ĐỀ CƯƠNG CÔNG NGHỆ VI SINH

Chương 1: Đại cương về Công nghệ sinh học

I. Khái niệm công nghệ sinh học
ĐN: CNSH là công nghệ sử dụng các quá trình sinh học của tế bào (vi sinh vật, động vật,
thực vật) để sản xuất sản phẩm ở quy mô công nghiệp phục vụ lợi ích của con người.
Nghĩa rộng:
Gồm nhiều dạng sử dụng VSV vào SX như làm rượu, men bánh mì, fomage, tương... và các
KT hiện đại di truyền học phân tử (> 100 TK trước)
Nghĩa hẹp:
Những kĩ thuật hiện đại như tái tổ hợp DNA, biến nạp gen, cố định enzym... (Tính từ 1970)
II. Phân loại CNSH

1. Phân loại theo thời gian

- CNSH truyền thống
+ Các quy trình chế biến, bảo quản thực phẩm, xử lý đất đai, phân bón, giống cây trồng và
động vật phục vụ nông nghiệp, chăn nuôi
+ Các quá trình lên men công nghiệp SX acid, acid amin, acid hữu cơ, dung môi, kháng sinh,
vitamin, enzym...
+ Thực phẩm lên men truyền thống
+ SX phân bón và thuốc trừ sâu VSV
+ SX sinh khối giàu protein
+ Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật
+ Lên men VSV SX acid amin, acid hữu cơ, dung môi, kháng sinh, vitamin, enzym...
+ Thụ tinh nhân tạo
- CNSH hiện đại
+ Công nghệ di truyền
+ CN tế bào
+ CN enzym và protein
+ CN VSV, CN môi trường...
+ Gắn với các đối tượng mang gen tái tổ hợp
+ NC genome
+ Thực vật và động vật chuyển gen
+ Động vật nhân bản
+ Chip DNA
+ Liệu pháp tế bào và gen
 + Protein trị liệu
+ Tin sinh học
+ Công nghệ sinh học nano
+ Hoạt chất sinh học
2. Lĩnh vực y dược
CNSH đang giúp nhân loại:
- Giảm tỷ lệ mắc bệnh truyền nhiễm
- Cứu sống hàng triệu trẻ em
- Thay đổi tỷ lệ mắc các bệnh nghiêm trọng, đe dọa tính mạng trên thế giới
- Tạo ra các công cụ chính xác hơn để phát hiện bệnh
- Điều chỉnh phương pháp điều trị, tạo ra các dược phẩm mới để giảm thiểu rủi ro sức khỏe và
tác dụng phụ
III. Lịch sử phát triển của CNSH
GIAI ĐOẠN CỔ ĐIỂN: đến cuối TK 19: GĐ lên men truyền thống
- CMSH lần 1 – Công nghệ lên men – lịch sử lâu đời nhất, tỷ trọng lớn nhất. Nhằm khai thác
khả năng của VSV, tạo điều kiện cho VSV hoạt động với hiệu suất cao
- Thực phẩm và đồ uống lên men (Bia, rượu, giấm, tương, dưa cà, phomat, bánh mì...)
VD: Nho được trồng từ 7.000 năm trước CN, sau đó rượu vang được SX.
- Thủ công, kinh nghiệm, thụ động không biết đến vai trò của VSV => hiệu suất thấp, không
đảm bảo GMP, SOP
- Chưa biết đến sự tồn tại và vai trò của VSV
- Nuôi cấy hở, nguồn gốc giống hoang dại => dễ nhiễm nấm mốc, sinh chất độc, dễ nhiễm
VSV, giống khác (dễ nhiễm tạp)
Giai đoạn CẬN ĐẠI: Đến nửa sau TK 20
- CMSH lần 2 – Công nghệ tế bào – Kỹ thuật nuôi cấy mô (tế bào động vật, thực vật) trong môi
trường nhân tạo
- Giữa TK 19 - Pasteur: bản chất sự lên men
- 1928 - Flemming tìm ra Penicillin
- Các SP lên men: kháng sinh, acid amin, enzym, vaccin, vitamin...
- Chọn lọc các thể đột biến cho năng suất cao hơn
- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô
- Nuôi cấy VSV chủ động, quy mô công nghiệp, thiết bị hiện đại, cơ giới hóa
- Lên men kín, giống thuần chủng, chọn lọc
=> năng suất cao, ít bị nhiễm tạp
Giai đoạn HIỆN ĐẠI
- CMSH lần 3 – Công nghệ gen – Sinh học và di truyền học phân tử. Cải biến chủng giống
nhằm nâng cao hiệu suất và đa dạng hóa sản phẩm
- Các enzym giới hạn, plasmid
- Công nghệ nano
- VSV biến đổi gen: Sản xuất insulin, interferon, Các KIT chẩn đoán..
- Thực vật biến đổi gen: Năng suất cao, tự cố định đạm, chịu khô hạn, kháng sâu rầy...
- Động vật biến đổi gen: Tăng sản lượng và chất lượng (thịt, sữa, trứng..), SX các cơ quan cấy
ghép...
Mục tiêu của CNSH hiện đại:
+ Cung cấp các sản phẩm và công nghệ đột phá để chống lại các bệnh nguy hiểm và hiếm
gặp
+ Giảm thiểu ô nhiễm môi trường (VD: xăng sinh học)
+ Cung cấp thực phẩm sạch
+ Sử dụng ít năng lượng sạch hơn
+ Sử dụng quy trình SX công nghiệp an toàn hơn, sạch hơn và hiệu quả hơn
IV. Phân loại sản phẩm của VSV

2. Theo giá trị thương mại của SP: (giá trị lợi nhuận giảm dần)
Theo Thomas D. Brock (1995)
- Ethanol - Bia, rượu, nhiên liệu
- Sinh khối - Biomass, Protein đơn bào, Nấm men, nấm sợi, tảo, vi khuẩn..
- Enzym - amilase, protease, rennin, lipase,
glucoisomerase, penicillinacylase..
- Dược phẩm - kháng sinh, vitamin, alcaloid..
- Chất điều vị - amino acid (glutamic, lysin, triptophan), aspartam...
 - Hoá chất thông dụng - acid citric, buthanol, acid acetic, acid lactic, glycerol...
3. Theo quá trình trao đổi chất của VSV
a. SP sinh khối tế bào VSV (vật chất tế bào)
Dinh dưỡng => TB (sinh khối) (sản phẩm)
- Sản phẩm là tế bào VSV, sống hoặc chết.
- Gồm:
+ Chế phẩm probiotics: Sinh khối VK lactic và một số VSV có lợi để SX chế phẩm men tiêu
hóa VSV; bổ sung vào sữa cho trẻ em...
Chứa VSV phải còn sống, không gây bệnh và hoàn toàn có lợi
probiotic là vật chất tế bào -> thu cuối pha log do cuối pha log VSV phát triển , nhanh lên
mạnh nhất -> số lượng VSV tạo thành lớn nhất và chất lượng tạo ra tốt do chưa sinh tạp
+ Vaccin: được SX từ sinh khối một số VSV gây bệnh (vaccin tả uống, vaccin bại liệt...)
Có thể VSV còn sống/đã chết
+ Protein đơn bào: Sinh khối vi tảo hoặc một số VSV không độc tính, giàu protein, giàu vitamin
nhóm B và chất khoáng, được dùng làm thuốc hay thực phẩm cho người và thức ăn cho gia
súc.
- Giống VSV: sinh khối TB VSV dùng làm giống nuôi cấy
VD: giống nấm men dùng làm men bánh mì, lên men rượu, giống VK lactic dùng làm sữa
chua, phomat, xúc xích...
- Chế phẩm sinh học: sinh khối VK cố định đạm làm phân bón vi sinh, sinh khối VSV trong
sản xuất các chế phẩm vi sinh xử lý rác, nước thải...
- Thuốc trừ sâu, diệt chuột: sinh khối vi khuẩn sinh độc tố đối với các loại sâu thân mềm phá
hoại rau màu, để sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, sinh khối vi khuẩn làm thuốc diệt chuột...
b. Sản phẩm trao đổi chất
Dinh dưỡng => Sản phẩm + Tế bào (nội bào+ngoại bào)
VD: Sản phẩm ngoại bào: men chua acid lactic giấm, ethanol, acid acetic
VD: dấm, kháng sinh, khí metan, rượu, enzym, acid amin
Quá trình tạo SP là quá trình trao đổi chất của VSV, bao gồm
- Các SP cuối cùng
- Các SP bậc 1
- Các SP bậc 2
- Enzym
● SP cuối cùng:
- Luôn được tế bào SX quá thừa, dễ sản xuất nhất (không cần dinh dưỡng cũng lên
men) VD: ethanol, dấm
- Gắn với quá trình sinh trưởng của VSV
Được tế bào tổng hợp ngay từ đầu pha log cho đến khi kết thúc pha cân bằng, cuối
quá trình thu được nhiều sản phẩm nhất (chỉ dừng khi chết)
Thu sp cuối cùng ở cuối pha cân bằng: VSV bắt đầu già yếu, không sinh ra sp nữa
SP cuối cùng có từ pha nhân lên chậm
- Bao gồm:
+ Bia, rượu vang, ethanol, glycerol, mannitol, butanol, aceton, khí methan..
+ Các SP từ sữa (phomat, sữa chua...
+ Acid lactic, acid acetic, acid propionic...
- Ethanol là SP cuối cùng có truyền thống lâu đời nhất, mang lại nhiều lợi nhuận nhất
- Một số chất khác lactic acid, khí hydro (H2), khí carbon dioxide (CO2), khí methan
- Một số SP khác đạt giá trị thương mại cao như glycerol (khoảng 600.000 tấn/năm), mannitol
(khoảng 100 triệu US $/năm)...
● SP bậc 1 (SP sơ cấp): hầu như tế bào nào cũng có
SP bậc một hay SP sơ cấp là những chất được tạo thành trong pha sinh trưởng đầu tiên của
VSV (khi nào VSV chết mới không tạo ra TB nữa), bao gồm:
- Các chất tham gia tạo thành cấu trúc tế bào (acid amin, nucleotid, vitamin, đường..)
- Các SP trung gian tạo thành trong quá trình trao đổi chất (acid hữu cơ)
- SP bậc một có thể có cấu trúc rất đa dạng, từ khí H2 (2 Da) Vitamin B12 (1.355Da)

