, Birmingham,
AL, United States
Nicole J. Croteau Pediatric Service, Department of
Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center,
New York, NY, United States
Michael A. Dyer Department of Developmental
Neurobiology, St. Jude Children’s Research Hospi-
tal, Memphis, TN, United States
René G€ unther Feichtinger Research Program for
Receptor Biochemistry and Tumor Metabolism,
Department of Pediatrics, University Hospital of
the Paracelsus Medical University, Salzburg, Austria
Paolo Grumati Institute of Biochemistry II, Goethe-
Universit€at Frankfurt am Main, Frankfurt am
Main, Germany
Ravi Kant Gupta Department of Nuclear Medicine,
All India Institute of Medical Sciences, New Delhi,
India
William Clay Gustafson University of California
San Francisco, San Francisco, CA, United States
Jung-Tung Hung Institute of Stem Cell and Transla-
tional Cancer Research, Chang Gung Memorial
Hospital at Linkou & Chang Gung University,
Taoyuan, Taiwan
ix
Naohiko Ikegaki Department of Anatomy and Cell
Biology, College of Medicine, University of Illinois
at Chicago, Chicago, IL, United States
Mariia Inomistova National Cancer Institute of
MPH of Ukraine, Kyiv, Ukraine; Educational and
Scientific Center “Institute of Biology and Medi-
cine”, Taras Shevchenko National University of
Kyiv, Kyiv, Ukraine
Meredith S. Irwin Division of Haematology/
Oncology, Hospital for Sick Children, Toronto and
Department of Pediatrics, University of Toronto,
Canada
Natalia Khranovska National Cancer Institute of
MPH of Ukraine, Kyiv, Ukraine
Barbara Kofler Research Program for Receptor
Biochemistry and Tumor Metabolism, Department
of Pediatrics, University Hospital of the Paracelsus
Medical University, Salzburg, Austria
Anupa Kudva Department of Pediatrics, Memorial
Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY,
United States
Prerna Kumar University of Illinois College of
Medicine at Peoria, Peoria, IL, United States
Rakesh Kumar Department of Nuclear Medicine,
All India Institute of Medical Sciences, New Delhi,
India
Michael P. La Quaglia Pediatric Service, Depart-
ment of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer
Center, New York, NY, United States; Department
of Surgery, Weill Cornell Medical College, New
York, NY, United States
Katherine K. Matthay University of California San
Francisco, San Francisco, CA, United States
Shakeel Modak Department of Pediatrics, Memo-
rial Sloan Kettering Cancer Center, New York,
NY, United States
x LIST OF CONTRIBUTORS
Daniel A. Morgenstern Division of Haematology/
Oncology, Hospital for Sick Children, Toronto and
Department of Pediatrics, University of Toronto,
Canada
Rosa Nguyen Department of Oncology, St. Jude
Children’s Research Hospital, Memphis, TN,
United States
Swapan K. Ray Department of Pathology, Microbi-
ology, and Immunology, University of South
Carolina School of Medicine, Columbia, SC, United
States
Domenico Ribatti Department of Basic Medical
Sciences, Neurosciences and Sensory Organs, Uni-
versity of Bari Medical School, Bari, Italy
James A. Saltsman Pediatric Service, Department of
Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center,
New York, NY, United States
Nina F. Schor Departments of Pediatrics, Neurology,
and Neuroscience, University of Rochester, Roches-
ter, NY, United States; National Institute of Neuro-
logical Disorders and Stroke, National Institutes of
Health, Bethesda, MD, United States
Hiroyuki Shimada Department of Pathology and
Laboratory Medicine, Children’s Hospital Los
Angeles, University of Southern California Keck
School of Medicine, Los Angeles, CA, United States
Oksana Skachkova National Cancer Institute of
MPH of Ukraine, Kyiv, Ukraine
L.L. Stafman University of Alabama, Birmingham,
AL, United States
Gian Paolo Tonini Neuroblastoma Laboratory,
Pediatric Research Institute-Citt

a della Speranza,
Padua, Italy
Alice L. Yu Institute of Stem Cell and Translational
Cancer Research, Chang Gung Memorial Hospital
at Linkou & Chang Gung University, Taoyuan,
Taiwan; Department of Pediatrics, University of
California in San Diego, San Diego, CA, United
States
 C H A P T E R

1
Neuroblastoma Pathology and
Classification for Precision Prognosis and
Therapy Stratification
Hiroyuki Shimada1, Naohiko Ikegaki2
1
Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital Los Angeles, University of
Southern California Keck School of Medicine, Los Angeles, CA, United States; 2Department of Anatomy
and Cell Biology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, United States

INTRODUCTION PATHOLOGY DIAGNOSIS

Neuroblastoma is often used as a collective
term for all types of peripheral neuroblastic
tumors of neural crest origin and includes
Neuroblastoma, Ganglioneuroblastoma, and
Ganglioneuroma. Historically tumors in this
group were described as “enigmatic” because
of their unique and often unpredictable clinical
behaviors, such as spontaneous regression,
tumor maturation, and aggressive progression
refractory to therapy. These clinical features are
now considered to be closely associated with
their genetic/molecular characteristics [1e3]. It
is also noted that tumors in this group offer
one of the best models for investigating the
biologically significant relationship between
their genetic/molecular properties and morpho-
logic manifestations [4].
Whenever feasible, it is recommended to
obtain biopsied/surgically resected samples
before starting chemotherapy/irradiation
therapy for pathology evaluation. Determining
the histologic/biologic characteristics of the tu-
mors is critical for patient stratification and
appropriate protocol assignment at the time of
diagnosis. International Neuroblastoma Pathol-
ogy Classification (INPC) is applied only to the
tumor specimen obtained before starting
chemotherapy/irradiation therapy [4,5]. After
chemotherapy, tumor samples, especially of
biologically/clinically unfavorable cases, show
acute chemotherapy effects including a large
area of necrosis and extensive hemosiderin
(intracellular iron storage complex) deposition.
Cytologic/morphologic changes of the tumors

Neuroblastoma
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812005-7.00001-1 1 Copyright © 2019 Elsevier Inc. All rights reserved.
2 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION
after chemotherapy, which could mainly
represent an epigenetic phenomenon, are often
not reliable for predicting clinical behaviors of
the individual tumors. We should conduct
further studies on recurrent tumors, as they
could demonstrate different genetic/molecular
properties of the tumors at the time of
diagnosis.
At the surgical pathology gross bench, the
priority should be the securing of enough
samples for histological examination. For deter-
mining biological characteristics of the given
tumor, it is critical for saving the snap-frozen
material for molecular tests. Diagnosis by touch
preparations is recommended for MYCN and
other analyses by the FISH (fluorescence-based
in-situ hybridization) test.
Immunohistochemical stainings often used
for confirmation of the neuroblastoma diag-
nosis include neuronal markers (NSE, PGP9.5,
Synaptophysin, Chromogranin, CD56, etc.)
and so-called neuroblastoma marker (NB84).
However, those markers are not specific for
neuroblastoma; for example, those neuronal
markers are usually positive for Ewing’s/
PNET. Markers for the neural crest tumors
with neuronal and neuroendocrine differentia-
tion, which include TH (tyrosine hydroxylase)
and Phox2b [6e8], are more specific for
neuroblastoma diagnosis. Between these two
neural crest markers, Phox2b is more stable
and can be used for the staining of the bone
and bone marrow samples after decalcification
[9]. In our experience, Phox2b is more sensitive
than TH and positive for all neuroblastomas
including undifferentiated subtype [9,10]. In
contrast, TH is positive only for sporadic cells
or even becomes negative in some of the
tumors in the undifferentiated subtype. It
should be noted that both Phox2b and TH are
positive for pheochromocytomas and paragan-
gliomas [10].
INTERNATIONAL
NEUROBLASTOMA PATHOLOGY
CLASSIFICATION (INPC)
Histologic Categories and Subtypes
The International Neuroblastoma Pathology
Committee defines four categories in this group
of tumors: each is characterized by the grade of
neuroblastic differentiation and the degree of
Schwannian stromal development [4]. They are
Neuroblastoma (Schwannian stroma-poor),
Ganglioneuroblastoma, intermixed (Schwannian
stroma-rich), Ganglioneuroma (Schwannian
stroma-dominant), and Ganglioneuroblastoma,
nodular (composite, Schwannian stroma-rich/
stroma-dominant and stroma-poor). It is
believed that all Ganglioneuromas are once
Neuroblastomas in their early stage of tumor
development. The maturation sequences from
Neuroblastoma to Ganglioneuroma are promp-
ted by the cross talk between neuroblasts and
Schwannian cells, comparable to the embryolog-
ically well-defined relationship in neural crest
development toward ganglion structure of the
autonomic nervous system [11]. The cross talk
seems to be supported by various signaling path-
ways including trkA/nerve growth factor (NGF)
signaling and Nrg1/ErbB signaling, etc. [12,13].
Neuroblastoma (Schwannian stroma-poor) - NB:
Tumors in this category include three subtypes:
They are: undifferentiated, poorly differentiated,
and differentiating. Those tumors are character-
ized by the typical growth pattern of neuroblas-
tic cells forming groups or nests demarcated by
thin fibrovascular stromal septa where limited
or no Schwannian cell proliferation is observed.
1. Neuroblastoma, undifferentiated
subtypedNB-UD is rare and supplementary
procedures, such as immunohistochemistry
and/or molecular tests, are required to
establish the diagnosis. The proliferating cells
 INTERNATIONAL NEUROBLASTOMA PATHOLOGY CLASSIFICATION (INPC)
are uniformly primitive without clearly
recognizable neurite production (Fig. 1.1A).
Neuroblasts in this subtype usually do not
express higher levels of a favorable marker
trkA (high-affinity NGF receptor) and do not
have a potential for differentiation.
Accordingly, tumors in this subtype are
considered as biologically unfavorable. The
nuclear morphology of NB-UD cells often
exhibits a vesicular euchromatic
(transcriptionally active chromatin)
appearance.
2. Neuroblastoma, poorly differentiated
subtypedNB-PD is composed of neuroblasts
having varying amounts of neurite
production with or without HomerWright
rosette formation. This is the most common
histological form among the peripheral
neuroblastic tumors. Less than 5% of tumor
cells have cytomorphologic features of
differentiating neuroblasts (see blow c.
NB-D). Nuclear morphology of the NB-PD
neuroblasts is often described as salt-and-
pepper (sprinklings of heterochromatin and a
few inconspicuous nucleoli) (Fig. 1.1B). It is
interesting to note that some tumors in this
subtype, and more in the undifferentiated
subtype, show the presence of some
prominent nucleoli (nucleolar hypertrophy),
especially when MYCN oncogene is amplified
(Fig. 1.1C). Tumors in this subtype are either
biologically favorable or biologically
unfavorable. Biologically favorable tumors
show spontaneous regression or cellular
differentiation/tumor maturation. As
mentioned above, the latter seems to be
supported by the cross talk between
neuroblastic cells and Schwannian stromal
cells; those neuroblasts express higher levels
of trkA and actively recruit Schwannian
stromal cells. In contrast, biologically
unfavorable tumors seem to have lower levels
of trkA expression, do not recruit Schwannian
stromal cells, and do not have a potential of
differentiation/maturation. Amplified
3
MYCN is known to downregulate trkA
expression. However, many MYCN
nonamplified tumors can also express lower
trkA levels, and considered to be biologically
unfavorable as well.
3. Neuroblastoma, differentiating subtyped
NB-D, is a tumor usually characterized by
abundant neurite production. More than 5%
of tumor cells show cellular differentiation
and have an appearance of differentiating
neuroblasts (Fig. 1.1D). Those differentiating
neuroblasts are defined by synchronous
differentiation of both the nucleus (enlarged,
eccentrically located with a vesicular
chromatin pattern and usually a single
prominent nucleolus) and the cytoplasm
(eosinophilic/amphophilic with a diameter or
twice or more of the nucleus). A Nissl
substance can be seen in the periphery of the
cytoplasm. Majority of the tumors in this
subtype are biologically favorable. However,
some of the patients with differentiating
subtype of neuroblastoma still have a poor
clinical outcome (please see Prognostic
Grouping section below).
Ganglioneuroblastoma, Intermixed (Schwannian
stroma-rich)dGNB-I: Tumor in this category
contains well-defined microscopic nests of
neuroblastic cells in a background of naked
neurites that are intermixed or randomly distrib-
uted in the ganglioneuromatous tissue. Those
microscopic nests represent the areas where
neuritic processes produced by the neuroblasts
are not incorporated in the cytoplasm of
Schwannian stromal cells. By definition, more
than 50% of tumor tissue in this category should
have a ganglioneuromatous appearance where
ganglion cells are individually embedded in
abundant Schwannian stromal cells. These
microscopic nests are composed of a mixture of
neuroblastic cells in various stages of differentia-
tion, often dominated by differentiating
neuroblasts (Fig. 1.1E). Some apoptotic cells
may be seen in the nests as well. Presence of
4 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION

