Biomaterials for cancer therapeutics:

evolution and innovation Second

Edition Park
Visit to download the full and correct content document:
https://ebookmass.com/product/biomaterials-for-cancer-therapeutics-evolution-and-in
novation-second-edition-park/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Prostate Cancer, Second Edition: Science and Clinical

Practice Jack H. Mydlo Md Facs

https://ebookmass.com/product/prostate-cancer-second-edition-
science-and-clinical-practice-jack-h-mydlo-md-facs/

Nanoengineered Biomaterials for Advanced Drug Delivery

(Woodhead Publishing Series in Biomaterials) 1st
Edition Masoud Mozafari (Editor)

https://ebookmass.com/product/nanoengineered-biomaterials-for-
advanced-drug-delivery-woodhead-publishing-series-in-
biomaterials-1st-edition-masoud-mozafari-editor/

Photonanotechnology for Therapeutics and Imaging 1st

Edition Ph.D. Choi

https://ebookmass.com/product/photonanotechnology-for-
therapeutics-and-imaging-1st-edition-ph-d-choi/

Advanced Dental Biomaterials Khurshid

https://ebookmass.com/product/advanced-dental-biomaterials-
khurshid/
Biomaterials for 3D Tumor Modeling (Materials Today)
1st Edition Subhas Kundu (Editor)

https://ebookmass.com/product/biomaterials-for-3d-tumor-modeling-
materials-today-1st-edition-subhas-kundu-editor/

The Tangled Bank: An Introduction to Evolution Second

Edition – Ebook PDF Version

https://ebookmass.com/product/the-tangled-bank-an-introduction-
to-evolution-second-edition-ebook-pdf-version/

Park’s Pediatric Cardiology for Practitioners 7th

Edition Edition Myung Park

https://ebookmass.com/product/parks-pediatric-cardiology-for-
practitioners-7th-edition-edition-myung-park/

Clinical Pharmacology and Therapeutics for Veterinary

Technicians E Book 4th Edition, (Ebook PDF)

https://ebookmass.com/product/clinical-pharmacology-and-
therapeutics-for-veterinary-technicians-e-book-4th-edition-ebook-
pdf/

Breast Cancer and Gynecologic Cancer Rehabilitation 1st

Edition Adrian Cristian Md (Editor)

https://ebookmass.com/product/breast-cancer-and-gynecologic-
cancer-rehabilitation-1st-edition-adrian-cristian-md-editor/
Biomaterials for Cancer
Therapeutics
This page intentionally left blank
Woodhead Publishing Series in Biomaterials

Biomaterials for Cancer

Therapeutics
Evolution and Innovation

Second Edition

Edited by

Kinam Park
Woodhead Publishing is an imprint of Elsevier
The Officers’ Mess Business Centre, Royston Road, Duxford, CB22 4QH, United Kingdom
50 Hampshire Street, 5th Floor, Cambridge, MA 02139, United States
The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, OX5 1GB, United Kingdom
Copyright © 2020 Elsevier Ltd. All rights reserved.
No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or
mechanical, including photocopying, recording, or any information storage and retrieval system, without
permission in writing from the publisher. Details on how to seek permission, further information about
the Publisher’s permissions policies and our arrangements with organizations such as the Copyright
Clearance Center and the Copyright Licensing Agency, can be found at our website: www.elsevier.com/
permissions.
This book and the individual contributions contained in it are protected under copyright by the Publisher
(other than as may be noted herein).
Notices
Knowledge and best practice in this field are constantly changing. As new research and experience
broaden our understanding, changes in research methods, professional practices, or medical treatment
may become necessary.
Practitioners and researchers must always rely on their own experience and knowledge in evaluating and
using any information, methods, compounds, or experiments described herein. In using such
information or methods they should be mindful of their own safety and the safety of others, including
parties for whom they have a professional responsibility.
To the fullest extent of the law, neither the Publisher nor the authors, contributors, or editors, assume
any liability for any injury and/or damage to persons or property as a matter of products liability,
negligence or otherwise, or from any use or operation of any methods, products, instructions, or ideas
contained in the material herein.
British Library Cataloguing-in-Publication Data
A catalogue record for this book is available from the British Library
Library of Congress Cataloging-in-Publication Data
A catalog record for this book is available from the Library of Congress
ISBN: 978-0-08-102983-1 (print)
ISBN: 978-0-08-102984-8 (online)

For information on all Woodhead Publishing publications

visit our website at https://www.elsevier.com/books-and-journals

Publisher: Matthew Deans

Acquisitions Editor: Sabbrina Webber
Editorial Project Manager: Peter Adamson
Production Project Manager: Sojan P. Pazhayattil
Cover Designer: Alan Studholme
Typeset by MPS Limited, Chennai, India
Contents

List of contributors xix

Preface xxv

1 Cancer: so common and so difficult to deal with 1

Ana Santos Cravo and Randall Mrsny
1.1 Introduction 1
1.2 General classification of cancers 3
1.3 Early detection—still the best medicine 4
1.4 Cancer genetics and epigenetics 5
1.5 Factors that make a cell cancerous 7
1.6 The concept of a transition from chronic inflammation to cancer 8
1.7 Current methods to treat various cancers 9
1.8 Cancer as a real estate concept—location, location, location 11
1.9 Areas of greatest unmet need in treating cancers 13
1.10 Conclusion and future trends 15
References 17

2 Phenotypic evolution of cancer cells: structural requirements for

survival 23
Farzaneh Atrian and Sophie A. Lelie`vre
2.1 Introduction 23
2.1.1 Phenotypic overview of cancer progression 23
2.1.2 Evolution of the organization of nuclei in cancer cells 24
2.1.3 Involvement of nuclear structural proteins in gene
transcription 25
2.1.4 The extracellular matrix component of the tumor
microenvironment 25
2.1.5 Drug resistance in cancer 27
2.2 Mechanical properties of the tumor microenvironment 28
2.2.1 Matrix remodeling in cancerous tissue 28
2.2.2 Influence of matrix stiffness and tissue geometry on cancer
phenotype 29
2.2.3 Future directions: design of “intelligent” biomaterials that
respond to microenvironmental changes 31
2.3 Nuclear structure as a mediator of information 33
2.3.1 Physical properties of the cell nucleus 33
vi Contents

2.3.2 Nuclear proteins involved in mechanosensing 34

2.3.3 Future directions: identification of internal nuclear features
that have the ability to link microenvironmental changes and
chromatin 36
2.4 Nuclear dynamics in anticancer drug resistance and cell survival 37
2.4.1 Drug resistance and survival in cancer cell populations 37
2.4.2 Nuclear dynamics and alterations in genome functions 39
2.4.3 Future directions: platforms and biomaterials to integrate
nuclear reorganization and cell survival in tumors 40
2.5 Conclusion 42
References 43

3 Immunoactive drug carriers in cancer therapy 53

Fanfei Meng, Soonbum Kwon, Jianping Wang and Yoon Yeo
3.1 Introduction 53
3.2 Synthetic polymers 54
3.2.1 Polyethyleneimine 54
3.2.2 Pluronic polymers 61
3.2.3 Polymeric drugs 63
3.3 Polysaccharides 64
3.3.1 Chitosan 64
3.3.2 Hyaluronic acid 65
3.3.3 Chondroitin sulfate 67
3.3.4 Alginate 68
3.3.5 Pectin 68
3.4 Polypeptides 69
3.4.1 Polypeptides as drug and gene carriers 69
3.4.2 Antiproliferative or immune adjuvant activities of
polypeptides 69
3.5 Polar lipids 71
3.5.1 Polar lipids in drug and gene delivery 71
3.5.2 Anticancer activities of polar lipids 71
3.5.3 Immune activities of polar lipids 72
3.6 Vitamin E derivatives 73
3.6.1 α-Tocopherol succinate 73
3.6.2 D-α-Tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate 75
3.7 Inorganic materials 76
3.7.1 Iron oxide 76
3.7.2 Graphene oxide 77
3.7.3 Others: Au, SiO2, and TiO2 78
3.8 Conclusion 80
Acknowledgment 80
References 80
Contents vii

4 Delivering anticancer drugs as carrier-free nanocrystals 95

Wei Gao, Clairissa D. Corpstein and Tonglei Li
4.1 Introduction 95
4.2 Preparation of drug nanocrystals 96
4.2.1 Top-down approach 96
4.2.2 Bottom-up approach 97
4.3 Cellular interactions and intracellular delivery 99
4.3.1 Cellular uptake and hybrid nanocrystals 99
4.3.2 Hybrid nanocrystals with environment-sensitive fluorophores 102
4.4 In vivo performance 106
4.5 Conclusion 109
References 110

