The Eukaryotic RNA Exosome:

Methods and Protocols 1st ed. 2020

Edition John Lacava
Visit to download the full and correct content document:
https://ebookmass.com/product/the-eukaryotic-rna-exosome-methods-and-protocols-
1st-ed-2020-edition-john-lacava/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Chaperones: Methods and Protocols 2nd Edition John M.

Walker

https://ebookmass.com/product/chaperones-methods-and-
protocols-2nd-edition-john-m-walker/

Flower Development: Methods and Protocols 2nd Edition

John M. Walker

https://ebookmass.com/product/flower-development-methods-and-
protocols-2nd-edition-john-m-walker/

Exosomes and Microvesicles: Methods and Protocols 1st

Edition Andrew F Hill (Eds.)

https://ebookmass.com/product/exosomes-and-microvesicles-methods-
and-protocols-1st-edition-andrew-f-hill-eds/

The Renewable Energy Transition: Realities for Canada

and the World 1st ed. 2020 Edition John Erik Meyer

https://ebookmass.com/product/the-renewable-energy-transition-
realities-for-canada-and-the-world-1st-ed-2020-edition-john-erik-
meyer/
The Precision Farming Revolution: Global Drivers of
Local Agricultural Methods 1st ed. 2020 Edition James
E. Addicott

https://ebookmass.com/product/the-precision-farming-revolution-
global-drivers-of-local-agricultural-methods-1st-ed-2020-edition-
james-e-addicott/

Peacebuilding and the Arts 1st ed. 2020 Edition Jolyon

Mitchell

https://ebookmass.com/product/peacebuilding-and-the-arts-1st-
ed-2020-edition-jolyon-mitchell/

Doing Business in Chile and Peru: Challenges and

Opportunities 1st ed. 2020 Edition John E. Spillan

https://ebookmass.com/product/doing-business-in-chile-and-peru-
challenges-and-opportunities-1st-ed-2020-edition-john-e-spillan/

Sustainability in Energy and Buildings: Proceedings of

SEB 2019 1st ed. 2020 Edition John Littlewood

https://ebookmass.com/product/sustainability-in-energy-and-
buildings-proceedings-of-seb-2019-1st-ed-2020-edition-john-
littlewood/

Maternal Sentencing and the Rights of the Child 1st ed.

2020 Edition Shona Minson

https://ebookmass.com/product/maternal-sentencing-and-the-rights-
of-the-child-1st-ed-2020-edition-shona-minson/
Methods in
Molecular Biology 2062

John LaCava
Štěpánka Vaňáčová
Editors

The Eukaryotic
RNA Exosome
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was
the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by-
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
 The Eukaryotic RNA Exosome

Methods and Protocols

Edited by

John LaCava
Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, New York, NY, USA
European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Center Groningen, Groningen,
The Netherlands

Štěpánka Vaňáčová
Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk University, Brno, Czech Republic
Editors
John LaCava Štěpánka Vaňáčová
Laboratory of Cellular Central European Institute
and Structural Biology of Technology (CEITEC)
The Rockefeller University Masaryk University
New York, NY, USA Brno, Czech Republic
European Research Institute
for the Biology of Ageing
University Medical Center Groningen
Groningen, The Netherlands

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-9821-0 ISBN 978-1-4939-9822-7 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9822-7
© Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2020
The chapters 5 and 6 are licensed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). For further details see license information in the chapters.
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.
The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A.
Preface

The RNA exosome complex was first described by Philip Mitchell, together with David
Tollervey and colleagues, in 1997 (Cell, Vol. 91, 457–466). In this seminal work, the exosome
was described as “a conserved eukaryotic RNA processing complex containing multiple 30 !50
exoribonucleases.” Since then, the field of exosome research has expanded steadily. The
proliferation of the field was fueled by the ever-growing list of roles played by the exosome
in (1) the precise processing of RNA precursors to mature forms and (2) the turnover of RNAs
in response to quality control surveillance and homeostatic RNA decay. The exosome was
found to be associated with a dizzying array of substrates and instance-specific modes of
enzymatic activity. The mechanisms regulating its biochemistry were thus swiftly brought to
the fore, inducing the search for adapter proteins and complexes that could impart functional
selectivity to the exosome. This, alongside abundant episodes of mystery and intrigue sur-
rounding the potential for exo- and endoribonucleolytic, as well as hydro- and phosphorolytic
exosome activities. Through the functions it serves, the exosome’s ubiquity extends to all the
domains of life. In bacteria and archaea, cognate proteins and complexes have been shown to
exhibit exosome-like activities, e.g., polynucleotide phosphorylase/the degradosome in bac-
teria and in archaea, a more orthologous complex, also called the exosome. Soon, it seemed
that the exosome was everywhere in RNA biology—and the situation remains much the same
today, 20 years on, with no sign that exosome research is yet petering out. Indeed, quite the
contrary, the exosome is understood to be a valuable biomedical target.
Thus, The Eukaryotic RNA Exosome: Methods and Protocols is intended to provide a
thorough basis in contemporary exosome research for the newcomer, this both in terms of
the techniques used and the general direction of the field. For those grizzled veterans of
exosome research who may have stuck mostly to their favorite model organism, we have
tried to provide a cross-section of protocols representing the diversity of model organisms
used for exosome research, hopefully empowering broader and more frequent cross-
organism comparisons within the same research team. This book begins with an introduc-
tion to RNA exosome biomedical relevance (Chapter 1) and then steps back to examine the
origins of exosome activity in bacteria (Chapters 2–3) and archaea (Chapter 4). From there,
methods of studying exosome RNA substrates are covered (Chapters 5–10), followed by the
study of exosome adapter complexes and the broader interaction networks that impart
selectivity to pathways the exosome participates in (Chapters 11–16). Finally, structural
and mechanistic biochemical studies are covered, with emphasis on methods that use
recombinant expression and exogenous reconstitution (Chapters 17–24).
Štěpánka and I would like to thank all the contributing authors for their enthusiasm,
professionalism, and scholarship. As our first experience editing a book of this nature, with
its associate learning curve and time commitment, we were lucky to have this group of
contributors to work with. Indeed, there was also a special “something” for us in being able
to edit this book together as a team. Additional thanks to Ms. Hua Jiang for proofreading
the chapters and to Dr. John Walker for the guidance on how to execute our tasks effectively
and the patience along the way to completion.

New York, NY, USA John LaCava

Brno, Czech Republic Štěpánka Vaňáčová

v
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

PART I INTRODUCTION TO THE RNA EXOSOME IN BIOMEDICINE

1 The RNA Exosome and Human Disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Milo B. Fasken, Derrick J. Morton, Emily G. Kuiper, Stephanie K. Jones,
Sara W. Leung, and Anita H. Corbett

PART II PROKARYOTIC RNASES AND EXOSOMES

2 The Bacterial Counterparts of the Eukaryotic Exosome:

An Evolutionary Perspective. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Sandra C. Viegas, Rute G. Matos, and Cecı́lia M. Arraiano
3 In Vitro Characterization of the Prokaryotic Counterparts
of the Exosome Complex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Rute G. Matos, Sandra C. Viegas, and Cecı́lia M. Arraiano
4 Enzymatic Analysis of Reconstituted Archaeal Exosomes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Elena Evguenieva-Hackenberg, A. Susann Gauernack, Linlin Hou,
and Gabriele Klug

PART III ANALYZING EXOSOME SUBSTRATES

5 Protocols for Northern Analysis of Exosome Substrates

and Other Noncoding RNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Cristina Cruz and Jonathan Houseley
6 Mapping Exosome–Substrate Interactions In Vivo
by UV Cross-Linking. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Clémentine Delan-Forino and David Tollervey
7 Global Identification of Human Exosome Substrates Using
RNA Interference and RNA Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Marta Lloret-Llinares and Torben Heick Jensen
8 High-Resolution Mapping of 3’ Extremities of RNA Exosome
Substrates by 3’ RACE-Seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Hélène Scheer, Caroline De Almeida, Natalia Sikorska, Sandrine Koechler,
Dominique Gagliardi, and Hélène Zuber
9 Determining mRNA Stability by Metabolic RNA Labeling
and Chemical Nucleoside Conversion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Veronika A. Herzog, Nina Fasching, and Stefan L. Ameres

vii
viii Contents

10 Thiouridine-to-Cytidine Conversion Sequencing (TUC-Seq)

to Measure mRNA Transcription and Degradation Rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
Alexandra Lusser, Catherina Gasser, Lukas Trixl, Paolo Piatti,
Isabel Delazer, Dietmar Rieder, Jeffrey Bashin, Christian Riml,
Thomas Amort, and Ronald Micura