FIGURE 1.1 Categories and Subtypes of Peripheral Neuroblastic Tumors: (A) Neuroblastoma, Undifferentiated subtype
(NB-UD); (B) Neuroblastoma, Poorly differentiated subtype (NB-PD); (C) MYCN amplified tumor showing the appearance
of NB-PD with a high MKI (Mitosis-Karyorrhexis Index), (inset: neuroblastic cells having prominent nucleolar formation);
(D) Neuroblastoma, Differentiating subtype (NB-D) (inset: typical differentiating neuroblasts with both cytoplasmic and
nuclear enlargement); (E) Ganglioneuroblastoma, Intermixed (GNB-I); (F) Ganglioneuroma (GN) [inset: completely mature
ganglion cell covered with satellite cell (arrow)]; (G) Ganglioneuroblastoma, Nodular (GNB-N) composed of two distinct
histologies (clones)dGanglioneurmatous tissue (left) and neuroblastomatous nodule (right).
 INTERNATIONAL NEUROBLASTOMA PATHOLOGY CLASSIFICATION (INPC)
these microscopic nests is considered as a sign of
the lagging behind of tumor maturation toward
ganglioneuroma and the tumors are biologically
favorable, leading to an excellent prognosis of
the patients.
Ganglioneuroma (Schwannian stroma-dominant) -
GN: Tumors in this category are characterized by
the presence of individually distributed ganglion
cells in the Schwannian stroma (Fig. 1.1F).
Neuritic processes produce by the ganglion cells
are immediately enveloped by the cytoplasm of
Schwann cells. Accordingly, there are no recog-
nizable microscopic foci of naked neurites
without Schwannian coverage. This category
includes two subtypes: maturing and mature.
The maturing subtype contains both maturing
and mature ganglion cells, whereas the mature
subtype contains only mature ganglion cells.
The mature ganglion cells are surrounded by
the satellite cells. The stromal tissue is usually
well organized and shows the fascicular profile
of Schwann cells bundled with perineurial
cells. Ganglioneuroma is a biologically/clinically
benign tumor. However, there are markedly
rare cases where malignant Schwannoma de-
velops in ganglioneuroma with or without
irradiation therapy [14].
Ganglioneuroblastoma, Nodular (composite,
Schwannian stroma-rich/stroma-dominant and stroma-
poor)dGNB-N: Tumors in this category are
characterized by the presence of grossly visible,
often hemorrhagic and/or necrotic, NB
nodule(s) (stroma-poor component), coexisting
with GNB-I (stroma-rich component) or with
GN (stroma-dominant component) (Fig. 1.1G).
The term “composite” implies that the tumor is
composed of biologically different clones.
Prognostic Grouping (Favorable
Histology Vs. Unfavorable Histology)
INPC distinguishes two prognostic groups,
Favorable Histology Group and Unfavorable
Histology Group (Fig. 1.2) [5,15]. Tumors in the
5
Favorable Histology Group are within a frame-
work of age-appropriate tumor differentiation/
maturation and age-appropriate mitotic and
karyorrhectic activities. As for the morphologic
indicators of tumor differentiating/maturation,
the categories and subtypes described above
are utilized. In other words, tumors in the
Favorable Histology Group can demonstrate
age-dependent differentiation/maturation from
NB-PD to NB-D, then to GNB-I and finally to
GN, based on the cross talk between tumor cells
and Schwannian stromal cells. However, to
observe tumor differentiation/maturation, it
seems to take a certain amount of time; i.e.,
in vivo latent period. It is expected to take
up to 18 months for those tumors of NB-PD sub-
type to become NB-D subtype, and up to
60 months to become GNB-I or GN. In contrast,
tumors of NB-UD subtype in any age group, tu-
mors of NB-PD subtype over 18 months of age,
and tumors of NB-D subtype over 60 months
of age are considered as having limited or no
differentiating potential, and they are classified
into the Unfavorable Histology Group.
Another morphologic indicator for predicting
clinical behavior in this disease is mitotic and
karyorrhectic activities of neuroblastic cells,
and that is applied to tumors in the NB category
[16]. One of three MKI (Mitosis-Karyorrhexis
Index) classes based on the activities is assigned
to the given NB tumors: They are Low (<100/
5000 cells), Intermediate (100e200/5000 cells),
and High (>200/5000 cells) and their prognostic
effects are also age-dependent. Low MKI
tumors in the patients <5 years of age at
diagnosis, and Intermediate MKI tumors in the
patients <18 months of age at diagnosis are
classified into the Favorable Histology Group.
High MKI NB tumors in any age group, Interme-
diate MKI tumors >18 months of age at diag-
nosis, and Low MKI tumors >60 months of age
at diagnosis are classified into the Unfavorable
Histology Group. MYCN amplified tumors are
typically associated with high MKI (please see
Fig. 1.1C) [17,18].
6 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION

Mitosis-Karyorrhexis Index*
Neuroblastoma
Law Intermediate High Age at Diagnosis

Undifferentiated UH UH Any
Intermediate h UH
High
Poorly Differentiated FH FH UH <18 months

Subtype
UH UH UH 18 – 60 months
C A T E G O R Y

UH UH UH >60 months

Differentiating FH FH UH <18 months

FH UH UH 18 – 60 months

UH UH UH >60 months

Ganglioneuroblastoma,
Intermixed** FH Any**

Ganglioneuroma** Any**
FH

Ganglioneuroblastoma, FH or UH*** Any**

Nodular***

Favorable Unfavorable
FH UH
Histology Histology

FIGURE 1.2 International Neuroblastoma Pathology Classification *: Mitosis-Karyorrhexis Index is not assigned for
“Ganglioneuroblastoma, Intermixed” and “Ganglioneuroma”. **: “Ganglioneuroblastoma, Intermixed”, “Ganglioneuroma”,
and “Ganglioneuroblastoma, Nodular” are diagnosed in older children. ***: Prognostic distinction of “Ganglioneuroblastoma,
Nodular” is determined by the age-linked evaluation of histologic markers (grade of neuroblastic differentiation and mitosis-
karyorrhexis index) of the neuroblastomatous nodule (see text).

GNB-I and GN are always classified into the
Favorable Histology Group [19], while tumors
in the GNB-N category are classified into the
Favorable Histology Group or Unfavorable His-
tology Group based on the characteristics of NB
nodule(s) [15]. For this purpose, the same criteria
of age-linked evaluation for the grading of
neuroblastic differentiation and the MKI class
utilized for the prognostic distinction of NB
tumors are applied to the NB nodule(s). It should
be noted that making the correct diagnosis of
GNB-N is often difficult by biopsy or partial
tumor resection, since NB nodule could be hid-
den and not sampled for pathology examination.
In that situation, it is recommended to add a
disclaimer ”based on the review of limited
material” in the diagnosis line after GN or
GNB-I, Favorable Histology in the surgical
pathology report. It is critically important since
the clinical behavior of the given tumor would
depend on the characteristics of NB nodule(s),
if present [14].
In neuroblastoma, the patient’s age at diag-
nosis is one of the prognostic indicators. Histor-
ically, 1 year has been used as the cutoff mark.
The prognostic contribution of age to the clinical
outcome seems to be naturally continuous, and
the survival rates of younger patients are always
better than older patients in any age cutoff.
Based on the Children’s Oncology Group
(COG) Neuroblastoma study, London et al.
reported the statistical evidence of an age cutoff
greater than 1 year for risk stratification [20], and
the COG is now in the process of moving the
cutoff from 1 year (365 days) to 18 months
(548 days). The age factor should be considered
 INTERNATIONAL NEUROBLASTOMA PATHOLOGY CLASSIFICATION (INPC) 7
as a surrogate for other genetic/biologic risk the Unfavorable Histology Group patients dies
markers. Although the INPC has an already from the disease despite the high-intensity multi-
built-in age cutoff point of 18 months, Sano modal therapy. Clearly, new innovative thera-
et al. demonstrated that the INPC was able to peutic approaches are required for those in the
add independent prognostic information Unfavorable Histology Group, who are resistant
beyond the prognostic contribution of age [21]. to the current treatment protocols. To address
In other words, the INPC clearly distinguishes this problem, we have attempted to identify the
two prognostic groups (Favorable Histology expression of potentially drug-targetable pro-
identifying a significantly better prognosis teins that appear to lay the foundation for the
group than Unfavorable Histology) in different aggressive behavior of certain neuroblastomas
age groups, such as < versus >12 months; < existing in the Unfavorable Histology Group.
versus >18 months, and < versus >24 months Examples of those proteins are summarized in
of age at diagnosis (Fig. 1.3). the following section. At this stage, we are plan-
Importantly, the survival rate of Favorable ning to refine the current INPC by incorporating
Histology Group is estimated to be around or immunohistochemical detection/evaluation of
over 90%, whereas that of Unfavorable Histol- the target proteins and developing a more pre-
ogy Group has remained at 50%e40% or less cise system of pathology classification for future
[5,21,22]. It indicates that at least one in two of patient stratification and protocol assignment.