5 Polymer therapeutics 117

Kyung Hyun Min, Hong Jae Lee and Sang Cheon Lee
5.1 Introduction 117
5.2 Polymeric drugs for multivalent biorecognition 118
5.2.1 Polymer therapeutics for cross-linking of antigens on the
cell surface 118
5.2.2 Polymeric drugs conjugated with an apoptosis-inducing
ligand 120
5.3 Polymeric drugs inhibiting chemokine receptors 120
5.4 Polymeric P-glycoprotein inhibitors 123
5.4.1 Multidrug resistance by P-glycoprotein 123
5.4.2 Classes of polymeric P-glycoprotein inhibitors 124
5.5 Summary and future perspectives 134
Acknowledgments 134
References 134

6 pH-sensitive biomaterials for cancer therapy and diagnosis 141

Kyoung Sub Kim, Jun Hu and You Han Bae
6.1 Introduction 141
6.2 Nature of pH-sensitivity 142
6.2.1 Protonation/deprotonation 142
6.2.2 Acid-labile bonds 145
6.3 Tumor pH probe 147
6.4 Nanosystem activation by pH 148
6.4.1 Simultaneous activation by extracellular/subcellular pH by
design 148
6.4.2 Sequential activation by tumor extracellular/subcellular pH 149
6.5 Applications of pH-sensitive biomaterials 150
6.5.1 Drug delivery 150
6.5.2 Tumor imaging 156
6.6 Conclusion and perspective 157
References 157
viii Contents

7 Nucleic acid anticancer agents 165

S. Samaddar and D.H. Thompson
7.1 Introduction 165
7.2 Oligonucleotides targeting RNA 166
7.2.1 siRNA (short interfering RNA) 166
7.2.2 Short hairpin RNA 169
7.2.3 microRNA 169
7.2.4 Splice-switching oligonucleotides 171
7.2.5 Gapmer 172
7.2.6 DNAzyme 172
7.3 Oligonucleotides targeting DNA 173
7.3.1 Triplex folding oligonucleotides (TFO) 173
7.4 Oligonucleotides targeting proteins 173
7.4.1 Oligonucleotides that stimulate the immune system 173
7.4.2 Aptamers 174
7.4.3 DNA decoys 175
7.5 Chemical modifications of nucleic acids to boost their in vivo
efficacy 175
7.5.1 Carbohydrate modifications 175
7.5.2 Backbone modification 177
7.6 Summary 178
References 178

8 Biomaterials for gene editing therapeutics 187

Gayong Shim, Dongyoon Kim, Quoc-Viet Le, Junho Byun, Jinwon Park
and Yu-Kyoung Oh
8.1 Introduction 187
8.2 Gene editing platform 188
8.2.1 Zinc finger nuclease 189
8.2.2 Transcription activator
like effector nuclease 190
8.2.3 Clustered regularly interspaced short palindromic
repeat
associated nuclease Cas9 191
8.2.4 Others 192
8.3 Delivery strategies for gene editing 193
8.3.1 Delivery vectors 193
8.3.2 Barriers for intracellular delivery 194
8.3.3 Mode of gene editing 195
8.4 Biomaterial-based delivery of gene editing systems 195
8.4.1 Polymers 195
8.4.2 Lipids 206
8.4.3 Peptides 209
8.4.4 Inorganic materials 212
8.4.5 Nucleic acid
based nanostructures 213
8.5 Clinical trials 215
8.6 Challenges and future perspectives 220
Acknowledgments 222
References 222
Contents ix

9 Liquid biopsies for early cancer detection 233

Stefan H. Bossmann
9.1 Introduction 233
9.2 Liquid biopsies 235
9.2.1 Liquid biopsies based on circulating tumor cells 235
9.2.2 Liquid biopsies based on the human genome and
characteristic mutations in cancer 237
9.3 Technologies for liquid biopsies based on genetic and epigenetic
mutations 239
9.3.1 State-of-the-art in liquid biopsies 240
9.4 Exosomes 240
9.5 Cytokines and other signaling proteins as biomarkers for cancer
progression 242
9.6 Classic methods of cytokine detection in biospecimens 242
9.6.1 Enzyme-linked immunosorbant assay 243
9.6.2 Radioimmunoassays 243
9.6.3 Chemiluminescence assays 244
9.6.4 Cytokine bioassays 244
9.6.5 Multiparametric flow cytometry in conjunction with using
(magnetic) beads 244
9.6.6 Enzyme-linked immunospots
(ELISPOT and FLUOROSPOT) 245
9.6.7 Bar code technology 246
9.6.8 Cytokine detection by means of surface-enhanced Raman
spectroscopy 246
9.7 Protease and kinase networks 247
9.7.1 Protease activity and cancer 247
9.8 Outlook: cost-effectiveness will be an important factor 249
References 250

10 Nanotechnology for cancer screening and diagnosis:

from innovations to clinical applications 261
R. Zeineldin
10.1 Introduction 261
10.1.1 Biosensing and screening of biomarkers 261
10.1.2 Imaging 263
10.2 Nanotechnology for cancer diagnosis 263
10.2.1 Properties and advantages of nanoparticles and
nanomaterials 264
10.3 Nanotechnology-based biosensing platforms 265
10.3.1 Lab-on-a-chip and microarrays 266
10.3.2 Sphere-based platforms 266
10.3.3 Magnetic-based assays 267
10.3.4 Other platforms 267
10.4 Nanotechnology for biosensing—early detection of cancer 267
x Contents

10.4.1 Screening—enhancing biomarkers detection 267

10.4.2 Detecting circulating tumor cells 268
10.4.3 Clinical applications of nanotechnology in biosensing 269
10.5 Nanotechnology for cancer imaging 269
10.5.1 Targeted molecular imaging 270
10.5.2 Types of imaging enabled by nanomaterials 271
10.5.3 Types of imaging enhanced by nanomaterials 271
10.5.4 Nano-based multimodal imaging 272
10.5.5 Theranostics 273
10.5.6 Nanotechnology for tumor classification/staging 273
10.5.7 Concerns with using nanomaterials in imaging 273
10.5.8 Clinical applications for nanotechnology in cancer
imaging 274
10.6 Conclusion and future trends 274
References 275

11 Advances and clinical challenges in biomaterials for in vivo tumor

imaging 291
Andre´ O’Reilly Beringhs, Raana Kashfi Sadabad and Xiuling Lu
11.1 Current state of tumor imaging in the clinic 291
11.1.1 Positron emission tomography 292
11.1.2 Magnetic resonance imaging 293
11.1.3 X-ray computed tomography 295
11.2 Potential clinical uses of novel biomaterials for tumor imaging 299
11.3 Preclinical advances in biomaterials for tumor imaging 300
11.3.1 Quantum dots 300
11.3.2 Carbon-based materials 306
11.3.3 Lipid-based materials 309
11.3.4 Polymer-based materials 311
11.4 Risk
benefit assessment and perspectives 316
References 317

12 Macroscopic fluorescence lifetime-based Förster resonance energy

transfer imaging for quantitative ligand
receptor binding 331
Alena Rudkouskaya, Denzel E. Faulkner, Nattawut Sinsuebphon,
Xavier Intes and Margarida Barroso
12.1 Assessment of target engagement in drug delivery 331
12.2 Challenges in the quantification of target engagement in
preclinical cancer research 332
12.2.1 Enhanced permeability and retention effect 332
12.2.2 Biochemical and imaging methods to assess target
engagement 333
12.2.3 Förster resonance energy transfer to quantify target
engagement 333
Contents xi

12.3 In vivo molecular imaging in preclinical research 334

12.3.1 Positron emission tomography versus optical imaging 334
12.3.2 Visible and near-infrared fluorescence lifetime imaging 335
12.3.3 Preclinical applications of fluorescence lifetime imaging
Förster resonance energy transfer imaging 336
12.4 Fluorescence lifetime imaging Förster resonance energy transfer
imaging to quantify ligand
receptor binding 339
12.4.1 Transferrin
transferrin receptor-mediated drug delivery 339
12.4.2 Wide-field time-resolved macroscopy fluorescence
lifetime imaging optical imager 340
12.4.3 MFLI Förster resonance energy transfer imaging of
transferrin
transferrin receptor binding 342
12.4.4 Advantages and limitations of MFLI Förster resonance
energy transfer imaging 345
12.5 Imaging with high-resolution beyond the microscopy limit:
mesoscopic fluorescence molecular tomography of thick tissues 346
12.6 Future directions of MFLI Förster resonance energy transfer
imaging in the clinic 347
Acknowledgments 349
References 349
Further reading 363

