Para aprender la patologia contemporinea de manera efi- ciente, esta fundamental que el estudiante est familiarizado con Tos diversos métodos de labortoro,yeon las enc y = rramientasempleadas para el estudio de esta materi, Fst pitulo se dedica a los aspectosbisicos de los métodosdispo niles en los laboratorios modemos de patologia desde In mieroscopia bisica-, hasta los métodos més recientes A PATOLOGIA EN LA AUTOPSIA £1 profesor William Boyd escribis con su estilo inimitable “La patologia se inics en la camilla de autopsias”. La impor- tancia dela autopsia para la patologia se destaca en la inscrip- ci6n en latin en una sala de atopsias, que significa: “Fst es el sitiodonde la muerte ayuda aa vida”, Como se afirms en el ca- pitulo anterior, el italiano G. B, Morgan (1682-1771) y el fan és. H. A. Laennec (1781-1826) comencaron a coleccionar i formes de casos hospitalarios y a rlacionar las earactersticas clinicas con ls lesiones observadas en las autopsins, de manera aque establecieron la corrlacinclnico-patologica. Este método akin se mantiene como la forma mis importante de enseNanza clinica en las instituciones médicas de todo el mundo. El minucioso examen posmértem le india al médco la pa- togenia de la enfermedad, le revela los efectos nocivos de a te- rapia administrada yestablece ls discrepancias entre ls ding nésticos previo y posterior ala muerte; atin no se hahallado un sustitato para este método Hay dos métodos traicionales para realizar una autopsi, aque se pueden emplear de forma indistinta 1. Extraccién en bloque de los érganos abdominals y toré- 2. Diseccién in situ de cada érgano por separado, ‘Cuando se cree que varios érganos podrian estar compro- ‘metidos, se debe realizar una autopsia completa, pero si se sos- pecha una enfermedad de un érgano especifico, una miniau- topsia o una autopsia limitada podrian ser suficientes. El estudio realizado durante la autopsia proporciona cono- cimientos y habilidades tanto al médico como al patélogo. Los objeticos principales de la autopsia son los siguientes, 1. Evaluacién de la calidad de a atencién del paciente mediante: §) Ia confirmacién de la causa de la muerte, ii) el establecimiento del diagnéstico de certeza y i) el estudio de a respuesta terapéutica 2. Ftucacién de todo el equipo comprometido en la atencién del ppaciente mediante: jel diagndstico en la autopsia de trastomnos que, a me- ‘nudo, pasan inadvertidos en el examen clinico, como por ejemplo neumonia, embolia pulmonar, pancreatitis aguda, carcinoma de prostata; ii) el descubrimiento de nuevas enfermedades en Ia autop- sia, como por ejemplo sindrome de Reye, legionelosis {enfermedad de los legionarios), sindrome de dificultad respiratoria aguda grave; Técnicas para el estudio de la patologia iit) el estudio de Ia demografia y la epidemiologia de las en fermedades y iy) la educacién de los estudiantes y el personal de patologia. La reduccién de la tasa de autopsia en todo el mundo durant fios se debe a las siguientes razones: 1. Diagnésticos més confiables gracias a Jos avances en I nicas de diagnéstico por la imagen, como la tomografia computa rizada (TC), la resonancia magnética (RM), la angiografia y otra 2, ‘Temor del médico frente a la responsabilidad legal por co- meter un error. La estimulacién de a realizacion de autopsias a cargo de médicos y patélogos en hospitales de tercer nivel es fundamen: tal para mejorar la atencién de los pacientes y para el avance de médica. la cienci PATOLOGIA QUIRURGICA PERSPECTIVA HISTORICA Eltérmino “patologia quirirgica” se aplic como sinénimo de histopatologia, anatomia pat ‘fa anatémica y patologia celular. La pato método clisico y comprobado para el diag: sao en el examen macrosc6pico y mi ‘Como se coments, la patologia quirurgica inici6 el es patol6gico de los tejidos obtenidos en las a n de los hallaz 0s cirujanos s6lo depend croscépicos y descartaban los tejicos rese Ja oportunidad de realizar un diagnéstico obstante, con los avances tecnoldgicos real de los colorantes en los primeros aiios del siglo se d Il6 Ia especialidad de la patologia quirtirgica di vvés de la creacién de la biopsia Al comienzo, esta tarea estaba a cargo ‘experiencia del equipo quirtirgico en los departam: rugia, que recibia el nombre apropi gico”. En la actualidad, el campo de la anatomia patologica qui firgica se expandié