PART IV EXOSOMES AND THEIR SUPRAMOLECULAR FUNCTIONAL INTERACTIONS

11 RNA Exosomes and Their Cofactors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
Cornelia Kilchert
12 Purification of Endogenous Tagged TRAMP4/5 and Exosome
Complexes from Yeast and In Vitro Polyadenylation-Exosome
Activation Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
Dagmar Zigáčková, Veronika Rájecká, and Štěpánka Vaňáčová
13 Comparative Poly(A)+ RNA Interactome Capture of RNA
Surveillance Mutants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
Cornelia Kilchert, Svenja Hester, Alfredo Castello, Shabaz Mohammed,
and Lidia Vasiljeva
14 Purification and In Vitro Analysis of the Exosome Cofactors
Nrd1-Nab3 and Trf4-Air2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
Odil Porrua
15 Affinity Proteomic Analysis of the Human Exosome
and Its Cofactor Complexes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
Kinga Winczura, Michal Domanski, and John LaCava
16 In Vitro Characterization of the Activity of the Mammalian
RNA Exosome on mRNAs in Ribosomal Translation Complexes . . . . . . . . . . . . . 327
Alexandra Zinoviev, Christopher U. T. Hellen, and Tatyana V. Pestova

PART V RECOMBINANT EXPRESSION STRATEGIES AND STRUCTURAL

CHARACTERIZATION OF EXOSOMES
17 Native Mass Spectrometry Analysis of Affinity-Captured
Endogenous Yeast RNA Exosome Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357
Paul Dominic B. Olinares and Brian T. Chait
18 Chemical Cross-Linking and Mass Spectrometric Analysis
of the Endogenous Yeast Exosome Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383
Yufei Xiang, Zhuolun Shen, and Yi Shi
19 Cryo-Electron Microscopy of Endogenous Yeast Exosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
Jun-Jie Liu and Hong-Wei Wang
20 Strategies for Generating RNA Exosome Complexes
from Recombinant Expression Hosts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
Eva-Maria Weick, John C. Zinder, and Christopher D. Lima
21 Reconstitution of S. cerevisiae RNA Exosome Complexes
Using Recombinantly Expressed Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427
John C. Zinder and Christopher D. Lima
 Contents ix

22 Reconstitution of the Schizosaccharomyces pombe RNA Exosome . . . . . . . . . . . . . . 449

Kurt Januszyk and Christopher D. Lima
23 Reconstitution of the Human Nuclear RNA Exosome. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467
Kurt Januszyk, Eva-Maria Weick, and Christopher D. Lima
24 Purification and Reconstitution of the S. cerevisiae TRAMP
and Ski Complexes for Biochemical and Structural Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491
Achim Keidel, Elena Conti, and Sebastian Falk

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 515
Contributors

STEFAN L. AMERES  IMBA—Institute of Molecular Biotechnology, Vienna Biocenter (VBC),

Vienna, Austria
THOMAS AMORT  Division of Molecular Biology, Biocenter, Medical University of Innsbruck,
Innsbruck, Austria
CECÍLIA M. ARRAIANO  Instituto de Tecnologia Quı́mica e Biol
ogica Ant
onio Xavier, Oeiras,
Portugal
JEFFREY BASHIN  Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA
ALFREDO CASTELLO  Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK
BRIAN T. CHAIT  Laboratory of Mass Spectrometry and Gaseous Ion Chemistry, The
Rockefeller University, New York, NY, USA
ELENA CONTI  Department of Structural Cell Biology, Max-Planck-Institute of
Biochemistry, Martinsried, Germany
ANITA H. CORBETT  Department of Biology, RRC 1021, Emory University, Atlanta, GA,
USA
CRISTINA CRUZ  Epigenetics Programme, Babraham Institute, Cambridge, UK
CAROLINE DE ALMEIDA  Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS), Université de Strasbourg, Strasbourg, France
CLÉMENTINE DELAN-FORINO  Wellcome Centre for Cell Biology, University of Edinburgh,
Edinburgh, UK
ISABEL DELAZER  Division of Molecular Biology, Biocenter, Medical University of Innsbruck,
Innsbruck, Austria
MICHAL DOMANSKI  Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern, Bern,
Switzerland
ELENA EVGUENIEVA-HACKENBERG  Institute for Microbiology and Molecular Biology, Justus-
Liebig-University Giessen, Giessen, Germany
SEBASTIAN FALK  Department of Structural Cell Biology, Max-Planck-Institute of
Biochemistry, Martinsried, Germany; Max Perutz Laboratories, Department of Structural
and Computational Biology, University of Vienna, Vienna, Austria
NINA FASCHING  IMBA—Institute of Molecular Biotechnology, Vienna Biocenter (VBC),
Vienna, Austria
MILO B. FASKEN  Department of Biology, RRC 1021, Emory University, Atlanta, GA, USA
DOMINIQUE GAGLIARDI  Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS), Université de Strasbourg, Strasbourg, France
CATHERINA GASSER  Department of Chemistry and Pharmacy, Institute of Organic
Chemistry, Leopold Franzens University, Innsbruck, Austria
A. SUSANN GAUERNACK  Institute for Microbiology and Molecular Biology, Justus-Liebig-
University Giessen, Giessen, Germany
CHRISTOPHER U. T. HELLEN  Department of Cell Biology, SUNY Downstate Health Sciences
University, Brooklyn, NY, USA
VERONIKA A. HERZOG  IMBA—Institute of Molecular Biotechnology, Vienna Biocenter
(VBC), Vienna, Austria
SVENJA HESTER  Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK

xi
xii Contributors

LINLIN HOU  Institute for Microbiology and Molecular Biology, Justus-Liebig-University

Giessen, Giessen, Germany
JONATHAN HOUSELEY  Epigenetics Programme, Babraham Institute, Cambridge, UK
KURT JANUSZYK  Structural Biology Program, Sloan Kettering Institute, Memorial Sloan
Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
TORBEN HEICK JENSEN  Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University,
Aarhus, Denmark
STEPHANIE K. JONES  Department of Biology, RRC 1021, Emory University, Atlanta, GA,
USA; Genetics and Molecular Biology Graduate Program, Emory University, Atlanta,
GA, USA
ACHIM KEIDEL  Department of Structural Cell Biology, Max-Planck-Institute of
Biochemistry, Martinsried, Germany
CORNELIA KILCHERT  Institut für Biochemie, Justus-Liebig-Universit€a t Gießen, Gießen,
Germany
GABRIELE KLUG  Institute for Microbiology and Molecular Biology, Justus-Liebig-University
Giessen, Giessen, Germany
SANDRINE KOECHLER  Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS), Université de Strasbourg, Strasbourg, France
EMILY G. KUIPER  Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer
Institute, Boston, MA, USA
JOHN LACAVA  Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University,
New York, NY, USA; European Research Institute for the Biology of Ageing, University
Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands
SARA W. LEUNG  Department of Biology, RRC 1021, Emory University, Atlanta, GA, USA
CHRISTOPHER D. LIMA  Structural Biology Program, Sloan Kettering Institute, Memorial
Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute,
New York, NY, USA
JUN-JIE LIU  Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division, Lawrence Berkeley
National Laboratory, Berkeley, CA, USA; Department of Molecular and Cell Biology,
University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA
MARTA LLORET-LLINARES  Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus
University, Aarhus, Denmark
ALEXANDRA LUSSER  Division of Molecular Biology, Biocenter, Medical University of
Innsbruck, Innsbruck, Austria
RUTE G. MATOS  Instituto de Tecnologia Quı́mica e Biol
ogica Ant
onio Xavier, Oeiras,
Portugal
RONALD MICURA  Department of Chemistry and Pharmacy, Institute of Organic Chemistry,
Leopold Franzens University, Innsbruck, Austria
SHABAZ MOHAMMED  Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK;
Department of Chemistry, University of Oxford, Chemistry Research Laboratory, Oxford,
UK
DERRICK J. MORTON  Department of Biology, RRC 1021, Emory University, Atlanta, GA,
USA
PAUL DOMINIC B. OLINARES  Laboratory of Mass Spectrometry and Gaseous Ion Chemistry,
The Rockefeller University, New York, NY, USA
TATYANA V. PESTOVA  Department of Cell Biology, SUNY Downstate Health Sciences
University, Brooklyn, NY, USA
PAOLO PIATTI  Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA
 Contributors xiii