13 Suppression of cancer stem cells 365

Carla Garcia-Mazas, Sheila Barrios-Esteban, Noemi Csaba and
Marcos Garcia-Fuentes
13.1 Introduction 365
13.1.1 Models of cancer origin 365
13.1.2 Characteristics of cancer stem cells 366
13.1.3 The cancer stem cell niche 367
13.1.4 Cancer stem cell drug resistance 367
13.2 Pharmacological strategies for suppressing cancer stem cells 368
13.2.1 Druggable pharmacological strategies 369
13.2.2 Gene therapies for cancer stem cells 372
13.3 Nanomedicines for cancer stem cell therapy 373
13.3.1 Delivery of small drugs to cancer stem cells 373
13.3.2 Gene delivery to cancer stem cells 377
13.3.3 Targeting to cancer stem cells 380
13.4 Concluding remarks 381
Acknowledgments 382
Abbreviations 383
References 383
xii Contents

14 Comparison of two- and three-dimensional cancer models for

assessing potential cancer therapeutics 399
Bailu Xie, Nicole Teusch and Randall Mrsny
14.1 Introduction 399
14.2 A brief history of two- and three-dimensional in vitro cancer
models 402
14.3 Methods used for high-throughput testing of potential
chemotherapeutics in vitro 404
14.4 Practical aspects of techniques to establish three-dimensional
in vitro cancer models 407
14.4.1 Spinner flasks/bioreactors 407
14.4.2 Gel-like substances/scaffold structures (hydrogels) 407
14.4.3 The hanging drop format 410
14.4.4 Low-attachment plates with centrifugation 411
14.4.5 Magnetic levitation 411
14.4.6 Micropatterning 412
14.4.7 Microencapsulation 412
14.4.8 Microfluidics 413
14.4.9 Bioprinting 413
14.5 The future of three-dimensional cancer models 415
Acknowledgments 416
References 416

15 Engineered tumor models for cancer biology and treatment 423

Hye-ran Moon and Bumsoo Han
15.1 Introduction 423
15.2 Complexities of cancers and the tumor microenvironment 423
15.3 Design and development of tumor models 426
15.3.1 Spheroids and organoids 427
15.3.2 Animal models 428
15.3.3 Microfluidic models 429
15.4 Challenges and opportunities 435
Acknowledgments 436
References 436

16 Cancer mechanobiology: interaction of biomaterials with cancer cells 445

Sarah Libring and Luis Solorio
16.1 What is mechanotransduction? 445
16.2 Native mechanobiology through cancer’s progression 447
16.2.1 The primary tumor microenvironment 448
16.2.2 The premetastatic niche and primary cell motility 451
16.2.3 Secondary tumor sites: dormancy, reactivation, and drug
resistance 453
16.3 Researching mechanotransduction 454
16.3.1 Techniques for studying mechanotransduction 455
16.3.2 Cancer models 459
Contents xiii

16.3.3 Material selection 463

16.4 Conclusion and future trends 466
References 467

17 Immunostimulatory materials 471

Evan Alexander Scott and Sean David Allen
17.1 Introduction 471
17.2 Immunostimulation 471
17.2.1 General mechanisms of immunostimulation:
antigen-presenting cells and Toll-like receptors 471
17.2.2 Cellular mediators of immune dysregulation within the
tumor microenvironment 475
17.3 Immunostimulatory hydrogels 476
17.3.1 Sustained delivery of immunomodulators 476
17.3.2 Hydrogels as artificial sites of immune stimulation 477
17.4 Enhancing immunostimulation via nanobiomaterials 477
17.4.1 Designing nanoscale biomaterials for cellular targeting 478
17.4.2 Biodistributions of administered nanobiomaterials 481
17.4.3 Antigen-presenting cells as key targets of therapeutic
immunostimulation 483
17.4.4 Nanobiomaterials for RNA interfering-based cancer
therapy 487
17.4.5 Nanobiomaterials to enhance cancer vaccination 488
17.4.6 Nanobiomaterials to enhance adoptive T-cell therapy 489
17.4.7 Future directions of nanobiomaterials for cancer immune
dysregulation 490
References 490

18 Biomaterials for cancer immunotherapy 499

Kinan Alhallak, Jennifer Sun, Barbara Muz and Abdel Kareem Azab
18.1 Noncellular immunotherapies 499
18.1.1 Delivery of antibodies 499
18.1.2 Delivery of immunomodulators 501
18.1.3 Delivery of other molecules 504
18.2 Artificial cellular immunotherapies 505
18.2.1 Artificial antigen-presenting cells 505
18.2.2 Artificial T cells 507
18.3 Adoptive cell therapy 508
18.3.1 T cells 508
18.3.2 Natural killer cells 510
18.3.3 Macrophages 511
18.3.4 Dendritic cells 512
18.4 Gene-based immunotherapies 512
18.4.1 Small interfering RNA 512
18.4.2 Messenger RNA 513
18.5 Conclusion 515
References 515
xiv Contents

19 Lymph node targeting for improved potency of cancer vaccine 527

Guangsheng Du and Xun Sun
19.1 Introduction 527
19.2 Tumor-draining lymph node as a target for cancer vaccines 528
19.2.1 The role of lymphatic vessels and lymph node in
vaccination 528
19.2.2 Lymphatic system in cancer conditions 529
19.3 Targeting strategies for lymph nodes 530
19.3.1 Direct intranodal injection 530
19.3.2 Passive draining of nanoparticulate vaccines from the
interstitial space 531
19.3.3 Active binding with lymphatic endothelium by
ligand
receptor interaction 534
19.3.4 Albumin “hitchhiking” approach 534
19.4 The dilemma between lymph node targeting and uptake and
retention in antigen-presenting cells 535
19.5 Lymph node
targeted vaccine carriers for cancer therapy 537
19.5.1 Polymeric micelles 537
19.5.2 Lipid-coated inorganic nanoparticles 538
19.5.3 Polymeric nanoparticles 539
19.5.4 Liposomes 540
19.5.5 Other nanoparticles 540
19.6 Summary, prospection, and conclusion 540
Acknowledgments 542
References 542

20 Immunogenic clearance-mediated cancer vaccination 549

Gi-Hoon Nam, Yoosoo Yang and In-San Kim
20.1 Introduction 549
20.2 Current cancer immunotherapies using cancer vaccines 550
20.2.1 Conventional cancer vaccines: past and present 550
20.2.2 Limitations and challenges of conventional cancer
vaccines 551
20.3 Immunogenic clearance 552
20.3.1 Immunogenic cell death for releasing neoantigens and
danger-associated molecular patterns 554
20.3.2 Enhancing tumor cell phagocytosis by innate immune
cells 554
20.3.3 Combination therapy utilizing immunogenic clearance 558
20.3.4 Biomaterials for immunogenic clearance 558
20.4 Enhancing the response rate of immune checkpoint blockades to
tumors 559
20.5 Conclusion 560
Acknowledgments 561
References 561
Contents xv

21 The future of drug delivery in cancer treatment 569

Amit Singh and Mansoor Amiji
21.1 Introduction 569
21.2 Challenges with designing and personalizing cancer therapy 570
21.2.1 Tumor heterogeneity and complexity 570
21.2.2 Multidrug resistance 571
21.2.3 Biological barriers 572
21.2.4 Physiological barriers 574
21.3 Challenges with nanotechnology-based drug delivery 575
21.3.1 Drug encapsulation and stability 575
21.3.2 Tumor-specific delivery and targeting 576
21.3.3 Pharmacokinetic modulation 578
21.3.4 Intracellular and subcellular delivery 580
21.4 Safety challenges with nano-drug delivery 581
21.4.1 Material safety issues 582
21.4.2 Limitations of characterization tools and biological
models 583
21.4.3 Immunological profiling and immunotoxicity 585
21.5 Formulation challenges with nano-drug delivery 586
21.5.1 Nanoparticle design 588
21.5.2 Analytical characterization 589
21.5.3 Manufacturing and scale-up issues 590
21.6 Current clinical landscape in nano-based drug delivery in cancer 591
21.6.1 Lipid nanoparticles 591
21.6.2 Polymeric nanoparticles 592
21.6.3 Protein nanoparticles 593
21.7 Conclusion and future perspective 594
References 596