tanto que sed subespecialidades, como nefropatologia, neuropatologia, be ‘matopatologia, dermatopatolog: Patologia pedistrica y otras microscopico. Ni do de “patologs rollaron’ varias LA EXTENSION Y LAS LIMITACIONES DE LA PATOLOGIA QUIRURGICA Los servicios de patologia quiningica de cualquier hospital grande depenclen, sobre todo, del material proporcionado por los cirujanos y los médicos familiarizados con la extensisin y las limitaciones de la especiatidad. En consecuencia, resulta funda ‘mental que el méslico se pueda comunicar con libertad con el pa- ‘logo, tanto de manera formal como informal, a través de for mularios de patologéa quirirgica, ce forma verbal y en diferentes foros como reuniones y conferencias interdepartamentales Escaneado con CamScanner 9 Fem titth |r) Ei 2 3 5 & z 2 2 2 a10 I NQID93aS SeolSeq seoluo9) { [BISUBD e\Bojojeg LOS PROTOCOLOS DE LA PATOLOGIA QUIRURGICA fs importante del FORMULARIOS. La primera tarea y la mas important ; latos de identificacién del pa: é rere co Tes del recipient con lo piezo te a in relevante So- Fl formulario debe contener toda la informac cheneo y la enfermedad (anamnesis, hallazgos en el examen a cirugia, resultados de otras pruebas bioquimicas antes y diagndsticos clinics ‘oyenk hematol6gicas y radiolbgicas rel + diferenciales) y referencias a exémenes citologicos o biopsias IECERCION DEL TEJIDO personal dl lbortro gus Sr eae eae ee SET See eee en eat ata técnica de inclusion en pa tuna solucién fijadora (con mayor frecuencia solucion fisiolégica ¥ formol al 10% o formalina amortiguada al 10%) ose puede re cibir en fresco sin fijar. Para el corte por congelacién, el tejido fresco sin fijacién, La fijacién con mi Siempre se transporta e ‘roondas también se puede usar en el laboratorio para la fi ci6n rapida y el procesamiento de piezas quirirgicas FXAMEN MACROSCOPICO. El examen macrosc6pico de la pieza recibida en el laboratories el paso siguiente mas impor tante, El corte tisular macroscépico apropiado, la descripeién ;crosc6pica y la scleccién de tina muestra representativa de tejido de una pieza més grande son partes esenciales del exa: men anatomopatol6gico del tejido remitido. Un error en este paso no puede resolverse en un estado posterior, ya que podria, requerir la separacion de fragmentos de tejido en fresco en caso de que la pieza sea bastante grande y de que se pueda retrasar el transporte; o, sila biopsia es pequena y se pierde en el pro- cesamiento, sera necesario realizar otra vez todo el procedi miento quirdirgico para obtener la biopsia, Los laboratorios modernos para la evaluacién macroseépica disponen de un sistema de grabacién de la descripcién macros- copica a través de un dictéfono sin la necesidad de un asistente que escriba el informe. Algunos laboratorios tienen tin proto: colo para la obtencién de fotografias de la pieza macroscopica y radiografias de la muestra antes y después del corte del tejido para su documentacién, Los tejidos calcificados y el hueso se deben someter a des- les y ablandar el tejido calcificacién para eliminar los mi ‘mediante su tratamiento con agentes descalcifiantes, como éci- ddos y quelantes (con mayor frecuencia, écido nitrico acuoso) Resulta fundamental que todo el personal de la sala de exa men macroscépico mantenga precauciones estrictas para la ma- nipulacion de los tejidos infectados con tuberculosis, hepatitis, HIV y otros virus, EL LABORATORIO DE HISTOPATOLOGIA. Los bloques de tejido con su ntimero de la sala de macroscopia se someten alos procedimientos del laboratorio, La mayoria de los departamen- tos de histopatologia usa procesadores tisulares automaticos (Fig, 2.1) que cuentan con doce espacios separados para com- pletar el ciclo durante la noche en aproximadamente dieciocho horas. Se describen a continuacién: @ formatina al 10% para su fijacién, @ _grados ascendentes de alcohol (10, 95% hasta 100%) para su deshidratacion durante cinco horas en 6 07 recipientes, @ sileno,tolueno y cloroformo para su limpieza en tres horas. ln dos recipientes e “@ impregnacion en parafina durante seis horas en dos bafios de cera con termostato. Figura 2.1 @ Procesador automatico de teido p mecianle la técnica de inclusién en parafina (Thermo Shandon, Reino Unido). Cortesia: To ud, Nueva Deli Para evitar la contaminacién del laborat y aleoholes, también se dispone de