(A) (B)
1.0 >=12 months, FH (n=149) 1.0
>=18 months, FH (n=86)
<12 months, FH (n=278) <18 months, FH (n=341)
PROBABILITY
PROBABILITY

0.75 0.75

0.5
0.25 <12: FH v. UH: P<0.0001
>12: FH v. UH: P<0.0001
<12 months, UH (n=25)
>=12 months, UH (n=294)
0.5
<18 months, UH (n=57)
0.25
<18: FH v. UH: P<0.0001
>=18 months, UH (n=262)
>18: FH v. UH: P<0.0001

0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12
YEARS YEARS
(C)
1.0 >=24 months, FH (n=62)
<24 months, FH (n=365)
PROBABILITY

0.75

0.5
<24 months, UH (n=96)

0.25
<24: FH v. UH: P<0.0001 >=24 months, UH (n=223)
>24: FH v. UH: P<0.0001

0 2 4 6 8 10 12
YEARS

FIGURE 1.3 International Neuroblastoma Pathology Classification significantly distinguishes event-free survivals for FH
(Favorable Histology) patients from UH (Unfavorable Histology) patients within different age groups: (A) <12 months versus
>12 months; (B) <18 months versus >18 months; and, (C) <24 months versus >24 months at the time of diagnosis. The figure
reproduced from Figure 3 in the published article by Sano H, Bonadio J, Gerbing RB, London WB, Matthay KK, Lukens JN, et al. Inter-
national neuroblastoma pathology classification adds independent prognostic information beyond the prognostic contribution of age. Eur J
Cancer 2006;42:1113e1119.
8 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION
SEARCHING FOR ACTIONABLE/
DRUGGABLE TARGETS
ASSOCIATED WITH THERAPY
RESISTANCE
In this section, some examples of our recent
effort are described using immunohistochem-
istry in searching for actionable/druggable
targets associated likely with refractory and
resistance to the current intensive multimodal
therapy in this disease.
MYC Driven Neuroblastoma
MYCN oncogene is considered as a significant
oncogenic driver of neuroblastoma. MYCN
amplification is seen in approximately 20% of
neuroblastomas [23,24]. The vast majority of
MYCN amplified tumors overexpress the
MYCN protein, and MYC-MAX protein hetero-
dimer formation is critical in activating down-
stream molecular targets through E-box gene
sequences and leading to aggressive tumor
growth [25]. There are rare MYCN amplified neu-
roblastomas without protein expression [26], and
also extremely rare MYCN nonamplified neuro-
blastomas with MYCN protein overexpression
[unpublished data].
Besides MYCN oncogene amplification and
subsequent MYCN protein overexpression, MYC
(aka C-Myc) protein overexpression, observed in
w10% of undifferentiated and poorly differenti-
ated neuroblastomas, is reported as a new prog-
nostic factor [27]. It seems extremely rare to
observe overexpression of both MYCN protein
and MYC protein in the same tumor. Recently
we have defined “MYC driven neuroblastoma”
that shows augmented expression of either
MYCN protein or MYC protein detectable by
immunohistochemistry [27]. These neuroblas-
tomas are highly aggressive and associated with
similarly low survival rates (3-year event-free
survival: 46.2
12.0% for MYCN overexpressing
neuroblastoma and 43.4
23.1% for MYC
overexpressing NB, respectively) (Fig. 1.4A).
Of note, neuroblastic cells in MYC driven neu-
roblastoma are often associated with the promi-
nent nucleolar formation (nucleolar
hypertrophy) [27,28], indicative of increased
rRNA synthesis leading to high levels of protein
expression (Fig. 1.4B-i and ii). Because of the
presence of one to a few prominent nucleoli,
MYC driven neuroblastoma can be
cytologically distinguished from the conven-
tional small-round-blue-cell neuroblastoma
with salt-and-pepper nuclei. In addition,
MYCN protein overexpressing neuroblastoma
(Fig. 1.4C-i) is significantly associated with
MYCN oncogene amplification, and present
with High MKI. In contrast, MYC protein
overexpressing neuroblastoma (Fig. 1.4C-ii) is
not associated with MYCN oncogene amplifica-
tion and often present with low or intermediate
MKI [27]. Currently, the precise molecular mech-
anism(s) for MYC protein overexpression in neu-
roblastoma is not known, but in some rare cases,
MYC gene amplification is involved [29].
MYC driven neuroblastoma, comprising
more than 50% of high-risk neuroblastomas, in-
cludes rare and unique tumors named large-cell
neuroblastoma that is often characterized by the
bull’s eye appearance of enlarged and uniquely
open euchromatin-rich nuclei containing highly
conspicuous nucleoli (Fig. 1.4D) [30]. Most large-
cell neuroblastomas overexpress higher levels of
MYCN protein or MYC protein than other MYC
driven neuroblastomas. Their euchromatin-rich
open nuclei also suggest the stem-cell like nature
of the tumor cells [31].
Neuroblastoma With ALK Mutation/
Overexpression and Amplification
ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) is a
receptor tyrosine kinase and expressed in the
developing sympathoadrenal lineage of the
neural crest. However, ligand(s) of ALK have
not been well established. In neuroblastoma,
mutations in the ALK gene account for the
majority of familial neuroblastoma cases [32].
 SEARCHING FOR ACTIONABLE/DRUGGABLE TARGETS ASSOCIATED WITH THERAPY RESISTANCE 9

(A) International Neuroblastoma Pathology Classification (B-I)

& MYCN/MYC protein expression

Favorable Histology &

No MYCN/MYC Overexpression (N=167)

Unfavorable Histology &

No MYCN/MYC Overexpression (N=84)

MYCN Overexpression (B-II)

MYC Overexpression (N=67)
(N=37)

P<0.0001

(C-I) (D)

(C-II)

FIGURE 1.4 A new concept of MYC driven neuroblastoma: (A) Event-free survivals by International Neuroblastoma
Pathology Classification and MYCN/MYC protein expression in Neuroblastoma, Undifferentiated and Poorly differentiated
subtype. Patients with MYC protein overexpressing tumor and those with MYCN protein overexpressing tumor have a similar
and significantly low survival rates. (B) Different nuclear morphologies; “salt-and-pepper” nuclei in non-MYC driven neuro-
blastoma (BeI) and prominent nucleolar formation (nucleolar hypertrophy) in MYC driven neuroblastoma (B-II). (C) MYC
driven neuroblastoma with MYCN protein overexpression (CeI) and MYC protein overexpression (C-II). (D) Large-cell neu-
roblastoma, a member of MYC driven neuroblastoma characterized by enlarged and uniquely open nuclei containing highly
conspicuous nucleoli. (A) The figure adapted by permission from Macmillan Publications Ltd.: Wang LL, et al. Augmented expression of
MYC and/or MYCN protein defines highly aggressive MYC driven neuroblastoma: a Children’s Oncology Group Study. Br J Cancer 2015;
113:57e63.

ALK mutations/overexpression and amplifica-
tion are also found in around 10% of sporadic
neuroblastoma cases [33,34]. It was also found
that ALK gene amplification and F1174 muta-
tions, which are among the most active forms
of the mutations in in vitro assay, are associated
with MYCN amplification [35]. Interestingly,
overexpression of ALK due to ALK amplification
as well as gene mutations appears to be respon-
sible for its oncogenic function [36]. In addition,
a feed forward activation loop between MYCN
and ALK expressions has been reported
[37e39]. ALK abnormalities seem to cause dys-
regulation of multiple pathways, including
PI3K, AKT, MEKK3, and MEK5 signal transduc-
tion pathways, to bring an uncontrolled prolifer-
ation of neuroblasts [38].
However, the prognostic significance of ALK
mutations/overexpression has been controver-
sial, as some reports suggest an association of
ALK mutations/overexpression with fatal
outcome of the disease, whereas others suggest
10 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION
otherwise. Initially, De Brouwer et al. showed no
significant survival difference in neuroblastomas
with or without ALK mutations or amplification
and reported no significant difference in the fre-
quency of ALK mutations between low- and
high-stage tumors [35]. Subsequently, however,
Schulte et al. reported that high levels of mutated
and wild-type ALK expression were associated
with reduced survival of neuroblastoma [36].
This difference appeared because the cohort of
De Brouwer et al. had included more unfavorable
neuroblastomas than that of Schulte et al. Thus, if
we only considered unfavorable neuroblastomas,
there would be no difference in survival of neuro-
blastomas with or without ALK mutations or
amplification. This idea is supported by the data
shown in Fig. 1.5, where there is little difference
in survival between ALK high- and low-
expressing tumors in the high-risk subset as
well as in the fatal cases of neuroblastoma pa-
tients. Passoni et al. first reported the immunohis-
tochemical detection of ALK protein in
neuroblastoma and its prognostic significance in
2009 [40], in that, high-level expression of ALK
was associated with adverse outcome of the dis-
ease. However, Regairaz et al. later showed
immunohistochemically that ALK and its active
form pALK expression were observed in many
neuroblastomas independent from ALK muta-
tion/amplification [41]. Based on these observa-
tions, it is less likely that future INPC will
incorporate the immunohistochemical detection
of ALK and/or pALK expression in the pathol-
ogy classification.
Telomere Maintenance and Elongation in
Neuroblastoma
Telomere maintenance and even elongation
could prevent neuroblasts from replication
senescence/cellular death due to telomere
erosion. Accordingly, neuroblasts could acquire
infinite proliferating capability.
Telomere elongation by increased TERT activity
(Fig. 1.6A and B): Immunohistochemically,
TERT (telomere reverse transcriptase) overex-
pression can be observed in both MYC driven
and non-MYC driven NBs in any age groups of
the neuroblastoma patients [42]. In other words,
there seem to be multiple mechanisms for upre-
gulation of TERT expression: It can be associated
with MYCN/MYC protein overexpression,
TERT rearrangement, or promoter hypermethy-
lation, etc. [43e47].
Alternative lengthening of telomere by ATRX loss
(Fig. 1.6C and D): ATRX (alpha-thalassemia/
mental retardation syndrome X-linked) muta-
tions are reported in older children with neuro-
blastoma and indicate a poor prognosis [48].
Most of the tumors with ATRX mutations
show alternative lengthening of telomere
(ALT). ATRX mutations causing loss of ATRX
expression can easily be detected by immunohis-
tochemistry. Neuroblastomas with loss of ATRX
are diagnosed in older children (>5 years of age
at diagnosis), and almost exclusively found in
the non-MYC driven neuroblastomas with Unfa-
vorable Histology [49]. Also, reported are rare
NBs with DAXX (Death Domain Associated Pro-
tein) gene mutations that are also known to cause
ALT [50]. ATRX and DAXX are components of
the molecular complex that functions to replace
Histone 3.1/2 with Histone 3.3. ATRX recog-
nizes DNA segments containing H3K4me0 and
H3K9me3, and DAXX removes Histone 3.1/2
and inserts Histone 3.3 in a replication-
independent fashion [51]. DAXX interacts with
KAP1 and SETDB1 to catalyze H3K9me3 modifi-
cation on newly deposited H3.3. ATRX/DAXX/
H3.3 are able to act continuously through the cell
cycle to ensure constant maintenance of
H3K9me3 heterochromatin (transcriptionally
inactive chromatin) at telomeres [52]. Therefore,
ATRX or DAXX loss will lead to recombinogenic
telomeres leading to the ALT phenotype (see
below).
 SEARCHING FOR ACTIONABLE/DRUGGABLE TARGETS ASSOCIATED WITH THERAPY RESISTANCE
FIGURE 1.5 Prognostic significance of ALK expression in neuroblastoma: Possible prognostic significance of ALK expression was assessed using the
whole cohort, High-Risk subset or Fatal cases. Analysis was done by R2 (http://r2.amc.nl), using Tumor Neuroblastoma - SEQC - 498 - RPM - seqcnb1
Dataset [88]. Note: ALK mutations and amplification result in high levels of ALK expression.