22 Development of clinically effective formulations for anticancer

applications: why it is so difficult? 599
David Needham
22.1 “Executive” overview 599
22.2 Introduction 602
22.2.1 So, you want to develop a clinically effective
formulation? 602
22.2.2 My motivation and goal 603
Part A. The nonscientific part 605
22.3 It is actually not that difficult to get drugs approved (there are
lots of them) 605
22.4 What about cancer statistics and cancer trials? 606
22.5 This regulated process costs money to cross “the valley of death” 608
22.5.1 So what does a clinical trial cost? 609
22.5.2 What about R&D? 610
22.6 But just because it is approved does not mean it works 611
xvi Contents

22.6.1 There is a crisis in cancer care 611

22.6.2 Treatment of osteosarcoma has not improved in over
30 years 611
22.7 And there are people who want to make money and are making
money (which is fine) 612
22.7.1 Doxil 613
22.7.2 Abraxane 615
22.7.3 So, are they making money? And who benefits? 619
Part B. The scientific part 620
22.8 For cancer though, yes, it is difficult (but I think it is not
impossible) 620
22.8.1 A brief biographical-scientific sketch 621
22.9 The intravenous dosing problem for cancer: from here to there 622
22.10 What is nanomedicine? And why? 624
22.10.1 Because we can 625
22.10.2 Because we have to? some things to consider starting
with the drugs themselves 632
22.10.3 Success-ratio between drug solubility and efficacy 635
22.10.4 The drug-absorbing sink 637
22.10.5 Laws theories and models 639
22.11 The only way to get a chemotherapeutic drug throughout a whole
tumor is to release it in the blood stream of the tumor 640
22.11.1 It takes two: Mark Dewhirst was an expert in
hyperthermia 640
22.11.2 Doxil is not working 641
22.11.3 The low-temperature-sensitive liposome: invention and
testing 647
22.11.4 A final word about the enhanced permeability and
retention effect (because this drives the next invention) 661
22.12 “Make the drug look like the cancer’s food”: our efforts to treat
osteosarcoma 663
22.12.1 Osteosarcoma: relatively few chemotherapeutic
advances over the past 30 years 666
22.12.2 No two tumors are the same, but they all have to eat 667
22.12.3 Cancers have an altered lipid metabolic reprogramming 668
22.12.4 Our drug of choice is niclosamide: repurposed for
cancer 669
22.12.5 Oral-niclosamide has low bioavailability that hampers
its repurposing in cancer 670
22.12.6 Current formulations of niclosamide in preclinical
development 671
22.12.7 In vitro cell studies 671
22.12.8 In vivo studies 672
22.12.9 Medicinal chemistry-approaches 672
22.12.10 An endogenous-inspired formulation for niclosamide 672
Contents xvii

22.12.11 Summary of our work so far 673

22.12.12 Nanoparticle-fabrication by a rapid solvent-exchange
process 674
22.12.13 Eight aspects (steps) of nanoprecipitation and drug
bioavailability 676
22.12.14 The niclosamide stearate prodrug therapeutic
component design 679
22.12.15 Nanoparticle data 682
22.12.16 In vitro tests in breast, prostate, glioblastoma, and
osteosarcoma 684
22.12.17 Bioluminescence and pulmonary metastasis assay 692
22.12.18 In vivo tests in an osteosarcoma lung metastasis
mouse model 693
22.13 Final thoughts 698
22.13.1 Here is where we are and where we have to go 699
22.13.2 Non-or-limited profit, avoid investor-driven decisions,
open source pharmaceuticals, start generic 701
References 705
Dedication 723

Index 725
This page intentionally left blank
List of contributors

Kinan Alhallak Department of Radiation Oncology, Washington University

School of Medicine, St. Louis, MO, United States; Department of Biomedical
Engineering, Washington University, St. Louis, MO, United States

Sean David Allen Northwestern University, Evanston, IL, United States

Mansoor Amiji School of Pharmacy, Bouve College of Health Sciences,

Northeastern University, Boston, MA, United States

Farzaneh Atrian Department of Basic Medical Sciences, Purdue University, West

Lafayette, IN, United States

Abdel Kareem Azab Department of Radiation Oncology, Washington University

School of Medicine, St. Louis, MO, United States; Department of Biomedical
Engineering, Washington University, St. Louis, MO, United States

You Han Bae Department of Pharmaceutics and Pharmaceutical Chemistry,

University of Utah, Salt Lake City, UT, United States

Sheila Barrios-Esteban Department of Pharmacology, Pharmacy and

Pharmaceutical Technology, Centre for Research in Molecular Medicine and
Chronic Diseases (CiMUS), University of Santiago de Compostela, Santiago de
Compostela, Spain

Margarida Barroso Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany

Medical College, Albany, NY, United States

André O’Reilly Beringhs University of Connecticut, Storrs, CT, United States

Stefan H. Bossmann Department of Chemistry, Kansas State University,

Manhattan, KS, United States; Nanotechnology Innovation Center, Kansas State
University, Manhattan, KS, United States; Johnson Cancer Research Center, Kansas
State University, Manhattan, KS, United States

Junho Byun College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical

Sciences, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea
Another random document with
no related content on Scribd:
osoitti hänen epäluuloaan — entä jos hän todellakin olisi nähnyt Karl
Augustin!

Hän istuutui puun juurelle etäisimpään holviin eikä ollut

huomaavinaan keveiden askelten asteettaista lähenemistä. Mutta
äkkiä askeleet tulivat nopeammiksi, ja isä seisoi hänen edessään
ilmeisesti hämmästyneen näköisenä.

— Mitä sinä täällä teet, tyttö? — kysyi hän karskisti, luoden

samalla raunioihin pitkän, viipyvän katseen, joka näytti tunkevan
jokaiseen sopukkaan.

— Istun mietiskelemässä, isä-kulta, — sai Alma sanotuksi.

— Hiiteen moiset mietiskelyt! Minä mietiskelin myöskin hieman

tullessani sattumalta eteiseen ja nähdessäni sinun livistävän
rakkaille raunioillesi. Mutta katso, ettet mieti sellaista, joka saattaa
sinulle käydä liian kalliiksi — ja kavahda, ettet vastedes tee niin
pitkiä kävelyretkiä paitsi isäsi ja sulhasesi seurassa!

— Et ole kieltänyt minulta sellaista ennen!

— Teen sen siis nyt — mene!

Onnellisena päästessään näin vähällä Alma kiiruhti edeltäpäin; ja

huulet yhteenpuristettuina, rypistäen kulmakarvojaan, keppi
kainalossa ja piippu hyvää vauhtia heiluen edestakaisin
ylijahtimestari tuli reippain askelin perässä, katsoen silloin tällöin
taakseen ja pari kertaa mutisten: — Hitto tuota poikaa — juuri hän se
oli, jonka minä iltapäivällä näin vilahtavan puistossa. Mutta
odotahan, odotahan, kyllä olet turhaan heittänyt koukkusi!
 Siitä hetkestä alkaen vakoilevat silmät vartioivat Almaa niin
ankarasti, että hän pelosta tavata Karl Augustia ei uskaltanut mennä
ovesta ulos. Mutta Karl August oli aikoja sitten kiinnittänyt itsensä
Hjo'hon, missä hän joka ilta istui Vetterin rannalla, katsellen milloin
valtavaa Ombergia, jonka helmaan hänen vastainen onnensa oli
kätketty, ja milloin loistavaa juovaa, jonka pyhän Birgitan jalanjälki oli
jättänyt sekä venäläisten kasakkain varjoja, jotka mustilla hevosillaan
kiitivät yli Vetterin sinisen kalvon.

Siten vähitellen lähestyi ratkaiseva päivä…

XX.

Pilvinen taivas sateineen ja myrskyineen oli ensimäinen tervehdys,

jonka Alma vastaanotti yhdeksäntenätoista syntymäpäivänään.

Ketään vierasta ei ollut nyt kutsuttu, mitään hyörinän kalistelua ei

kuulunut keittiöstä, ei edes Neta-tädin äänikään kajahdellut
eteisessä tahi portaissa: kaikki oli hiljaista, ikäänkuin päivällä ei olisi
ollut mitään merkitystä.

Alma oli kauhuissaan, itki ja rukoili mitä palavimmin, samalla

huokaillen: — Jospa jo olisi ilta!