ODIL PORRUA  Institut Jacques Monod-UMR7592, CNRS, Université de Paris, Paris,

France
VERONIKA RÁJECKÁ  Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk
University, Brno, Czech Republic
DIETMAR RIEDER  Division of Bioinformatics, Biocenter, Medical University of Innsbruck,
Innsbruck, Austria
CHRISTIAN RIML  Department of Chemistry and Pharmacy, Institute of Organic Chemistry,
Leopold Franzens University, Innsbruck, Austria
HÉLÈNE SCHEER  Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS), Université de Strasbourg, Strasbourg, France
ZHUOLUN SHEN  Department of Cell Biology, University of Pittsburgh School of Medicine,
Pittsburgh, PA, USA; School of Medicine, Tsinghua University, Beijing, China
YI SHI  Department of Cell Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh,
PA, USA
NATALIA SIKORSKA  Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS), Université de Strasbourg, Strasbourg, France
DAVID TOLLERVEY  Wellcome Centre for Cell Biology, University of Edinburgh, Edinburgh,
UK
LUKAS TRIXL  Division of Molecular Biology, Biocenter, Medical University of Innsbruck,
Innsbruck, Austria
ŠTĚPÁNKA VAŇÁČOVÁ  Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk
University, Brno, Czech Republic
LIDIA VASILJEVA  Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK
SANDRA C. VIEGAS  Instituto de Tecnologia Quı́mica e Biol
ogica Ant
onio Xavier, Oeiras,
Portugal
HONG-WEI WANG  Ministry of Education Key Laboratory of Protein Sciences, Tsinghua-
Peking Joint Center for Life Sciences, Center for Structural Biology, School of Life Sciences,
Tsinghua University, Beijing, China
EVA-MARIA WEICK  Structural Biology Program, Sloan Kettering Institute, Memorial Sloan
Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
KINGA WINCZURA  School of Biosciences, College of Life and Environmental Sciences,
University of Birmingham, Birmingham, UK
YUFEI XIANG  Department of Cell Biology, University of Pittsburgh School of Medicine,
Pittsburgh, PA, USA
DAGMAR ZIGÁČKOVÁ  Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk
University, Brno, Czech Republic
JOHN C. ZINDER  Structural Biology Program, Sloan Kettering Institute, Memorial Sloan
Kettering Cancer Center, New York, NY, USA; Tri-Institutional Training Program in
Chemical Biology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
ALEXANDRA ZINOVIEV  Department of Cell Biology, SUNY Downstate Health Sciences
University, Brooklyn, NY, USA
HÉLÈNE ZUBER  Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS), Université de Strasbourg, Strasbourg, France
 Part I

Introduction to the RNA Exosome in Biomedicine

 Chapter 1

The RNA Exosome and Human Disease

Milo B. Fasken, Derrick J. Morton, Emily G. Kuiper, Stephanie K. Jones,
Sara W. Leung, and Anita H. Corbett

Abstract
The evolutionarily conserved RNA exosome is a multisubunit ribonuclease complex that processes and/or
degrades numerous RNAs. Recently, mutations in genes encoding both structural and catalytic subunits of
the RNA exosome have been linked to human disease. Mutations in the structural exosome gene EXOSC2
cause a distinct syndrome that includes retinitis pigmentosa, hearing loss, and mild intellectual disability. In
contrast, mutations in the structural exosome genes EXOSC3 and EXOSC8 cause pontocerebellar hypo-
plasia type 1b (PCH1b) and type 1c (PCH1c), respectively, which are related autosomal recessive, neuro-
degenerative diseases. In addition, mutations in the structural exosome gene EXOSC9 cause a PCH-like
disease with cerebellar atrophy and spinal motor neuronopathy. Finally, mutations in the catalytic exosome
gene DIS3 have been linked to multiple myeloma, a neoplasm of plasma B cells. How mutations in these
RNA exosome genes lead to distinct, tissue-specific diseases is not currently well understood. In this
chapter, we examine the role of the RNA exosome complex in human disease and discuss the mechanisms
by which mutations in different exosome subunit genes could impair RNA exosome function and give rise
to diverse diseases.

Key words Pontocerebellar hypoplasia, Retinitis pigmentosa, Spinal motor neuronopathy, Multiple
myeloma, RNA exosome, EXOSC2, EXOSC3, EXOSC8, EXOSC9, DIS3, Rrp4, Rrp40, Rrp43,
Rrp45, Rrp44

1 Introduction

The RNA exosome is a conserved ribonuclease complex, made of

structural and catalytic subunits, which processes and/or degrades
numerous RNAs [1–6]. Recently, mutations in several RNA exo-
some subunit genes have been identified in individuals with tissue-
specific diseases. In this chapter, we examine the mutations in genes
encoding RNA exosome structural subunits—EXOSC2, EXOSC3,
EXOSC8, and EXOSC9—and the catalytic subunit—DIS3—that
have been linked to human diseases.
The RNA exosome is composed of ten conserved core subunits
that form a ring-like structure [1, 2, 4, 5] (Fig. 1). The exosome
subunits in humans are termed Exosome Component (EXOSC)

John LaCava and Štěpánka Vaňáčová (eds.), The Eukaryotic RNA Exosome: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 2062, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9822-7_1, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2020

3
4 Milo B. Fasken et al.

A
Current Structure of
Human RNA Exosome
(11 Subunits) with Top View Side View Reverse Side View
MTREX & MPH6
Exosome Cofactors DNA/ MTREX
RNA (MTR4)
EXOSC1
1 MTREX EXOSC3
MPH6
MPH6 (MTR4) (MPP6) EXOSC10
(MPP6) EXOSC2
3 2 EXOSC6
10 6 EXOSC7
8 EXOSC4
5 7
9 4 EXOSC5
EXOSC9
DIS3 RNA
EXOSC8

DIS3
B 180°
Current Structure of 90°
Yeast RNA Exosome
(11 Subunits) with
Mtr4, Mpp6, & Rrp47
Exosome Cofactors Mtr4
RNA
Rrp47
Csl4
Mtr4 6 Csl4 Rrp6
Mpp6 Rrp40 Rrp4
47 Mpp6
40 4
Mtr3
43 Mtr3 Rrp42
Rrp41
46 42
45 41 Rrp46
Rrp45 Rrp43
Dis3/44
Dis3/Rrp44

Fig. 1 Structure of the RNA exosome, a multisubunit ribonuclease complex that processes/degrades multiple
classes of RNA. (a) To the left, a cartoon representation of one of the current structures of the 11-subunit
human RNA exosome in association with two exosome cofactors (MTREX (MTR4); MPH6 (MPP6)) is depicted
[7]. The 10-subunit core exosome is composed of a three-subunit cap (EXOSC1/2/3) at the top, a six-subunit
ring (EXOSC4-9) in the middle, and ribonuclease subunit, DIS3, at the bottom. Part of eleventh riboexonu-
clease subunit, EXOSC10, which could be resolved in the structure, associates with the EXOSC6 ring subunit.
The MTREX (MTR4) helicase cofactor associates with the EXOSC2 cap subunit and the MPH6 (MPP6) cofactor,
whereas the MPH6 (MPP6) cofactor associates with the EXOSC3 and EXOSC1 cap subunits. To the right of the
cartoon, surface representations of this 11-subunit human RNA exosome structure in complex with MTREX
(MTR4) and MPH6 (MPP6) cofactors (PDB# 6D6Q) [7] are shown, depicted in top, side, and reverse side views.
The structure of the 10-subunit human core exosome reveals a ring-like architecture composed of three cap
subunits—EXOSC1/Csl4 (gray), EXOSC2/Rrp4 (teal), and EXOSC3/Rrp40 (slate blue), six PH-like ring sub-
units—EXOSC4/Rrp41 (orange), EXOSC5/Rrp46 (yellow), EXOSC6/Mtr3 (marine blue), EXOSC7/Rrp42 (salmon
red), EXOSC8/Rrp43 (magenta), and EXOSC9/Rrp45 (firebrick red), and a catalytic base subunit, DIS3 (brown).
Part of the eleventh catalytic subunit, EXOSC10/Rrp6 (forest green), associates with EXOSC6/Mtr3. At the top
of the complex, the cofactor, MTREX (MTR4) (deep olive green), associates with EXOSC2/Rrp4 and MPH6
(MPP6), whereas the cofactor, MPH6 (MPP6) (hot pink) associates with EXOSC3/Rrp40. The DNA/RNA chimera
(black) used to stall the MTREX (MTR4) helicase during unwinding is also shown in the structure. The EXOSC2/
 The RNA Exosome and Human Disease 5

proteins and most exosome subunits in S. cerevisiae and Drosophila

are termed Rrp proteins [1, 19, 20]. The 10-subunit core exosome
comprises a central, 6-subunit ring (EXOSC4-9; Rrp41/42/43/
45/46/Mtr3), a 3-subunit cap (EXOSC1-3; Csl4/Rrp4/Rrp40),
and a ribonuclease subunit (DIS3/Dis3/Rrp44), which associates
with the six-subunit ring at the base [4, 5, 21] and possesses both
endoribonuclease and exoribonuclease activity [6, 22–24]. In addi-
tion, the RNA exosome in eukaryotes contains an eleventh riboex-
onuclease subunit, EXOSC10/Rrp6, which associates with the cap
[5, 14, 25]. Interestingly, EXOSC8/Rrp43, which is conserved
from yeast to human, is apparently absent from Drosophila [26].
Structures of the archael, yeast, and human RNA exosome have
been instrumental in deciphering exosome function [4, 5, 7,
13–15, 25, 27–30] (see, e.g., Chapters 4, 21, and 23). In Fig. 1a,
one of the current 11-subunit human RNA exosome structures,
which includes the DIS3 catalytic subunit, part of the EXOSC10
catalytic subunit, and two exosome cofactors (MTREX (MTR4);
MPH6 (MPP6)) [7], is depicted and, in Fig. 1b, one of the
11-subunit S. cerevisiae RNA exosome structures, which includes
Dis3/Rrp44 and Rrp6 catalytic subunits and three exosome cofac-
tors (Mtr4; Mpp6; Rrp47) [13], is shown. Importantly, these
ä