11
12 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION

FIGURE 1.6 Immunostainings for ATRX (alpha-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked) and TERT (telomerase
reverse transcriptase) Expression: (A) Neuroblastoma with ATRX loss (Note: endothelial cells retain ATRX); (B) Neuroblastoma
with positive ATRX; (C) Neuroblastoma with TERT overexpression; (D) Neuroblastoma without TERT overexpression.

PROPOSED SUBGROUPS OF
UNFAVORABLE HISTOLOGY
NEUROBLASTOMA FOR
“PRECISION MEDICINE”
As we have gained additional knowledge
about the potential molecular targets that under-
lay the therapy-resistant phenotype associated
with Unfavorable Histology neuroblastomas
(indicated above), we may incorporate such
information into the INPC toward precision
prognosis and therapy stratification.
The first example of this approach was to
examine the expression of MYC family proteins.
Consequently, this study has led to the concept
of MYC family protein driven neuroblastoma
or in short MYC driven neuroblastoma, having
a high-level expression of MYC family proteins
with a dismal survival rate [27]. Thus, this study
was able to retrospectively identify a group of
high-risk patients who would likely fail the cur-
rent high-risk therapy. Those patients are who
would likely benefit from an alternative high-
risk protocol that includes an MYC-targeted
regimen (see below). For this study, we have
used anti-MYCN (NCM II 100) and anti-MYC
(Y69) antibodies separately to detect MYCN
and MYC proteins. In future studies, we are
planning to use an anti-pan-MYC antibody
(NCM II 143) that can simultaneously detect all
three members of the MYC family proteins,
MYC, MYCN, and MYCL (though we still have
not identified MYCL overexpressing neuroblas-
tomas in our file), to streamline the process
(Fig. 1.7). Recently, we have been extending the
immunohistochemical approach to TERT and
 PROPOSED SUBGROUPS OF UNFAVORABLE HISTOLOGY NEUROBLASTOMA FOR “PRECISION MEDICINE” 13

MYCN-Protein MYC-Protein MYCN/MYC-Protein

Expressing NB Expressing NB Negative NB

H&E

MYCN FISH

MYCN

MYC

Pan-MYC

FIGURE 1.7 Neuroblastomas overexpressing MYCN protein (left column), MYC protein (middle column), and no MYCN/
MYC protein (right column) shown by H&E staining, MYCN FISH (Fluorescence in situ hybridization), MYCN protein immu-
nostaining, MYC protein immunostaining, and Pan-MYC protein immunostaining (Note: MYCN overexpressing neuroblas-
toma is MYCN amplified): In contrast, MYC overexpressing neuroblastoma and both protein negative neuroblastoma are
MYCN nonamplified. Pan-MYC immunostaining yields positive signals in both MYCN and MYC overexpressing
neuroblastomas.

ATRX expression, and the preliminary results
appear promising [42,49].
Based on these observations, we could refine
the Unfavorable Histology Neuroblastoma
stratification using immunohistopathological
analysis shown in Table 1.1. We propose to
use three (or four) immunohistochemical stain-
ings with anti-pan-MYC antibody (or anti-
MYCN and anti-MYC), anti-TERT antibody,
and anti-ATRX antibody to classify Unfavor-
able Histology Neuroblastomas into four
subgroups.
MYC subgroup: As augmented MYC family
protein expression stimulates rRNA synthesis
and protein translation, this subgroup should
exhibit prominent nucleolar formation (nucle-
olar hypertrophy) and hypertrophic cell
morphology. In addition, MYC family protein
overexpression would also lead to open chro-
matin as MYCN/MYC proteins recruit histone
acetyltransferases on to chromatin globally.
Thus, the overall histologic appearance of MYC
driven tumors would ultimately become the
large-cell neuroblastoma. It is also expected
that a considerable number of MYC driven neu-
roblastomas are associated with TERT overex-
pression, and this is because TERT is a direct
gene target of MYC family proteins, whereas
TERT can stabilize MYC protein via its non-
canonical enzymatic function, creating a positive
14 1. NEUROBLASTOMA PATHOLOGY AND CLASSIFICATION

TABLE 1.1 Proposed Subgroups of Unfavorable Histology Neuroblastomas

IHC Markers

Pan-MYC Predicted Survival

Subgroup (MYCN/MYC) TERT ATRX Histologic Markers on Current Therapy

MYC Overexpression Overexpression or Retention? Nucleolar hypertrophy Dismal

(MYCN/MYC) No Overexpression (including LCNBa)
TERT No Overexpression Overexpression Retention S&Pb Dismal
b
ALT No Overexpression No Overexpression Loss S&P Dismal
b
Null No Overexpression No Overexpression Retention S&P Better Response
a
LCNB ¼ Large-cell neuroblastoma.
b
S&P ¼ Conventional neuroblastoma with salt-and-pepper nuclei.

feedback loop between MYCN/MYC and TERT Null subgroup: There are still Unfavorable
expression [46,53]. Histology Neuroblastomas without MYCN/
TERT subgroup: Higher levels of TERT MYC overexpression, TERT overexpression,
expression are also observed in neuroblastomas and ATRX loss. Unless otherwise any other
without MYCN/MYC protein overexpression. aggravating factors are found, the patients in
The activation of TERT expression, in this case, the Null subgroup would hopefully respond to
is likely due to long-range genomic rearrange- the current high-risk treatment regimens.
ments, but not to promoter mutations in
neuroblastoma [54]. TERT promoter hyperme-
thylation might also be its activating mechanism
MOLECULAR TARGETING
[45,55].
THERAPIES FOR UNFAVORABLE
ALT subgroup: ATRX loss results in the ALT
HISTOLOGY NEUROBLASTOMA
(alternative lengthening of telomere) phenotype. RESISTANT TO THE CURRENT
ATRX is rarely mutated in the MYC subgroup
THERAPY
and TERT subgroup, and loss of ATRX is exclu-
Along with the well-documented ALK inhib-
sively seen in the older children over 5 years of
itors for ALK overexpression [57], potential
age. Because one of the normal ATRX functions
agents targeting MYC family protein overex-
is to insert the variant histone H3, namely
pression and telomere maintenance/elongation
H3.3, in concert with DAXX into chromatin to
are discussed in this section. Those are candi-
maintain transcriptionally active euchromatin
dates to be included in our future protocols of
[56], the absence of ATRX may result into a
molecular targeting therapy in neuroblastoma
more transcriptionally inactive heterochromatic
(Table 1.2).
state. Thus, the histological/cytological appear-
ance of the ALT subgroup could be the conven-
Targeting of MYC Driven Neuroblastoma
tional type with salt-and-pepper nuclei rather
than that with nucleolar hypertrophy or bull’s In order to develop treatment strategies for
eye type. the “MYC driven neuroblastomas”, new targets
 MOLECULAR TARGETING THERAPIES FOR UNFAVORABLE HISTOLOGY NEUROBLASTOMA
TABLE 1.2 Potential Agents Against Therapy Refractory and Resistant Unfavorable Histology Neuroblastomas
NB Subgroups Biomarkers
MYC driven MYC family protein (MYCN/MYC)
Overexpression
Nucleolar hypertrophy
Telomere maintenance/ TERT Overexpression
elongation aberrations
Loss of ATRX Expression
ALK Mutations/amplification ALK protein Overexpression
and potential therapeutic agents should be
clearly defined. However, the direct targeting
of MYC family proteins with small molecules
has turned out to be a highly formidable task
[58]. Hence, many have sought indirect
approaches to downregulate MYC family
protein expression in cancer cells. The strategies
under current consideration include transcrip-
tional repression of MYC/MYCN genes by BET
(Bromo- and Extra-Terminal)-inhibitors [59,60]
and CDK (Cyclin-dependent kinase) inhibitors
[61,62] or destabilization of MYCN by Aurora
kinase A inhibitors [63].
We have been seeking other indirect strategies
to down-regulate MYC family protein expres-
sion in neuroblastoma. Since MYC driven neuro-
blastomas are characterized by prominent
nucleolar formation, inhibition of rRNA gene
transcription and protein translation by small
molecule inhibitors could be a potential thera-
peutic approach for this subset of biologically
15
Potential Agents
BET Bromodomain Inhibitors:
(GSK525762, RO6870810, CPI-0610)
CDK inhibitors:
(Roscovitine, THZ1)
Aurora Kinase Inhibitors:
(CD532, MLN8237)
rRNA synthesis inhibitors:
(CX-5461)
Protein translation inhibitors:
(Halofuginone)
Telomerase inhibitors:
(Imetelstat)
p21 inhibitors:
(Sorafenib, UC2288)
ATR inhibitors:
(AZD6738)
CHK1 inhibitors:
(MK8776)
ALK inhibitors:
(Crizotinib, Lorlatinib)
unfavorable neuroblastomas [64]. In fact, those
small molecules, such as CX-5461 and Halofugi-
none, are currently examined for their efficacy in
various human diseases in clinical trials [65,66].
CX-5461 disrupts the binding of the SL1
transcription factor to the rDNA promoter and
prevents the initiation of rRNA synthesis by
RNA Pol I [67]. Consequently, the ribosomal
assembly will be halted, leading to the accumu-
lation of unassembled ribosomal proteins. Free
ribosomal proteins will then promote cancer-
specific activation of p53 [64]. Interestingly, a
similar set of freed ribosomal proteins could
also down-regulate MYC protein by distinct
mechanisms [68,69]. Halofuginone, on the other
hand, specifically inhibits glutamyl-prolyl
tRNA synthetase (EPRS) [70], resulting in the
accumulation of uncharged prolyl tRNAs, which
then leads to suppression in protein translation
via the induction of amino acid starvation
response [71]. In addition, inhibition of EPRS
Another random document with
no related content on Scribd:
 »Senpä minä juuri pyydän saada kertoa teidän ylhäisyydellenne.»
»Pyydän, tehkää se, ja Jumalan nimessä, tehkää se nopeasti, mies.
Sillä jos minun täytyy vaivautua kuuntelemaan jokaista petturikoiraa,
niin täytyy minun istua tässä kevätkäräjiin saakka.»