— Hyvää huomenta, lapsi-riepu! — kuului vihdoin ovesta, ja Neta-

neiti, kädessään pieni, mitätön kukkaseppele, astui makuusijan
ääreen. — Katsoppa, — sanoi hän laskien seppeleen peitolle, — ota
nyt se, koska et tahdo parempaa. Sinulle olisi muutoin soveltunut
paremmin tänään kantaa seppelettä ja kruunua — silloin täälläkin
olisi ollut toinen ääni kellossa.

— Onko täti nähnyt isää tänään?

— Olen niinkin, luulen kyllä nähneeni — vastikään kutsui minut

soittokellolla niin kiivaasti, että luulin nauhan katkeavan! Nyt et saa
puhua majurin etkä kenenkään toisenkaan kanssa, ennenkuin sinut
kutsutaan sisälle, eikä se tapahdu aamiaiseksi, jonka ylijahtimestari
tänään syö yksinään. Senjälkeen hän odottaa majuria — ja sitten
lopuksi sinuakin, arvelen.

— Ja sillä aikaa, — valitti Alma, — minä menehdyn

levottomuuteen! Ei ketään, jonka kanssa puhella, — jonka kanssa
neuvotella — voi, miten kaipaankaan äitiä: hyvää, hellää äitiäni, —
hän ei olisi kovuudella lykännyt luotaan tytärtään, hän.

— Ja teenkö minä niin? — kysyi Neta-neiti hiukan lempeämmällä

äänellä. — Enkö tee enemmänkin kuin mistä kohtuudella saattaisin
vastata, kun en puhu erästä asiaa, jonka sinä kai itse tiedät, joskaan
et luule kenenkään muun tietävän.

— En ymmärrä, — sanoi Alma hiljaa.

— Vai niin, sinä et ymmärrä, että tuolla vanhalla luostarinröttelöllä

on useampia korvia kuin luuletkaan… no, no, no, älähän keikahda
kumoon! Koska olen voinut pysyä vaiti kokonaisen kuukauden, voin
kai tänäänkin.

— Täti… täti! — Alma vapisi niin rajusti, ettei saanut suustaan

sanaakaan.

— No, no, rauhoitu nyt — siellä ei ollut muita kuin sisäkkö-Sohvi,

joka toisella puolella oli tapaamassa omaa hempukkaansa. Mutta
minä annoin hänelle jokseenkin hyvät kengät, jotta hän pitäisi
suunsa kiinni.

Silloin Alman kasvot hehkuivat häpeän voimakasta punaa. —

Vakuutan teille, täti, — sanoi hän, ja leimahtavaa ylpeyden tunne
antoi voimaa ja elämää hänen sanoilleen, — minä vakuutan, että
minä itse tänä päivänä sanon sen isälle! Ja silloin sekä hän että täti
ja kaikki, jotka saavat sen tietää, huomaavat, ettei kellään ole
oikeutta loukkaantua siitä tapaamisesta!

— Siunaa ja varjele, — huudahti Neta-neiti, ja löi

hämmästyksissään kätensä yhteen, — miten topakaksi olet tänään
tullutkin, lapseni — älä vaan tule hämillesi, kun joudut silmätysten
isäsi kanssa!

*****

Omassa huoneessaan ylijahtimestari istui aamiaispöytänsä

ääressä. Kolme kertaa hän oli kiinnittänyt lautasliinan napinreikään
ja jälleen irroittanut sen siitä; ja Neta-neiti, jonka itsensä piti häntä
palvella, oli niinikään kolme kertaa nostanut kyljysvadin kannen ja
laskenut sen jälleen paikoilleen, koska huomasi, ettei aika ollut vielä
tullut.

Tämä hiljaisuus oli aivan kuulumatonta liukaskielisen

ylijahtimestarin tapaiselle miehelle; tekipä se Neta-neidinkin
voimakkaihin hermoihin sellaisen vaikutuksen, että hän — ensi
kerran ylijahtimestarin taloon tultuaan — olisi toivonut saavansa
muutamiksi tunneiksi jättää tehtävänsä.

— Tuokaa tänne pullollinen reininviiniä ynnä lasit ja toimittakaa

sitten sana majurille, että pyydän hänen tekemään minulle sen
kunnian, että joisi täällä kerallani lasillisen aamiaiseksi!

Neta-neiti leijaili ovelle.

— Odottakaa hetkinen — oletteko ollut tänään Alman luona?

 — Olen tietysti!

— No?

Kykenemättä käsittämään, mikä vastaus ylijahtimestaria

tämäntuulisena miellyttäisi, Neta-neiti rajoittui lyhyeen "mitä"-
kysymykseen.

— Samantekevä — tehkää mitä olen pyytänyt!

Jäätyään yksin omien ajatustensa seuraan ylijahtimestari asteli

piippu kädessä kiivaana edestakaisin. Näki hänen olevan
voimakkaiden mielenliikutusten vallassa, jotka vuorotellen pyrkivät
voitolle hänen sielussaan. Silloin tällöin hän huiskautti piippuaan
ilmaan ikäänkuin karkoittaakseen jotakin; hän ei tahtonut suoda sijaa
lempeämmille tunteille.

Hetkisen kuluttua Neta-neiti palasi kantaen uutta tarjotinta, ja

vähän jälkeenpäin saapui majuri, levollisena, mutta hieman tavallista
kalpeampana.

— Jättäkää meidät, — sanoi ylijahtimestari luoden katseen

taloudenhoitajattareensa.

Herrat istuutuivat pöytään…

Järjestelmällisellä pitkäveteisyydellä ylijahtimestari oli avannut

pullon, pyyhkäissyt pois lakan, täyttänyt lasit ja asettanut pullon
paikoilleen.

— No, veliseni, meillä on tänään juhlapäivä, joka ei varmaankaan

ole veljelle samantekevä. — Näin puhuessaan ylijahtimestari
sinkahutti majuriin silmiensä salamat.
 — Ei, ei suinkaan — nythän on Alman syntymäpäivä.

— Oikein, ja samalla sinun ja hänen kihlauksensa vuosipäivä…

Saamme kai juoda morsiamesi maljan!

— Alman maljan! — änkytti majuri.

— Miksi eroittaa hänen nimeään siitä arvonimestä, joka on hänelle

tuleva — mitä, häh, majuri, mitä sellainen merkitsee? Juon sinun
morsiamesi maljan, ja toivon, ettet kieltäydy vastaamasta siihen!

— Veli… kuule minua!

— Kuulen, — sanoi ylijahtimestari, samalla kun antoi käden, jonka

oli ojentanut tarttuakseen lasiin, verkalleen laskeutua, — minä
kuulen, mutta veli ajatelkoon, mitä aikoo puhua.

— Olen jo ajatellut! Asianlaita ei voi, ei saa olla toinen: minun

kunniani, minun sanani ovat panttina… minun täytyy lunastaa ne —
tästä päivästä alkaen ovat Alman siteet katkaistut!

— Ahaa, suurkiitos, varsin mielenkiintoisia keksintöjä! — vastasi

ylijahtimestari kylmänivallisesti samalla kun polttava verivirta
syöksähti hänen kasvoilleen. — Veli on niinmuodoin ollut sitä
mielipidettä, että minä olen mies, jonka kanssa saattaa leikkiä mielin
määrin? Mutta sitä ei tehdä! Minun tyttäreni kättä ei pyydetä sitä
varten, että se jälleen muitta mutkitta hyljätään — ei, hyvä herra, ja
sen minä sanon, että silloin ei ole tunnettu, mikä on se mies, jota on
niin karkeasti loukattu!

— Veli, veli, — sanoi majuri äänensävyllä, jonka syvä

sydämellisyys jonkun verran hillitsi ylijahtimestarin rinnassa riehuvaa
myrskyä, — tämä on liikaa! Älä tee minulle uhria vaikeammaksi kuin
se on, vaan kuule minua kärsivällisyydellä — tee se meidän
monivuotisen ystävyytemme tähden!

— Juuri sen vuoksi ei tämän hetken olisi pitänyt koskaan tulla.