Fig. 1 (continued) Rrp4 (teal) and EXOSC3/Rrp40 (slate blue) cap subunits altered in novel syndrome and
pontocerebellar hypoplasia 1b (PCH1b), respectively [8, 9], EXOSC8/Rrp43 (magenta) ring subunit altered in
PCH1c [10], EXOSC9/Rrp45 (firebrick red) ring subunit altered in PCH-like disease [11], and DIS3 (brown)
catalytic subunit altered in multiple myeloma [12] are highlighted (b) To the left, a cartoon representation of
one of the current structures of the 11-subunit S. cerevisiae RNA exosome in association with three exosome
cofactors (Mtr4; Mpp6; Rrp47) is depicted [13]. The 11-subunit exosome is composed of a three subunit cap
(Csl4/Rrp4/Rrp40) at the top, a six-subunit ring (Rrp41/Rrp42/Rrp43/Rrp45/Rrp46/Mtr3), and two catalytic
subunits (Dis3/Rrp44 and Rrp6) [14]. The Mtr4 helicase cofactor associates with the Rrp4 cap subunit and the
Mpp6 cofactor, the Mpp6 cofactor associates with the Rrp40 and Csl4 cap subunits, and the Rrp47 cofactor
associates with Rrp6. To the right of the cartoon, surface representations of this 11-subunit yeast RNA
exosome structure in complex with Mtr4, Mpp6, and Rrp47 cofactors (PDB# 6FSZ) [13] are shown, depicted in
top, side, and reverse side views. The 11-subunit yeast RNA exosome structure shows a ring-like shape with
three cap subunits—Csl4 (gray), Rrp4 (teal), and Rrp40 (slate blue), six PH-like ring subunits—Rrp41 (orange),
Rrp46 (yellow), Mtr3 (marine blue), Rrp42 (salmon red), Rrp43 (magenta), and Rrp45 (firebrick red), and two
catalytic subunits, Dis3/Rrp44 (brown) and Rrp6 (forest green). The cofactor, Mtr4 (deep olive green),
associates with Rrp4 and Mpp6, the cofactor, Mpp6 (hot pink), associates with Rrp40, and the cofactor,
Rrp47 (pink), associates with Rrp6. The RNA (black) is also shown in the structure. The DIS3/Dis3/Rrp44
ribonuclease subunit contains both a riboexonuclease (large oval) and riboendonuclease (small oval) catalytic
site. The RNA exosome structures illustrate how the catalytic subunits, DIS3/Dis3/Rrp44 and EXOSC10/Rrp6,
and the exosome cofactors, MTREX/Mtr4, MPH6/Mpp6, and Rrp47, interface with the ring-like core of the RNA
exosome. The ring-like RNA exosome structures forms a central channel through which RNA is directed to the
catalytic subunit, DIS3/Dis3/Rrp44, for processing/degradation. In the yeast RNA exosome, RNA can also gain
access to Dis3/Rrp44 in a channel-independent or direct access manner [15–17]. The color scheme of the
human and yeast RNA exosome subunits is identical. Comparison of the human and yeast RNA exosome
structures reveals that the RNA exosome structure is highly evolutionarily conserved in eukaryotes
(Figure adapted from Morton et al. [18])
6 Milo B. Fasken et al.

structures reveal that the RNA exosome forms a ring-like shape

with a central channel through which RNA substrates are threaded
from the cap to the hexameric ring to the catalytic subunit, DIS3/
Dis3/Rrp44, at the base for processing/degradation [4, 5, 7, 21,
25, 31]. RNA substrates can also be directly targeted to Rrp6 via
the cap [14, 15] or directly targeted to Dis3/Rrp44 via a channel-
independent or direct access mechanism [15–17]. These structures
also provide details on the specific molecular contacts made by each
exosome subunit with other subunits in the complex and exosome
cofactors [5, 7, 13–15, 25, 28, 29]. These elegant RNA exosome
structures thus permit speculation about the function of specific
amino acids in the exosome subunits that are altered in disease.
The RNA exosome functions in both the nucleus and the
cytoplasm [32–34], processing numerous noncoding RNAs
(ncRNAs) in the nucleus and degrading many improperly pro-
cessed, “faulty” RNAs in nuclear and cytoplasmic surveillance path-
ways [35, 36]. In particular, the RNA exosome processes rRNAs,
snRNAs, and snoRNAs [1, 2, 19, 37, 38] and degrades unstable
ncRNAs, including cryptic unstable transcripts (CUTs) [39] in
budding yeast and promoter upstream transcripts (PROMPTs)
[40] and transcription start site-associated antisense RNAs (xTSS-
RNAs) [41] in human cells. The RNA exosome also turns over
mature tRNA [42, 43]. Finally, the RNA exosome degrades aber-
rant, improperly processed RNAs, including pre-mRNAs and hypo-
modified tRNAs [44–49].
In current models, specificity of the RNA exosome for distinct
RNA substrates is conferred by different exosome cofactors that
target the exosome to specific RNAs for processing/degradation
[32, 33, 36, 50, 51] (see Chapter 11). Key conserved, nuclear
exosome cofactors include the TRAMP complex (yeast Trf4/5-
Air1/2-Mtr4 Polyadenylation complex; human TENT4B
(PAPD5)-ZCCHC7-MTREX (MTR4) complex) [39, 52–55],
Mpp6/MPH6 (MPP6) [3, 56], Rrp47/C1D [57, 58], and the
NNS complex (yeast Nrd1-Nab3-Sen1 complex; human SETX)
[59, 60] (Fig. 1). Additionally, in humans, the NEXT complex
(Nuclear Exosome Targeting complex: MTREX (MTR4)-
ZCCHC8-RBM7) has been identified as an important nuclear
exosome cofactor [54]. Critical, conserved cytoplasmic exosome
cofactors include the Ski complex (yeast Ski2-Ski3-Ski8 complex;
human SKIV2L-TTC37-WDR61 complex) [61] and Ski7/
HBS1L3 [32, 62, 63]. The nuclear cofactor Mtr4/MTREX
(MTR4) and cytoplasmic cofactor Ski2/SKIV2L are RNA helicases
that help to remodel RNA substrates for compartment-specific
exosome complexes [34, 64]. Thus far, mutations in genes encod-
ing components of the NEXT complex (RBM7) and the Ski com-
plex (SKIV2L and TTC37) have been linked to human disease
[65–67].
 The RNA Exosome and Human Disease 7

Functional studies of the RNA exosome genes in different

model organisms indicate that most RNA exosome genes are essen-
tial for life. In S. cerevisiae, all nine core structural exosome genes
(RRP4/40/41/42/43/45/46/MTR3/CSL4) and the core catalytic
exosome gene, DIS3/RRP44, are essential, but the additional cat-
alytic exosome gene, RRP6, is not essential [1, 2, 68]. Similarly, in
S. pombe, studies indicate that core exosome genes, including dis3,
are essential, but rrp6 is not essential [69, 70]. In Drosophila,
several of the exosome genes (dDis3, dMtr3, dRrp6, dRrp41,
dRrp42) are essential and critical for normal fly development
[71, 72]. In mice, consistent with the other models analyzed, the
Exosc3 gene encoding the murine Rrp40 ortholog has been
reported to be essential for viability, but the data supporting this
conclusion remains to be published [41]. These results support the
idea that all ten core exosome subunits are essential for viability and
suggest that the RNA exosome is essential for function in cells from
yeast to man.

2 Mutations in RNA Exosome Genes Linked to Different Human Diseases

Recently, mutations in four structural exosome subunit genes,

EXOSC2, EXOSC3, EXOSC8, and EXOSC9, and one catalytic
exosome subunit gene, DIS3, have been linked to different tissue-
specific diseases [8–12]. In particular, mutations in EXOSC2 have
been linked to a novel syndrome that causes retinitis pigmentosa
and other phenotypes [9], mutations in EXOSC3 and EXOSC8
have been linked to pontocerebellar hypoplasia [8, 10, 73, 74],
mutations in EXOSC9 have been linked to cerebellar atrophy with
spinal motor neuronopathy [11], and mutations in DIS3 have been
linked to multiple myeloma [12, 75–78].
Most of these exosome gene mutations are missense mutations
that alter conserved amino acids within the evolutionarily con-
served subunit sequences (Figs. 2 and 4a). In Figs. 2 and 4a, the
domain structures of the human EXOSC2, EXOSC3, EXOSC8,
EXOSC9, and DIS3 proteins are shown that highlight the amino
acid changes identified in each protein in individuals with disease.
Below the domain structures, alignments of human, mouse, Dro-
sophila and S. cerevisiae EXOSC2/3/8/9/DIS3 ortholog
sequences are depicted that show the conservation of the residues
altered in disease and the surrounding sequences. In Table 1, all the
amino acid substitutions in EXOSC2/3/8/9 and the most preva-
lent amino acid changes in DIS3 that have been identified in
affected individuals are summarized along with the corresponding
genotypes and phenotypes of the affected individuals.
As EXOSC2/3/8/9 and DIS3 are presumed essential genes in
all eukaryotes, based predominantly on data from yeast and flies,
the fact that these exosome gene mutations lead to different tissue-
8 Milo B. Fasken et al.