VTM B1 ko sx bằng lên men, chỉ bằng hóa học

VTM B2, B12 chỉ sx bằng lên men sinh vật
 - Acid amin: Các acid amin được SX với số lượng lớn nhất là: glutamic acid, aspartic acid,
phenylalanine, lysine
- Vitamin: Có 7 vitamin và tiền vitamin được SX thương mại bằng công nghệ lên men vi sinh
vật: beta-carotene, vitamin B12, vitamin B13, riboflavin, vitamin C, linolenic acid (vitamin
F), ergosterol
Hơn 50% sản lượng vitamin (hóa học và sinh học) được sử dụng trong ngành chăn nuôi
- Các acid hữu cơ: Một số acid hữu cơ quan trọng được SX bằng CN lên men gồm acid citric,
acid acetic, acid lactic, acid gluconic, acid itaconic
Acid lactic sinh ra bởi vi khuẩn lactic thì là sản phẩm cuối cùng, nhưng cũng có 1 số loại
VSV sinh acid lactic như sp trung gian TDC thì là sp bậc 1
- Các nucleotid và nucleosid: Một số nucleotid có giá trị thương mại là purine ribonucleoside
5’- monophosphate, có tên là Guanisine monophosphate (5’-GMP) và isosinic
monophosphate (5’-IMP)
Sản lượng GMP và IMP ở Nhật đạt 2500 tấn, ~ 350 triệu USD/năm
- Các sản phẩm bậc 1 khác: Một số SP bậc 1 khác như Xanthan gum, Dextran, scleroglucan,
curdlan, alginat, galactomannan, glucomannan, mannans...
Sản lượng vi tảo Rhodophyta và Phaeophyta (SX agar, alginate, carrageenan) đạt 7.5 triệu
tấn/năm, đem lại 6 tỷ USD
Thu sản phẩm bậc 1 ở cuối pha cân bằng: pha log sản phẩm tăng nhanh nhất, đến pha cân bằng các sp
trung gian tạo thành trong quá trình TDC vẫn có thể tăng. SP bậc 1 bắt đầu có từ pha nhân lên chậm
Phân biệt SP cuối cùng và SP bậc 1:
SP cuối cùng lúc nào cũng sản xuất quá thừa rất nhiều mà không cần thiết nên rất dễ sản xuất (VD:
ethanol độc cho TB, không cần cho TB nhưng vẫn sản xuất thừa, các acid quá thừa có thể gây ức chế
VSV như acid lactic, acid acetic)
SP bậc 1 là cần thiết cho TB thì mới sinh ra (cần thiết để tham gia vào cấu trúc tế bào, sp trung gian
tạo thành trong quá trình TĐC) (VD: vitamin rất cần thiết cho TB)
● SP bậc 2:
Là các chất:
- Tạo thành gần vào lúc kết thúc pha log (pha sinh trưởng đầu), có thể vào gần giữa pha cân
bằng (TB hoàn thiện thì SP mới đc sinh ra)
- Nên thu SP vào cuối pha cân bằng k nên thu ở cuối pha suy vong vì cuối pha suy vong thì số
lượng tế bào chết tăng -> tạp sinh ra nhiều-> khó xử lý dịch chiết sau khi thu.
- Chỉ tồn tại trong 1 số loài, TB, không phải lúc nào cũng sinh ra => do ko tham gia vào cấu
trúc TB
- Khó thu SP, Phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy => cần phải nuôi cấy 1 thời gian thì nó mới
sinh ra
- Gồm: Kháng sinh, 1 số statin, 1 số alcaloid, Độc tố (vaccin giải độc tố, thuốc trừ sâu...), chất
kích thích sinh trưởng
Các kháng sinh
CN lên men SX kháng sinh bắt đầu từ năm 1940. Thị trường KS toàn cầu đạt
khoảng 46.8 tỷ (2012) trong đó chiếm đa phần là các betalactam
Hầu hết các KS được SX bằng CN lên men VSV (trừ nhóm Flouroquinolon)
Khoảng 12000 chất KS từ VSV được phát hiện và mô tả nhưng chỉ có ~ 160 chất được SX và mang
lại lợi nhuận
Các SP bậc 2 khác
Một số chất hạ cholesterol hiệu quả được SX từ VSV như compactin, lovastatin
(Mevinolin), pravastatin...
Trong các statins có compactin, lovastatin, pravastatin là SP từ VSV, simvastatin là SP bán tổng hợp;
còn flu-, ator-, pita- và rosuvastatin là SP tổng hợp hóa học
Avermectins (Ivermectin, Doramectin), nhóm thuốc SX từ VSV chống ký sinh trùng
Acid clavulanic (kháng enzym betalactamase): SX từ xạ khuẩn Str. Clavuligerus
Độc tố của vi khuẩn uốn ván (Clostridium tetani), vi khuẩn bạch hầu (Corynebacterium diphtheria)...:
vaccin giải độc tố
Thuốc trừ sâu BT (Bacillus thuringiensis)
Chất kích thích sinh trưởng Gibberellin
● Enzym
- Hầu hết các enzym công nghiệp được SX nhờ VSV, trong đó 60% là các protease.
- 75% protease dùng trong CN bột giặt, 10% trong CN SX phomai, còn lại là thuộc da, thực
phẩm...
 - Ứng dụng:
Thuốc: có > 60 Ez
- Loại cục máu đông: Streptokinase, Urokinase, serratiopeptidase
- Sạch vết thương: Proteinase, chymotrypsin collagenase, papain, trypsin
- Trị bệnh bạch cầu: L asparaginase
- Hỗ trợ tiêu hóa: pepsin, amilase, pancrease, bromelain...
- Trị nhiễm khuẩn: lysozyme
Chẩn đoán
- Glucooxydase: KIT tiểu đường
- GPT - glutamic piruvat transaminase: gan
- GOT - glutamic oxalat transaminase: nhồi máu cơ tim
SX nguyên liệu làm thuốc:
- Penicillinacylase
- Cephalosporinacylase…
c. SP chuyển hóa
- Quá trình sử dụng VSV hoặc enzym VSV để thực hiện các phản ứng hoá học đặc biệt mà hoá
học hữụ cơ không làm được hoặc quá phức tạp, đắt tiền được gọi là chuyển hoá sinh học

SP ko phải là SP nội bào

Tiền sản phẩm có thể ko phải từ VSV
- Chuyển hóa Penicillin thành các nguyên liệu bán tổng hợp các kháng sinh mới nhóm
beta-lactam

- Chuyển hoá sinh học chủ yếu chỉ được ứng dụng để SX một số hormone, vitamin C, acid
acetic
 CHƯƠNG 2: GIỐNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THUỐC VÀ CÁC CHẾ PHẨM
SINH HỌC
1. Tiêu chuẩn chung
Tiêu chuẩn chung của giống VSV dùng SX thuốc:
- Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng
- Không gây bệnh, không hoặc ít độc tính
- Cho SP với hiệu suất cao
- Ít tạo SP phụ
- SP dễ tách chiết
- Dễ nuôi cấy, có thể sử dụng nguyên liệu rẻ tiền
- Phải ổn định trong bảo quản và dễ bảo quản.
Giống là yếu tố quan trọng đầu tiên quyết định giá thành SP
a. Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng
- Phải là giống thuần khiết, không nhiễm VSV lạ, ổn định phenotype và genotype
- Phải liên tục tuyển chọn qua các thế hệ, nếu không giống sẽ bị hồi biến tính hoang dại, thoái
hóa => hiệu suất thấp
- Trong công nghiệp thường sử dụng giống đã biến đổi nguồn gốc di truyền năng suất cao và
ổn định
- Giống thuần chủng (gốc) được lưu giữ tại các bảo tàng giống lớn trên thế giới
- Giống trong lên men truyền thống ở quy mô thủ công, gia đình thường được tuyển chọn sàng
lọc từ các chủng tự nhiên => không ổn định, năng suất thấp
- Giống có thể phân lập từ MT đang SX để chọn ra chủng thích ứng với điều kiện SX (lấy ở
pha log/cân bằng). Nếu mua từ các ngân hàng giống chỉ được các giống gốc, không có hiệu
suất cao
b. Không gây bệnh, không hoặc ít độc tính (tiêu chí bắt buộc với probiotic)
(Lưu ý: SX vaccin..., SX probiotic)
Probiotic phải là hoàn toàn không gây bệnh còn vaccine thì không
Phân loại VSV theo độ an toàn:
- Không gây bệnh – an toàn (GRAS – Generally Recognized As Safe)
- Có thể gây khó chịu cho người, động vật, gây ô nhiễm môi trường
- Gây bệnh, truyền bệnh nhưng chữa được
- Gây bệnh, truyền bệnh rất nhanh nhưng chưa có cách chữa

c. Cho SP với hiệu suất cao:

- Sản phẩm chính phải chiếm đa số cả về số lượng và chất lượng
VD: Men tiêu hóa muốn hiệu suất cao phải sinh sản nhanh
- Tùy thuộc sản phẩm là gì: Đối với probiotics cần sinh khối nhiều, đối với KS cần lấy ở pha
log
d. Ít SP phụ
e. SP dễ tách chiết:
 - SP ngoại bào: SP phải dễ tách khỏi môi trường nuôi cấy và sinh khối
VD: ethanol, acid acetic
- SP nội bào: dễ phá vỡ tế bào, bền với acid… hay dùng lysozym để phá vỡ tế bào
f. Dễ nuôi cấy:
- Tốc độ trao đổi chất nhanh mạnh (nhanh tạo SP đích).
- Phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm.
- Phát triển tốt ở điều kiện không hoặc ít cần bổ sung các yếu tố tăng trưởng, vitamin...
- Sinh sản nhanh, phát triển mạnh trong môi trường SX. Phát triển nhanh và mạnh thì sẽ lấn át
các VSV tạp nhiễm.
g. Ổn định di truyền trong bảo quản, dễ bảo quản.
2. Các bước phân lập một VSV
Để có chủng VSV năng suất cao cần thu thập từ thiên nhiên, lập bộ sưu tập giống, bảo quản chủng
giống
- Có thể mua chủng giống từ các bộ sưu tập hay ngân hàng chủng giống
- Có thể phân lập từ thiên nhiên:
+ Rẻ
+ Giảm phụ thuộc ngân hàng giống
+ Ưu thế độc quyền chủng SX
2.1. Tìm kiếm VSV sinh kháng sinh
Hầu hết các kháng sinh được SX bằng công nghệ lên men vi sinh vật, phân lập chủng giống từ tự
nhiên là nguồn chính SX công nghiệp
Tiêu chuẩn VSV sinh kháng sinh
- Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng
- Không gây bệnh, không hoặc ít độc tính (không quan trọng vd KS chống ung thư rất độc
nhưng vẫn phải dùng)
- Sinh Kháng sinh với hiệu suất cao (quan trọng nhất)
- Ít tạo SP phụ
- SP dễ tách chiết
- Dễ nuôi cấy, có thể sử dụng nguyên liệu rẻ tiền
- Phải ổn định trong bảo quản và dễ bảo quản

Thống kê từ năm 2010 cho thấy có khoảng 12.000 chất kháng sinh, trong đó:
70% có nguồn gốc từ vi sinh vật, trong số đó:
- 67% từ xạ khuẩn (VK Gr(+)): Cloramphenicol, Tetracyclin, Aminosid
- 15% từ nấm mốc: Penicilin, Cephalosporin C
- 7% từ vi khuẩn: Monobactam, Polymycin
=>Chủ yếu nhóm xạ khuẩn được sử dụng trong sản xuất Kháng sinh
2.2. Tìm kiếm VSV Probiotics
Probiotic là những VSV còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật
chủ
LỢI ÍCH CỦA PROBIOTICS
- Ổn định hệ VSV đường ruột ổn định hàng rào niêm mạc ruột
- Phòng chống các bệnh ở đường tiêu hóa trên;
- Phòng ngừa, ngăn chặn tiêu chảy
- Cải thiện, tăng cường chức năng miễn dịch
- Cải thiện khả năng dung nạp lactose (probiotics có lactase, chuyển hóa lactose cho người bất
dung nạp lactose => glucose + galactose)
- Phòng chống ung thư ruột kết
- Ngăn ngừa cholesterol máu cao
TIÊU CHUẨN VSV PROBIOTICS
1. Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng
- Có định danh chính xác
- Có đặc điểm di truyền ổn định
- Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người (phân lập từ đường tiêu
hóa của những người khỏe mạnh) - khác với kháng sinh: thường phân lập từ đất
2. Không gây bệnh cho vật chủ, không sinh độc tính (nằm trong nhóm hoàn toàn an toàn)
- Các chủng probiotics thường thuộc nhóm an toàn (GRAS)
- Được phân lập từ những nguồn an toàn: probiotics cho người được phân lập từ người là an
toàn nhất => thường lấy từ thức ăn cho người
- Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được (việc sd probiotic trong chăn
nuôi làm tăng nguy cơ tạo chủng probiotics sinh kháng sinh)
- Không liên quan đến bệnh tật
3. Sinh sản phẩm với hiệu suất cao: Có đặc tính probiotics: có khả năng sống sót qua đường tiêu hoá,
phát triển trong ruột và có tác dụng có lợi cho vật chủ
4. Dễ nuôi cấy: thu sinh khối tế bào sống (hết pha logarit là thu): Tăng sinh nhanh trong môi trường
SX, có thể đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp
5. Phải ổn định trong bảo quản và dễ bảo quản: Có khả năng tồn tại độc lập trong thời gian dài, Tỷ lệ
sống sót cao trong thời gian bảo quản
(thu sinh khối nên ko cần quan tâm đến tiêu chí ít sản phẩm phụ và sản phẩm dễ tách chiết)
NGUỒN TÌM KIẾM VSV PROBIOTICS
Các nguồn phân lập VSV probiotics: người khỏe mạnh hệ tiêu hóa, thực phẩm
- L. acidophilus được phân lập từ sữa
- Bifidobacterium longum được phân lập từ phân trẻ sơ sinh
- Saccharomyces cerevisiae được phân lập từ quả nho
- Sacharomyces bourlardi được phân lập từ quả vải
- Bacillus clausii được phân lập từ đất
CÁC VSV PROBIOTICS
- Vi khuẩn
VK lactic
- Lactobacillus
- Bifidobacteria (thực phẩm bảo vệ sức khỏe)
- Streptoccocus...
Vi khuẩn Bacillus (sinh bào tử)
- B. subtilis (dược phẩm)
- B. clausii...
- Nấm men Saccharomyces: S. cerevisiae, S. boulardii
CÁC BƯỚC PHÂN LẬP
1. Tìm nguồn thích hợp
 2. Pha loãng, cấy trên môi trường dinh dưỡng
3. Tách riêng các khuẩn lạc thuần nhất
4. NC môi trường nuôi cấy thích hợp thu sinh khối
5. Thử khả năng chịu acid, muối mật, khả năng đối kháng vi khuẩn kiểm định, khả năng bám
dính ruột non...
6. NC điều kiện bảo quản
2.3. LỰA CHỌN VI SINH VẬT SX PROTEIN ĐƠN BÀO
Protein đơn bào (Single Cell Protein – SCP) là một thuật ngữ chỉ tế bào khô (chết) của vi sinh vật
(giàu protein, vitamin nhóm B và chất khoáng) được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật.
TIÊU CHUẨN VI SINH VẬT SX PROTEIN ĐƠN BÀO
1. Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng (vì làm thực phẩm)
2. Không gây bệnh cho người và động thực vật, Không chứa các chất độc (làm thức ăn)
3. Giá trị dinh dưỡng cao
4. Dễ nuôi cấy, giá thành SX thấp
- tốc độ sinh trưởng
- Hàm lượng protein
- nhu cầu dinh dưỡng
- dễ tách và làm khô (lấy sinh khối)
VSV SX PROTEIN ĐƠN BÀO
- Vi tảo (nhiều nhất)
- Nấm men
- Nấm mốc
- Vi khuẩn
(không dùng virus vì độc, xạ khuẩn chủ yếu sinh kháng sinh)
2.4. LỰA CHỌN VSV SX VẮC XIN
Định nghĩa DĐVN: Vaccin là chế phẩm chứa các kháng nguyên có khả năng tạo miễn dịch chủ động
và đặc hiệu để phòng bệnh do vi sinh vật gây nên. Vaccin được SX từ vi khuẩn, Rickettsia hoặc virus.
Vaccin dùng cho người có thể là:
(1)VSV đã được bất hoạt nhưng vẫn giữ được tính sinh miễn dịch; hoặc
(2) VSV sống không độc; hoặc
(3) Các thành phần kháng nguyên của VSV
TIÊU CHUẨN VSV SX VẮC XIN
1. Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng (rất quan trọng)
2. Ít độc tính
3. Có thể nuôi cấy được
4. An toàn và có hiệu lực (khác những cái khác)
5. Giống ổn định trong bảo quản
(Tiêu chí Không gây bệnh, không hoặc ít độc tính không quan trọng vì vaccin phải nghiên cứu từ
những con gây bệnh)
VSV SX VACCIN:
- Virus
- Vi khuẩn
- Nấm men (VC thế hệ mới)
 Chương 3: SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM BẬC 2
I. CÁC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN
1. Đại cương
- Giống VSV sinh KS: Xạ khuẩn Streptomyces spp.
- Phân loại
+ Một số KS bán tổng hợp: Rolitetracyclin, Doxycyclin, Minocycline , Mepicyclin;
Lymecyclin, Tygecycline, Omadacycline, Sarecycline , Eravacycline…
+ KS tự nhiên: Clotetracyclin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, Dimethyl Clotetracyclin
(Demeclocyclin)
- Ứng dụng Tetracyclin:
+ Bệnh trứng cá, nhiễm khuẩn hô hấp, ngoài da...
+ Chăn nuôi (kích thích sinh trưởng, chữa bệnh thú y...)
- Tính chất chung:
+ Bền với acid uống, ngoài da
+ Tạo phức bền với Ca++, Mg++, Fe++
+ Dễ bị oxy hóa, bị ánh sáng phân hủy
+ Dễ bị đồng phân hóa
+ Dễ bị kháng thuốc
+ Nhiều td phụ
+ Lưỡng tính:
-N(Me)2 + acid => clohydrat Te
-OH + Ca++, Mg++ => Tetracyclinat
=> phải kết tinh nhanh
+ Tạo phức bền với các ion kim loại (Ca++, Fe2+, Fe3+, Mg++, Cu2+, Al3+...) => khó
phá => nếu thừa ion KL (Ca++) sẽ tạo phức nên sau lên men phải loại ion KL thừa
+ Dễ bị đồng phân hóa
+ Ở pH 2,0 – 6,0 dễ tạo epi-Te ko hoạt tính
+ Quá kiềm, acid tạo anhydro & iso mất hoạt tính => lưu ý khi chiết Te mà cho acid,
kiềm phá vỡ tế bào phải khuấy trộn đều tránh cục bộ quá acid/kiềm
2. Quy trình lên men
Giống sản xuất: Xạ khuẩn (mọc ở lớp đất phía trên => độ hiếu khí thấp hơn Penicilin (nấm
mốc- độ hiếu khí cao, mọc trên bề mặt)
- Streptomyces rimosus; Str. aureofaciens; Str. platensis; Str. gilvus…
Đặc điểm
- Hô hấp: hiếu khí khuấy, cấp khí: 1 VVM; quan trọng nhất: 6 - 12 h đầu (lắc: PTN)
- pH : 6,6 – 7,0
- Nhiệt độ : 27 – 28 độ C (khó vì ở VN nóng, chi phí để kiểm soát nhiệt độ sẽ cao)
- T/gian : 100 - 144h
Dinh dưỡng:
Hydrat C:
- Bột ngô, bột khoai tây, bột mì
- Thích hợp Glucose, maltose... hơn saccarose, lactose
Nitơ:
- N vô cơ: (NH4)2SO4; NH4NO3; NH4Cl
- N hữu cơ: cao ngô, bột đậu tương, lạc
Phospho: phải vừa đủ
- P vô cơ: KH2PO4, K2HPO4; P hữu cơ : cao ngô
- Thiếu và thừa P đều cho hiệu suất thấp (thiếu P: phát triển kém, thừa P: phát triển nhanh)
 Vi lượng:
- Mg, Mn, Fe, Cu.. (sulfat); Thừa Fe: tạo phức mất hoạt tính
- Cobalt: kích thích sinh trưởng
CaCO3: ổn định pH (vì CaCO3 là chất không tan, khi sinh sản phẩm phụ là các acid thì nó sẽ
tan dần dần => ổn định pH (có kết hợp khuấy trộn))
Vitamin B12 không cần CaCO3 vì thu sinh khối, sản phẩm nằm trong tế bào, có CaCO3 sẽ
ảnh hưởng đến quá trình thu vitamin B12
Dầu phá bọt: Dầu lạc, dầu nành, octadecanol...
Tiền chất: hợp chất mạch vòng chứa S => tăng hiệu suất sinh sản phẩm
- Benzyl thiocyanat
- 2-mercaptobenzothiazol