— Sitä ei saattanut estää. Se on kuitenkin minun oma syyni,

ainoastaan minun… veli muistaa varmaankin vuosi sitten vallinneet
suhteemme? En saata antaa itselleni anteeksi, etten silloin heti
päättävästi vetäytynyt takaisin. Mutta heikkous, heikkous — enkö
silloin koettanut uskotella itselleni, että Alma uusissa olosuhteissa
pian unohtaisi mieltymyksen, jota pidin ohimenevänä kuumeena. No,
niin, veli: sillä hetkellä, jolloin pyysin saada olla kahdenkesken Alman
keralla, houkuttelin hänet vuodeksi… koevuodeksi… tekemään
sitoumuksen kerallani, ja jätin hänelle kunniasanallani oikeuden
saada jälleen vapautensa siinä tapauksessa, että hänellä vielä
tämän ajan jälkeen olisi silloin tuntemansa taipumus. Ehdotukseni
näytti minusta silloin viisaimmalta — koska… koska, — lisäsi hän
verkalleen, — olin hullu saattaessani uskoa, että vanhemman
miehen rehelliset ja hellät huolehtimiset saattaisivat hävittää sen
vaikutuksen, minkä nuoruus, kauneus ja rakkaus kerran ovat
tehneet.

— Leikkiä niinmuodoin, ainoastaan leikkiä, — sanoi ylijahtimestari

verkalleen, katkerasti, — leikkiä minun kerallani! Ja onko minun
tyttäreni, jonka pidin lunta valkoisempana, onko hän vuoden,
kokonaisen vuoden saattanut valehdella isälleen, joka kuitenkin niin
lämpimästi, yli kaiken mitä kieli voi kertoa, on häntä rakastanut! —
Hänen näin lausuessaan herahti kyynel hänen silmäänsä ja tuiman
tuskan piirre kuvastui hänen ryppyiselle otsalleen.

— Herran nimessä, veli, — pyysi majuri hellyttävällä äänellä. —

Älköön veljen viha, veljen suru kohdistuko häneen! Minä olen
ohjannut hänet harhaan; minä olen nähnyt hänen suuren tuskansa,
hänen vastahakoisuutensa, hänen ahdistuksensa ja — sanonko sen,
veli… anna anteeksi, veli, että tuotan vielä enemmän kipua…
sanonko sen suoraan, pelko, tuo kauhistava tunne, joka on niin
arvoton olemaan lapsen ja isän sydämen välillä, se antoi Almalle
rohkeutta mihin hintaan hyvänsä ostamaan itsensä vapaaksi isänsä
vihasta.

— Heikkoutta se oli, viheliäistä, halveksittavaa heikkoutta! —

huudahti ylijahtimestari; mutta hänen äänessään ei ollut tuota
kiivasta kuohuntaa, joka tavallisesti ennusti myrskyä: siinä oli
kumeasti suhisevan tuulen ääni, joka katkee kesken kaikkein
raivokkainta rynnistystään.

— Veli, minä houkuttelin, syy oli minun!

— Niin oli, — lisäsi ylijahtimestari, verkalleen saavuttaen tavallisen

määrätyn mielenmalttinsa, — ja veljen velvollisuus on korjata paha.

— Juuri sitä minä sydämestäni ja sielustani toivon!

— Toivo siten, kuin miehelle sopii! Teemme leikistä toden; hänen

täytyy vielä, niin, hänen täytyy tulla veljen puolisoksi!

— Heitä tämä mieliharha! — pyysi majuri lämpimästi ja hartaasti.

—
Se on mahdotonta: hänen sydämensä on peruuttamattomasti
luovutettu.
Veli ei saata tahtoa hänen onnettomuuttaan. Ja ajatteleppa
vastuunalaisuutta… ajatteleppa sitä niin kauan kun on aika!
 — Minä teen sen! Minä tiedän mikä on hänen onnensa ja
onnettomuutensa, paremmin kuin hän itsekään… Jätä minut, majuri,
jätä minut! Tahdon selvittää ajatukseni; tahdon puhua tytön keralla;
tahdon nähdä saattaako hän katsoa minua silmiin!

— Veli, veli!

— Veli, veli — hiton pitäisi olla veljen veli eikä minun, kun veli
panee toimeen tuollaisia hulluinhuoneseikkailuja! Mutta jollen minä
tule veljen apeksi kaikella asianmukaisella kunnialla, niin — on
mennyttä sekä vanha ystävyys, että myöskin se kunnioitus, jonka
olen lahjoittanut veljelle… mene nyt, mene ja salli minun koota
ajatuksiani!

Ylijahtimestari kulautti pari viinilasillista, hieroi otsaansa, heittäytyi

sohvalle, mutta nousi jälleen ylös ja asettui keskelle lattiaa odottaen
tytärtään.
XXI.

Ovi aukeni hiljaa. Alma astui kynnyksen yli. Silmät, jotka olivat luodut
lattiaan, todistivat hämminkiä, mutta samalla mitä nöyrintä rukousta
lempeyteen.

— Tule esille, lapseni! — sanoi ylijahtimestari, ei lämpimästi, ei

kylmästi, mutta mitä suurin alakuloisuus äänessään.

Alma kohotti katseensa. Hänen silmissään oli kirkkaat kyyneleet;

ne tipahtivat yksitellen isän kädelle, kun tytär syvään kumartuen
painoi sen huuliaan vasten.

— Minulla on sinulle puhumista, tyttäreni; mutta pyydän ettet

vastaa lapsen tavoin, joka joka hetki pelkää vitsaa; vaan avoimesti,
kuten tyttären tulee hänen puhuessaan ensimäisen ja parhaan
ystävänsä kanssa!

— Oi, isä, mikä hyvyys! — änkytti Alma, hämmästyneenä vaipuen

polvilleen; — en ole sitä ansainnut — tunnen, etten ole sitä
ansainnut!

— Siitä olen minäkin vakuutettu, — vastasi ylijahtimestari

kohottaen hänet ylös; — mutta se mikä ei ole tapahtunut, saattaa
vielä tapahtua: katuvaiselle, hellälle tyttärelle on isä aina valmis
antamaan anteeksi, tottelemattomalle… mutta sinä et kai enää tahdo
lukeutua sellaisiin — suo minun uskoa se, Almani!

— Ah, isä, minä…

— Kas niin, kas niin, mitäs äsken sanoin: suo minun päästä näistä
huokauksista äläkä enää huutele "ah" ja "mutta", kyynäränpituisin
keskeytyksin — puhu selvästi!

— Juuri sitä haluan, isä!

— No, hyvä, no alkakaamme: — Piditkö itseäsi tehdessäsi

sitoumuksen majurin kanssa ja tunnustaessasi minulle, isällesi, itsesi
hänen morsiameksensa, — piditkö itse itseäsi jonakin muuna?

— Pidin itseäni pakosta häneen vuodeksi sidottuna, sidottuna

hänen morsiamekseen nimellisesti. Huomasin myöskin pian, että
hän uskoi pakon vuoden kuluessa muuttuvan vapaaksi tahdoksi,
mutta niin ei käynyt.

— Nyt vastasit enempään kuin mitä sinulta kysyttiin. Oliko sinulla

myöskin mielestäsi majuria kohtaan ne velvollisuudet, jotka
hyvinkasvatetulle tytölle sopivat sitä kohtaan, jonka kanssa hän on
tehnyt niin tärkeän sitoumuksen?

— Niin, luonnollisesti, majuri oli myöskin ottanut minulta sellaisen

lupauksen.

— Ja sinä kuitenkin rikoit sen… — Ylijahtimestari astui

kirjoituspöytänsä ääreen, ja otti siitä pienen kiven pitäen sitä Alman
silmien edessä.
 Näkyi selvästi, että hän oli odottanut tästä menettelystään jotakin
onnellista, jotakin suurta tulosta, että hän oli odottanut näkevänsä
Alman ahdistuksessa ja tuskassa pyytävän häneltä anteeksi; mutta
mitään sellaista ei kuulunut. Alma otti kiven käteensä, katseli
lemmittynsä nimen alkukirjaimia ja sanoi sitten hiljaa ja
sydämellisesti: — Se tuli minun tietämättäni, isä, se on totta, samoin
kuin sekin, että minä pari kertaa hämärässä näin Karl Augustin
varjon vilahtavan puitten välitse hänen tehdessään tänne
salaperäisen retkensä, luulin sitä hänen haamukseen; mutta
koskaan hän ei tullut esille, koskaan hän ei puhutellut minua!

— No, oletko senjälkeen nähnyt Adonistasi, ollut kirjevaihdossa

tahi tavannut häntä?

— Olen, mutta ainoastaan yhden kerran, — vastasi Alma, joka nyt

oli tehnyt sen lujan päätöksen, ettei salaisi vähintäkään.