G30V G198D
Hs EXOSC2 N S1 KH
1 74 80 159 168 293
G30 G198 GxNG
Hs EXOSC2 27 VVPGDTI 195 VILGNNGFIWIYP
Mm EXOSC2 26 LVVGDTI 195 VILGNNGFIWIYP
Dm Rrp4 30 YTPGEVL 198 VILGNNGYIWISP
Sc Rrp4 55 VTPGELV 223 VVLGVNGYIWLRK
V80F Y109N G135E A139P G191C
G31A D132A W238R
Hs EXOSC3 N S1 KH
1 107 113 181 196 275
G31 D132 GxNGW238
Hs EXOSC3 28 VLPGEEL 129 FKVDVGG 229 IVFGMNGRIWVKA
Mm EXOSC3 28 VLPGEEL 128 FKVDVGG 228 IVFGMNGRIWVKA
Dm Rrp40 8 VMPGERI 84 YRVDIGA 183 IAVGVNGRIWLKA
Sc Rrp40 5 IFPGDSF 84 YKVSLQN 186 VAIGLNGKIWVKC
A2V S272T
Hs EXOSC8 PH
1 276
A2 S272
Hs EXOSC8 1 MAAGFKT 272 IKSMKPK
Mm EXOSC8 1 MAAGFKT 272 IQSMRHK
Sc Rrp43 1 MAESTLL` 387 DLSTRFNI

L14P
Hs EXOSC9 PH
1 439
L14
Hs EXOSC9 11 RRFLLRA
Mm EXOSC9 11 RRFLLRA
Dm Rrp45 17 RSFVQLA
Sc Rrp45 12 SKFILEA

Fig. 2 Amino acid substitutions identified in the EXOSC2, EXOSC3, EXOSC8, and EXOSC9 subunits of the RNA
exosome in individuals with a novel syndrome, pontocerebellar hypoplasia (PCH), and PCH-like disease.
Domain structures of human EXOSC2, EXOSC3, EXOSC8, EXOSC9 proteins highlighting the amino acid
changes identified in affected individuals [8–11, 73, 74, 79, 80]. Amino acid changes in the EXOSC2 and
EXOSC3 cap subunits (shown in red), linked to a novel syndrome and pontocerebellar hypoplasia type 1b
(PCH1b), respectively, are located in the N-terminal domain (green), the central putative RNA-binding S1
domain (blue), or the C-terminal putative RNA-binding K homology (KH) domain (yellow). Amino acid changes
in the EXOSC8 and EXOSC9 ring subunits (shown in red), linked to pontocerebellar hypoplasia type 1c (PCH1c)
and PCH-like disease (cerebellar atrophy with spinal motor neuronopathy), respectively, are located in the
PH-like domain (orange). Below the domain structures, alignments of EXOSC2/3/8/9 ortholog sequences from
human (Hs), mouse (Mm), Drosophila melanogaster (Dm), and S. cerevisiae (Sc) that surround the evolution-
arily conserved residues altered in disease (highlighted in red, labeled in black above) are shown. The GxNG
motif (boxed in green) present in the EXOSC2/Rrp4 and EXOSC3/Rrp40 KH domains may play a structural role,
as the GXNG motif in ScRrp40 is buried at the interface between the S1 and KH domains [81]. Amino acid
positions are shown below the domain structures (Figure adapted from Morton et al. [18])

specific diseases may be considered surprising. These different phe-

notypes suggest that the disease-associated amino acid changes in
EXOSC2/3/8/9 and DIS3 support sufficient exosome activity for
viability but could have specific consequences that vary in different
tissues and/or cell types. Prior to the discovery of these disease-
causing mutations, it would likely have been assumed that any
impairment of the RNA exosome complex would have had similar
functional consequences. For these reasons, considering how the
disease-linked amino acid substitutions in EXOSC2/3/8/9 and
DIS3 may affect RNA exosome function could provide insights
 The RNA Exosome and Human Disease 9

into what exosome RNA processing steps and protein-protein

interactions are altered. In Fig. 3a, b, the conserved amino acids
in human EXOSC2/3/8/9 that are altered in disease are depicted
in the context of the 9-subunit human RNA exosome structure
(PDB# 2NN6) [4] and in the isolated human EXOSC2/3/8/9
structures. In Fig. 4b, the conserved amino acids in DIS3 that are
most commonly altered in disease are shown in the isolated human
DIS3 structure from the recent 11-subunit human RNA exosome
structure (PDB# 6D6Q) [7]. Visualization of the positions of these
disease-linked amino acids in these exosome structures permitted
us and others to speculate on how the amino acid changes in
EXOSC2/3/8/9 and DIS3 could alter RNA exosome function;
detailed below.

3 EXOSC2 Mutations

Mutations in EXOSC2, which encodes a structural cap subunit of

the RNA exosome (Figs. 1a and 2), have been linked to a novel
syndrome characterized by early onset retinitis pigmentosa, pro-
gressive sensorineural hearing loss, hypothyroidism, premature
aging, and mild intellectual disability [9]. The EXOSC2 protein
contains three domains: an N-terminal domain, a putative
RNA-binding S1 domain, and a putative RNA-binding K homol-
ogy (KH) domain (Figs. 2 and 3b). Exome sequencing of two
related individuals with disease identified homozygous EXOSC2
(G30V) mutations—located in the N-terminal domain of
EXOSC2 (Figs. 2 and 3b; Table 1). In addition, exome sequencing
of a third unrelated individual revealed compound heterozygous
EXOSC2 (G30V) and EXOSC2 (G198D) mutations—located in
the N-terminal and KH domain of EXOSC2, respectively (Figs. 2
and 3b; Table 1). All three affected individuals showed relatively
mild disease (alive at ages 6, 44, and 28) and borderline or mild
cerebellar atrophy.
Analysis of the human RNA exosome structure suggests that
the highly conserved G30 residue in EXOSC2/Rrp4 could be
important for intersubunit interactions with EXOSC4/Rrp41
(Fig. 3a) [4]. Structural modeling suggests the EXOSC2-G30V
substitution could impair interactions with key EXOSC4 residues
(D153, D154, F155) [9]. In contrast, the conserved G198 residue
in EXOSC2/Rrp4, which is located at the end of a β-strand in the
KH domain, could play a structural role within EXOSC2/Rrp4
itself (Fig. 3b): the G198D substitution could shorten and disturb
the β-hairpin structure in EXOSC2 [9]. At present, little functional
analysis of the EXOSC2/Rrp4 variants has been performed.
Another random document with
no related content on Scribd:
 Tunti ennen päivällistä alkoi lasten peseminen.

Äiti istui vieressä ja lastenhoitaja hankasi sienillä lasten ruumiita,

kuin olisi hän höylännyt uusia lautoja.

— Anna Margarethe, sanoi äiti, huomaa toki kynnet.

Anna Margarethe harjasi kynsiä, niin että nahka oli vähällä lähteä
sormenpäistä.

— Ne eivät ole vieläkään puhtaita, sanoi äiti: Herra tiesi missä ne

kuopivat…

— Entä korvat, sanoi äiti.

— Antakaa tänne.

Hän rupesi itse korvia pesemään.

— Ja kun ne lopulta saa puhtaiksi, sanoi hän epätoivoisena, niin

ne rupeavat punoittamaan.

Punaisia ne olivatkin.

Alettiin pukea vaatteet ylle, ja kaikissa oli tahroja.

Äiti hieroi hieromistaan hansikasnahalla ja hajuvedellä.

— No, kelvatkoot sitten, Jumalan nimessä, sanoi äiti.

Isä talutti tädit pöytään. Heidän pukunsa olivat valkean- ja

mustanjuovikkaasta silkistä — heidän kylpylaitoksen aikaiset
päivällispukunsa — ja sormissa oli monet sormukset, jotka
kilahtelivat tavattoman laihoissa käsissä. He asettivat kumpikin
pulverirasian lautasensa viereen.

Lasten silmät tuijottivat kauhusta. He kaasivat heti pöytäliinalle.

Äiti keskusteli johtaakseen huomion muualle — niin että poskissa

hehkuivat punaiset täplät — he puhelivat Kööpenhaminasta ja
kaikista tuttavista.