Vitamin B12 là sp bậc 1, Te là

Sp bậc 2
Kết thúc nuôi cấy ở bắt đầu
pha suy vong

3. Quy trình xử lý dịch

lên men

=> giảm khả năng phân

hủy sinh protein tạp (Te
sợi khó phân hủy hơn,
có thể làm lạnh ở 8 độ
C)

Tetracyclin là SP nội
bào, nhưng do KS cũng có
hại cho TB VK => khi SX thừa thì sẽ có tiết ra MT (có cả ngoại bào) => thu cả dịch và sinh khối để
phá TB tạo thành bã sinh khối
- Xử lý dịch lên men: Te là SP nội bào => Thu sinh khối, Phá màng tế bào
- Lọc loại bã. Thu dịch lọc chứa KS
- Loại tạp
- Chiết:
+ P/p kết tủa
+ P/p dùng dung môi hữu cơ
+ P/p dùng nhựa trao đổi ion
Kết tinh
Tinh chế
4. SINH TỔNG HỢP CLOTETRACYCLIN
 a. Đại cương
Năm phát hiện: 1948 (B. Duggar)
Tên khác: Biomycin, Aureomycin..
b. Cấu trúc hóa học

c. Tính chất
- Bột tinh thể vàng, vị đắng
- Bền trong dung dịch acid (pH 0,6-2,6)
- Bị ánh sáng phân hủy
- Hoạt tính mạnh (> 4 Te): mỡ, viên nén
- Độc =>Biovit bổ sung vào thức ăn gia súc
d. Sinh tổng hợp:
- Chủng giống: Str. aureofaciens
- Cung cấp ion Cl: NaCl; NH4Cl...
e. Chiết

Cần Acid hóa trước để giải phóng KS ra MT rồi mới lọc

5. Sinh tổng hợp Tetracyclin
a. Đại cương
- Năm phát hiện: 1953
b. Cấu trúc hoá học
 Clotetracyclin rất độc => Loại Cl
c. Tính chất
- Ít tan trong nước và dung môi hữu cơ
- Dạng clohydrat bền hơn dạng base
d. Sinh tổng hợp:
Giống: Str. viridifaciens (hiệu suất kém) , Str. aureofaciens (sinh Clotetracyclin, cho vào MT ức chế
Clo => Thu đc Te)
Ức chế quá trình clo hoá:
- muối bạc (đắt)
- I, Br (nhiều quá tạo 7 Br-Te)
- 2-thiouraxyl, d/s của acid dithiocacbamic...

Acid hóa bằng acid oxalic

Vai trò acid oxalic:
+ phá vỡ TB
+ loại tạp Ca, Mg rồi tạo phức mới lọc
6. SINH TỔNG HỢP OXYTETRACYCLIN
a. Đại cương
Năm phát hiện: 1949 (AC Finlay)
Tên khác: Terramycin, Abbocin, Oxymycin...
b. Cấu trúc hoá học
 c. Tính chất
- Bột tinh thể vàng, không mùi, vị đắng
- Ít tan trong nước và dung môi hữu cơ
- Dạng base ít bền hơn dạng clohydrat
d. Sinh tổng hợp:
Giống SX: Str. rimosus (hay dùng), Str. griseoflavus, Str. armilatus
- thích hợp với maltose
- đồng hoá chất béo nhanh =>tạo nhiều bọt trong pha logarit => thêm dầu phá bọt vào MT dinh dưỡng
ban đầu (bọt lên là phải cho dầu)
ngoài ra có thể phá bọt bằng siêu âm (không cần chất phá bọt)
e. Chiết
P/p sắc ký trao đổi ion
Tạo dịch lọc
- T = 15 độ C. Loại Ca, Fe (pH = 1,9 – 2,2)
- Chỉnh pH = 3,0 – 3,2 (Na2CO3) => để không phá hủy SP (phá vỡ vong) do SP bị phân hủy
ở pH thấp
- Lọc
Hấp phụ trên nhựa
- Loại protein trên bông thủy tinh. Hạ xuống 7 – 8 độ C
- Hấp phụ trên nhựa sulfocationit
Phản hấp phụ:
- rửa cột bằng nước cất
- phản HP: đệm borat amoni (pH = 9,6 - 10,0) => ở pH này dễ phá vỡ vòng nên cần làm rất
nhanh để tránh mất sản phẩm
SO SÁNH CÁC PP CHIẾT
- Kết tủa (hiện nay ít dùng)
+ Rẻ, Nhanh
+ Nhiều tạp
+ Ăn mòn t/bị (do sd acid với kiềm)
- DUNG MÔI (kết hợp với nhựa trao đổi ion)
+ Nhanh
+ KS ko bị phân hủy
+ HS cao (70 – 75%)
+ Dễ cháy nổ
+ Độc hại
+ Dung môi đắt tiền
- TRAO ĐỔI ION
+ Độ tinh khiết cao
 + Lâu => KS phân hủy =>HS thấp
+ Phức tạp
+ Chi phí cao

Vitamin B12: nuôi cấy kị

khí => không cần cho dầu
phá bọt
GD cho dầu phá bọt thường
ở pha logarit (ít khi ở pha
cân bằng)
Oxetetracyclin cho ngay từ
giai đoạn đầu vì nó thích
chất béo

II. SẢN XUẤT KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID

1. Đại cương
Nguồn gốc: Xạ khuẩn
- Streptomyces: Streptomycin, Kanamycin, Neomycin...
- Micromonospora: Sisomicin, Gentamicin, Kasugamicin..
- Bán tổng hợp: Amikacin (từ Kanamycin), Netilmicin (từ Sisomicin), Plazomicin (từ
Sisomicin)
Tính chất
- Dễ tan: nước, khó tan: d/m hữu cơ
- Phổ rộng (VK G -, VK hiếu khí)
- Bền pH, bền nhiệt
- Độc (ốc tai, tiền đình, thận)
- Dự trữ, giá rẻ
- Nông nghiệp (Str trị bệnh cho cây táo…)
Cấu trúc hóa học: aminocyclitol + các glycosid
Dựa vào aminocyclitol chia ra 4 nhóm AMG
- Streptidin:
+ Streptomycin
+ Dihydrostreptomycin
- Bluesin
+ Bluensomycin

- 2 - deoxystreptamin
+ Neomycin
+ Kanamycin
+ Sisomicin
 + Gentamicin
+ Tobramycin
+ Plazomicin

- Actinamin (trị bệnh cho cây trồng)

+ Spectinomycin
+ Kasugamicin
+ Validomycin
+ Hygromycin
+ Destomycin

2. Sản xuất Streptomycin

- Chủng xạ khuẩn: Str. griseus
- Phổ td:
+ VK G (-) hiếu khí (đặc trị VK lao)
+ VK G (+) hiếu khí
+ không t/d VK kỵ khí
+ nhiều VK kháng
- Độc cho tai và thận không hồi phục
- Không hấp thu qua đường tiêu hoá

cấu trúc: đường và nhiều nhóm

amin
=> MT cần đường và các N hữu cơ
 SP bậc 2 => thời điểm sinh là hết
pha logarit sang pha cân bằng
(mất ít nhất 2 ngày)
Ngừng nuôi cấy: cuối pha cân
bằng, đầu pha suy vong => mất
khoảng 6-7 ngày

2.1. Điều kiện nuôi cấy

- Chủng: Str. griseus
- Đặc điểm sinh lý:
+ Hô hấp: Hiếu khí (thấp hơn Te)→ 0,8-1,0 VVM
+ Nhiệt độ: 26 – 28OC.
+ pH: 6,8 – 7,0.
+ Thời gian : 96h – 120h
+ Dinh dưỡng: Nitơ, a.a...
- Một số đặc tính cần lưu ý:
+ Sợi mảnh → khó lọc (thường cho thêm chất trợ lọc)
+ Dễ nhiễm phage độc => cần chủng không nhạy cảm với phage, giữ đk vô
trùng nghiêm ngặt (lên men Glutamic cũng dễ nhiễm phage ôn hòa (nằm im
không nhân lên)
- Dinh dưỡng:
Hydrat Cacbon:
+ Tinh bột, glucose, dextrin, maltose, fructose... (tham gia trực tiếp vào phân tử KS)
+ Glucose thừa: giảm Hiệu suất do tạo Manozidostreptomycin (không có hoạt tính
kháng sinh)
Penicilin G cũng ko đc Glucose thừa
+ Có protease → đồng hóa bột đậu tương, bột lạc, bột cá, men bia....
Nito:
+ N hữu cơ: cao ngô, bột đậu, cao nấm men
+ N vô cơ: hợp amoni; không hợp nitrat
Photpho: P vô cơ tan KH2PO4
CaCO3: ổn định pH.
Vi lượng: Mg, Mn, Fe, Cu... (sunfat) →cao ngô, bột đậu, bột lạc....
Tiền chất: Chưa xác định được.
NaCl : tăng H/suất
- Môi trường lên men (%):
Glucose : 4,0
Bột đậu : 3,0
Cao ngô : 0,5
(NH4)2SO4: 0,6
NaCl : 0,25
CaCO3: 0,6
 KH2PO4: 0,01
Dầu phá bọt : 0,2 (do hiếu khí)
Lấy mẫu kiểm tra: 4h/lần - phage; glucose
2.2. Chiết
Streptomycin là SP nội bào, trong quá trình nuôi cấy, chủng tiết ra MT (giống Te cần acid hóa trước
rồi mới lọc)
Tính base yếu → nhựa R-COONa
Tạo dịch lọc chứa KS
- hạ nhiệt độ ~ 8 độ C