Ylijahtimestari virnisti kauheasti. — Niin, kauniisti sinä olet

täyttänyt lupauksesi — olethan unohtanut soveliaisuuden
vaatimuksetkin!

— En milloinkaan, isä! En saattanut menetellä toisin pelkäämättä

jotakin vielä pahempaa! — Ja yksinkertaisesti ja totuudenmukaisesti
Alma kertoi Kultakäpälän salaisen lähetyksen ja syyn, joka pakotti
hänet, saatuaan kirjelipun, tapaamaan nuorta miestä raunioilla.

— Joskin minä teidät viipymättä keskeytin?

— Niin kävi, isä, vieläpä ennen kuin juuri sanaakaan oli vaihdettu!
Mutta olen varma, ettei Karl August tahtonut tavata muusta syystä
kuin varottaakseen ja vannottaakseen minua, etten toista kertaa
uudistaisi sitä heikkoutta, jota olen ehtinyt niin kauan katua. Ja nyt,
hyvä isä, usko minua, kun vakuuttamalla vakuutan, että tämän
ainoan kerran olen tavannut, tämän ainoan kirjeen olen saanut, siitä
lähtien kun annoin majurille lupaukseni.

— Hyvä, olkoon niin. Mutta toivon, ettet kuitenkaan kuvittele

mielessäsi sen muuttavan rahtuakaan asiaa ja sitä suunnitelmaa,
jonka olen viitoittanut sinun tulevaisuudellesi?

— Toivon, isä, sitä toivon sydämeni pohjasta, ja vieläkin

suuremmalla syyllä, kun majuri tänäpäivänä antaa minulle vapauteni!

— Tahtoi, aikoi antaa sinulle vapautesi! — oikaisi ylijahtimestari. —

Hän teki tosiaankin varsin vakavia yrityksiä siihen, mutta et kai
suurestikaan ihmettele, kun sanon sinulle, etten minä ole se mies,
jolle saa tehdä pilaa kunnia-asioista! Hän on pyytänyt sinua
vaimokseen, sinä olet ilmaissut olevasi halukas siksi tulemaan, ja
niinmuodoin minä en salli minkään romanttisen kujeen häiritä
parasta suunnitelmaa, mille konsanaan olen iloinnut!

— Isä — huudahti Alma syvästi kiusaantuneena — asia ei saata

olla niin; itse majurikin peruuttaa kosintansa!

— Sitä en ihmettele, kun hän näkee sen tällä tavalla palkituksi.

Mutta jos sinä, Alma, kuten minä äsken, olisit nähnyt tuon
kunnollisen, rehellisen ja voimakkaan miehen, surun ja katkeran
kaipuun masentamana, tyytymättömänä itseensä ja koko
maailmaan, hylkäävän toivonsa ja ilonsa ja kerjäläisen tavoin
lähtevän sen taivaan ovelta, jonka hänen liian arka kunniantuntonsa
itse sulki; jos olisit nähnyt sen, Alma, jos olisit kuullut miten
lämpimästi hän puolusti sinua, miten hellästi hän rukoili puolestasi,
niin en saata uskoa, että olisit sellainen kivisydän, ettet olisi tullut
liikutetuksi! Jotakin aivan toista on kuitenkin miehen syvä, vakava ja
hiljainen suru kuin nuorukaisen myrskyävä ja helposti ohimenevä
tuska.

Almaan teki vaikutuksensa isän äänen huomattavan hento sävy.

Ylijahtimestarilla oli suuri vaikutusvalta, kun hän äänellään kykeni
ilmaisemaan syvimpiä tunteitaan. Hän teki Almaan tällä hetkellä
voimakkaamman vaikutuksen kuin koskaan ennen; hän huomasi sen
ja lisäsi: — Alma, sinä tuotat minulle suurimman surun mitä minulla
on eläissäni ollut — sinä lasket isäsi hautaan, jollet täytä hänen
toivomustaan!

— Oi, isä, isä, laske minut ensiksi sinne! — pyysi tyttö ja puhkesi
itkuun, niin kiivaaseen, niin rajuun, että ylijahtimestaria kauhistutti se
epätoivo, joka oli koko hänen olemuksessaan… — levätkäämme
kernaammin siellä molemmat — mutta anna minulle anteeksi, oi,
anna minulle anteeksi, muutoin en saata elää enkä kuolla!

— Älä itke, Alma lapseni, rakas, pikku Almani, älä itke — eihän
isäsi ole mikään tyranni! — ja sydämellisesti ja kauan syleillen isä
sulki vapisevan tyttären rinnoilleen… — Mutta kuule nyt minun
menettelytapani vaikuttimia; sillä tällä hetkellä tulee Alman ja hänen
isänsä sydämen välillä olla täysi luottamus — kuule rauhassa ja
ymmärryksellä!

— Minä kuulen! — kuiskasi Alma; ja istuen isän vieressä hän

kuunteli yhä kasvavassa jännityksessä hänen huuliltaan lähteviä
sanoja:

— Hento, ruumiiltaan ja sielultaan hento nainen, Alma, tarvitsee

elämänsä tärkeimmässä askeleessa vanhemman, vakavan
seuralaisen — seuralaisen, joka juuri sen vuoksi, ettei itse enää ole
nuori, tuntee itsensä tyytyväiseksi, niin, onnelliseksi, ihastuneeksi,
kun vain hyvä, lempeä lapsi, nuori, ystävällinen puoliso hymyilee ja
leikkii hänen ympärillään. Sinä, Almani, joskin sinä jonkin kerran,
erikoisissa tilaisuuksissa, voit olla hieman ryhdikäs, olet kuitenkin
tuollainen hento olento. Sinä, lapseni — olen sanonut, että
puhuisimme suoraan tällä hetkellä — joskin olet kaunis, miellyttävä
ja rakastettava, et ole suinkaan saanut runsaasti järjenlahjoja.
Minulle tekee kipeää sanoa tätä, ja näen poskillasi tapahtuvasta
värivaihtelusta, että sinun laitasi on sama sitä kuullessasi; mutta
totuus on totuus. Minun vakaumukseni on nyt se, että sinä eläessäsi
yhdessä kunniallisen ja kelpo majurimme kanssa et koskaan kaipaisi
näitä älyn korkeampia etuja, kun sinä taasen miehen kanssa, jolla on
erilainen luonne, terävämpi katse, lyhyesti sanoen syvät, voimakkaat
tunteet, mielikuvitusta ja runoutta j.n.e., kaipaisit niitä varsin paljon.

Ylijahtimestari pysähtyi hetkiseksi, jolloin hän kädellään hiveli

Alman kumarassa olevaa otsaa. Senjälkeen hän jatkoi:

— Kun kuherruskuukaudet ovat menneet ja niiden keralla

ensimäinen rakkaudenhuuma, hakee jälkimäinen mies toisenlaisia
aarteita kuin lapsellisen kauneuden ja lapsellisen sopertelemisen
pikku viehätyksiä; hän tahtoo puolison, joka saattaa käsittää,
ymmärtää ja seurata häntä, itse jutella ja keskustella hänen
kanssaan, kun hän väsyneenä päivänsä työstä palaa jälleen kotiin.
Mutta kun hän hyvinkin pian surukseen huomaa, ettei toinen
sellaiseen kykene, kun vaimo silloin salaisella hämmästyksellä
näkee, miten mies vetäytyy syrjään, ja huomaa hänen tehneen
havaintoja, jotka vahingoittavat hänen rakkauttansa — miten käy
silloin: salainen kärsimys, vaikea masentuminen kalvaa vaimon
sielua; hän huomaa, ettei hän enää ole miehelleen kaikki kaikessa,
ja mitättömyytensä tunne tekee hänet yhä alakuloisemmaksi ja
araksi, saattaa hänet kykenemättömäksi käyttämään niitäkin
viehätyskeinoja, joita luonto on hänelle antanut. Vakava suru on
mato, joka kalvaa elämän kukkaa. Nainen menettää kauneutensa,
sen mukana erään mahtavimpia aseitansa, joita hänellä on ollut; sen
tuottama epätoivo vähentää hänen olemuksensa viehätysvoimaa,
hyvyyttä ja rakastettavaisuutta, ja kauniista, ujosta, nuoresta,
leikillisestä tytöstä on tullut ruma, tyytymätön, luulosairas vaimo, joka
ei kykene tekemään omaansa eikä miehen elämää iloiseksi!

— Isä, isä, — huudahti Alma ja kohotti hehkuvat kasvonsa, —

sopiiko tämä kuva minuun — olenko minä tyhmä, yksinkertainen,
avuton olento?