»Olin siellä, teidän ylhäisyytenne, lääkärin asioissa, sitomassa

lordi
Gildoyn haavoja.»

»Mitä tämä merkitsee? Kerrotteko meille, että muka olisitte

lääkäri?»

»Oppiarvon suorittanut Kolminaisuuden yliopistossa Dublinissa.»

»Hyvä Jumala!» huudahti lordi Jeffreys korottaen ääntään ja

katsoen juryyn. »Mikä häpeämätön roisto! Te kuulitte todistajan
äsken sanovan, että hän oli tuntenut hänet Tangerissa vuosikausia
sitten ja että hän silloin oli Ranskan palveluksessa oleva upseeri. Te
kuulitte syytetyn myöntävän, että todistaja oli puhunut totta.»

»Niin hän olikin. Mutta se mitä minä nyt kerron teille, on myös
totinen tosi. Muutama vuosi sitten olin sotilas, mutta sitä ennen olin
jo lääkäri ja olen sitä ollut taas viime tammikuusta saakka asetuttuani
Bridgewateriin, kuten sadat todistajat voivat todistaa, jos tarvitaan.»

»Siihen ei ole tarpeellista tuhlata aikaamme. Tahdon omalla

roistomaisella suullanne näyttää valheeksi puheenne. Kysyn teiltä
vain: Kuinka jouduitte Monmouthin herttuan armeijaan, vaikka
esitätte itsenne tässä lääkärinä, joka harjoittaa rauhallista
ammattiaan Bridgewaterin kaupungissa?»
 »En ole koskaan kuulunut siihen armeijaan. Ei kukaan ole
todistanut sitä eikä tule todistamaankaan, sen vannon. Minulla ei
ollut mitään tekemistä äskeisen kapinan kanssa. Pidin sitä
mielettömänä seikkailuna. Rohkenen kysyä teidän ylhäisyydeltänne,
(hänen irlantilainen murteensa tuli entistä tuntuvammaksi) mitä
minulla, joka olen syntynyt ja kasvatettu paavin uskossa, saattoi olla
tekemistä armeijassa, joka taisteli protestanttisuuden puolesta?

»Tekö paavin uskolainen?»

Ylituomari tuijotti häneen hetken. »Pikemminkin te muistutatte

honottavaa, määkivää presbyteeriläis-Taavettia. Vakuutan, mies, että
haistan presbyteeriläisen jo neljänkymmenen mailin päästä.»

»Siinä tapauksessa rohkenen ihmetellä, ettei niin tarkka nenä

haista paavinuskolaista neljän jalan päästä.»

Parvekkeelta kuului naurun hihitystä, mutta tuomarin tuima katse

ja oikeudenpalvelijain ääni vaimensivat sen heti.

Lordi Jeffreys nojasi eteenpäin pöytää vasten. Hän kohotti hienon

kätensä, jossa hän vieläkin piteli pitsiröyhelöistä, hyväntuoksuista
nenäliinaansa.

»Jätämme uskontokysymyksen sikseen tällä kertaa, ystäväni»,

sanoi hän. »Mutta huomatkaa tarkoin, mitä sanon.» Hän korosti
hennolla etusormellaan jokaista sanaa. »Tietäkää, ystäväni, ettei ole
mitään uskontoa, joka antaisi luvan valehtelemiseen. Teillä on kallis
kuolematon sielu, eikä ole mitään koko maailmassa, joka olisi
arvokkaampaa kuin se. Ajatelkaa, että suuri taivaan ja maan Jumala,
jonka tuomioistuimen edessä te ja me ja kaikki ihmiset viimeisenä
päivänä seisomme, on kostava teille jokaisen valheen ja
oikeudenmukaisesti heittävä teidät iankaikkiseen tuleen, pudottava
teidät tulisen pätsin pohjattomaan kuiluun, jos väistytte hivenenkään
totuuden tieltä, hivenenkään, sillä minä vakuutan teille, että Jumala
ei anna itseään pilkata. Tämän perusteella vaadin teitä vastaamaan
totuuden mukaisesti:

Miten jouduitte vangituksi näiden muiden kapinallisten kanssa?»

Peter Blood tuijotti hetken hämmästyneenä yli tuomariin. Mieshän oli
uskomaton, epätodellinen, mielikuvituksellinen painajaistuomari.
Sitten hän kokosi ajatuksensa ja vastasi:

»Minua pyydettiin tuona aamuna auttamaan lordi Gildoyta ja minä

pidin velvollisuutenani noudattaa pyyntöä, koska olin sen ammatin
harjoittaja.»

»Vai piditte velvollisuutenanne!»

Ylituomari, jonka kasvot olivat pelottavan näköiset — ne olivat

kalmankalpeat, ja hänen vääntyneet huulensa olivat punaiset kuin
veri, jota hän janosi — katsoi Peter Bloodia häijyn pilkallisesti. Sitten
hän hillitsi itsensä, kuten näytti, vaivoin. Hän huokasi ja puhui
aikaisempaan, hiljaisen valittavaan tapaansa. »Hyvä Jumala, miten
te tuhlaatte kallista aikaamme! Mutta minä koetan olla kärsivällinen
kanssanne. Kuka teitä pyysi sinne?»

»Master Pitt tuossa, kuten hän voi todistaa.»

»Oh! Master Pitt todistaa — hän, joka itse on tunnustanut

olevansa maanpetturi. Siinäkö teidän todistajanne ovat?»

»Täällä on myös master Baynes, joka voi todistaa samaa.»

 »Master Baynesin on vastattava omista synneistään, ja minä
luulen että hänellä tulee olemaan täysi työ koettaessaan vapauttaa
kaulansa hirttosilmukasta. No, sir, eikö teillä ole muita todistajia?»

»Voisin saada Bridgewaterista muitakin todistajia, jotka näkivät

minun lähtevän sinä aamuna master Pittin hevosen selässä
matkaan.»

Hänen ylhäisyytensä hymyili. »Se ei ole tarpeellista. Sillä

huomatkaa, minä en aio tuhlata enempää aikaa teidän vuoksenne.
Vastatkaa minulle ainoastaan: Tiesittekö, kun master Pitt, kuten
väitätte, tuli teitä noutamaan, että hän, kuten kuulitte hänen
tunnustavan, oli kuulunut Monmouthin kapinallisiin.»

»Tiesin, teidän ylhäisyytenne.»

»Te tiesitte! Vai niin!» Lordi katsoi pelokkaaseen juryyn ja naurahti

lyhyesti. »Ja siitä huolimatta menitte hänen kanssaan?»

»Auttamaan haavoitettua ihmistä, kuten pyhä velvollisuuteni

vaati!»

»Pyhä velvollisuutenne, sanoitte?» Lordi raivostui taas. »Hyvä

Jumala! Missä käärmeitten sukukunnassa elämmekään! Teidän pyhä
velvollisuutenne, roisto, kuuluu kuninkaalle ja Jumalalle. Mutta
olkoon. Kertoiko hän teille, ketä teidät pyydettiin auttamaan?»

»Kyllä — lordi Gildoyta.»

»Ja te tiesitte, että lordi Gildoy oli haavoittunut taistelussa ja millä

puolella.»

»Tiesin sen.»
 »Ja sittenkin, vaikka koetatte uskotella meille, että olette
herramme kuninkaan uskollinen alamainen, menitte auttamaan
häntä?»

Peter Blood menetti kärsivällisyytensä hetkeksi.

»Minulla oli tekemistä vain hänen haavojensa eikä hänen

valtiollisten mielipiteittensä kanssa, teidän ylhäisyytenne.»

Hyväksymisen mutinaa kuului sekä parvekkeelta että juryn

puolelta. Se oli omiaan vain saamaan ylituomarin täyteen raivoon.

»Jeesus Jumala!» huusi hän. »Onko maailmassa koskaan nähty

hävyttömämpää vintiötä kuin te?» Hän kääntyi kalmankalpeana juryn
puoleen. »Minä toivon, herrat juryn jäsenet, että te otatte huomioon
tämän petturiroiston kauhistuttavan käytöksen, ja siitä te ette voi olla
havaitsematta, millainen mielenlaatu tämänkaltaisilla ihmisillä on,
kuinka konnamaista ja pirullista heidän menettelytapansa on. Omalla
suullaan on hän lausunut hirttotuomionsa moneen kertaan ja vielä
siinä on lisää. Vastatkaa minulle, sir: Kun te saitte petetyksi kapteeni
Hobartin valheillanne tämän toisen petturin, Pittin, yhteiskunnalliseen
asemaan nähden, missä ominaisuudessa te silloin toimitte?»

»Pelastaakseni hänet joutumasta ilman tutkintoa hirtetyksi, kuten

häntä uhattiin.»

»Mitä teillä oli sen asian kanssa tekemistä, joutuiko hän hirteen ja
miten se tapahtui?»

»Oikeudenmukaisuus on jokaisen uskollisen alamaisen asia, sillä

oikeudenrikos, jonka kuninkaan valtuutettu tekee, tuottaa häpeää
hänen kuninkaalliselle majesteetilleen.»
 Se oli ovelasti ja terävästi sinkautettu huomautus jurylle ja se
ilmaisi, miten valpas ja maltillinen miehemme äly oli ja miten se juuri
äärimmäisen vaaran hetkellä oli terävimmillään. Jokaiseen muuhun
juryyn se varmaan olisi tehnyt tarkoitetun vaikutuksen. Se olisi
saattanut tehdä sen tähänkin juryyn, joka oli kokoonpantu aroista
lampaista, ellei ylituomarin pelottava hahmo olisi tehnyt sitä tyhjäksi.