proce vacio con sistema cerrado. La fijacién del tejido se realiza en cera di que se preparan con molde metalicos L (4 tualidad, también hay moldes plastic s para constituir bloques con las divers. eso de fijar los tejidos y form: través dela temperatura; ademas, hay ce jacién de los tejidos (Fig. 2.2), pués de su seccién con micrétomo, c tun micr6tomo rotatorio, que emplea turf desechables (Fig. 2.3) El criéstato o el corte por congelaci spa sos de procesamiento tisular y de cambio, el tejido se congela répidamen do de 25 °C -que actiia como medio de sec ciona (Fig. 2.8). A continuacién, los cortes paras tincidn. El corte por congelacion es un pr : Figura 2.2 © Centto de inclusion tisular para la técica do parana (Histocente) {Thermo Shandon, Reine Unido). Cortesia: Towa Optics (Inia) PY Ld, Nueva Det Escaneado con CamScannerFigura 23. © Miciotomo rotatoro para la seccis teanea de inclusion en parfina {Thermo Shandon, Reino Unido). Cortes: Towa Optes (India) Pv tid: Nuova Dat ae néstic intraoperatorio répido que se puede llevara cabo en los tejidos antes de avanzara una cirugia radical mayor. Asimismo, también se usa para identificar algunos componente que, en condiciones normales, se pierden durante el procesamiento en, alcohol o xileno, como por ejemplo los lipidos, las enzimas y otros. Este procedimie cerca de la camilla Figura 2.4 © Cridstato para la realizacién de cortes mediante a te ‘en de conglacén (crytanes) {Trermo Sandon, Relze Unido). Cortes: Towa Opts (India) Pvt Ud, Nueva Delhi Las cartes incluidos en parafina se tinen de forma sisters tica con hematoxilina y eosina (H & E). El material somet corte por congelacién se puede tefir con H é& E répida o con azul de toluidina de manera habitual. Se pueden emplear ciones especiales con cualquiera de los dos métodos de acuerd con la necesidad. Los cortes se colocan en un portaobjetos y se cenvian al laboratorio para su estudic ATOLOGICO, La iltima tarea, EL INFORME ANATOMG Ja mas importante det laboratorio de patologia, es la elabor cidn de un informe rapido, preciso, breve y con relevancia pro rstica. El informe ideal debe contar con cinco elementos i) Datos del paciente (disponibles para el patélogo, como el nombre del paciente) ii) Deseripeién macroscépica precisa. ii) Hallazgos microsc6picos. iv) Diagndstico morfologico, que debe incluir el 6rgano con fi nes de clasificacién con los eédigos de SNOMED (Scientific N menclature in Medicine, Nomenclatura cientifica en medicina). ¥) Otros comentarios en algunos casos, EL CONTROL DE CALIDAD. El control de la calidad de la in formacién proporcionada por el laboratorio de histopatologia cs importante para detectar los resultados inadecuados, los pro cedimientos de actualizacién y los avances en los informes de- finitivos. Es posible implementar un control de calidad interno mediante discusiones mutuas en los casos controvertidos y la ‘autoevaluacién de la calidad de los cortes en el Ambito del la- boratorio, En la actualidad, también se cuenta con program oratorio de hist de control de calidad externo de todo el EL HISTOPATOLOGO Y LOS ASPECTOS LEGALES. En momento, el problema de las demandas por neglige prictica en histopatologia se equipara con el que acecha a ot dlisciplinas clinicas, En las biopsias y en los casos controve dlos, se pueden solicitar interconsultas internas y exten ‘mismo, la tarea responsable nunca se debe delegar, salvo que el superior sienta confianza de que su delegado tiene la suficiente experiencia y capacidad TINCIONES ESPECIALES (HISTOQUIMICA) Con a tincién de H & E, la hematoxlina tte ls ndcleosy a teriales extracelulaes. La tncid con H&E se empiea de forma ‘eosina se usa como contratincién para el citoplasma y vari habitual para diagnosticar mediante microscopia la ria de las piezas quirtrgicas. Sin embargo, en algunas circuns. tancias “especiales tancias © componentes especifics de las eélulas para confirmar constituyentes etioldgicos, histogénicos o patogénicos, se pueden, cemplear tinciones especiales también denominadas “tinciones histoquimicas”. La tincién depende de las caractersticas fiscas ‘oquimicas, o dela solubilidadl diferencia entre la tincién y los te jidos, Los principios de algunos de los procedimientos de tincion, se conocen de forma amplia, pero otros atin son desconocidlos ‘Algunas de las sustancias para las cuales