- Phá vỡ tế bào bằng acid, giải phóng hoạt chất

- Lọc (khuấy nhẹ, bổ sung chất trợ lọc)
- Loại tạp (Mg++, Ca++)
- Lọc loại tủa
- chỉnh pH = 7,0 - 7,5 (NaOH)
- Loại protein (lọc bông thuỷ tinh)
 Chương 4: SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM CHỨA SINH KHỐI VI SINH VẬT
NGUYÊN TẮC CHUNG NUÔI CẤY VSV THU SINH KHỐI
Thuộc nhóm SP sinh khối VSV:
- MT giàu dinh dưỡng để phát triển tế bào
- Thường thu SP khi hết pha logarit (sinh khối nhiều nhất). Thời gian phát triển nhanh
hay chậm, mạnh hay yếu tùy loại VSV: (B12 nuôi lâu do kị khí phát triển rất chậm
còn hiếu khí phát triển nhanh)
+ VK probiotics: 24 – 72h
+ Virus trong phôi gà: 4 – 5 ngày
+ Vi tảo: 8 – 15 ngày
+ VK lao bò(rất yếu nên phát triển rất chậm): 1 – 2 tháng (sx vaccin BCG
phòng lao)
I. Sản xuất Probiotics
1. Khái niệm:
2002 định nghĩa của WHO và FAO: “Probiotics là những vi sinh vật sống, khi được đưa vào
cơ thể với số lượng đủ lớn sẽ đem lại lợi ích cho vật chủ” => thu SP hết pha logarit
2. Tác dụng
- Tiêu hóa
+ Phòng ngừa, ngăn chặn tiêu chảy, các bệnh ở đường tiêu hóa trên
+ Cải thiện khả năng dung nạp lactose
- Miễn dịch
+ Ổn định hàng rào niêm mạc ruột
+ Phòng chống ung thư ruột kết
+ Cải thiện, tăng cường chức năng miễn dịch
- Khác
+ Ngăn ngừa nhiễm khuẩn âm đạo
+ Ngăn ngừa cholesterol máu cao
+ Ngừa sâu răng...
3. Tiêu chuẩn VSV Probiotics
1. Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng (Chủng phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế).
- Có định danh chính xác
- Có đặc điểm di truyền ổn định
- Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người (phân lập từ
đường tiêu hóa của những người khỏe mạnh)
Theo WHO: “việc xác định được “chủng” VSV cần thiết để biết tác dụng của Probiotic” Các SP
probiotic cần phân lập tới cấp chủng để biết rõ tác dụng đã được chứng minh bằng các bằng chứng
khoa học
VD: Lactobaccillus reuteri DSM 17938
Chủng: DSM 17938
Loài: reuteri
Chi: Lactobaccillus
2. Không gây bệnh, không sinh độc tố (Chủng phải nằm trong nhóm GRAS, được đánh giá
xác định an toàn và không có độc lực).
- Được phân lập từ những nguồn an toàn: probiotics cho người được phân lập từ người
là an toàn nhất
- Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được
- Không liên quan đến bệnh tật
- Nguồn VSV được chọn làm chế phẩm probiotics?
 Vi sinh vật có ích trong hệ tiêu hóa người khỏe mạnh
Vi sinh vật trong thực phẩm:
+ sữa mẹ, sữa động vật, các sản phẩm lên men truyền thống
+ Hoa quả: Nho, vải, táo...
Nguồn khác...
3. Có đặc tính probiotics
Đặc tính quan trọng nhất đối với các VSV Probiotics:
- có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa. =>chịu acid (VK sinh acid lactic), muối mật,
acid mật, enzym tiêu hóa, tạo bào tử
=> kỵ khí, vi hiếu khí, phát triển ở 37 độ C, bám dính vào ruột non, sinh bacteriocin
(ức chế sự phát triển của các VSV có hại)
- có khả năng phát triển trong ruột. (ngày nay là quan trọng nhất)
- có hiệu quả có lợi và đáng tin cậy (được chứng minh một cách khoa học, thử nghiệm
trên động vật và trên người).
Những VSV có lợi cho hệ tiêu hóa là những VSV sinh bacteriocin, sinh acid lactic (thích MT
acid, giảm pH ruột=> cạnh tranh nơi sống với những VSV có hại phát triển), sinh enzym có lợi cho
vật chủ
(VK làm giấm, làm tương phải hiếu khí nên không làm probiotics đc)

4. Dễ nuôi cấy:
Định nghĩa probiotics: Chế phẩm chứa VSV sống => có thể đưa vào SX công nghiệp (chỉ có
khoảng <20 con): Tăng sinh nhanh trong môi trường SX.
5. Phải ổn định trong bảo quản và dễ bảo quản:
- Có khả năng tồn tại độc lập trong thời gian dài
- Tỷ lệ sống sót cao trong thời gian bảo quản
Định nghĩa probiotics: Chế phẩm chứa VSV sống, đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn
- Số lượng đủ lớn: 5x10^9 tế bào VSV/ngày =>độ ổn định của chế phẩm
- Điều kiện bảo quản chế phẩm: 30 độ C, 75% ẩm (sau khi nuôi cấy phải đông khô)
- Dạng bào chế: độ ẩm lý tưởng <1%
- Hạn sử dụng: ít nhất 2 năm.
4. VSV sử dụng SX probiotics
Nguồn gốc chủng giống SX:
- Vi sinh vật có ích trong hệ tiêu hóa
- Vi sinh vật trong thực phẩm:
+ sữa mẹ, sữa động vật (bò, dê, cừu)
 + các sản phẩm lên men truyền thống (sữa chua, phomat, dưa muối, nem
chua...)
- Nguồn khác: Đất
Các VSV sử dụng làm giống SX probiotic
- Nấm men
+ Saccaromyces spp.: S. cerevisiae (làm men rượu), S. boulardi (phân lập từ
vải)
- Vi khuẩn
+ Vi khuẩn lactic: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Bifidobateria spp.
+ Vi khuẩn Bacillus: Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus coagulans
Vd: Streptococcos (phô mai), Lactobacillus (sữa bò), Saccaromyces (quả vải), Lactobacillus (táo, hoa
quả chua, muối chua…)
=> Những VSV được lựa chọn để SX chế phẩm probiotics:
- Chịu acid, sinh acid: VK lactic, nấm men
- Chịu acid: dạng bào tử Bacillus
5. Đặc điểm các nhóm VSV Probiotic
a. Nhóm vi khuẩn lactic - (lactic acid bacteria -LAB): chi Lactobacillus, Streptococcus,
Bifidobacteria
Lịch sử:
- Được nghiên cứu các tác dụng có lợi từ 1907
- Phân lập từ phân trẻ sơ sinh (L. acidophillus, Bifidobacterium longum – Mitsuoka 1965), sữa
lên men (L. bulgaricus – Metchnhikov - 1907),
- Lactobacillus casei – 1930, Streptococcus thermophilus... từ thực phẩm lên men như phomai,
đồ muối chua...
Các đặc điểm probiotics:
- Vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử nhưng vẫn bám được trong ruột
- Có trong hệ tiêu hóa của người, sữa, thịt, thực vật và các sản phẩm lên men
- Hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí => phát triển trong ruột
- Nhiệt độ thích hợp: 37 độ C, không phát triển ở 20 - 22 độ C hoặc > 48 độ C
- Có khả năng chịu pH acid
VD L. acidophilus sống ở pH 3.0 trong 5h
- Sinh a. lactic, bacteriocin, lactase
b. Nhóm các Nấm men: Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardii
Lịch sử:
- Năm 1920 Henri Boulard - nhà khoa học người Pháp - thấy thổ dân Indonesia dùng
vỏ quả vải để điều trị bệnh tả lị và phân lập được nấm men Saccharomyces boulardii.
- S. boulardii được dùng như probiotic từ năm 1950. Hiệu quả trong tiêu chảy nhiễm
trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng
Helicobacter pylori.
Đặc điểm probiotic:
- Nảy chồi, ít sinh bào tử
- Không có trong hệ tiêu hóa của người (ko phải là đặc điểm probiotics)
- Hô hấp kỵ khí hoặc hiếu khí
- Nhiệt độ thích hợp: 28 - 30oC, có thể đến 40oC.
- Chịu được pH thấp, muối mật.
- Sinh ez phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra, proteinase làm giảm
độc tố do Clostridium difficile sinh ra
- Kháng một số kháng sinh, chịu được một số hóa chất
 c. Nhóm vi khuẩn chi Bacillus: Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus coagulans
Lịch sử:
- Bacillus clausii được dùng như thuốc từ 1958 là SP của Sanofi Aventis. Dieter Claus (Đức)
phân lập năm 1995 trong đất
- Bacillus coagulans được B.W. Hammer phân lập từ sữa đông tụ năm 1915. Đến 1935 được
gọi là Lactobacillus sporogenes. Có đặc điểm cả 2 chi Bacillus là Lactobacillus.
Đặc điểm nào là đặc điểm probiotic?
- Vi khuẩn Gram (+), sinh bào tử => chịu được acid
- Chưa tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người => sau khi sd đào thải qua phân
- Hô hấp kỵ khí hoặc hiếu khí
- Nhiệt độ thích hợp: 37 độ C, không phát triển ở 20 - 22 độ C hoặc > 48 độ C
- Có khả năng chịu được pH acid
- Kháng nhiều dòng kháng sinh, chịu được nhiều hóa chất => có thể sd kèm kháng sinh
- Sinh protease=> giúp tiêu hóa thức ăn , bacteriocin
6. Nguyên tắc sản xuất nguyên liệu và chế phẩm probiotics
Định nghĩa probiotics: VSV sống
- Thuộc nhóm SP chứa sinh khối VSV
- Sản phẩm sau lên men: tế bào VSV sống
- Các yếu tố quan trọng:
+ Thành phần môi trường dinh dưỡng: giàu N
+ Thời điểm thu Sinh khối: thu sinh khối là sinh dưỡng (nấm men, lactic) => hết pha logarit,
bào tử (Bacillus) => hết pha cân bằng
+ Xử lý sinh khối đảm bảo tỷ lệ sống cao: tách riêng sinh khối nên môi trường dinh dưỡng
thường ko có hydrat carbon vì nếu có thì khó xử lí sinh khối
+ Thiết kế công thức và dạng bào chế giảm thiểu ảnh hưởng đến VSV đảm bảo tỷ lệ sống sót và
độ ổn định cao
1. Chủng giống: VK lactic, VK bacillus, Nấm men
2. Điều kiện nuôi cấy: (Dựa vào đặc điểm sinh lý của giống)
- Môi trường dinh dưỡng: giàu a.a, các chất tan
- Nhiệt độ: 30 – 37 độ C. Tùy thuộc VSV
- Điều kiện cấp khí: Tùy thuộc VSV
- Thời điểm kết thúc: Sinh khối/bào tử đạt tối đa
3. Xử lý dịch lên men thu sản phẩm: Thu sinh khối tế bào hoặc chuyển dạng bào tử.
4. Đông khô (dạng sinh dưỡng)
NGUYÊN TẮC TẠO DẠNG BÀO CHẾ: tạo dạng bào chế để giữ VSV sống sót nhiều nhất
Định nghĩa probiotics: Chế phẩm chứa VSV sống, đưa vào cơ thể với số lượng đủ lớn
➔ Đảm bảo VSV còn sống
➔ Số lượng đủ lớn: 5x10^9 tế bào VSV/ngày => độ ổn định của chế phẩm
➔ Điều kiện bảo quản chế phẩm: 30 độ C, 75% ẩm
➔ Dạng bào chế rắn: độ ẩm 4% (lý tưởng <1% )
➔ Dạng bào chế lỏng: sinh dưỡng, bào tử
➔ Hạn sử dụng: ít nhất 2 năm.
1. Tiêu chuẩn của chế phẩm probiotics
- Chứa VSV sống
- Số lượng đủ (108 – 109 cfu/g)
- Không nhiễm tạp, không độc tố
2. Các dạng bào chế thường gặp:
- Bột, cốm pha hỗn dịch
- Nang cứng
- Nén (dập thẳng), đặt
- Ống uống
Nguyên tắc tạo dạng bào chế probiotics:
- Bảo vệ VSV sống sót qua hệ tiêu hóa
- Giảm các tác nhân ảnh hưởng trong QT bào chế
Thế hệ 1:Không bao: dạng bào chế: bột, cốm, đơn loài => chọn VSV chịu được acid dạ dày, muối mật
Thế hệ 2: Không bao, tạo dạng bào chế nang cứng, đơn và đa loài
Thế hệ 3: Bao tan trong ruột => DM, tá dược tác dụng lên VSV
Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột,,,
Thế hệ 5: Bao kép. Lớp 1: peptide/protein; lớp 2: polysaccharide và
hydrocolloid, giải phóng VSV ở ruột
II. SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO
1. Khải niệm:
Protein đơn bào (Single Cell Protein – SCP - 1966 – Caroll L. Wilson) để chỉ tế bào khô của
vi sinh vật (giàu protein, vitamin nhóm B và chất khoáng) được sử dụng làm thức ăn cho
người, động vật.
Chưa chính xác:
- không phải protein thuần khiết
- có thể từ VSV đơn bào hay đa bào
- hiện nay sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác (dược phẩm, thực phẩm chức năng, thực
phẩm bảo vệ sức khoẻ)
2. Tầm quan trọng
1. Bổ sung nguồn protein đang thiếu hụt
Nguồn cung cấp protein:
Động vật:
- thịt, trứng, tôm, cá...
- dễ hỏng => bảo quản (vật lí, hoá học...) sấy, muối, hun khói, làm mắm, nem chua, thịt hộp...
Chăn nuôi:
- Nhu cầu ngày càng nhiều
- Thiên tai, dịch bệnh, thực phẩm bẩn tăng
- Tiêu thụ nước, ngũ cốc...
- Làm ô nhiễm môi trường
Thuỷ hải sản:
- Chỉ 10% diện tích đại dương có khả năng khai
thác thuỷ sản
- ô nhiễm nặng
Thực vật:
- Các cây họ đậu, ngô, chủ yếu là đậu tương
- Chế biến thành tương, đậu phụ, sữa đậu, xì dầu...
Trồng trọt:
- diện tích đất canh tác co lại do đô thị hoá
- đất đai ngày càng kém màu mỡ và ô nhiễm
- thiên tai, dịch bệnh
=> Thiếu hụt protein:
- tốc độ tăng sản lượng lương thực, thực phẩm không kịp với tốc độ tăng dân số (1,1% năm)
- lương thực dùng chăn nuôi, rượu, SX nhiên liệu sinh học
2. Cung cấp thức ăn cho chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản
 3. Cung cấp thực phẩm cho người ăn chay
- Tỷ lệ người ăn chay đang gia tăng.
- Người ăn chay thường thiếu máu, protein, collagen và các vi khoáng chất, loãng
xương. Sử dụng các sản phẩm protein đơn bào giúp giảm tình trạng thiếu chất này
- Sản xuất protein đơn bào từ VSV và ăn chay giúp giảm ăn thịt động vật,
Từ đó:
4. Góp phần giảm tiêu thụ lương thực, thực phẩm và giảm ô nhiễm môi trường
Sản xuất protein đơn bào từ VSV và ăn chay giúp giảm ăn thịt động vật, nhờ đó:
- Giảm khai thác tài nguyên đất
- Giảm tác động đến môi trường (tiết kiệm nước, giảm CO2, giảm khí thải nhà kính...)
=> Chống biến đổi khí hậu
- Có thể tận dụng sản phẩm phụ của các quá trình SX khác => tránh lãng phí
- Rẻ hơn SX protein từ đậu tương, gà, bò... giảm nhu cầu thức ăn chăn nuôi và phân
bón, giảm tiêu hao năng lượng, giảm diện tích nuôi trồng...
3. Tiêu chuẩn:
- Nguồn gốc rõ ràng
- Không gây bệnh, không chứa các chất độc (do làm thức ăn)
- Giá trị dinh dưỡng cao: Hàm lượng protein cao: (40 - 70%)
- Dễ nuôi cấy, giá thành SX thấp (rẻ hơn các quá trình nuôi cấy động vật, trồng lương thực…)
+ tốc độ sinh trưởng cao
+ nhu cầu dinh dưỡng thấp
+ dễ tách và làm khô
- Hàm lượng acid nucleic thấp (<2%)
4. Ưu thế của SCP
- Giàu protein hơn động thực vật (40 - 80%)
- Giống protein động vật, thực vật - tương đối đầy đủ các acid amin, protein của vi
khuẩn gần giống protein của cá, protein của nấm men gần giống protein của đậu
tương, giàu vitamin
- Tốc độ tổng hợp protein của VSV cao (gấp 40 – 50 lần thực vật, 100 – 1.000 lần đại
gia súc)
- Dễ điều chỉnh thành phần và giá trị dinh dưỡng
- Chiếm diện tích nhỏ, sản lượng cao (trừ tảo)
- Không phụ thuộc khí hậu, môi trường
- Tận dụng nguồn nguyên liệu phi protein và phế liệu để SX protein (rỉ đường, gỗ tạp,
bã mía...)
=> Nhược điểm:
- Hàm lượng a. nucleic cao (5- 10%) => gây nên bệnh gout
- Hàm lượng 1 số a.a chứa lưu huỳnh thấp => thường thiếu methionin
- Hương vị kém
- Hiện nay SCP dùng cho người chủ yếu từ vi tảo, chỉ một vài SP từ nấm sợi, vi khuẩn
- SCP từ nấm men và VSV chủ yếu sử dụng làm thứ ăn gia súc và thủy sản.
5. Quy trình sản xuất SCP
Các nhóm VSV sử dụng SX SCP
- Nấm men
- Vi khuẩn
=> Thức ăn chăn nuôi
- Nấm mốc
- Vi tảo => Dược phẩm
 => Thực phẩm

- Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng (C, N, P...)

- Khử trùng
- Cấy giống, nuôi cấy/lên men
+ Thông khí mạnh (trừ tảo: CO2 , ánh sáng)
+ Làm mát
- Tách sinh khối tế bào
+ Lọc, ly tâm, vắt (tảo)
- Hậu xử lý (loại a. nucleic): Tinh chế hoặc không
- Tiêu chuẩn sản phẩm:
+ Hàm lượng protein cao (Độ tinh khiết)
+ Hàm lượng acid nucleic thấp: SP cho người phải <1%
Các phương pháp giảm hàm lượng acid nucleic
- Thuỷ phân bằng kiềm
- Chiết bằng hoá chất
- Điều khiển về sinh trưởng và sinh lý tế bào
- Hoạt hoá ARNase (sốc nhiệt)
6. Sản xuất sinh khối tảo Spirulina
Các chủng vi tảo hay vi khuẩn lục lam (do nhân chưa hoàn chỉnh, nhân chưa có màng, không
có ty thể và lục lạp) được sử dụng phổ biến: Spirulina, Scenedesmus, Chlorella
Yêu cầu chủng SX:
- Tốc độ sinh trưởng nhanh
- Năng suất quang hợp cao
- Chịu được thay đổi của điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ muối...)
- Hàm lượng protein cao
Ưu điểm
- Hàm lượng protein cao, nhiều vitamin
- Không có độc tố
Nhược điểm:
- Tốc độ sinh trưởng thấp hơn vi khuẩn và nấm men, Mật độ tế bào thấp
- Khó giữ vô trùng.
- Không cần cấp khí O2 nhưng cần cấp CO2
- Khuấy trộn bắt buộc
- Tỷ lệ a.a chứa S thấp (cần bổ sung methionin)
- Yêu cầu ánh sáng, diện tích rộng
- Thành tế bào dày => Khó tiêu hoá ở người
Điều kiện nuôi cấy:
- Hô hấp: Cấp khí CO2 (Phân bố trong hồ: lơ lửng sâu từ 10 - 50cm)
- Nhiệt độ: 24 độ C
- pH: Kiềm 8,5-9,5
- Ánh sáng: quang dưỡng bắt buộc (PTN 10.000lux, Bể nuôi cấy: 50.000 - 100.000
lux)
- T/g thu SP: 8 - 15 ngày
- Dinh dưỡng:
+ Nguồn Nitơ: không có khả năng sử dụng N2 trong không khí mà sử dụng dưới các
dạng nitrat (NO3-, NH3 (có trong nước thải Biogas); (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4...
+ Giàu khoáng chất
+ NaCl ~2.5%
 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE

1. Phân loại của vắc xin tả uống

Theo Dược điển Việt Nam, vắc xin tả uống là loại vắc xin bất hoạt. Điều này có nghĩa là nó được điều
chế từ vi khuẩn tả đã bị giết chết hoặc làm mất khả năng gây bệnh thông qua các phương pháp xử lý
như formaldehyd hoặc nhiệt độ.

Ưu điểm của vắc xin bất hoạt (vắc xin chết)

1. An toàn hơn: Do vi khuẩn đã bị giết chết hoặc làm mất khả năng gây bệnh, vắc xin bất hoạt
an toàn hơn so với vắc xin sống giảm độc lực, đặc biệt là đối với những người có hệ miễn
dịch suy yếu.
2. Không gây bệnh: Không có nguy cơ vi khuẩn trong vắc xin gây ra bệnh vì chúng không còn
sống.
3. Ổn định hơn: Vắc xin bất hoạt thường ổn định hơn trong điều kiện bảo quản và vận chuyển,
không yêu cầu điều kiện bảo quản lạnh nghiêm ngặt như vắc xin sống.

Nhược điểm của vắc xin bất hoạt

1. Hiệu quả thấp hơn: Do không kích thích hệ miễn dịch mạnh mẽ như vaccine sống, vắc xin
bất hoạt thường yêu cầu nhiều liều tiêm nhắc lại để duy trì hiệu quả bảo vệ.
2. Miễn dịch yếu hơn: Khả năng kích thích phản ứng miễn dịch của vắc xin bất hoạt thường
không mạnh bằng vắc xin sống, do đó có thể cần sử dụng thêm các chất bổ trợ (adjuvants) để
tăng cường hiệu quả.
3. Khả năng đáp ứng miễn dịch ngắn hạn: Thường yêu cầu các liều tiêm nhắc lại để duy trì
khả năng bảo vệ lâu dài.

Ví dụ về vắc xin chết - bất hoạt

1. Vắc xin ho gà (Pertussis): Dùng trong vắc xin DTaP (ho gà, bạch hầu, uốn ván).
2. Vắc xin bại liệt (IPV - Inactivated Poliovirus Vaccine): Sử dụng để phòng ngừa bệnh bại
liệt.
3. Vắc xin viêm gan A (Hepatitis A vaccine): Sử dụng để phòng ngừa viêm gan A.
4. Vắc xin dại (Rabies vaccine): Sử dụng để phòng ngừa bệnh dại.
5. Vắc xin viêm não Nhật Bản (Japanese Encephalitis vaccine): Sử dụng để phòng ngừa
viêm não Nhật Bản.
6. Vắc xin cúm (Inactivated Influenza vaccine): Sử dụng để phòng ngừa cúm.

Tóm lại

Vắc xin tả uống là một loại vắc xin bất hoạt, mang lại sự an toàn cao nhưng yêu cầu nhiều liều tiêm để
đạt hiệu quả bảo vệ tốt nhất. Việc sử dụng các phương pháp như xử lý bằng formaldehyd hoặc nhiệt
độ giúp đảm bảo rằng vi khuẩn trong vắc xin không thể gây bệnh, tạo điều kiện an toàn cho người sử
dụng.

Các phương pháp bất hoạt VSV:

Trong sản xuất vắc xin, các vi sinh vật (vi khuẩn hoặc virus) có thể được bất hoạt bằng nhiều phương
pháp để đảm bảo chúng không thể gây bệnh nhưng vẫn duy trì khả năng kích thích hệ miễn dịch.
Dưới đây là các phương pháp bất hoạt vi sinh vật phổ biến:

1. Sử dụng hóa chất

Formaldehyd:

● Cơ chế: Formaldehyd liên kết với các nhóm amin trong protein và acid nucleic của vi sinh
vật, làm mất hoạt tính sinh học của chúng.
● Ứng dụng: Thường được sử dụng để bất hoạt virus trong vắc xin cúm và bại liệt (IPV).

β-Propiolactone (BPL):

● Cơ chế: BPL liên kết với các nhóm chức trong acid nucleic và protein, gây biến đổi cấu trúc
và mất hoạt tính của vi sinh vật.
● Ứng dụng: Sử dụng trong bất hoạt nhiều loại virus, bao gồm virus dại và cúm.

2. Sử dụng nhiệt độ

Nhiệt độ cao:

● Cơ chế: Nhiệt độ cao phá hủy cấu trúc protein và acid nucleic của vi sinh vật, làm mất khả
năng gây bệnh.
● Ứng dụng: Thường được sử dụng để bất hoạt vi khuẩn trong các vắc xin như vắc xin ho gà
toàn tế bào.

Nhiệt độ thấp:

● Cơ chế: Sử dụng nhiệt độ thấp để duy trì tính ổn định của vi sinh vật trong quá trình xử lý
bằng nhiệt độ cao hoặc hóa chất.
● Ứng dụng: Thường được kết hợp với các phương pháp khác để bảo đảm hiệu quả bất hoạt
mà không làm mất cấu trúc kháng nguyên.