— Niin, sanoi Bothilde-täti, onhan Jane erittäin herttainen. Mutta

hänellä on omituisuutensa. Tuskin on ennättänyt istahtaa hänen
pöytänsä ääreen, ennenkuin hän alkaa keskustella
uskontunnustuksista.

— Kultaseni — hän kääntyi äkkiä vanhimman pojan puoleen —

hyväntapainen poika työntää aina rinnan eteenpäin ja hartiat
ylöspäin syödessään. Siten pysyy suorana …

— Ja minun mielestäni — hän jatkoi taas keskusteluaan Janesta

ja uskontunnustuksista kuin ei olisi muusta puhunutkaan — ei
sellaisista asioista sovi aterioidessa keskustella.

— Voi syödä piispan luona ensimäisenä joulupäivänä, eikä siellä

sanallakaan kosketella uskontoa ja muuta senkaltaista …

— Se ei todellakaan sovi hiottujen lasien ja posliinin ääressä.

Anna-täti rupesi puhumaan lasista ja posliinista ylipäänsä. Hän

puhui lasitehtaasta Etelä-Ranskassa:

— Sieltä, sanoi hän isälle, saa todella erittäin hienoja esineitä…

Mutta, hyvä ystävä, nyt se vasta johtuu mieleeni, minkä vuoksi sinun
kauniita, hiottuja karahvejasi ei tänä vuonna näy missään.
 — Madeiraako varten?

Äidin päätä poltti — tätien luona ei milloinkaan mikään särkynyt.

— Niin, Margarethe — muistathan hänet — särki, tuli särkeneeksi

toisen…

— Niin, missä on Margarethe? Tuo sievä tyttö, muistan mainiosti

tuon sievän, vilkkaan pikku henkilön, sanoi Bothilde-täti.

— Hänen kävi hullusti, valitettavasti, niin että hänen täytyi muuttaa

pois talosta …

— Hänkin, sanoi Anna-täti.

Mutta Bothilde täti loi äkkiä katseensa lapsiin ja katkaisi

keskustelun.

— No.

Tämä ainoa sana "No" kaikui, kuin olisi rautaportti pamahtanut

lukkoon.
Eikä karahveista sen enempää puhuttu.

— Pikku Stella — tämä seurasi sekunti "No" huudahduksen

jälkeen — pikkunen tyttö ei istu jalat ristissä pöydän ääressä.

Sisar hätkähti niin, että häneltä putosi haarukka.

- Kas niin, nyt tahraat hameesi, sanoi täti, ja kääntyen äidin

puoleen sanoi hän kuin puoleksi anteeksi pyytäen:

— Ystäväni, sellaisia asioita täytyy alinomaa muistuttaa, jotta ne

mieleen painuisivat.
 Ja päästyään lempiaineestansa puhumaan, sanoi hän vielä
lopuksi.

— Kun totuttaa lapsia istumaan ruokapöydän ääressä, täytyy

totuttaa heitä pitämään kyynärpäät ruumiissa kiinni syödessään.

Ateria oli päättynyt, ja kahvi vietiin puutarhasaliin.

Lapset olivat syösseet ulos ruokasalista niin että kompastuivat

toisiinsa käytävässä.

— Mutta, sanoi Anne-täti — hän oli tuskin ehtinyt istuutua — en

voi unhoittaa Margaretheä, tuota kaunista, vilkasta, pientä tyttölasta.

— Kauneimmille käy aina huonointen, sanoi äiti kaataessaan

kahvia kuppeihin.

— Mutta, sanoi Bothilde-täti, tässä pitäjässähän tapahtuu sellaista

joka vuosi.

Äiti hymyili kahvipannun takaa:

— Niin, montakin kertaa.

Bothilde-täti istui hetken vaiti. Sitten hän sanoi:

— Eihän meikäläinen voi sellaista käsittää. Mutta Jumalan kiitos,

eihän meillä ole sellaisen kanssa mitään tekemistä. Anne-täti sanoi:

— Tapahtuu kai elämässä monenmoista. Paras on, ettei ole sitä

näkevinään… silloin tuntuu kuin ei sitä olisikaan. Mutta sellaiset
ihmiset eivät olekaan saaneet kasvatusta …

Äiti vain hymyili:

 — Mahtaneeko se sitten auttaa? sanoi hän. Ja tätejä ajattelematta
sanoi hän äkkiä:

— Onnettomuus on vain siinä, että luonto on julmuudessaan

luonut eläimiä, jotka ajattelevat. Ensin parittuu eläin ja sitten ihminen
sitä inhoo.

Bothilde-täti istui kivettyneenä, niin että tuskin sai sanaa suustaan.

— Niin, mutta onpa sinulla mielipiteitä…

— Onpa todellakin… Olemme kai kaikki Jumalan luomia.

Kahvinsa juotuaan nukkuivat tädit.

Anne-täti levitti hiljaa nenäliinan kasvoilleen.

Levättyään he lukivat. Sisarukset lukivat vuorotellen. He

tutkiskelivat kolmella suurella sivistyskielellä kirjoitettuja teoksia,
jotteivät niitä unohtaisi.

Bothilde-tädin lempikirjailija oli Dickens.

— Hyvä ystävä, se mies opettaa meille paljon ihmisistä. Onhan

Goethelläkin puolensa. Mutta minuun hän Weimareineen tekee
kivisen vaikutuksen.

Anne-täti piti enemmän naiskirjailijoista, ja siitä kysymyksestä

syntyi todellinen tora:

— Voihan kieli tosin olla kaunista, sanoi Thilda täti; mutta sisällys,
ystäväiseni, aina vain sitä alituista rakkautta.
 — Ja senhän asteen, Jumalan kiitos, pian sivuuttaa. Sitäpaitsi on
elämässä rakkautta kylliksi.

Ennen teetä kävelivät tädit taas. Mutta tällä kertaa

puistokäytävällä.

Teenjuonnin jälkeen he istuivat puoli tuntia puutarhan portailla ja

joivat ilmaa.

— Puhutaan vedestä ja vedestä, sanoivat he, mutta ensi sijassa

tulee ilma. Jos ihmiset olisivat niin viisaita, että nukkuisivat ikkuna
auki, he eläisivät sadan vuoden vanhoiksi.

Kuuden viikon kuluttua oli jälkiparannuskausi lopussa. He

matkustivat samana päivänä kuin se päättyi.

Viimeiseksi työkseen he jakoivat silkkipaperiin käärittyjä

juomarahoja.

*****

Tätien lähdettyä tuli toinen aika.

Äidin ystävättäret tulivat vierailulle. He olivat sen kartanon tyttäriä,

jossa äiti oli saanut kasvatuksensa. He olivat kuin kirjavia
pitkämatkaisia lintuja.

Viikon päivät loistivat heidän päivänvarjonsa puutarhan käytäviltä.

Ikkunat olivat auki, niin ettei taloa ja puutarhaa mikään erottanut;

outoja nimiä kuuli kaikkialla, ja posti toi kirjeitä, joiden
päällekirjoituksia ei kukaan keittiössä osannut lukea.

Se oli vuoden valoisin aika.

 Ystävättärillä oli yllään vannehameet, jotka lasten mielestä
muistuttivat Amaliegadin ylösalasin käännetyitä kynttiläkruunuja, ja
pitkäliepeiset vaipat. Lähtiessään ajelemaan oli heillä
kamelikurjensulat päässään kuten Zampalla, pienellä hevosella,
jonka lapset olivat nähneet Augustenborgissa, ja joka osasi istua
pöydän ääressä ja soittaa pienellä kellolla kun halusi ruokaa. Kaikki
ystävättäret puhuivat taukoamatta, eniten kuitenkin lady Lipton.

Hän asui kaukana vieraassa maassa ja hänellä oli monta rikasta ja

ylhäistä tuttavaa. Isä talutti aina häntä päivällispöytään.

Mutta syötyään joivat he kahvia puutarhasalissa, ja lady Lipton

puheli. Hän kertoi Rachelista, jota rakasti, ja Tuileriain keisarihovista
ja kaikista kaukaisista ja ihmeellisistä ihmisistä — äidin
kuunnellessa.

— Kerro vielä, sanoi äiti, ja lady kertoi; suuren maan runoilijoista,

joiden joukossa hän eli, sen taiteilijoista, joiden taideteoksia hän
omisti, ja varsinkin nuoresta ihmeellisestä itämaisesta runoilijasta,
jonka hän oli tavannut suuressa kaupungissa, missä monet ihmiset
tapaavat toisiansa, ja jonka valokuva oli hänen pöydällään
vierashuoneessa. Hänestä tahtoi äitikin mieluimmin kuulla.

— Kultaseni, sanoi lady, luulen että elämä on sivuuttanut hänet.

Hän on unohtanut olemisen taidon. Hän ei enää osaa silittää
korkeata hattuansa eikä viitsi napittaa käsineitään lähteäkseen
vierailulle; hän ei pysty enää kaikkiin koneellisiin pikkutoimiin, jotka
muodostavat elämän: esim. parturilla käymiseen, kahvin juomiseen
kahvilassa tai seurusteluun pöytätoverinsa puuterikaulaisen naisen
kanssa . ..