hay tinciones es Peciales que se emplean con frecuencia en el laboratorio de pa- tologia quirtrgica son el amiloide, los hidratos de carbon, los lipidos, las proteinas, los dcidos nucleicos, el tejido conectivo, Jos microorganisms, os tejidos nerviosos, los pigmentos y los ‘minerales; estas tinciones se enumeran en el Cuadeo 2.1 ando el patslogo desea demostrar sus Escaneado con CamScanner rom ah tl\ fo} se ja Bed SeoIUD9 |2 eres seoiseq seoiuse) { je19ua6 B)Bojo1eq CUADRO 2.1: Tinciones especiales (histoquimicas) usadas con mayor frecuenc Tinelon A AMILOIDE 1. Rojo Congo con biz olarizada 2 Azul de toluicina 8. HIDRATOS DE CARBONO Acido penidco de Sohit (as) 4. Mucicarmin Garmin de Best 5. Azul alesin 6. Azul aleidn-PAS combinados ©. TEJIDOS CONECTIVOS 7. ge Van Gieson ‘8. Theromico de Masson 9. Acido fastotingstico- hhematoxiina (PTAH) 10, Elastco oe Vernoet! 11, de Gordon y de Sweet D.LiPIDos 12, Acsite rojo O 13, Sudan negro 8 14, Tero oe osmio E_MICROORGANISMOS. 15, de Gram 16. de Ziehi-Neokson 17, Fite-Wade 18, Metenamina de pata 6 Grocett 19. Giemsa 20, Orcoina de Shikata Componente/tjido Amioido ‘Amioide Hicratos do carbono (en particular, glucdgano), todas las Mucina acida Mucina dda Mucina neutra Colageno extracellar Colégeno extracolular Musculo y flamentos glales Fras elisticas Fibras reteulares LUpidos (crdstato sin far) Lipdos (enstato sin far) Lpidos (erstato sin ar) Bacteria (cocos, baclos) Badios twboreuiosos Bacios de a lepra Hongos Pardsitos ‘Antigenos de superiie de la hepatitis 8 (HBSAg) rr Colorantos ojo Congo ‘zu de wolviina ‘Acido peridco, reactive da Shi (tuesina basco) carmin ‘Azul aloian (a pH 25) ‘Azul allan ‘eido plerico,fuesina dcida, celeste azul heralum Fuesina dcida,dcido feslomolidénco, met azul, celeste azul hemalum Hematerira, écido fosfotingsticn, permanganato, cido oxalico Hematosina,cloruro férieo, yodo, yoduro de potasio virato do pata ‘cate rojo 0 ‘Susin negro B Tetroxido de osmio Cristal vileta, yodo Lugel, "00 neuro Carbo fucsna, azul de matieno Carbo! fucsina, azul de matieno (ecolrar en acido sultiico 10%) Tetraborato de sod, nitrato de plata, metenamina, Poko de Giemsa, Permanganato dco, orceina, tevrazina mt BiroVingoncia verde: amici ‘Azul ortocrométion amiise Glucdgeno y otros hisratos de ‘carbono: magenta Mucloos: azul ‘Mucina: rojo Nicloos: azu! Mucina dcida: azul Nicleos: rojo Muscina dcida: azul Mucina neuiva: magenta Micloos: azul pido Nidleos: azwinego oldgeno: rojo Otros taidos: amarilo Nicteos: azulnegro Citoplasma: misculo Cblulas rojas: rojo Coldgeno: azu Estrias musculares, Nbr: neuroglales,flrina: az! NNicleos: azu! (Ctoplasma: rosa palido Fibra eldsticas: negro (Otros teidos: corratincon Fora reticulares: negro ‘Nicleos: negro 0 conta ‘cates minerles: jo Lipids no saturados, fost Lpidos no saturados: az noo Lipldos no saturases: marron Lipids saturados: no tericos Grampostivas: queraina,fibrine zu GGramnegatvas: jo Bacio tuberculosos @e pilose, actnomices: rojo Fondo: azul palo Bacos de la lepra: rojo Fondo: azul Hongos, Pneumocystis: negro CCéllas rojas: amarito Fondo: verde palido Protozoos: azul oscuro Nudleos: azul HBsAg positive: marron a negro Fondo: amarilo CContnie Escaneado con CamScannernn Tielén Componentateito Color nonprnaaesy F TEJIOS NERVIOSOS 21, AzuI rdpido 40 Lurol Motion Aut rp do Luxo,volota de Miaina: azwlverde sue Colas: volea/rosa 22, Plata de Bltschowsky prongs Aen bere ‘sone y neurftoilas: nog G.PIGNENTOS Y MINERALES 23. Azul de Prusia de Peri Homosiderna, hor Ferrcianuro do poasio Hieno trio: azul Ndloos: 179 124, Masson-Fontana Molanina, cdllas argentatines Rojo alizarn S von Kossa 25. Calo 2% ueso mineraizado 27, ode rabesnico Cobre 28 Extraccién de pigment Eminacén del plgmento formalina y del pigment de la 28. de Grimolus Culas argectias H. PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS valoda plata Rojo alzarin S| Nivato de plata, salranina © ‘Acido ribednico ‘Acide picrico aleohdtico Ntrato de plata Molanina, argentatin, cxomain, Igotuesina: negro cleo rojo. Depésitos de cali: rojo naranja Hueso mineralizado: ogra Ostecide: 1070 Cobre: negro verdoso Nueloos ej pido Pigmentolormatna/pgment de ‘malaria: elmnadoe Grinvlos argrtios: marrn-ne mee NA Metabisutito de potasio DNA: rojo pirpu 31 Met verde pronina NA, RNA Coplasma: verde Verde de mato, pironina ¥ ON verses