Lordi Jeffreys nojautui raskaasti eteenpäin ja haukkoi ilmaa

hämmästyksestä.

»Herra taivaassa!» myrskysi hän. »Onko koskaan nähty

hävyttömämpää roistoa? Mutta asia on selvä. Minä näen jo, mikä te
olette miehiänne. Näen hirttonuoran kaulallanne.»

Sanottuaan sanottavansa loppuun silmät häijysti mulkoilevina hän

rauhoittui ja istuutui takaisin paikalleen. Oli kuin esirippu olisi
pudonnut. Kaikki mielenliikutus hävisi hänen kalpeilta kasvoiltaan.
Niille palasi taas entinen, hiljainen surumielisyys. Kun hän taas
hetken perästä puhui, oli hänen äänensä pehmeä, miltei hellä, ja
kuitenkin kuului joka sana selvästi suuressa oikeussalissa.

»Jos tunnen sydämeni oikean laadun, niin en tahtoisi vahingoittaa

ketään, vielä vähemmän iloita siitä, että joku menee iankaikkiseen
kadotukseen. Ainoastaan säälistä teitä kohtaan olen tuhlannut näin
paljon sanoja tähtenne, koska tahtoisin, että panisitte jotakin arvoa
kuolemattomalle sielullenne, ettekä saattaisi sitä iankaikkiseen
kadotukseen itsepintaisesti turvautumalla valheeseen ja
kiroilemiseen. Mutta huomaan, että mitkään yritykset siihen
suuntaan eivät vaikuta teihin nähden mitään, ja sen vuoksi en aio
sanoa teille enempää.» Hän käänsi taas kauniit, tarkkaavat
kasvonsa juryn puoleen. »Hyvät herrat, minun täytyy lain puolesta,
jonka tulkitsijoita me olemme ettekä te, selittää, että jos joku henkilö
on tosiasiallisesti noussut kapinaan kuningasta vastaan ja joku
toinen henkilö — joka ei todella vielä asiallisesti ole tehnyt sitä —
tieten ottaa luokseen ja majoittaa, hoivaa ja auttaa häntä, niin on hän
yhtä suuressa mitassa kapinallinen kuin se, joka kantoi asetta. Me
olemme valamme ja omantuntomme velvoituksella sidotut
osoittamaan teille, mitä laki on, ja te olette valanne ja omantuntonne
perusteella velvolliset lausunnossanne ilmaisemaan ja päättämään,
minkä tuomion lain totuus teitä vaatii langettamaan.»

Sitten hän jatkoi tulkintaansa selittäen, millä tavalla Baynes ja

Blood olivat syypäitä valtiopetokseen, ensinmainittu sen vuoksi että
hän oli ottanut luokseen maanpettureita, ja jälkimmäinen sen nojalla,
että hän oli auttanut petturia hoitamalla hänen haavojaan. Hän
sovitteli puheensa lomaan teennäisiä viittauksia luonnolliseen
herraansa ja lailliseen ruhtinaaseensa, kuninkaaseen, jonka Jumala
oli heidän valtiaakseen asettanut, sekä moitti nonkonformisteja ja
Monmouthia, josta — omien sanojensa mukaan — uskalsi varmasti
sanoa, että alhaisimmallakin alamaisella, joka oli laillisesti avioliitosta
syntynyt, oli suurempi oikeus kruunun perimiseen kuin hänellä.

»Jeesus Jumala! Että meidän pitääkin elättää keskuudessamme

sellaista kyykäärmeitten sukukuntaa», lopetti hän vihdoin retorisin
elein vimmaisen purkauksensa. Sitten hän vaipui paikalleen
väsyneenä ponnistuksestaan. Hetken hän oli aivan hiljaa pyyhkien
vain huuliaan. Sitten hän liikahti levottomasti. Uudelleen vääntyivät
hänen kasvonsa tuskaisesti ja muutamin kähein, miltei hajanaisin
sanoin hän lähetti juryn tekemään päätöstään.

Peter Blood oli kuunnellut hänen hillitöntä, jumalatonta ja miltei

iljettävän herjaavaa sanatulvaansa osoittaen mielenmalttia, mikä
häntä perästäpäin ihmetytti. Hän hämmästyi siinä määrin miestä,
hänen sielullisesti ja ruumiillisesti vaihtelevia tilojaan ja hänen
uhkailevaa ja verenvuodatukseen pakottavaa menettelyään juryyn
nähden, että hän miltei unohti, että hänen oma elämänsä oli
kyseessä.

Häikäistyn juryn poissaolo ei kestänyt kauan. Lausunto julisti

kaikki kolme vankia syyllisiksi. Peter Blood katsoi ympärilleen
punaiseen verhotussa salissa ja hetken hänestä näytti kuin
kalpeitten kasvojen muodostamat rivit olisivat huojuneet. Sitten hän
oli taas oma itsensä ja hän kuuli äänen kysyvän, mitä hänellä oli
sanomista siihen ja miksi hän ei saisi kuolemantuomiota, kun hän
kerran oli todistettavasti ollut mukana maanpetoksellisessa
toiminnassa.

Hän nauroi ja hänen naurunsa kuulosti aavemaisen kamalalta

kuoleman hiljaisuuden vallitessa oikeussalissa. Koko toimitus oli ollut
äärimmäisen luonnoton. Sanomatonta oikeuden pilkkaa, jota tuo
punaviittainen, tutkivasilmäinen ilveilijä oli jakanut, kostonhimoisen ja
raa’an ilkeämielisen kuninkaan lahjottava kätyri, jonka koko olemus
oli rienaajan. Peter Bloodin nauru taittoi kokonaan kärjen ilveilijän
ankaruudelta.

»Nauratteko, sir, hirttonuora kaulallanne, aivan iankaikkisuuden

kynnyksellä, jonka yli te aivan kohta olette astuva.»

Silloin Peter Blood kosti.

»Totisesti minulla on parempi syy nauruun kuin teillä, teidän

ylhäisyytenne. Sillä minulla on, ennen kuin lausutte tuomioni, vielä
jotakin sanomista teille. Teidän ylhäisyytenne näkee minut —
viattoman miehen, jonka ainoa rikos on siinä, että harjoitin
armeliaisuutta — hirttonuora kaulassa. Teidän ylhäisyytenne puhuu
minulle oikeusoppineena asiantuntevasti, mitä minulle on tapahtuva.
Minä saanen lääkärinä sanoa yhtä varmalla asiantuntemuksella,
mitä teidän ylhäisyydellenne on tapahtuva. Vakuutan teille, etten nyt
vaihtaisi osaani teidän kanssanne, että en vaihtaisi sitä nuoraa,
jonka te heitätte kaulaani, siihen kiveen, jota te kannatte
ruumiissanne: Se kuolema, jonka te ehkä nyt sanelette minulle, on
kepeä huvi siihen kuolemaan verrattuna, johon teidät on tuominnut
se suuri Tuomari, jonka nimeä te niin kevyesti käyttelette.»

Herra ylituomari jäykistyi, hänen kasvonsa muuttuivat

tuhkanharmaiksi ja hänen huulensa vavahtivat. Olisi voinut laskea
kymmeneen ennen kuin kuului ääntäkään hämmästyksestä
halvaantuneessa oikeussalissa Peter Bloodin lopetettua puheensa.
Kaikki, jotka tunsivat lordi Jeffreysin, käsittivät sen myrskyn edellä
vallitsevaksi tyveneksi ja varustautuivat rajuilman puhkeamisen
varalle. Mutta se ei puhjennut. Hitaasti, heikosti palasi väri
tuhkanharmaille kasvoille. Punaviittainen mies menetti jäykkyytensä
ja kumartui eteenpäin. Hänen ylhäisyytensä alkoi puhua. Hiljaisella
äänellä ja lyhyesti — paljon lyhyemmin kuin hänen tapansa oli
sellaisissa tilaisuuksissa ja aivan koneellisesti kuten ihmisien, jonka
ajatukset ovat kaukana siitä mitä huulet puhuvat — hän julisti
kuolemantuomion asiaankuuluvassa järjestyksessä ja viittaamatta
sanallakaan siihen, mitä Peter Blood oli sanonut. Lopetettuaan hän
vaipui peräti uupuneena tuoliinsa, silmät puoleksi ummessa ja otsa
kiiltävänä hiestä.

Vangit marssivat ulos.

Herra Pollexfenin — whig-puoluelainen huolimatta asemastaan

ylimpänä syyttäjänä — kuuli eräs juryn jäsenistä kuiskaavan
vierustoverinsa korvaan:
 »Sieluni kautta, tuo musta roisto säikähdytti hänen ylhäisyytensä
perin pohjin. Oikein käy sääliksi häntä, kun hänen täytyy kuolla
hirsipuussa. Sillä mies, joka pystyy pelottamaan Jeffreysiä, menisi
varmaan pitkälle.»

Neljäs luku

IHMISKAUPPAA

Herra Pollexfen oli yhtaikaa sekä oikeassa että väärässä, seikka

joka sattuu paljon useammin kuin yleensä luullaankaan.

Hän oli oikeassa lausuessaan välinpitämättömästi ajatuksensa,

että mies, jonka ilmeet ja sanat saattoivat pelästyttää niin pelätyn
miehen kuin lordi Jeffreys oli, pystyi luomaan luonteensa voimalla
huomattavan tulevaisuuden. Hän oli väärässä — vaikkakin
anteeksiannettavasti — otaksuessaan, että Peter Blood joutuisi
hirteen.

Olen sanonut, että niihin harmeihin, joita hänen

armeliaisuuskäyntinsä Oglethorpessa aiheutti hänelle, sisältyi —
vaikkei hän silloin sitä tietenkään käsittänyt — kaksikin syytä
kiitollisuuteen. Toinen oli se, että hän ylimalkaan joutui oikeuden
eteen, ja toinen taas, että oikeudenkäynti sattui syyskuun
yhdeksänneksitoista päiväksi. Yhdeksänteentoista päivään saakka
oli oikeuden tuomiot pantu täytäntöön pilkulleen ja siekailematta.
Mutta yhdeksännentoista päivän aamuna saapui Tauntoniin lordi
Sunderlandin, valtiosihteerin, lähetti, joka toi kirjeen lordi Jeffreysille.
Kirjeessä oli ilmoitus, että hänen majesteettinsa oli armollisesti
suvainnut käskeä, että yksi toistasataa kapinallista oli varattava
lähetettäviksi joillekin hänen majesteettinsa uutisviljelyksille
Jamaikaan, Barbados- tai jollekin Pienten Antillien saarelle.

