‫ביוכימיה (אביב תשפ"ד)‬

‫תרגיל מספר ‪6‬‬

‫חומצות אמיניות‪ ,‬פפטידים‪ ,‬חלבונים ‪ -‬סיכום‬

‫‪.1‬‬
‫שאלה ‪ 4‬מתירגול קודם‬

‫‪.2‬‬
‫מועד א' (תשע"ט)‪ .‬שאלה ‪2‬‬

‫במעבדת מחקר חוקרים אנזים מתוך תערובת חלבונים שהוכנה ממצוי גולמי של פולי סויה‪ .‬לבידוד האנזים‬
‫השתמשו החוקרים בשלוש שיטות‪ :‬מסננת מולקולרית‪ ,‬כרומטוגרמה במחליף יונים וכרומטוגרפיה זיקתית‪.‬‬

‫א‪ .‬בחרו באחת משלוש השיטות הללו והסבירו בקיצור את העיקרון עליו מבוססת שיטת ההפרדה שבחרתם‪.‬‬

‫בתהליך ניקוי האנזים במסננת מולקולרית בדקו החוקרים את ריכוז החלבון‪ ,‬ואת פעילות האנזים בשלושה‬
‫מקטעים‪ :‬מיצוי גולמי‪ ,‬מבחנות שטיפה של העמודה ומבחנות האילוציה (ניתוק) של האנזים מהעמודה‪ .‬החוקרים‬
‫חישבו את הפעילות הספציפית של האנזים בכל אחד מן המקטעים שנבדקו‪ .‬התוצאות מובאות בטבלה ‪ 1‬לשאלה זו‪.‬‬

‫טבלה ‪1‬‬

‫פעילות ספציפית (יחידות פעילות אנזים למ"ג חלבון)‬ ‫המקטע הנבדק‬

‫‪1.7‬‬ ‫מיצוי גולמי‬
‫‪0.01‬‬ ‫תכולת מבחנות שטיפה‬
‫‪7.3‬‬ ‫תכולת מבחנות אילוציה‬
‫ב‪ .‬האם הצליחו החוקרים לנקות את האנזים מתערובת החלבונים? הסבירו את תשובתכם על פי התוצאות‬
‫שבטבלה ‪ 1‬לשאלה זו‪.‬‬

‫ג‪ .‬חשבו מה היא ההעשרה שהתקבלה בשיטת המסננת המולקולרית בהשוואה למיצוי גולמי‪.‬‬

‫בהמשך הניסויים לניקוי ואפיון האנזים השתמשו החוקרים בעמודת מחליפי יונים‪ .‬הם סיפחו את המיצוי הגולמי על‬
‫עמודה טעונה שלילית ושטפו את העמודה בבופר ב‪ .pH=6.0 -‬מרבית הפעילות האנזימטית התקבלה בתכולת‬
‫מבחנות השטיפה‪ .‬החוקרים הסיקו מכך שהנקודה האיזואלקטרית של האנזים נמוכה מ‪.6 -‬‬

‫ד‪ .‬הסבירו כיצד הגיעו החוקרים למסקנתם‪.‬‬

‫שיטה נוספת בה ניקו החוקרים את האנזים היא כרומטוגרפיה זיקתית‪ .‬גם בשיטה זו ספחו חוקרים את המיצוי‬
‫הגולמי על העמודה‪ ,‬שטפו את העמודה ולאחר מכן שטפו בבופר אילוציה שניתק את האנזים מהעמודה‪ .‬בכל מקטע‬
‫בדקו החוקרים את ריכוז החלבון ואת הפעילות האנזימטית‪ .‬התוצאות מובאות בטבלה ‪ 2‬לשאלה זו‪.‬‬
 ‫טבלה ‪2‬‬

‫החלבון פעילות אנזימטית (יחידות פעילות ספציפית (יחידות פעילות‬ ‫ריכוז‬ ‫המקטע הנבדק‬
‫אנזימטית למ"ג חלבון)‬ ‫פעילות למ"ל)‬ ‫(מ"ג למ"ל)‬
‫‪18‬‬ ‫‪12‬‬ ‫מיצוי גולמי‬
‫‪0.2‬‬ ‫‪6‬‬ ‫תכולת מבחנות שטיפה‬
‫‪10‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫תכולת מבחנות אילוציה‬

‫ה‪ .‬חשבו את הפעילות הספציפית בכל אחד מהמקטעים שנבדקו‪ .‬האם שלב ניקוי זה היה מוצלח? מה הוא‬
‫פקטור הטהור (העשרה) שהתקבל בשלב זה?‬

‫‪.3‬‬
‫מועד א' (תשע"ג)‪ .‬שאלה ‪2‬‬

‫א‪ .‬כיצד תפריד למרכיביה תערובת המכילה את הטריפפטידים הבאים‪:‬‬

‫‪Ala-Phe-Glu, Lys-Ala-Gly, His-Val-Asp, Glu-Asp-Tyr‬‬

‫ב‪ .‬רשום את נוסחת המבנה של פפטיד ‪ Lys-Ala-Phe‬ב‪.pH=10 -‬‬

‫ג‪ .‬איזה מקטעים תקבלו מפירוק הפפטיד הבא עם ציאנוגן ברומיד‪:‬‬

‫‪Val-Lys-Glu-Met-Ser-Trp-Met‬‬

‫ד‪ .‬האם לחומר ‪ cellulase‬מבנה סיבי או גלובולרי?‬

‫‪.4‬‬
‫‪( .‬תשס"ח‪ ,‬מועד א'‪ ,‬שאלה ‪)2‬‬
‫נתון דקאפפטיד ‪ .A‬לאחר הידרוליזה מלאה נמצא שהוא מורכב מחומצות אמיניות הבאות‪:‬‬
‫‪Met, Ala, Leu, 2Lys, Phe, Tyr, Glu, Gly, Ser‬‬
‫לקביעת רצף החומצות האמיניות בפפטיד ‪ A‬בוצעו הבדיקות הבאות‪:‬‬
‫הוספת ‪ FDNB‬והידרוליזה נתנה בין היתר ‪-2,4‬דיניטרופניללאוצין‪.‬‬ ‫א‪.‬‬
‫הוספת ציאנוגן ברומיד לפפטיד ‪ A‬גרמה לשבירתו לשני פפטידים המכילים אותו מספר של חומצות‬ ‫ב‪.‬‬
‫אמיניות‪.‬‬
‫הוספת קרבוקסיפפטידאז לפפטיד ‪ A‬שחררה לתמיסה חומצה אמינית אלאנין‪.‬‬ ‫ג‪.‬‬
‫ד‪ .‬הוספת אנזים פפסין גרמה לשבירת פפטיד ‪ A‬לשלושה פפטידים קטנים‪:‬‬
‫‪Phe, Met‬‬
‫‪Glu, Leu, Ser‬‬
‫‪Lys, Ala, Lys, Gly, Tyr‬‬
‫ה‪ .‬הוספת האנזים טריפסין שברה את הפפטיד לאוקטאפפטיד ולשתי חומצות אמיניות בודדות אלאנין וליזין‪.‬‬
‫ו‪ .‬הוספת האנזים ‪ V8 protease staphylococcus aureus‬שברה את הפפטיד ‪ A‬לדיפפטיד‬
‫ולאוקטאפפטיד‪ .‬בקביעת ‪-N‬סופי של האוקטאפפטיד נמצאה חומצה אמינית סרין‪.‬‬
‫על סמך כל הבדיקות הנ"ל קבע‪/‬י את הרצף של החומצות האניניות בפפטיד ‪.A‬‬