cee Gee Cras Las técnicas histoquimicas para las enzimas requieren te jido no fjado para poder cortarlo con el criéstato, y no se pue- den aplicar en piezas fijadas en parafina o en formalina dado que las enzimas se dafan con rapidez. En la actualidad, la his. foquimica para las enzimas tiene una uilidad diagnéstica limi tada y no es tan popular; en parte, debido al requerimiento de tejidos frescos y ala técnica compleja y en parte, a causa de la excasez reativa de especficidad de la reaccin en muchos ca- ses, Esto determiné que las técnicas histoquimicas se reempla- cen en la mayoria de los casos por procedimientos inmunohis- toquimicos y ténicas de patologia molecular. En este momento algunas de las aplicaciones més frecuen tes de la histoquimica para las enzimas en patologia diagnos- tica son para la identificacién de enzimas relacionadas con el ‘misculo (ATPasas) en las miopatias; acetilclinesterasa, para el dliagndstico dela enfermedad de Hirschsprung; cloroacetatoes- terasa, para detectar células mieloides y mastocitos; reaccién OPA, para la actividad de la tirosinasa en los melanocitos; deshidrogenasa end6gena (que requiere nitroazul de tetrazolio ‘©NBN), para establecer la viabiidad del misculocardiaco,y las fosfatasas écida y alealina MICROSCOPIA BASICA E{ microscopio es la herramienta bisica para el pat6logo, de Ja misma manera que el estetoscopio lo es para el médico cli nico y el espéculo para el ginec6logo. Este instrumento permite agrandar las imagenes de objetos diminutos. MICROSCOPIA OPTICA. EI tipo de micros ‘mayor frecuencia en los laboratorios clinicos ‘roscopio éptico. En general, hay dos ti ticos: sd croscapios Sp- Microscopio simple. Es una lupa que tier nificadora de entre 2x y 200% Microscopio compuesto, Posee una bateria de le ues tos en un instrumento complejo, Un tipo de lente permanece cerca del objeto (objetivo) y otro tipo se ubica cerca del ojo d observador (ocular). El ocular y el objetivo tienen distintas ‘magnificaciones. El microscopio compuesto puede ser mono lar, con un solo ocular, 0 binocular, con dos oculares (Fig. 22 Los microscopios multcabezales se usa en el ambito de flanza y con fines demostrativos. VARIEDADES DE MICROSCOPIOS OPTICOS. Ademas de los microscopios épticos, a continuacién se describen otras mo- dificaciones especiales para el laboratorio clinico: Tuminacién de campo oscuro. Fste meétocio se usa para el ex men de microorganismos vivos no tenides, como por ejemplo Treponema pallidum. Los microorganismos se iluminan con un hhaz de luz oblicuo que no atraviesa e! microorganismo. El con. lensaclor se oscurece en el centro y la luz pasa a través de su periferia para iluminar el microorganismo vivo sobre un por- taobjetos. Microscopia de luz polarizada. Este método se usa para mos trar birrefringencia,p¢j, del amiloide, cuerpas extraios, pelos, ‘etoétera, Se emite una luz polarizada plana. Tras atravesor wn disco, los haces de luz vibran en un solo plano en angulo recto Escaneado con CamScanner rion littl) ce) jed SPOIUDD | pjBojored e) 9p oipnise joseoiseq seaius9} A je1ouab e/Bojojeq Figura 25 @ Microscopio dpi binocular (Modelo E400, Nikon, J Pn), Gortesia: Towa Optics (India) Pvt. Ltd, Nueva Delhi si. Se colocan dos discos prismas en la trayectoria de la, uz: uno debajo del objeto denominado p tubo denomi ador. El disco inf la luz quede polarizada en un plano. INMUNOFLUORESCENCIA Latéen ador'y otro en el nado jr Se rota para que -a de inmunofluore ncia se emplea para localizar moléculas antigénicas sobre las células en el examen microscé- pico. Este método se lleva a cabo mediante anticuerpos espect- ficos que actiian contra la molécula antigénica para formar el complejo antigeno-anticuerpo en el sitio antigénico especifico, que se visualiza gracias al empleo de un fluorocromo, el cual tiene la propiedad de absorber la radiacién en forma de luz. ul- avioleta, de manera que quede dentro del es visible en el examen microscépico. stro de la luz. E] método de inmunofluorescencia posee los siguientes componentes esenciales: MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. Se basa en el princi pio de que la radiacién que emite la luz ultravioleta de menor longitud de onda -360 nm-o la luz azul -longitud de onda 400 nm- causa fluorescencia en ciertas sustancias y luego ‘yuelve a emitir la luz con mayor longitud