— Et mikään niistä, lapseni, sinä olet lahjoiltasi vain

keskinkertainen; ja jos olisit antanut minun rauhassa lopettaa
kuvaukseni, niin olisin sitten näyttänyt sinulle, että juuri ne
ominaisuudet, joita sinulla on, olisivat kehittyneet sinussa — jos olisit
mennyt naimisiin majurin kanssa, — miehen, joka on tasainen,
levollinen ja perin rehellinen ja joka koko elämänsä olisi sinua
käsillään kantanut, — puhtaimmaksi ja korkeimmaksi onneksi,
onneksi, jonka kestävyys ei olisi häiriintynyt. Itse intohimottomana,
tyynenä, lempeämielisenä ei hän olisi koskaan pyytänyt sinulta mitä
itse ei olisi tarvinnut, ja sinä olisit lisännyt niiden harvain, mutta
onnellisten naisten lukua, jotka täyttäessään hellän puolison ja äidin
velvollisuuksia, ympärillään paras mitä elämällä on, kunnioitus ja
hyvinvointi, eivät joudu tuntemaan senlaatuista nöyryyttävää
köyhyyttä, jonka tietoisuus avaa sen haudan, mihin moni nuori
nainen on nähnyt elämänsä onnen vaipuvan… Ja nyt, Almani, olen
sanonut kaiken. Ajatteleppa, että isäsi, jonka katse on seurannut
sinua varhaisimmasta lapsuudestasi, täytyy tuntea sinut paremmin
kuin itse tunnet itsesi — ja huomaa nyt, mitä hän on tahtonut, mitä
toivonut: huomaa, ettei hänellä koko maan päällä ole pyhempää ja
lämpimämpää toivomusta kuin että näkisi sinut onnellisena!

Muutamia hetkiä isän vaiettua Alma istui hiljaa. Jo aikoja sitten oli
hänen poskillaan palanut tumma purppura, hänen silmissään oli
loistanut voimakas ja vilkas tuli. Nyt hän kohosi ylös, laski kätensä
isän käteen ja sanoi levollisesti, mutta varmasti: — Suo minulle
anteeksi, isäni, mutta minä… minä tohdin uskoa, että lausuntosi tahi
ainakin osa siitä on johonkin määrin erehdyttävä!

— Mitä sanot, Alma? — kysyi ylijahtimestari ja katsoi

hämmästyneenä tyttöä silmiin: — erehdyttävä?

— Niin, isä, en ole koskaan ennen tuntenut sitä mitä tässä

hetkessä tunnen, mutta jokin minussa nousee sanojasi vastaan, isä,
ja vakuuttaa minulle, etteivät ne sovellu minuun; ja nyt, jos sallit, isä,
tahdon minäkin sanoa, miksi liitto majurin kanssa, kaikissa oloissa —
vaikka en olisi tuntenutkaan Karl Augustia — olisi tullut minulle ylen
vastenmieliseksi… ajatteleppa, isä, vaan nuorta tyttöä, joka ei ole
lahjoiltaan niinkään keskinkertainen, mutta joka ensimäisistä
lapsuusvuosistaan alkaen on tottunut konemaiseen tottelemiseen,
tottelemiseen, joka ei ole koskaan antanut tilaa tahi aavistustakaan
oikeaa tahi väärää koskeville ajatuksille eikä edes minkäänlaista
ajatuksenvapautta: jos tämä tyttö nyt vähitellen alkaa tuntea, että
hänelläkin on jotakin arvoa, että hänenkin pitäisi osata tuntea,
ajatella ja menetellä omin neuvoin, niin hänen ensimäinen ja hartain
halunsa on se, että hän, jos hänen on erottava isästä, jota hän on
niin sydämellisesti rakastanut, silloin saisi seurata miestä, joka
antaisi hänelle, ei ainoastaan vaatteita ja ruokaa ja pitäisi ystävällistä
huolta hänen pikku huviensa ja oikkujensa tyydyttämisestä, vaan
myöskin ennen muuta tulisi hänen rakkaimmaksi seurakseen, mutta
yhtäkaikki ei olisi häntä niin paljoa korkeammalla, etteivät he voisi
kohdata toisiaan kaikilla niillä aloilla, joilla miehen ja naisen
ymmärryksen ja tunteen tulee olla tasapainossa.

— Mistä, Herran nimessä, — huudahti ylijahtimestari keinuen

tuolilla edestakaisin, — olet saanut kaiken tämän, tyttö?

— Olen saanut sen yksinomaan omasta tunteestani, isä. Mutta

milloin, isäni, olisit huomannut, että Almasi olisi ymmärtänyt muuta
kuin totella, leikkiä ja hyväillä: minähän en ole koskaan muulloin
paitsi tänään, kun sinä itse avasit tien, uskaltanut avoimesti lausua
ajatustani. Mutta, isä-kulta, anna minulle vapaus ja oikeus siihen —
ja silloin saat nähdä, etten minä ole se nuori nainen, jota sinä
kuvailet, vaan että minä tahdolla, tunteella, käytöksellä ja
ymmärryksellä kyllä koetan pitää kiinni siitä miehestä, jonka olen
valinnut. Jos minä sen sijaan pakosta tahi houkutuksesta tekisin sen
synnin, että antaisin kunnialliselle miehelle käden ilman sydäntä, niin
olisin ollutta ja mennyttä, silloin kuihtuisin ja kuolisin kuin köyhä,
tallattu kukka, ja niinmuodoin tuottaisin itseeni luottavalle miehelle
elinkautisen katumuksen kotoisen ilon asemesta. Olisiko se hyvä,
isä?… Ei, hyvä se ei olisi, sillä minun täytyy lopettaa tunnustamalla,
etten luule itsessäni olevan luonnetta kestämään pilalle mennyttä
elämää.

Ylijahtimestarin kasvoilla oli pitkän aikaa taistellut valtava

mielenliikutus; mutta sinä hetkenä, jona Alma lakkasi puhumasta,
sanoi hän melkein hennolla äänellä: — Tule syliini, lapsi! Sellaisena
sinun olisi pitänyt esiintyä aikoja sitten — olen tyytyväinen sinuun,
Alma, hyvin tyytyväinen. Jumala katsoo tahtoon: sinun hyväsi oli
kuitenkin joka tapauksessa aina minun päämääränäni.
 — Ja nyt… — änkytti Alma, nojaten polttavan poskensa isän
poskeen.

— … saamme ajatella asiaa, ennenkuin toimimme, lapseni! En

anna tämän jälkeen suorastaan kieltävää vastausta, mutta
minunkaan ikäisenäni ei kernaasti luovuta, kaikkein vähimmin
väkivaltaisesti, lempiajatuksestaan… Koetan keksiä jonkun keinon,
joka saattaisi sovittaa meidän kaikkien tunteet. Mutta nyt, lapseni,
jätä minut rauhaan — — olet todellakin saanut minut vakuutetuksi
siitä, ettet ole se, miksi olen sinut kuvannut: ja niin iloinen olen siitä,
että olen tehnyt yhdeksäntoista vuoden pituisen erehdyksen, että
tästä hetkestä alkaen annan sinulle täyden vapauden avoimesti
lausua ajatuksesi kaikista asioista.

— En käyttäisi sitä väärin, isä! — sanoi Alma, nöyrästi suudellen

isänsä kättä, jolle vierähti muutamia kyyneliä. — Sillä koskaan en ole
samassa määrässä kuin nyt tuntenut halua tottelemisella ja
sanomattomalla hellyydellä ansaita rakkauttasi, isä.

— Hyvä, hyvä, lapseni — luulin, sieluni kautta, että juuri tänään

tapahtuisi jotakin erittäin merkillistä. — Ylijahtimestari ajatteli repeter-
kelloa, jonka vetämisen hän ensimäisen kerran niin moniin vuosiin oli
unohtanut.

Niin, ja mitkä vallankumoukset hänen valtakunnassaan olivat

tapahtuneet parin tunnin kuluessa: majuri hylkää kihlauksen, Alma
heittää pois vanhan ihmisen ja tulee uudeksi — ja hän itse saa
selville, että hän yhdeksäntoista vuoden ajan on ollut erehdyksessä
oman tyttärensä luonteesta!

Saman päivän iltapuolella oli ylijahtimestarilla, kun hän koko ajan

oli ollut sulkeutuneena omaan huoneeseensa, majurin kanssa pitkä