Ei suinkaan pidä luulla, että tämä käsky johtui jonkinlaisesta

armollisuuden tunnosta. Lordi Churchill oli vallan oikeassa, kun hän
sanoi, että kuninkaan sydän oli yhtä tunteeton kuin marmori.
Havaittiin, että tuollainen summittainen hirttohomma oli mitä
häikäilemättömintä arvokkaan aineksen tuhlausta. Uutisviljelyksille
tarvittiin kipeästi orjia, ja terveen, voimakkaan miehen laskettiin
olevan ainakin kymmenen- viidentoista punnan arvoinen. Sitä paitsi
oli hovissa monta herrasmiestä, jotka mikä mistäkin syystä odottivat
kuninkaan puolelta jotakin suosionosoitusta. Tässä tarjoutui helppo
ja vaivaton keino suorittaa nuo pikku velat. Kapinallisten joukosta
saattoi erottaa osan, jonka voi lahjoittaa näille herroille heidän
vapaasti käytettävikseen.

Lordi Sunderlandin kirje antaa tarkat yksityistiedot siitä, miten

anteliaasti kuningas jakeli ihmislahjojaan. Tuhat vankia piti jaottaman
kahdeksan hoviherran ynnä muiden kesken, samalla kun kirjeen
jälkikirjoituksessa määrättiin sata vankia kuningattaren tarpeita
varten. Vangit piti heti lähetettämän kuninkaan eteläisille viljelyksille
ja heidän tuli jäädä sinne kymmeneksi vuodeksi ennen kuin he taas
pääsisivät vapauteen, ja oli niihin osiin siirtomaita, joihin heidät oli
määrätty, hetimmiten ilmoitettava heidän saapumisestaan ja muuten
huolehdittava siitä, että lähettämiseen heti ryhdyttiin.

Tiedämme ylituomarin sihteerin muistiinpanoista, miten lordi

Jeffreys sinä iltana raivohumalaisen tavoin moitti sitä
epäonnistunutta lempeyttä, johon kuningas oli saatu viekoitelluksi.
Me tiedämme, miten hän kirjeellisesti koetti saada kuningasta
peruuttamaan määräyksensä. Mutta Jaakko pysyi päätöksessään.
Se oli — puhumattakaan siitä hyödystä mitä se hänelle tuotti —
erinomainen osoitus siitä lempeydestä, joka oli hänelle ominaista.
Hän tiesi, että hän säästämällä täten heidän henkensä saattaisi
heidät suorastaan elävään kuolemaan. Monen heistä oli pakko
sortua Länsi-Intian kauheassa orjuudessa eloonjäävien hartaasti
kadehtimana.

Ja niin tapahtui, että Peter Blood ja hänen kanssaan Jeremias Pitt

ja Andrew Baynes, sen sijaan että olisivat joutuneet roikkumaan
hirressä kuten heidän tuomionsa määräsi, vietiin Bristoliin ja siellä
noin viidenkymmenen muun vangin kanssa sullottiin Jamaikan
kauppiaaseen.

Laivan ruumassa vallitseva ahtaus, kehno ravinto ja pilaantunut

juomavesi aiheuttivat pian heidän joukossaan vaikean taudin, johon
yksitoista kuoli. Heidän joukossaan oli myös onneton Oglethorpen
isäntä, joka oli raaisti raahattu rauhallisesta kodistaan, kukoistavan
puutarhansa keskeltä vain sen vian vuoksi, että oli tehnyt armeliaan
teon.

Ellei Peter Bloodia olisi ollut, olisi kuolleisuus varmaan noussut

paljon korkeammaksi. Alussa oli Jamaikan kauppiaan kapteeni
kiroillen ja uhkaillen vastannut tohtorin vastalauseisiin sen johdosta,
että sallittiin ihmisten kuolla sillä tavoin, ja hänen vaatimukseensa
saada haltuunsa lääkekirstu ja hoitaa sairaita. Mutta pian havaitsi
kapteeni Gardner, että hän saattoi joutua vastaamaan niin suuresta
inhimillisen kauppatavaran hukkaamisesta, ja sen vuoksi hän
vihdoinkin tajusi, että hän ilolla saattoi käyttää Peter Bloodin taitoa
hyväkseen. Tohtori kävi työhön innokkaana ja määrätietoisesti ja
menetteli niin taitavasti hoitaessaan sairaita ja parantaessaan
onnettomuustovereittensa oloa laivalla, että hän sai taudin enemmän
levenemisen estetyksi.

Joulukuun keskivaiheilla laski Jamaikan kauppias ankkurinsa

Carlisle-lahden poukamassa ja päästi maihin neljäkymmentäkaksi
eloonjäänyttä tuomittua kapinallista.

Jos nämä onnettomat olivat kuvitelleet — kuten monet näyttivät

tehneen — että he olivat tulossa johonkin villiin, asumattomaan
seutuun, niin oli varmaan se näky, joka heitä kohtasi jo ennen kuin
heidät oli laskettu laivan kupeella odottaviin veneisiin, omiaan
karkottamaan sen harhaluulon. He näkivät päinvastoin verraten
uljaan kaupungin, jonka talot olivat rakennetut eurooppalaiseen
malliin, mutta ei niin tiheään sulloutuneina kuin Euroopan
kaupungeissa oli tavallista. Kirkon torni kohosi hallitsevana
punaisten tiilikattojen yllä. Laajan sataman suuta vartioi linnoitus,
jonka tykkien suut pistivät esille muurin aukoista, ja hallitustalon pitkä
julkisivu näkyi kauaksi pieneltä mäeltä kaupungin yläpuolella. Tämä
mäki oli yhtä eloisan vihreä kuin konsanaan englantilainen
huhtikuinen kunnas, ja päiväkin muistutti elävästi huhtikuista päivää
Englannissa, sillä runsaiden sateiden kausi oli juuri päättynyt.

Laajalla mukulakivisellä rantaäyräällä he tapasivat punatakkisen

sotaväenosaston, joka oli heitä vastaanottamassa, sekä väkijoukon
— jonka heidän tulonsa oli sinne viekoitellut — joka puvuissaan ja
tavoissaan sangen vähän erosi siitä joukosta, jota kotoisissa
merisatamissa tavallisesti näki, paitsi siinä, että siinä oli vähemmän
naisväkeä ja enemmän neekereitä.

Kun heidät oli järjestetty riviin sillalle, tuli heitä tarkastamaan

kuvernööri Steed, lyhyt, ryhdikäs ja punakka herrasmies,
taftikankaisessa puvussa, jossa oli suunnaton määrä kultapunosta,
ontuen hieman ja nojaten raskaasti tukevaan eebenpuiseen keppiin.
Hänen jäljessään astui kookas, lihava mies, pystyssä päin ja hartiat
paljon korkeammalla kuvernööriä, puettuna Barbados-saaren miliisin
everstin pukuun, ja häijy ilme mahdottoman suurilla kellahtavilla
kasvoillaan. Hänen sivullaan ja omituisena vastakohtana hänen
korkeudelleen asteli kepeän poikamaisesti hoikka nuori neitonen
muodinmukaisessa ratsastuspuvussa. Leveälierinen harmaa hattu,
jossa hulmusi punertava kamelikurjen sulka, peitti osaksi hänen
soikeat kasvonsa, joiden hienolle värille ei edes etelän syövyttävä
aurinkokaan ollut mahtanut mitään. Punaruskeat, pitkät kutrit
riippuivat hänen hartioilleen saakka. Rehellisyys ja suoruus paistoi
hänen utuisista silmistään, jotka olivat aivan selkosellaan, ja sääli oli
vaimentanut veitikkamaisuuden, joka tavallisesti karehti hänen
raikkailla, nuorilla huulillaan.

Peter Blood hämmästyi huomatessaan tuijottavansa tytön pirteitä

kasvoja, jotka näyttivät niin huonosti sopeutuvan tähän ympäristöön,
ja huomattuaan, että häneen kohdistui yhtä tarkkaava katse, hän
liikahti levottomasti. Hän havaitsi itse, miten surkea nähtävyys hän
mahtoi olla. Pesemättömänä, tukka takkuisena ja hajallaan, musta,
siivoton parta leuassa ja hänen kerran niin hieno kamlottikankainen
pukunsa, jossa hänet oli vangittu, niin repaleisena, että se olisi ollut
häpeäksi variksenpelätillekin, hän ei suinkaan ollut mitään herkullista
silmänruokaa niin suloiselle olennolle. Siitä huolimatta tyttö ei
kääntänyt hämmästynyttä, miltei lapsellista ja säälin ja ihmetyksen
sekaista katsettaan hänestä. Hän kosketti kädellään kumppaninsa
punaista hihaa, ja tämä käänsi pahantuulisesti murahtaen suuren
ruhonsa niin, että joutui aivan päin tyttöä.

Katsoen miestä suoraan silmiin puhui tyttö hänelle vakavana

jotakin, mutta eversti ei ilmeisesti kuunnellut puolella korvallakaan.
Hänen pienet helmenkaltaiset silmänsä, joiden välissä oli pitkä ja
paksu nenä, olivat kääntyneet tytöstä poispäin ja suuntautuivat
Bloodin vieressä seisovaan vaaleatukkaiseen ja vankkarakenteiseen
nuoreen Pittiin…

Kuvernööri oli myös pysähtynyt hetkeksi, ja pieni kolmihenkinen

seurue jäi siihen keskustelemaan. Peter Blood ei voinut kuulla, mitä
tyttö sanoi, sillä tämä alensi ääntään. Everstin ääni kuului hänen
korviinsa sekasortoisena rummutuksena, mutta kuvernööri ei sen
sijaan ollut varovainen eikä pieniääninen. Hänellä oli kimakka ääni,
joka kantoi kauaksi, ja luullen itseään sukkelaksi hän tahtoi, että
kaikki olisivat kuulleet häntä.

»Mutta rakas eversti Bishop, teidän on tietenkin ensin valittava

tuoreimmat tuosta kukkavihosta ja vielä omaan määräämäänne
hintaan. Sitten vasta lähetämme heidät huutokaupattaviksi.»

Eversti nyökäytti päätään myöntymykseksi. Hän korotti äänensä

vastaukseksi. »Teidän ylhäisyytenne on kovin hyvä, mutta tottavie,
tuo joukko näyttää niin kehnolta, ettei siitä juuri paljoakaan ole
hyötyä viljelyksillä.» Hänen pienet silmänsä tutkivat vankeja
uudelleen, ja halveksunta, jota hän tunsi heitä kohtaan, korosti
hänen häijyä ilmettään. Näytti siltä kuin häntä olisi harmittanut,
etteivät he olleet sen paremmassa kunnossa. Sitten hän viittasi
luokseen kapteeni Gardnerin ja he keskustelivat jonkin minuutin
erään luettelon johdosta, jonka kapteeni hänen pyynnöstään oli
ottanut esille.