de onda, @ Algunas sustancias tienen fluorescencia natural, que se de- nomina fluorescencia primania 0 autofluorescencia; aunque se te- quiere luz ultravioleta para observarlas mejor, como por ejem- plo la vitamina A, la porfirina y la clorofila. @ La fluorescencia secundaria se emplea con mayor frecuencia yes la produceidn de fluorescencia a través del agregado de co Jorantes o compuestos quimicos denominados “fluorocromes” Fuente de luz. El vapor de mercurio y las limparas de gas xe- ‘nén se usan como fuente de luz para la microscopia de fluores- cencia ot Filtros, Hay varios filtros que se usan entre la fuente de jy objetivo; 1 lugar, 1 filtro que absorbe el calor hugar, el filtro que detiene la luz roja y en tercer lugar, el citador que sélo permite et pasaje de la luz de la lon onda deseada, AL atravesar In pieza, se redine tanto | tadora como la que emite fluorescencia, La luz excitador ‘mina debido al pasaje por otro filtro Hamado filtro bu cado entre el objetivo y el observador, que protes observador para que sélo la luz fluoresce alcar Condensador. Elcondensador de campo croscopio de fluorescencia para que la luz directa no “objeto y, en cambio, se cree un fondo de contraste la fluorescencia TECNICAS. Hay dos tipos de téenicas de fluorescen realizadas en cridstatos sobre tejido no fijado, que se di nan directa ¢ indirecta @ Enna tecnica directa ~presentada por Coons (1941 aliz6 el estudio original sobre inmunofluorescenc lun anticuerpo conjtigado con un fluorocromo cont geno, y luego, el tejido se examina bajo microscopi @ Ena féenien indirecta, también denominada Wich”, se genera una interaccién entre un antigenc anticuerpo especifico, seguida por el lavado y luex gado de un fluorocromo para completar la reac de inmunofluorescencia indirecta se aplica pa anticuerpos en el suero del paciente. APLICACION aplican para realizar las siguier Los métodos de inmunof 1, para la deteccién de autoanticuerpos en el s E ticuerpos contra el miisculo liso (SMA, por s anticuerpos antinucleares (ANA, por su sigla cuerpos antimitocondriales (AMA, por su sigla ticuerpo micros6mico tiroideo, etestera las enfermedades renales, pa noglobulinas, complemento y fibrina en varios medades glomerulares mediante el corte por ¢ se dlescribira en el Capitulo 3, en enfermedades de Ia piel, para detectar dep, m noglobulina mediante el corte por congelacion:e la unién dermoepiclérmica y en la porcion s is, por ejemplo en Ia dermatosis ampolla 4. para el estudio de los mareadores de superfc vrontclear con anticuerpos monoclonales; 5. y para el diagnéstico especifico de enfern sss . gj, en la hepatitis viral MICROSCOPIA ELECTRONICA La microscopia electr6nica, desarrolla ddécada de 1930 en Alemania, experiments modificaciones debic gado de nuevos conocimientos para la comprensidn de la tructura y la funcidn de las eéh nivel de los organulos celulares as normales y enfermas en e in embargo, en etapos ms ientes, la difusion de la inmunohistoquimica diagn6 patologia quirtirgica limits la aplicacion de la microscopia ele~ {rénica a las siguientes dreas de la patologia diagnostica: 1, en Jas enfermedacles renales, junto con la microscopia P tica y la inmunofluorescencia (Capitulo 22) 2, ena ultraestructura de los tumores de histogénesisincier’® Escaneado con CamScanner3. para el estudio subcelular de los macréfagos en enfe des por depésito de sustancias; 4. y-con fines de -perimentacisn. TIPOS DE MICROSCOPIA ELECTRONICA Hay dos tipos principales de microscopia electrénica 1. Microscopia electrénica de transmisién. Es la herramienta de eleccién para el estudio de la ultraestructura de la célula y sus organulos, Este estudio consiste e n el pasaje de un haz de electrones a través de una seccién ultradelgada de tejido. La magnificacin obtenida oscila entre 2.000 y 10.000 veces, 2. Microscopia electrénica de barrido, Evaltia la estructura de la superficie celular y produce una imagen tridimensional Por ejemplo, para observar los podocitos en el glomérulo renal Aspectos técnicos A continuacién se mencionan alguna téenicas pri de las consideraciones pales relacionadas con la microscopia electrénica 1._Fijacién, Siempre que se plance evaluar un tejido con micros copia electronica, se debe fijar una limina delgada y pequefia de tejido de no mas de 1 mm de espesor en glutaraldehido amorti- guado al 2% al 