3. Sử dụng tia bức xạ

Tia gamma:

● Cơ chế: Tia gamma gây đứt gãy DNA và RNA của vi sinh vật, làm mất khả năng tái tạo và
gây bệnh.
● Ứng dụng: Sử dụng để bất hoạt nhiều loại vi sinh vật, đặc biệt là trong các sản phẩm y tế cần
đảm bảo vô trùng.

Tia UV:

● Cơ chế: Tia UV gây đột biến DNA và RNA, ngăn chặn sự sao chép và chức năng của vi sinh
vật.
● Ứng dụng: Sử dụng hạn chế do hiệu quả bất hoạt không cao bằng tia gamma, thường dùng
trong môi trường phòng thí nghiệm.
4. Sử dụng phương pháp vật lý

Siêu âm:

● Cơ chế: Sóng siêu âm tạo ra các lực cơ học phá hủy cấu trúc tế bào của vi sinh vật.
● Ứng dụng: Thường sử dụng trong kết hợp với các phương pháp khác để tăng cường hiệu quả
bất hoạt.

Tổng kết

Các phương pháp bất hoạt vi sinh vật trong sản xuất vắc xin bao gồm sử dụng hóa chất như
formaldehyd và β-propiolactone, nhiệt độ cao và thấp, tia bức xạ như tia gamma và UV, cùng các
phương pháp vật lý như siêu âm. Mỗi phương pháp có cơ chế và ứng dụng riêng, nhằm đảm bảo vi
sinh vật không thể gây bệnh nhưng vẫn giữ được khả năng kích thích phản ứng miễn dịch.

2. Vắc xin sống giảm độc lực: Ưu nhược điểm và ví dụ

Ưu điểm của vắc xin sống giảm độc lực

1. Kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ: Do vi khuẩn hoặc virus vẫn còn sống (dù đã
giảm độc lực), chúng có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và tự nhiên, giống
như khi cơ thể bị nhiễm bệnh tự nhiên.
2. Đáp ứng miễn dịch lâu dài: Thường chỉ cần một hoặc hai liều để đạt được khả năng bảo vệ
lâu dài, không cần nhiều liều tiêm nhắc lại.
3. Kích thích cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể: Vắc xin sống giảm độc lực kích
thích cả hai loại đáp ứng miễn dịch, giúp tạo ra sự bảo vệ toàn diện hơn.

Nhược điểm của vắc xin sống giảm độc lực

1. Nguy cơ gây bệnh: Có nguy cơ (dù rất thấp) vi khuẩn hoặc virus trong vắc xin có thể quay
trở lại trạng thái độc lực và gây bệnh, đặc biệt ở những người có hệ miễn dịch suy yếu.
2. Yêu cầu bảo quản nghiêm ngặt: Thường cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh để duy trì hiệu
quả, điều này có thể là thách thức trong các điều kiện không có cơ sở hạ tầng bảo quản lạnh
tốt.
3. Không phù hợp cho một số đối tượng: Không thể sử dụng cho những người có hệ miễn
dịch bị suy yếu (như người mắc bệnh HIV/AIDS, người đang điều trị hóa trị, người nhận cấy
ghép cơ quan).

Ví dụ về vắc xin sống giảm độc lực

1. Vắc xin BCG (Bacillus Calmette-Guérin): Sử dụng để phòng ngừa bệnh lao (tuberculosis).
2. Vắc xin sởi, quai bị, rubella (MMR): Sử dụng để phòng ngừa ba bệnh này.
3. Vắc xin thủy đậu (varicella): Sử dụng để phòng ngừa bệnh thủy đậu.
4. Vắc xin rotavirus: Sử dụng để phòng ngừa nhiễm rotavirus, nguyên nhân gây ra tiêu chảy
nặng ở trẻ em.
5. Vắc xin sốt vàng (Yellow fever): Sử dụng để phòng ngừa bệnh sốt vàng.
Tóm lại

Vắc xin sống giảm độc lực có hiệu quả cao và cung cấp khả năng bảo vệ lâu dài với ít liều tiêm,
nhưng đi kèm với một số rủi ro và yêu cầu bảo quản nghiêm ngặt. Chúng rất hữu ích trong phòng
ngừa nhiều bệnh nhiễm trùng, nhưng cần được sử dụng cẩn thận, đặc biệt ở những người có hệ miễn
dịch suy yếu.

3. Vắc xin giải độc tố: Ưu nhược điểm và ví dụ

Vắc xin giải độc tố là gì?

Vắc xin giải độc tố được tạo ra bằng cách vô hiệu hóa độc tố của vi khuẩn mà vẫn giữ được tính
kháng nguyên của nó. Điều này có nghĩa là độc tố được biến đổi thành dạng không gây hại nhưng vẫn
kích thích hệ miễn dịch tạo ra kháng thể chống lại độc tố tự nhiên.

Ưu điểm của vắc xin giải độc tố

1. An toàn: Do độc tố đã bị vô hiệu hóa, vắc xin không có khả năng gây bệnh. Điều này làm
cho vắc xin giải độc tố an toàn cho người sử dụng, bao gồm cả những người có hệ miễn dịch
suy yếu.
2. Hiệu quả cao: Vắc xin giải độc tố thường kích thích hệ miễn dịch sản xuất ra kháng thể đặc
hiệu chống lại độc tố, giúp bảo vệ hiệu quả khỏi các bệnh gây ra bởi độc tố.
3. Bảo quản dễ dàng: Vắc xin giải độc tố thường ổn định hơn so với vắc xin sống giảm độc lực
và không yêu cầu điều kiện bảo quản lạnh nghiêm ngặt.

Nhược điểm của vắc xin giải độc tố

1. Yêu cầu nhiều liều: Để đạt được và duy trì hiệu quả bảo vệ, thường cần nhiều liều tiêm nhắc
lại.
2. Không bảo vệ chống lại vi khuẩn: Vắc xin chỉ bảo vệ chống lại độc tố mà không bảo vệ
chống lại vi khuẩn gây ra độc tố. Do đó, vắc xin này không ngăn chặn nhiễm trùng vi khuẩn,
mà chỉ ngăn chặn các triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi khuẩn.
3. Cần sử dụng chất bổ trợ: Để tăng cường hiệu quả miễn dịch, vắc xin giải độc tố thường cần
bổ sung thêm các chất bổ trợ (adjuvants).

Ví dụ về vắc xin giải độc tố

1. Vắc xin bạch hầu (Diphtheria toxoid vaccine): Bảo vệ chống lại bệnh bạch hầu, một bệnh
nhiễm trùng do vi khuẩn Corynebacterium diphtheriae gây ra.
2. Vắc xin uốn ván (Tetanus toxoid vaccine): Bảo vệ chống lại bệnh uốn ván, một bệnh nhiễm
trùng do vi khuẩn Clostridium tetani gây ra.
3. Vắc xin ho gà (Pertussis toxoid vaccine): Dùng trong vắc xin DTaP (ho gà, bạch hầu, uốn
ván).

Tóm lại

Vắc xin giải độc tố là một phương pháp an toàn và hiệu quả để bảo vệ chống lại các bệnh do độc tố vi
khuẩn gây ra. Chúng ổn định và dễ bảo quản, nhưng thường yêu cầu nhiều liều tiêm và có thể cần sử
dụng các chất bổ trợ để tăng cường hiệu quả miễn dịch. Các ví dụ phổ biến bao gồm vắc xin bạch hầu,
uốn ván và ho gà.

4. Vắc xin tiểu đơn vị (Subunit Vaccines): Ưu nhược điểm và ví dụ

Vắc xin tiểu đơn vị là gì?

Vắc xin tiểu đơn vị chứa các thành phần cụ thể của vi khuẩn hoặc virus (chẳng hạn như protein,
polysaccharide hoặc peptide) mà có khả năng kích thích hệ miễn dịch. Những thành phần này không
bao gồm toàn bộ vi sinh vật, mà chỉ là các phần tạo ra phản ứng miễn dịch.

Ưu điểm của vắc xin tiểu đơn vị

1. An toàn hơn: Do không chứa toàn bộ vi khuẩn hoặc virus, vắc xin tiểu đơn vị không có khả
năng gây bệnh. Điều này làm cho chúng an toàn hơn, đặc biệt là cho những người có hệ miễn
dịch suy yếu.
2. Ít tác dụng phụ: Thường gây ra ít tác dụng phụ hơn so với các loại vắc xin sống giảm độc
lực hoặc vắc xin bất hoạt.
3. Định hướng miễn dịch cụ thể: Vắc xin tiểu đơn vị chỉ chứa các kháng nguyên cần thiết để
tạo ra phản ứng miễn dịch, do đó, hệ miễn dịch được kích thích cụ thể chống lại phần đặc hiệu
của vi sinh vật.

Nhược điểm của vắc xin tiểu đơn vị

1. Hiệu quả miễn dịch yếu hơn: Do không sử dụng toàn bộ vi sinh vật, phản ứng miễn dịch có
thể yếu hơn so với các loại vắc xin sống giảm độc lực. Do đó, thường cần nhiều liều hoặc liều
tăng cường.
2. Cần chất bổ trợ: Để tăng cường hiệu quả miễn dịch, vắc xin tiểu đơn vị thường cần bổ sung
các chất bổ trợ (adjuvants).
3. Phức tạp trong sản xuất: Việc sản xuất các thành phần kháng nguyên cụ thể có thể phức tạp
và tốn kém.

Ví dụ về vắc xin tiểu đơn vị

1. Vắc xin viêm gan B (Hepatitis B vaccine): Chứa protein bề mặt của virus viêm gan B.
2. Vắc xin HPV (Human Papillomavirus vaccine): Chứa các protein L1 của virus HPV, giúp
bảo vệ chống lại các loại HPV gây ung thư cổ tử cung.
3. Vắc xin phế cầu (Pneumococcal polysaccharide vaccine): Chứa các polysaccharide từ vỏ
vi khuẩn Streptococcus pneumoniae.
4. Vắc xin ho gà vô bào (Acellular pertussis vaccine): Chứa các thành phần tinh khiết của vi
khuẩn Bordetella pertussis, thường được dùng trong vắc xin DTaP (bạch hầu, uốn ván, ho gà).
5. Vắc xin cúm tiểu đơn vị (Influenza subunit vaccine): Chứa các protein từ virus cúm, giúp
kích thích phản ứng miễn dịch mà không chứa toàn bộ virus.

Tóm lại

Vắc xin tiểu đơn vị là lựa chọn an toàn và ít tác dụng phụ, đặc biệt thích hợp cho những người có hệ
miễn dịch suy yếu. Tuy nhiên, chúng có thể yêu cầu nhiều liều hoặc cần sử dụng chất bổ trợ để đạt
hiệu quả miễn dịch tối ưu. Các ví dụ phổ biến bao gồm vắc xin viêm gan B, HPV, phế cầu, ho gà vô
bào và cúm tiểu đơn vị.

TIÊU CHUẨN VSV SẢN XUẤT VACCINE

Bổ sung so với slide:

 SẢN XUẤT ENZYM
1. Đại cương
a. Định nghĩa enzym
• Có trong tế bào
• Chất xúc tác sinh học:
– cường độ xúc tác mạnh
– đặc hiệu
• Bản chất protein
b. Cấu trúc
• Enzym đơn giản: protein (~100/3.000)
• Enzym phức tạp:
– protein (apoenzym)
– không protein (coenzym)
• Các L - α - amino acid kết hợp bằng liên kết peptit
• Trọng lượng từ 12.000 đến 1.000.000 dalton
c. Tính chất
• Có hoạt tính xúc tác mạnh, đặc hiệu
• Trọng lượng phân tử lớn khó qua màng tế bào
• Lưỡng tính, tan trong nước, muối loãng, glycerin, dd hữu cơ phân cực p/p tách chiết, tinh chế
• Không bền ở nhiệt độ cao, acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng
Nguồn nguyên liệu: không tổng hợp hóa học (do cấu trúc phức tạp, tổng hợp hóa học có thể không ra
cấu trúc của enzym (cấu trúc xoắn cuộn) -> ko có hoạt tính sinh học, có thể tạo hỗn hợp racemic..),
chủ yếu từ động vật, thực vật, vi sinh vật
d. PP sản xuất
– Tách chiết từ động vật, thực vật
– Sinh tổng hợp từ vi sinh vật
• Tách chiết và tinh chế
– Tách chiết từ động, thực vật: giải phóng enzym tách chiết và tinh chế dựa vào t/c
– Sinh tổng hợp từ VSV: enzym nội bào hay ngoại bào, tách chiết và tinh chế dựa vào t/c
e. Ứng dụng
• Thuốc: có > 60 E được sử dụng
–Loại cục máu đông: streptokinase, urokinase, nattokinase...
–Sạch vết thương: proteinase, trypsin, chymotrypsin, collagenase, papain...
– Trị bệnh bạch cầu: L - asparaginase
–Hỗ trợ tiêu hóa: amylase, pepsin, pancrease, bromelain, papain...
– Trị nhiễm khuẩn: lysozyme
Ưu điểm của việc sử dụng thuốc chứa E
- ít phản ứng phụ có hại
- có tính đặc hiệu cao
Hạn chế của việc sử dụng thuốc chứa E
- Khối lượng ptử lớn khó qua màng tế bào (kn thấm kém)
- Dễ biến tính (nhiệt độ, pH acid..) ở đường tiêu hoá
- Có thể bị bất hoạt bởi hệ dịch của cơ thể
-Dễ gây phản ứng tạo kháng thể khi sử dụng lặp lại nhiều lần =>gây dị ứng do là pr lạ
- Giá thành cao
- Nếu dùng quá nhiều lại feedback ngược lại lên hệ thống enzym nội sinh của cơ thể, cơ thể rất lâu
mới quay trở lại đc trạng thái cân bằng (enzym cơ thể ko sản sinh ra nữa => khi ngừng đưa enzym
vào, cơ thể không hoặc chậm sinh enzym) => dùng thời gian ngắn (3-5 ngày) (probiotic dùng lâu
cũng ko sao)
• Y học: Chẩn đoán
- Glucooxydase: KIT tiểu đường
- GPT - glutamic piruvat transaminase: gan
- GOT - glutamic oxalat transaminase: nhồi máu cơ tim
• Công nghệ sinh học: cellulase (tạo tế bào trần), polymerase (PCR)...
• SX nguyên liệu làm thuốc: penicillinacylase
Thực phẩm
- Làm trong (pectinase)
- Đông tụ sữa (rennin)
- Bánh kẹo (invertase – kẹo xốp, mật ong)
- Đồ uống (glucoisomerase, amylase)
- Bánh mỳ (amylase, proteinase)
- Làm mềm thịt (proteinase)
- Loại bỏ glucose (glucose oxidase)
Nông nghiệp
- Trộn vào thức ăn chăn nuôi: amylase, dextrinase, maltase, glucoamylase
- Hiệu quả: tăng hiệu suất sử dụng thức ăn
Giặt là
- Tẩy các vết máu ở bệnh viện và lò mổ (alcalase)
- Tẩy vết bẩn (proteinase, amylase, lipase...)
Mỹ phẩm, thuốc đánh răng và súc miệng
- Thuốc nhuộm tóc (oxydase, peroxydase)
- Làm quăn tóc (amylase, proteinase)
- Lột da mặt (proteinase)
- Làm trắng da
- Chống tạo cao răng (glucoseoxydase)
- Tẩy trắng răng (proteinase, papain)
Ngành khác
- Dệt
+ Rũ hồ vải (amylase)
+ Xử lý các tạp chất của sợi (proteinase)
+ Làm trắng sợi trước nhuộm màu (catalase)
- Giấy:
+ Xử lý keo tinh bột (amylase)
+ Tẩy mực
- Da: Khử lông (keratinase)
- Môi trường: Xử lý nước thải (catalase)
- Khai thác dầu mỏ
3. Phương pháp lên men sản xuất enzym từ VSV
a. Chủng giống
- Tất cả các nhóm VSV đều sinh enzym
- Hệ E rất da dạng (1 VSV sinh nhiều E, 1 E do nhiều VSV sinh ra)
- Tìm hiểu đặc điểm VSV, enzym sinh ra
- Các nhóm sinh enzym: Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn
b. Điều kiện lên men
 - Nhiệt độ: mát, do E ổn định ở nhiệt độ này , nhiệt độ cao quá enzym có thể biến tính
(20 – 30oC, có thể lên đến 37oC)
- pH: ~trung tính (ổn định cho VSV phát triển, sau nếu E ổn định ở kiềm hay acid thì
chiết sau)
- Cấp khí: thường hiếu khí hiệu suất sinh enzym cao hơn (nhóm VSV kỵ khí phát triển
chậm hơn nên sinh ít E hơn)
- Thời gian: sinh E ngay sau pha sinh trưởng
c. Môi trường dinh dưỡng
● Nguồn C: fructose, saccharose, glucose… (do enzym là một mạch chất hữu cơ rất
lớn)
● Nguồn N: bột đậu, pepton…(enzym là acid amin)
- pectinase: pectin, lactose
- cellulase: bã mía, mùn cưa, lõi ngô...
● Chất cảm ứng để sinh sản phẩm mong muốn: (muốn sinh enzym gì thì đưa cơ chất
enzym đấy)
- amylase: tinh bột, dextrin, maltose...
- proteinase: casein (enzym thủy phân sữa)…
- pectinase: pectin
● Các t/p khác: vi lượng, điều chỉnh pH, phá bọt…(tùy theo nhu cầu VSV)
d. Phương pháp lên men
● PP lên men bề mặt (xốp)
- Cám mì, cám gạo, bột đậu, bột ngô...
- Bổ sung trấu, mùn cưa => tăng độ xốp (<25%)
- Hấp chín và làm ẩm
- Độ dày: 2 – 5 cm
- Độ ẩm: 55 – 65%
- Làm ẩm, thổi khí, làm mát
- Thời gian: 36 – 48h
● Ưu điểm của lên men bề mặt
- Nồng độ E cao hơn lên men chìm
- Dễ sấy khô và ít hao tổn hoạt tính E
- Chế phẩm thô dễ vận chuyển
- Thiết bị đơn giản, tốn ít năng lượng
- Có thể xử lý cục bộ khi bị nhiễm
● PP lên men chìm
- Nguyên liệu: tinh bột, nitơ, khoáng
- Hồ hóa, khử trùng (30ph/1atm)
- Nhiệt độ: 28 – 30oC
- pH: tùy thuộc vào VSV (thường là trung tính)
- Khuấy trộn, cấp khí, làm mát
- Thời gian: 48 – 96h
e. Chiết enzym
- Có thể sử dụng E thô: SX rượu hoặc E tinh khiết: y dược, thực phẩm, CN nhẹ...
- E ngoại bào: loại sinh khối; E nội bào: phá vỡ tế bào
+ PP vật lý: phá vỡ tế bào
+ PP hóa học: acid, kiềm...
+ PP sinh học (enzym): lysozyme, cellulase...
=> Lọc lấy dịch chứa E
 - E thô: sấy khô đến 8 – 12%
- E tinh khiết:
+ Chiết bằng nước cất, nước muối (NaCl, (NH4)2SO4) bão hòa => làm mất điện tích
protein E (trung hòa hết điện tích của enzym) => E tụ lại thành khối (các E khác nhau tách
phân đoạn tùy loại muối)
+ Chiết bằng PP sắc ký khác nhau dựa vào tính chất (tích điện, ái lực với các phân tử
khác, kỵ nước...) => SK trao đổi ion, ái lực, kỵ nước, hấp phụ
+ Dung môi hữu cơ (cồn, aceton) ở 28 – 30oC
+ Hạ xuống 10oC, cô chân không => E tinh khiết
f. Tinh chế (dựa vào KT, điện tích, độ tan)
- kết tủa enzym trong dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol, aceton)
- kết tủa enzym trong dd muối trung tính
- sàng phân tử
- điện di
- hấp thụ chọn lọc
- sắc ký ái lực (enzym có ái lực với chất này, ko có ái lực với chất khác=> cố định đích
trên hạt sắc kí)
- siêu ly tâm (khác nhau về KT, khối lượng=> dùng sàng phân tử, điện di)
thứ tự sd các pp: tách chiết phân đoạn => dựa vào độ tan => điện tích => ái lực => kích thước,
KLPT
4. Kỹ thuật cố định enzym và tế bào
4.1. Đại cương
- Enzym: chất xúc tác sinh học
+ Cường độ xúc tác mạnh => tăng tốc độ phản ứng trăm triệu – tỷ lần
+ Đặc hiệu
- Enzym dạng tự do
+ Thường ko bền với các yếu tố: pH, to...
+ Quá trình tách chiết, tinh chế tốn kém
+ Không thu hồi được enzym ra khỏi hỗn hợp phản ứng sau khi sử dụng => tốn công, chi phí tốn kém
4.2. Định nghĩa
- Thuật ngữ “cố định”
Enzym hoặc tế bào được định vị trong 1 không gian xác định sao cho chúng bảo toàn
được hoạt tính sinh học (vẫn có khả năng xúc tác)
- Mục đích
+ Sử dụng được nhiều lần
+ Dễ tách khỏi sản phẩm
+ Có thể ngừng phản ứng khi cần
4.3. Cấu trúc hệ cố định: Chất mang + Enzym/ tế bào

4.3.1. Yêu cầu của enzym / tế bào

- Enzym
+ Đủ tinh sạch
+ Giữ được hoạt tính cao
- Tế bào
+ Chứa E nội bào có hoạt tính mạnh (ko thể là E ngoại bào)
+ Không có các E can thiệp vào phản ứng E chính, tạo ra các phản ứng phụ
+ Sản phẩm của tế bào phải đi qua được màng tế bào
4.3.2. Yêu cầu của chất mang
- Bền với nhiệt độ, pH, VSV, tác nhân hóa học
- PP cố định đơn giản
- Độ bền phù hợp, giữ được hoạt tính của hệ trong thời gian dài
- Không (ít) độc với E/ tế bào/ cơ thể sống
- Giá thành phù hợp
4.4. Phân loại chất mang
- Vô cơ (có lỗ xốp hoặc có khả năng hấp phụ)
+ bentonite, silica
+ thủy tinh, các kim loại, oxyd kim loại
- Hữu cơ (có chất tạo ra cấu trúc mạng lưới để giữ E, TB, tạo lk)
+ Polymer tự nhiên
Các polysaccharide (cellulose, dextrans, agar, agarose, chitin, alginate)
Các protein (collagen, albumin)
+ Polymer tổng hợp
+ Polyacrylamide (polystyrene, polyamides)
4.5. PP cố định enzym/ tế bào
4.5.1. Phân loại
- PP hóa học: tạo liên kết đồng hóa trị, tạo liên kết chéo...
- PP vật lý: hấp phụ, bẫy – bao gói...
- Cố định enzym: sử dụng cả 2 pp (enzym có mạch nhánh để tạo lk hóa học)
- Cố định tế bào (khả năng liên kết kém): sd chủ yếu pp vật lý (nhờ KT lớn hơn lỗ của chất mang)
4.5.2. Phương pháp hóa học
a. Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị
+ Nguyên tắc: E (NH2, COOH, CH2) tạo liên kết đồng hóa trị với các nhóm chức trên chất mang
(NH2, CO, OH) không tan trong nước (tạo 1 hệ ko tan => dễ tách) (TB ko làm pp này)
+ Ưu điểm: bền vững, hệ ổn định, giữ được đặc tính của hệ tốt; chất mang đa dạng
+ Nhược điểm: điều kiện phức tạp để tạo liên kết bền vững (nhiệt độ, xúc tác)
do liên kết rất bền vững, muốn tách enzym khỏi chất mang cần phá vữo liên kết => không thể tái sử
dụng chất mang, enzym ; tác động đến trung tâm hoạt động của enzym (cản trở trung tâm hoạt động)
=> có thể ảnh hưởng đến enzym (cấu trúc, hoạt tính...)

b. Phương pháp tạo liên kết ngang (chéo)

- Nguyên tắc:
 + Gắn enzym với enzym bằng các liên kết đồng hóa trị thành đại phân tử không tan => hệ tương
đối bền => chống chịu được tác nhân
+ Khi E liên kết nhiều với nhau => tạo hệ lớn => ko ở dạng tự do nữa mà kết tụ lại, và giữ được
E ở 1 vị trí nào đó
+ Các E gắn với nhau nên E vẫn giữ được hoạt tính
+ Tác nhân hay dùng là glutaraldehyd (do E có các nhóm NH2, COOH, COOH sẽ gắn vào
đường 2 để tạo cầu nối
- Ưu điểm:
+ Ít bị rửa trôi
+ Tăng tính chống chịu được các yếu tố biến tính, độ bền tốt do lk chặt chẽ
- Nhược điểm:
+ Lượng E cố định ít hơn pp khác do ko gắn với chất mang
+ Không thể tái sd enzym khi phá vỡ liên kết
+ Có thể gây giảm hoạt tính E, do tác nhân glutaraldehyd tạo liên kết bền vững hoặc che trung
tâm hoạt động của E
+ Giá thành cao

4.5.3. Phương pháp vật lý

a. Phương pháp bẫy
- E/ TB được nhốt trong các mạng lưới polymer (tạo ko gian giữa các mạng lưới giữ các TB
trong này)
- Vẫn giữ được hoạt tính do vẫn có không gian bên trong mạng lưới cho E
chuyển động, tiếp cận cơ chất
- 1 số chất mang có sẵn mạng lưới, nhưng 1 số cần kích hoạt nhờ các phản ứng, quá trình
+ Ví dụ: alginat
Ban đầu alginat có các đoạn mạch thẳng, gấp khúc, ban đầu thường là muối của KL hóa trị 1
như Na, mà Na không đủ để giữ 2 mạch cạnh nhau. Muốn cố định TB, E, cần đưa vào dd
Ca2+ ( Ca có điện tích 2+, COOH điện tích âm) , khi đó Ca xếp xen kẽ vào 2 mạch xếp song
song, đồng thời tạo liên kết tĩnh điện, và liên kết tạo phức => 2 mạch gần lại và xếp song
song, tạo ra các vị trí trống để kẹp các E/TB mà ko bị rơi ra ngoài

b. Phương pháp bao gói

+ E/TB được gói trong các vi nang (microcapsule) có đường kính từ 1 – 100 μm
 + Khác PP bẫy các cấu trúc có ở trên toàn hệ (đặc), còn PP bao gói thì bên trong là 1 không
gian rộng, không có cấu trúc ở trong (rỗng) (không có mạng lưới, chỉ có màng polymer bên
ngoài)