Sitten hän työnsi luettelon syrjään ja lähti yksin vankeja kohti,

katsellen heitä huulet nyrpällään. Nuoren somersetshireläisen
merikapteenin eteen hän vihdoin pysähtyi ja seisoi hetken tuumien
hänen arvoaan. Sitten hän koetteli nuoren miehen käsivarsilihaksia
ja käski hänen avata suunsa, jotta näkisi hänen hampaansa. Hän
pisti huulensa pitkään tönölle ja nyökäytti.

Olkansa takaa hän virkkoi Gardnerille:

»Viisitoista puntaa tästä miehestä.» Kapteeni näytti

kauhistuneelta.

»Viisitoista puntaa! Se ei ole puoltakaan siitä, mitä aioin pyytää

hänestä.»

»Se on puolta enemmän kuin aioin antaa hänestä», murahti

eversti.

»Mutta kolmekymmentäkin on helppo hinta, teidän armonne.»

»Sillä hinnalla saan neekerinkin. Nämä valkoiset siat eivät jaksa

elää täällä. He eivät kelpaa täkäläiseen työhön.»

Gardner alkoi kehua Pittin terveyttä, nuoruutta ja voimia. Hän ei

kehunut ihmistä hänessä, vaan kuormajuhtaa. Pitt, tunteellisena
miehenä, seisoi mykkänä ja liikkumattomana. Ainoastaan
värinvaihtelut hänen kasvoillaan ilmaisivat sitä sisäistä taistelua, jolla
hän sai säilytetyksi mielenmalttinsa.

Peter Bloodia iljetti inhottava tinkiminen.

Taempana vankirivin suuntaa käveli neiti keskustellen kuvernöörin

kanssa, joka hymyili ja pöyhisteli kävellessään hänen vieressään.
Tyttö ei tiennyt mitään siitä inhottavasta kaupankäynnistä, jossa
eversti paraikaa askaroi. Oliko hän myös välinpitämätön siitä,
ihmetteli Blood itsekseen.
 Eversti Bishop kääntyi kantapäillään jatkaakseen kaupantekoa.

»Nostan kahteenkymmeneen asti. Penniäkään ei enempää ja

sekin on jo puolta enemmän kuin Grabstonilta saatte heistä.»

Kapteeni Gardner huomasi, että tarjous oli lopullinen, joten hän

huokasi ja suostui. Bishop oli jo menossa eteenpäin vankiriviä pitkin.
Peter Bloodiin ja hänen vieressään seisovaan kuihtuneeseen
nuorukaiseen eversti katsahti vain ohimennen halveksivasti. Mutta
seuraava mies, keski-ikäinen jättiläinen nimeltä Wolverstone, veti
hänen huomionsa puoleensa ja tinkiminen alkoi uudelleen.

Peter Blood seisoi loistavassa auringonpaisteessa ja veti

keuhkoihinsa ilmaa niin hyväntuoksuista, ettei hän eläissään ollut
sellaista hengittänyt. Se oli täynnä outoa tuoksua, kukkivan
havumetsän, maustepippurin ja hyvänhajuisten setrien sekoitusta.
Hän vaipui hyödyttömiin mietteisiin, joihin suloinen tuoksu hänet
viekoitteli. Hänellä ei ollut pienintäkään halua keskusteluun, eikä
myöskään Pittillä, joka seisoi synkkänä hänen vieressään ja jonka
mieltä pääasiassa painoi sillä hetkellä se ajatus, että hänen nyt täytyi
erota siitä miehestä, jonka vierellä hän oli seissyt viimeiset raskaat
kuukaudet ja jota hän oli oppinut rakastamaan erinomaisena
neuvonantajana ja auttajana. Turvattomuuden ja yksinäisyyden
tunne, jonka rinnalla kestetyt vaivat eivät tuntuneet miltään, valtasi
hänet. Pittistä ero tuntui kestettyjen kärsimysten huipulta.

Muitakin ostajia tuli, tarkasteli heitä ja meni taas menojaan. Sitten

syntyi rivin päässä levotonta liikehtimistä. Gardner puhui kovalla
äänellä ilmoittaen jotakin ostajille, jotka olivat odottaneet vuoroaan,
kunnes eversti Bishop oli valinnut parhaimmat inhimillisestä
kauppatavarasta. Kun hän oli lopettanut, huomasi Blood
katsoessaan sinnepäin, että tyttö puhutteli Bishopia ja viittasi
hopeahelaisella ratsupiiskallaan rivin toiseen päähän. Bishop varjosti
kädellään silmiään tytön osoittamaan suuntaan. Sitten hän lähti
hitaasti, astuen raskasta, vyöryvää käyntiään Gardnerin kanssa
takaisin rivin alkupäähän, tytön ja kuvernöörin seuratessa perässä.
He astelivat eteenpäin, kunnes eversti oli Bloodin kohdalla. Hän aikoi
kävellä edelleen, mutta silloin tyttö kosketti ratsupiiskallaan hänen
käsivarttaan ja sanoi:

»Tätä miestä minä tarkoitin.»

»Tätä?» kuului halveksiva vastaus. Peter Blood huomasi

tuijottavansa pariin helmentapaisia ruskeita silmiä, jotka olivat
painuneet kellahtavaan, rasvaiseen naamaan kuin pari korinttia
vehnäkohokkaaseen. Hän tunsi, kuinka halveksivan loukkaava
tarkoitus nostatti hänen verensä kasvoihin. »Pyh, luukasa, mitä minä
sillä tekisin.»

Hän oli kääntymässä, kun Gardner tuli väliin.

»Olkoon, että hän on hoikka, mutta hän on sitkeä, sitkeä ja terve.

Kun toinen puoli heistä oli sairaana ja toinen puoli sairastumaisillaan,
niin pysyi tämä roisto jaloillaan ja lääkitsi vielä toisia. Ellei häntä olisi
ollut, niin heitä olisi kuollut paljon enemmän. Sanokaamme viisitoista
puntaa. Se on kohtuullinen hinta. Hän on sitkeä, vakuutan teidän
armollenne, hän on sitkeä ja voimakas, vaikka onkin laiha. Hän on
juuri niitä miehiä, jotka kestävät kuumuutta kun sen aika tulee.
Ilmanala ei tapa häntä, ikävä kyllä.»

Kuvernööri Steed nauraa hykerteli. »Kuulittehan, eversti. Uskokaa

vain veljentytärtänne. Hänen sukupuolensa tuntee heti miehen
nähdessään hänet!» Ja hän nauraa hytkytti hyvillään
sukkeluudestaan. Mutta hän nauroi yksin. Suuttumuksen puna
valahti everstin veljentyttären kasvoille, kun taas eversti itse oli liian
kiintynyt kaupanhierontaansa kuunnellakseen kuvernöörin
sukkeluuksia. Hän pyyhkäisi kädellään leukaansa ja mutristi huuliaan
hieman. Jeremias Pitt pidätti hengitystään jännityksestä.

»Annan kymmenen puntaa hänestä», sanoi eversti vihdoin.

Peter Blood rukoili sisimmässään, ettei tarjousta hyväksyttäisi.

Syistä, joita hän ei olisi voinut selittää, hän tunsi tavatonta
vastenmielisyyttä ajatellessaan joutuvansa tuon raa’an, eläimellisen
miehen omaisuudeksi ja sen kautta tavalla tai toisella myös
samettisilmäisen tytön omaisuudeksi. Mutta kohtalon määräykseltä
säästyäkseen tarvittiin enemmän kuin mitä vastenmielisyys saattoi
aikaansaada. Orja on orja eikä hänellä ole voimaa muuttaa
sallimuksen säädöksiä. Peter Blood oli myyty eversti Bishopille —
vastenmieliselle ostajalle — häpeällisestä kymmenen punnan
hinnasta.

Viides luku

ARABELLA BISHOP

Eräänä tammikuun aurinkoisena sunnuntaiaamuna, noin kuukausi

Jamaikan kauppiaan saapumisen jälkeen Bridgetowniin ratsasti neiti
Arabella Bishop setänsä kaupungin pohjoisenpuoleisilla mäkimailla
sijaitsevasta upeasta talosta. Häntä seurasi kaksi neekeripalvelijaa,
jotka ravasivat hänen jäljessään kunnioittavan välimatkan päässä, ja
hänen matkansa päämääränä oli kuvernöörin talo, jonne hän oli
menossa tervehtimään kuvernöörin puolisoa, joka vastikään oli
sairastellut. Noustuaan pienen heinäisen kukkulan laelle hän näki
hoikan, pitkän ja tavalliseen herrasmiehen pukuun pukeutuneen
miehen tulevan vastaansa. Mies oli hänelle outo, ja outo henkilö
saarella oli harvinainen ilmiö. Ja kuitenkaan hän ei näyttänyt
Arabellasta aivan vieraalta.

Arabella-neiti pysähdytti hevosensa ollen ihailevinaan näköalaa,

joka kyllä olikin katsomisen arvoinen. Mutta — salaa hän katseli
syrjäsilmällä tarkkaavasti vastaantulevaa miestä. Hän sai hieman
korjata äskeistä havaintoaan hänen vaatetukseensa nähden. Se oli
kylläkin siisti, mutta kaukana gentlemannin puvusta. Takki ja housut
olivat yksinkertaista kotikutoista, ja jos ne istuivat hyvin, oli se
pikemminkin hänen siron vartalonsa kuin räätälin ansiota. Hänen
sukkansa olivat raakaa, karkeaa puuvillaa, kangashattu, jonka hän
kunnioittavasti nosti päästään tullessaan tytön kohdalle, oli vanha ja
nauhoja tai töyhtöä vailla. Se, mikä tytöstä äsken oli näyttänyt
tekotukalta, olikin läheltä nähtynä vain miehen oma tuuhea ja
aaltoileva tukka.

Hänen kasvonsa olivat puhtaiksi ajetut ja vakavat, ja hän katsoi

hämmästyttävän sinisillä silmillään tarkkaavasti tyttöä. Mies oli
menossa tytön ohi, mutta tämä esti sen.

»Luulen että tunnen teidät, sir», hän sanoi.

Hänen äänensä oli reipas ja poikamainen, ja muutenkin oli hänen

käytöksessään jotakin poikamaista, jos nyt niin somasta tytöstä voi
sellaista sanoa.

Se pohjautui hänessä ehkä eräänlaiseen vapaaseen, suoraan

luonteenpiirteeseen, joka halveksi hänen sukupuolensa tavallista
teennäisyyttä ja joka saattoi hänet hyviin väleihin koko maailman