4% o en una mezcla de formalina y glutaralde- hido. Después de la fijacién, el tejido se ia en una solucién amor- tiguada de tetréxido de osmio para aumentar el contraste 2. Inclusién. El teido se ineluye en resina, en una grill, 3. Cortes semidelgados. En primer lugar se realizan cortes se midelgados de un espesor de 1. ym y se titen con azul de me- tileno 0 azul de toluidina. A veces, también se pueden cortar bloques de parafina para su estudio con microscopia elect nica; pero, en general, no son bastante satisfactorios debido a la existencia de numerosos artefactos. Los cortes semidelgados guian el diagnéstico diferencial y la seleccién del drea que se debe analizar en los cortes ultradelgados 4. Cortes ultradelgados. Para el examen ultraestructural, los cortes ultradelgados se realizan con un bisturi de diamante, Con el fin de aumentar la densidad electrénica, los cortes del: gados se pueden tefira través de la inmersién de la grila en. tuna solucién de citrato de plomo y de acetato de urinilo, INMUNOHISTOQUIMICA La inmunohistoquimica es la aplicacion de téenieas inmu- nol6gicas a la patologia celular. La téenica se emplea para de- tectar el estado y la localizacién de un antigeno especifico en las células (membrana, citoplasma 0 niicleo) mediante el empleo de anticuerpos especificos, que luego se observan con un cro- ‘mageno de color marron. De esta manera, se contribuye ala de- terminacién del linaje celular especifco o se puede confirmar ‘una infeccin, La inmunohistoquimica revolucion6 la patologia iagnéstica -conocida como la “revolucin marrén’ —y,en mu- ‘hos laboratorios soisticados, esta téenica reemplazs a la histo- ‘quimica como procedimiento auxiliar. Ademas de los princi- ppios subyacentes a la inmunohistoquimica y a la histoquimica, estas dos técnicas se diferencian en el resultado final: la histo- ‘quimica produce diversos colores para los distintos componen- tes tenidos de acuerdo con la sustancia tenida, mientras que la inmunohistoquimica produce solamente en el sitio apropiado de la célula su caracteristico color marrén como restiltado final En la tltima década, se realizaron avances significativos en las técnicas inmunohistoquimicas, En la actualidad, es posible ‘emplear de forma habitual bloques de tejido procesados inclu dos en parafina para realizar la inmunohistoquimica, lo que in fluye de forma significativa sobre el desarrollo de la patologia ciones entre los observadores -en particular, en lesiones fronte Fizas y en lesiones de origen indeterminado- pero, el uso de Inmunohistoquimica agreg6 objetioidad, espe " bilidad al diagnéstico patologico quirargico. Generalidades de la inmunohistoquimica © La inmunohistoguimica surgié de los mélodos de in fluorescencia, en los cuales los anticuerpos marcados con ¢ ppuestos fluorescentes podian localizar un antigeno especifc en el corte con cridstat. @ La necesidad de microscopia de fluorescencia se evité gra cias al desarrollo subsiguiente de la téen igin sistema colorig nera que el corte por con peroxidasa de ribano con de un fluorocromo; de tun anticuerpo marcado se puede observar con microscopia 6p tica. Los cromégenos empleados con mayor frecuencia en la reac cién inmunohistoquimica son el tetracloruro de diaminobenct dina (DAB, por su sigla en inglés) y el aminoetil carbazol (AEC por su sigla en inglés), ambos para producir un producto fin estable de color marron oscuro @ Luego, se desarroll la téenica de inmunoperoxidasa, que em plea el método del anticuerpo marcado en cores de parafna ‘on formalina y que, en la actualidad, se emplea con frecuencia @ En Ia actualidad, los dos procedimientos empleados mayor frecuencia en la inmunohistoquiimica son los siguien 1) Método de peroxidass-antiperoxidasa (PAP, por en in és), que consiste en la generacién del reactivo PAP en inm nocomplejos estables para su reaccién con el anticuerpo prima: rio mediante un anticuerpo intermedio. ii) Técnica tymunoenzimatica con el conju (ABC, por su sigla en inglés), que consiste en el empleo de tn anticuerpo secundario biotinilado para combinar el anticuerpo primario con un complejo grande preformado de avidina, bio~ tina y peroxidasa. @ La selecci6n del anticuerpo o los anticuerpos para la real: zacion de tinciones inmunohistaquimicas se realiza tras el di néstico diferencial en cortes con H & E. En general, se prefiere