— Sen ymmärrän, sanoi äiti.

 — Hän ei varmaankaan tunne surua, sanoi lady — eikä
pettymystä, sillä hänen esi-isänsä ovat jo hänenkin puolestaan
kokeneet turhien toiveiden raukeamisen.

Hän oli vaiti hetken, sitten hän sanoi:

— Sanoisin ennemmin hänen kuuluvan ryhmään "les

désinteressés", välinpitämättömät. Elämän arvot ovat kuihtuneet
yhdentekeviksi ja naurettaviksi tai suorastaan hämmästyttäviksi.

Lady naurahti äkkiä.

— En voi milloinkaan unohtaa sitä päivää, jolloin hän tuli luokseni

ja levitti äkkiä "Le Figaron" pöydälleni kapealla kädellään sanoen
tavattomalla kauhulla — ei kauhulla, vaan jonkinlaisella väsyneellä
hämmästyksellä:

— Ei siinä puhuta muusta kuin Kiinan sodasta. Lady vaikeni

hetkeksi, sitten hän sanoi:

— Asian laita taitaa olla se, että hänelle on kaikki vähitellen

muuttunut Kiinan sodaksi.

Äiti ojensi kupit.

Sitten hän sanoi hiljaa,

— Ehkäpä hän rakastaa — tai on rakastanut.

Lady vastasi.

— Sitä en usko, kultaseni.

 — Kaikissa suurissa maissa on ihmeellisiä ihmisiä, joille
rakkauden — miten sen sanoisinkaan? — suorastaan ruumiillinen
puoli on voittamattoman vastenmielistä. Heistä tulee
liikahienostuneita askeetteja, he himoitsevat lakkaamatta, mutta
kiroovat tyydytystä.

— René on siis sellainen.

— Hän tuntee vetovoimaa naisia kohtaan, mutta tuskin he ovat

hänen sylissään, ennenkuin hän syytää suustaan haukkumasanoja.

— Silloin hän ei rakasta, sanoi äiti.

Lady oli hetken vaiti. Sitten hän sanoi:

— Onko rakkaus muuta kuin himon tuntemista ja sen

tyydyttämistä?

— Etkö osaa yhtäkään hänen runoistaan? sanoi äiti.

— Yhden ainoan, sanoi lady.

— Lausu se, sanoi äiti.

Lady nojautui taaksepäin tuolillaan, ja hiukan vierasvoittoisella

kielellään, joka antoi sanoille harvinaisen soinnun, lausueli hän
hitaasti:

Sua lemmin kuin meri lempii aavaa rannikkoa, jota aallot

sen huuhtoo, sitä suojaten, peittäin sen ainaisella,
iankaikkisella suutelolla. Kuten suudella lempivä voi, mi
kantapäästä ain kiireelle asti sulohuulin ruumista lemmittynsä
 siks koskettaa, kokonaan sen että omistaa vois autuudess'
ainaisessa. Niin sinua lemmin ma — niin.

Ei, sua lemmin kuin aurinko lempii rusopilviä illan, sylihinsä

ne sulkee, ja kuollen, viimeisen kerran ihanuutta maan kurjan
tervehtää.

— Osaathan toisenkin, sanoi ladyn sisar.

— Niin, sanoi lady, osaan toisenkin.

Ja samassa asennossa, liikkumatta, lausui hän, ja hänen

alttoäänensä kaikui pehmeämpänä:

Yöt pitkät kun yksin ma vuoteella lepään eik' kasvojain

kenkään nää, ei silmiäni, jotk' kuivat ovat — Ma aattelen
silloin: Minut kuolo jos korjais, kenties tulisit sa ja polvistuisit
leposijani ääreen, kävisit kätehein, jota kaihdat nyt, kätehen,
mi on kylmä, ja korvaani, joka ei kuulla voi enää, sa kuiskaisit
kuten kuiskit ennen: Miten sentään sua lemmin — Leviäis
hymy huulille vainaan.

Äiti oli istuutunut ja silmät suurina hän tuijotti eteensä kädet

ristissä polvilla. Sitten hän sanoi:

— Lausu se vielä, kunnes sen opin.

Lady nauroi.

— Osaathan sinä sen nyt jo, sanoi hän.

— Niin, viimeisen.
 Ja äärettömän hellästi, melkein kuulumattomasti, lausui hän
uudelleen vieraat sanat. Kädet olivat yhä ristissä polvilla:

Ei, sua lemmin kuin aurinko lempii rusopilviä illan, sylihinsä

ne sulkee, ja kuollen, viimeisen kerran ihanuutta maan kurjan
tervehtää.

Kaikki olivat hetken vaiti.

Sitten sanoi lady Lipton:

— Mutta kuvalleen hän on kirjoittanut sen runon, jota eniten

rakastan.

— Sen osaan, sanoi äiti.

Ja hiljaisella äänellä, melkein kuin olisi kehtolaulua hyräillyt, lausui

hän pienen runon, joka oli kirjoitettu kuvalle — vieraan ja
tuntemattoman runoilijan kuvalle:

Kuten kuihtuvi yrtti, min juuret vailla on vettä, kuten

kelmenee kukka, mi katveessa kituu, siten kuihdun ja
kelmenen ma, kun et mua lemmi.

He olivat taas vaiti, kunnes eräs ladyn sisarista rupesi nauramaan

ja sanoi:

— Lapsikullat, ei olisi hulluinta, jos joutuisi sen miehen rakkauden

esineeksi.

He nauroivat kaikki ääneen, äiti ylinnä, juoksivat puutarhaan ja

heittäytyivät nurmikolle, niin että vannehameet nousivat korkealle.

Ilta oli hauskin aika.

 Ystävättärillä oli ilotulitusvehkeet mukana ja he sytyttivät sinisiä ja
vihreitä liekkejä kaikkiin pensaihin, niin että koko puutarha oli vähällä
syttyä palamaan.

Äiti toi tulitikkuja ja taputti käsiään.

Lapset katselivat yöpaitasillaan lastenkamarin ikkunasta.

— Ihanaa, ihanaa, huusi äiti.

Kaikissa pensaissa leimusi sinisiä ja punaisia liekkejä ja äiti seisoi

itse keskellä kenttää. Valkeat kasvot olivat ylöspäin kääntyneet ja
hänen kätensä olivat koholla.

Sitten sanoi hän äkkiä:

— Mutta tähdet ovat vieläkin kauniimmat.

Ja ilotulituksen hitaasti sammuessa ja pensaitten pimetessä,

katselivat he ylöspäin elokuun tähtiä.

— Näytä nyt meille kaikki tähtesi, sanoi lady Lipton.

Äiti pudisti päätään:

— Ei, sanoi hän, nyt ollaan vaiti.

Hän jäi seisomaan ja ystävättäret olivat hekin vaiti. Vähitellen he

menivät sisään. Huoneissa oli pimeä ja kylmä. He istuutuivat kaikki
arkihuoneeseen, eikä kukaan puhunut. Vihdoin sanoi äiti:

— Luulen, että tähdet ovat olemassa murheellisia varten; jotta he

huomaisivat, ettei sureminenkaan hyödytä, sillä surummekin on liian
pieni.
 Kukaan ei vastannut.

Mutta äiti nousi seisomaan, ja pimeässä huoneessa hän istuutui

klaveerin ääreen.

Valkeat kädet liukuivat koskettimilla ja hitaasti — vallan hitaasti —

kaikuivat muutamat akordit hänen puoleksi laulaessaan nuo vieraat
sanat. Sävelen hän oli itse sepittänyt.

Kuten kuihtuvi yrtti, min juuret vailla on vettä, kuten

kelmenee kukka, mi katveessa kituu, siten kuihdun ja
kelmenen ma, kun et mua lemmi.

Oli äänetöntä.

Puutarhan, peltojen ja niittyjen yllä loistivat syksyn tähdet.

*****

Ystävättäret matkustivat ja elonaika saapui. Raskaat elovaunut

vierivät pihaportista sisään, äiti ja Tine istuivat kuormalla
palvelustyttöjen vieressä ja lapset heittivät kirkuen kuperikeikkaa
täyttyvässä luuvassa.

Äiti hypähti suoraan isäntärengin syliin huutaen:

— Auttakaa minua alas!

Perästäpäin hän pelkäsi pihtihäntiä ja riisuutui ilkoisen

alastomaksi.

Elonaikakin meni, ja syyskuun hiljaiset, seesteiset päivät

saapuivat, ja puutarha oli loistava ja aivan äänetön. Ei hyttynenkään
laulanut lemmelle.
 Äiti istui enimmäkseen valkeilla portailla auringon paisteessa ja
Tine askarteli puutarhassa hänen jalkojensa juuressa.
Puistokäytävän poppeleihin tuli keltaisia lehtiä; näytti siltä kuin ne
olisivat pidentyneet kuulakkaassa ilmassa. Äiti kyyristyi kokoon
kylmässä:

— Varjot ovat käyneet niin pitkiksi, sanoi hän.