Phương pháp bẫy - bao gói

- Chất mang
+ Các polymer tổng hợp như polyacrylamid, polyvinyl, polyureetan...
+ Phổ biến là thạch, alginat, carageenan (polymer tự nhiên)
- Ưu điểm (PP bẫy – bao gói)
+ E/TB dễ định vị trong gel
+ Cho E, cơ chất đi qua
+ Mạng lưới chất trùng hợp càng nhỏ càng giữ chặt E/TB hơn (nhưng ko được nhỏ quá,
nếu nhỏ quá thì E, cơ chất ko đi qua được)
- Nhược điểm (PP bẫy – bao gói)
+ E/TB phân bố không đều
+ Không tái sử dụng được chất mang do quá trình không đảo nghịch được (cấu trức
chặt chẽ, bền vững => phá vỡ thì sẽ phá vữo cả hệ)
c. Phương pháp hấp phụ
- E/TB được hấp phụ lên bề mặt các chất mang rắn có lỗ xốp hoặc không có lỗ xốp nhờ
lực hấp phụ, ion, tạo phức, tĩnh điện, Van der Walls
- Chất mang: than hoạt, bentonite hay đất sét, silica (có lỗ xốp) cao lanh, hexyl
–agarose, trityl – agarose, các ester của cellulose (tạo phức)

Ưu điểm:
• Ít ảnh hưởng đến hình dạng, hoạt động của enzym, tế bào (chỉ hấp phụ, ko
tạo liên kết hóa học)
• Hiệu suất cao
• Dễ thực hiện
• Tái sử dụng được chất mang (do lk yếu, khi phá vỡ ko ảnh hưởng đến chất
mang và tế bào)
Nhược điểm
• Liên kết lỏng lẻo tế bào/ E dễ bị đây ra ngoài => ko an toàn khi cố định tế bào
• Dễ bị rửa trôi
Ưu điểm phương pháp cố định
- Enzym và tế bào ổn định
- Có thể tái sử dụng E hay tế bào giảm chi phí tinh chế SP
- Dễ tách SP
- Chủ động ngừng phản ứng khi cần
- Chuyển sang phản ứng liên tục có thể tự động hoá, cơ giới hóa
- Có thể phát triển hệ thống p/ứng nhiều enzym hay tế bào
Nhược điểm:
- Hoạt tính E cố định < E tan
- Do bị giữ trong khuôn gel, cơ chất khó tiếp cận với E/tế bào phản ứng khó thực hiện hơn
- Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất giữa E và chất mang
- Duy trì sự sống của tế bào cố định khó hơn tế bào tự do
5. Ứng dụng
a. Sản xuất nguyên liệu bán tổng hợp các β –lactam: 6 – APA, 7 – ACA, 7 - ADCA
- Nguyên tắc

- Cố định enzym penicilinamidase: tinh sạch, hoạt tính cao (nên tách từ VK E. Coli, B.)
- Cố định tế bào E. coli, B. megatherium (dùng trong công nghiệp)
+ P-amidase nội bào
+ thuỷ phân Pe G nhanh, chọn lọc
+ pH = 9,0
+ Sp 6-APA là ngoại bào vì nếu là nội bào thì phải phá vỡ => mất hệ cố định
- Chất mang: polyacrylamide, alginate...
Chỉ nên cố định TB để sản xuất các sản phẩm ngoại bào, do nếu là SP nội bào thì ta còn cần phải phá
hủy tế bào, phá vỡ hệ cố định (VD: ko cố định tế bào để SX vitamin B12)
b. Sản xuất acid amin bằng aminoacylase cố định
Enzym amino acylase cố định trên DEAE Sephadex để chuyển hoá hỗn hợp racemic thành L - acid
amin.

c. Sản xuất L - acid aspartic bằng enzyme aspartase cố định

Cố định tế bào Brevibacterium flavum chứa enzym aspartase bằng cách gói trong gel polyacrylamid.
d. Sản xuất siro fructose bằng glucose isomerase cố định
Note: Cố định tế bào nguyên vẹn => phải sử dụng pp vật lí (cả 2 pp đều có thể đc sd)
Tuy nhiên pp hấp phụ khó hơn vì tb nguyên vẹn khó có khả năng hấp phụ lên bề mặt chất mang bền
vững bằng bẫy-bao gói
Kiếm soát hiệu suất, khả năng sinh trường, phát triển bằng pp đếm
Thường thu tế bào ở đầu pha cân bằng để duy trì số lượng tb đc cố định, nếu lấy ở pha log thì đang là
giai đoạn sinh ra tế bào con => nhiều tb con sẽ bị đẩy ra
 SẢN XUẤT VITAMIN B12
1. Đại cương về vitamin B12
a. Phân bố
• VSV: VK propionic và metan
• Xạ khuẩn: Streptomyces
• Thực vật: tảo, mầm hạt
• Người:gan, ruột già, phân
• Động vật: thịt (bò), gan, thận, tim, trứng, sữa, phân...
• Hải sản: cua, cá, trứng cá…
b. Cấu trúc hóa học:

Từ nhân Corin => VSV cần MTDD có rất nhiều C (đg, tinh bột), N (đạm vô cơ, đạm hữu cơ), ion
Cobalt
Đường ribose phosphat => cần đường ribose, photphat (có thể lượng nhỏ)
5,6 DMB => VSV khó tổng hợp/khi tổng hợp có thể gây độc cho VSV => cần đưa từ bên ngoài vào
=> là tiền chất (dưới dạng chất tinh khiết) định hướng tạo sp
Để gắn 5,6 DMB vào nhân Corin thì cần phải có Oxy vì đây là PƯ OXH-K
Tách chiết và tinh chế: Để tạo dẫn xuất của cobalamin (hoạt tính ko cao, độ bền vững ko lớn) : Dẫn
xuất được quyết định bởi nhóm gắn vào nhân Corin => tạo dạng ổn định, tạo tính chất, có hoạt tính
điều trị: 3 gốc thường gặp là Cyanocobalamin (-CN), Hydroxocobalamin (-OH) và Methylcobalamin
(-CH3) (vai trò tốt trong 1 số bệnh về mắt. TK và độc tính thấp hơn) (phải làm các phản ứng bên
ngoài chứ ko tổng hợp lên men đc => đưa vào giai đoạn tách chiết, tinh chế). Trước đây phổ biến là
dạng Cyanocobalamin, tuy nhiên gần đây chuyển sang sử dụng 2 dạng còn lại do có tính ổn định và
hoạt tính tốt hơn
Không nên tổng hợp hóa học vì hoạt tính ko cao bằng lên men
 c. Tính chất
Cyanocobalamin
● có khả năng kết tinh: tinh thể hình kim màu đỏ sẫm
● không mùi vị
● dễ hút ẩm (12%)
● dễ tan trong nước, ethanol
● không tan trong ether, aceton, chloroform => độ tan khác nhau trong 1 số dm => ứng
dụng tách chiết và tinh chế
2. Phương pháp sản xuất
1948 - chiết từ cao gan: 10 – 20mg B12/ 1 tấn
a. Chiết từ bùn cống (bùn cống có nhiều VSV sinh khí Metan và Propionic)
•1951 (Frieric & Berna)
•nhóm VK sinh metan
•0,5 - 1μg B12/1g bùn khô (ủ)
•bổ sung vào thức ăn gia súc (do hiệu suất ko cao, lẫn nhiều tạp)
•kiểm tra độ ô nhiễm môi trường
b. Chiết từ nước thải của công nghiệp kháng sinh
• xạ khuẩn: Str. griseus, Str. aureofaciens, Str. rimosus… => tạo ra KS là SP chính, B12 ở nước thải
• 40mg B12/100 lít nước thải
c. Lên men công nghiệp
• Chủng giống: Propionibacterium shermanii
• Lên men chìm kỵ khí, nguyên liệu từ glucose, bổ sung 5, 6 DMB
• 150mg/l, trị giá 71 triệu USD
3. Lên men SX B12: PP sinh tổng hợp
a. Chủng giống:
- Propionibacterium shermanii
- Propionibacterium freudenreichii => VSV sinh Acid propionic => tạo nhiều acid làm thay đổi
pH môi trường, cần kiểm soát pH
VSV thường ở bùn cống => ưa mát
• trực khuẩn Gram (+)
• kỵ khí, hiếu khí không bắt buộc (hiếu khí tạo nhiều acid hữu cơ)
• phát triển mạnh khi kỵ khí => chọn đk kị khí
kỵ khí: hình cầu (Φ = 0,5 - 0,6μm), đơn lẻ hay chuỗi ngắn
• hiếu khí: hình que, xếp đôi; chuỗi ngắn
chịu pH acid tốt, phát triển ở môi trường pH trung tính, hơi acid
b. Môi trường dinh dưỡng:
- Cacbon (cần lượng rất lớn): glucose, sucrose, không sử dụng được tinh bột (muốn sử dụng
được phải thủy phân) do ko có enzym thủy phân
- Nitơ:
Nito vô cơ: aminoacid, muối amoni...methionine h/suất tăng 10 – 12%
Nito hữu cơ: cao ngô, cao thịt, cao nấm men…
- Ion k/loại:
Coban (đưa vào dưới dạng muối tan: Clorit, Nitrat) tăng h/suất
Fe, Cu, Zn, Mn giảm h/suất do cạnh tranh tạo phức => cần loại ion bằng cách sd nước khử
khoáng, kiểm soát hàm lượng tạp KL ở các nguyên liệu đầu vào, có thể tăng lượng Coban đưa
vào
- Các vitamin: kích thích sinh trưởng (thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic)
- Chất tiền thể: 5,6 DMB – bổ sung vào giờ thứ 72 (1-10mg/l) (ko bổ sung ngay từ giai đoạn
đầu tiên do chất tiền thể khá cồng kềnh=> đưa vào VSV ko ngấm được/có thể ức chế gây độc
 cho VSV, để thời gian cho VSV tổng hợp khung cơ bản đầu tiên rồi mới gắn chất tiền thể giúp
hiệu suất cao )
c. Điều kiện lên men
• Nhiệt độ: 28 – 30oC (ưa mát)
• pH: 6,8 - 7,2 (đ/c pH =NH4OH hoặc chất đệm/ sd đầu dò pH, khi nào quá thì thêm dung
dịch điều chỉnh)
• Cấp khí:
- 50h đầu: kỵ khí bắt buộc (vì đây là giai đoạn tích lũy sinh khối lớn)
- sau đó cấp khí 15ph/1h (mức độ nhỏ, quá trình vi hiếu khí=> cung cấp 1 lượng nhỏ
Oxy cho quá trình OXH-K), giờ thứ 72 bổ sung 5,6 DMB (=> kết hợp với O2 kk, gắn
vào nhân Corin)
• Thời gian lên men: 6 – 7 ngày
• H/suất: 80 – 100mg/l
4. Chiết xuất và tinh chế
Nguyên tắc và các giai đoạn chính
a. Thu sinh khối:
B12 là sản phẩm nội bào (phá vỡ màng tế bào bằng nhiệt độ: đun nóng với acid HCl trong thời gian
ngắn vì nếu lâu sẽ phân hủy B12) => lọc/ly tâm => lấy sinh khối
b. Giải phóng Vitamin B12:
• hòa sinh khối vào nước tạo hỗn dịch
• chỉnh pH = 4,5 (HCl 10%)
• đun nóng 80oC/30 phút
• lọc lấy dịch
c. Chiết Vitamin B12:
•Chiết B12 từ nước sang pha phenol: n-butanol (1:1)
• V hữu cơ : V nước = 1:3
• Chiết B12 lại nhiều lần bằng nước
Chiết bằng nhựa hấp phụ (SK hấp phụ)
d. Cyanid hoá:
• Cyanid hoá bằng KCN
• Chỉnh pH về 8,0 - 8,5
• Để 3h: Coenzym => Cyanocobalamin
• Cô chân không ở ≤ 60oC đến 10.000 μg/ml
(muốn tạo dẫn xuất methyl thì tiến hành methyl hóa như dùng CH3Cl,...)
=> cần tạo dẫn xuất để bền hơn, hoạt tính cao hơn (VSV chỉ tổng hợp đc cobanlamin)
e. Tinh chế:
• Sắc ký trên cột oxyd nhôm đã hoạt hoá 300OC/1h
• Hấp phụ dung dịch B12 lên cột trong dung dịch aceton - nước 75%.
• Chuyển dịch B12 trên cột: aceton - nước (80%)
• Phản hấp phụ: aceton - nước (50%)
• Lấy phân đoạn đậm đặc nhất
f. Kết tinh:
• Pha loãng dịch bằng aceton (do ít tan trong aceton)
• Khuấy nhẹ, để kết tinh 12h/4°C (tạo mầm tinh thể)
• Lọc tinh thể
• Rửa (aceton); sấy khô (bình hút ẩm)
• Hàm lượng Vitamin B12 ≥ 95%.
7. Định lượng:
• đo quang λ = 361nm
• PP vi sinh vật – (E. coli): đảm bảo hoạt tính hơn (B12 kích thích sự phát triển VSV => nếu VSV
phát triển tốt thì có B12) nhưng thời gian lâu