Tine sitoi ruusut seiniin kiinni ja katseli kenttää.

— Niin, sanoi hän, kesä on mennyt.

Mutta äiti tuijotti aurinkoisia kukkalavoja, joissa mikään ei

värähtänyt, kaikki vain loisti, lehdet, asterit ja myöhäiset ruusut. Hän
virkkoi:

— Tine, yhdessä paikassa on kuitenkin rauhaa: kuolemassa.

Tuli varhain pimeä. Tine, äiti ja lapset menivät puiston läpi,

vainioiden yli, joiden ojat olivat täynnä karhunmarjaköynnöksiä.

He eivät nähneet ketään. Kaikkialla oli äänetöntä. Heidän

takanaan syttyivät valot kylän mökkien ikkunoissa. Samassa
kaikuivat iltakellot.

Äiti pysähtyi; lapset hiipivät lähemmäksi häntä. Niin pitkälle kuin

silmä kantoi, näkyivät vain laajat kentät ja tuolla, hämyssä, kylän
hiljaiset valot. Taivas oli pimeä ja tähdetön.

Pitkään aikaan ei kukaan puhunut. Sitten sanoi äiti, joka näytti niin
pitkältä pimeässä:

— Tiedättekö Tine, tänne pitäisi viedä ne ihmiset, jotka kärsivät.

 Mutta vähän ajan perästä hän sanoi — ja ääni oli äärettömän
väsynyt —:

— Eikä se kumminkaan auttaisi. Luulen, että maan kauneus vain

lisää sielun kärsimyksiä:

— Ei ole mitään lohdutusta.

He kulkivat eteenpäin hämärän peittämien vainioiden yli. Kellojen

soitto oli tauonnut, eikä kuulunut muuta ääntä kuin parin koiran
haukuntaa. Sitten sekin vaikeni.

— Mennään kotiin, sanoi äiti.

Mutta kotiin tultuaan leikkivät lapset yöpaitasillaan sirkusta

keskellä arkihuonetta.

*****

Lähiseudun papit tulivat korttia pelaamaan. Heidän vanhat

vaununsa
vierivät pihalle. Etuistuimella istuivat paksut punanaamaiset ajurit.
Pelipöytä vedettiin esille isän huoneessa ja peli oli käynnissä.
Pitkistä piipuista tuprusi savu, niin ettei kättä siinä voinut eroittaa.

Vanha Fangel manasi ja kirosi, niin että kirjahyllyt tärisivät ja

Mynsterin saarnat hyppivät. Lapset, joiden oli mahdotonta nukkua,
hypähtivät vuoteistaan ja saivat viskunoita, jotta menisivät taas
nukkumaan.

Äiti soitti klaveeria.

 Isän huoneessa papit kiihtymistään kiihtyivät. Totilaseja täytettiin ja
vanha Fangel kiroili.

— Nyt viimeinen peli ulkona nurmikolla, sanoi vanha Fangel.

— Niin, se on tehtävä, sanoi äiti.

Papit nousivat tuoleiltaan — jalat olivat hiukan epävarmat — ja

menivät arkihuoneen läpi.

— Herranen aika, sanoi Fangel, näkyypä taas Jumalan kirkas

päivä.

He hoipertelivat puutarhaportaita alas, totilasit asetettiin

nurmikolle, ja he pelasivat maaten mahallaan ja takoivat ruohoa
suurine käsineen.

Äiti istui puutarhaportailla ja nauroi nauramistaan. Mutta

villavaipan hän levitti vanhan Fangelin yli.

Kylästä tuli väkeä ja he kulkivat puistokäytävän ohi.

— Hyvää huomenta, he sanoivat ja nostivat hattua papeille

— Huomenta, huomenta, sanoi vanha Fangel.

Mutta aurinko loisti korkealta taivaan laelta ja papit jatkoivat

pelaamistaan.

*****

Päivät lyhenivät lyhenemistään, lehdet harvenivat puissa ja

viimeiset ruusut paleltuivat valkean talon seinämillä.
 Etelänpuolisella seinustalla riippuivat viinirypäleet täysinä ja
suurina.

Äiti katseli niitä joka päivä.

— Huomenna me ne poimimme, sanoi hän Tinelle. Seuraavana

päivänä hän sai tikapuut esille ja kori kädessä seisoi hän ylimmällä
astuimella ja poimi rikkaat tertut.

Toisia hän söi, toisia taas heitti vasten Tinen kasvoja.

— Ota kiinni, ota kiinni, hän huusi.

Tikapuita siirrettiin, ja hän poimi poimimistaan.

Ylinnä hän seisoi. Leikillään piteli hän rypäleterttua tumman

hohtavia hiuksiaan vastaan, toinen terttu riippui ojennetussa
kädessä. Aurinko valaisi häntä, kimaltelevia rypäleitä ja kiiltävää
tukkaa.

Isäntärenki meni ohi ja pysähtyi. Samassa heitti äiti rypäletertun

suoraan hänen kasvojaan vastaan.

— Kauniilta mahdan näyttää, sanoi hän ja tuli alas tikapuilta. Ne

vietiin pois ja Tine rupesi laskemaan terttuja.

Äiti seisoi kauvan katsellen alastonta viiniköynnöksen runkoa.

Hänen kasvonsa olivat muuttuneet.

— Nyt se on ohi, sanoi hän.

Hän meni sisään katsomatta rypäleitä ja jäi kauvan pimeään

istumaan omaan tuoliinsa. Kädet helmassa.
 Edes takaisin kaikuivat sisältä isän askeleet.

Keittiössä kuului Tine askartelevan viinirypäleiden korjaamisessa

ja väki tuli sisään satoa katsomaan. Tine tuli sisään kertomaan
montako terttua poimittiin.

‒ Paljonhan niitä onkin, sanoi äiti.

‒ Niin, kymmenen enemmän kuin viime vuonna, sanoi Tine.

‒ Niin,

Jens-renki oli sytyttänyt lyhdyn mennessään karjaa katsomaan.

Lehmät ammuivat pitkään hänen avatessaan ovea.

Äiti nousi paikaltaan. Varjon tavoin kulki hän läpi huoneen

hämärän.
Hän istuutui pianon ääreen.

— Oletteko siellä, Tine, sanoi hän.

— Olen, rouva.

— Tiedättekö, olen istunut ja miettinyt miten ihminen voisi olla

onnellinen.

— Mutta onhan onnellisiakin ihmisiä kaikkialla, sanoi Tine.

 — On tyytyväisiä ihmisiä, Tine, ja onhan sekin hyvä.

Tine istui hetken.

— Onhan monenlaista onnea, Jumalan kiitos, sanoi hän.

Äiti istui hetken, sitten hän sanoi:

— Ei, Tine, minä olen sanonut sen Teille ennen: on vain yksi onni
ja se lienee onnellisin, joka ei sitä milloinkaan ole tuntenut.

— Sitä en ymmärrä, sanoi Tine.

— Niin, sillä se ei kestä.

Oli hiljaa hetkisen, kunnes äidin kauniit kädet liukuivat yli

koskettimien, ja hillitysti isän, varjon lailla, näyttäytyessä ovellaan,
lauloi äiti:

Kuten kuihtuvi yrtti, min juuret vailla on vettä, kuten

kelmenee kukka, mi katveessa kituu,

Siten kuihdun ja kelmenen ma, kun et mua lemmi.

Laulu lakkasi.

Ulkona oli yö. Sisällä oli pimeää.

Äiti nousi.

- Sytytä lamppu, Tine, sanoi hän. Lasten pitää mennä nukkumaan

ja väestä täytyy pitää huolta.
*** END OF THE PROJECT GUTENBERG EBOOK VALKEA TALO
***

Updated editions will replace the previous one—the old editions will
be renamed.

Creating the works from print editions not protected by U.S.

copyright law means that no one owns a United States copyright in
these works, so the Foundation (and you!) can copy and distribute it
in the United States without permission and without paying copyright
royalties. Special rules, set forth in the General Terms of Use part of
this license, apply to copying and distributing Project Gutenberg™
electronic works to protect the PROJECT GUTENBERG™ concept
and trademark. Project Gutenberg is a registered trademark, and
may not be used if you charge for an eBook, except by following the
terms of the trademark license, including paying royalties for use of
the Project Gutenberg trademark. If you do not charge anything for
copies of this eBook, complying with the trademark license is very
easy. You may use this eBook for nearly any purpose such as
creation of derivative works, reports, performances and research.
Project Gutenberg eBooks may be modified and printed and given
away—you may do practically ANYTHING in the United States with
eBooks not protected by U.S. copyright law. Redistribution is subject
to the trademark license, especially commercial redistribution.

START: FULL LICENSE