un panel de anticuerpos sobre una sola prueba para evitar errores © Los anticuerpos uilzados en inmunohistoquiimica se pro- dicen con féonieas monoclonaes (ibridona) y policlonales. La primera se emplea, sobre todo, para produit antcuerpos con afinidad elevada por un antigeno. En la actualidad, se dispone de un gran miimero de anticuerpos contra los antigenos ceula- res para su. empleo en la inmunohistoquimica, y el listado tiende a aumentar de fortna continua, @ Las tinciones inmunohistoguimicas siempre se deben aso- ciar con los cotraes postiees apropindos; es decir, es un tejido que expresa un antigeno especifico y que acta como contra el ual puede ser un contol interno o de tro teido. La tenica del bloque tisular “en salchicha”, que se considera muy econémica combina la tincidn de miiltples tejos en un solo portaabjetos con un tinico procedimiento de contro @ Para ta interpretacién de los resultados de las tinciones in- ‘munohistoquimica, es importante recordar que difrentesantige- nos localiza en distntos sitios de aclu membrana, citoplasma, Escaneado con CamScanner 15 rSemlahil-\ fe} Bojojed e| ep olpnise jo eed seolude,UN Te} koko = (3) seolseq seoiuoe) A jesaua6 eiBojojeg inicleo) y, en consecuencia, la tincién positiva se observa y se in terpreta en es0s sitios, como por ejemplo, fineién membranes para el antigeno comin leucoctaro, tincién nuclear para Tos re= Ceptores de estrdgeno y progesterona (RE-RP),tinciin citoplas matica para la actina del miisculo liso, entre otras. “@ ss tnciones inmunohistoquimicas no se pueden aplicnr para as lesiones neoplisias de las no neoplscas 0 1 t= asdstinciones se deben llevar nig distinguir | mores enigos de smalls sts dstnions jos tradicionales de patologia q ‘a cabo mediante métod ‘Aplicaciones principales de la inmunohistoquimica Ena actualidad, las tinciones inmunohistog plean para los siguientes objetivos, que se enumeran en el or- den de uatilidad diagnéstica: 1. Tumores de histogénesis incierta. La inmunohi .gener6 una revolucién en el diagnéstico de los tumores de origen incierto, tanto primarios como metastésicos de un tumor primario desconoxido, Se elige un conjunto de anticuerpos para resolver es- tos problemas con el diagnéstco; la selecién de Tos anticuerpos se basa en la historia clinica las caracteristicas morfol6gicas y los resultados de otras investigaciones importantes. Son de gran uti- lidad los colorantes de inmunohistoquimica para tenir los file- ‘mentos intermedios expresados por las células tumorales (quer tina, vimentina, desmina, neurofilamentos y proteinas dcidas fibrilares gliales), ademas de los enuumerados en el Cuadro 2.2. oquimica Marcadores de pronéstico para el cAncer. La segunda apli- cacién de la inmunohistoquimica en importancia es la predic ion del pronéstico de los tumores a través de la identificacion de las micrometistasis, las metdstasis ocultas y con ciertas ca- racteristicas adquiridas, de productos elaborados o genes ex- presados en exceso por las células malignas para establecer el Inmunotincion Tumor 1) Pangueratina (tacciones: queratinas de ato y bajo peso molecular, HMW.K, Lwin) 1) Artigano de la membrana eptelal (EMA) i) Aniigeno carcinoomerionario (CEA) Iv) Enolasa neuronoespociica (NSE). 1. Tumares eptaales (carcinomas) ‘) Vimentina (mesénguima en general) i) Desmina (mogénico en generales) ii) Aetna muscular espectica (miogénico ‘on generales) |v) Mioglobina (miogénicos esqueléticos) ‘) at-antiqumotpsin (paral histoctoma fbreso maligno) vi) Factor Vl (para ls tumores vasculares) i) C034 (marcador endeteal 2 Tumores masenquimaticos (sarcomas) 3. Grypos especiales a) Melanoma |) HMB-45 (més espectica) |) Vimentina ii) S-100 1) Antigono comin leucoctaro (LCACDAS) 1) Par (iemunogicbulinas, CD20) ii) Pan-T (C03) Jy) C015, CD30 (marcador de las cdulas FS para la enlermodad de Hodgkin) 1) Neuroflamertos (NF) i) NSE 8 GFP a ures ae) M) Cromoganina ouroondocrnos) » Shaptotsina ) Linfoma ©) Tumores: eurales y ‘euroendocrines co del tumor, A modo de ejemplo, comportamiento bioldg! a expresién ¢ pueden mencionar los protooncogenes, como cesiva de HER-2/neu (carcinoma de mama), g (p. ef, gen Rb, p53), receptores de 1s supresore tumo factores de crecimiento (p.¢), recep! epidérmico 0 EGFR) y marcadores de li fulas tumorales (p. ¢)., ki67, antigeno de prolifer celular PCNA). El andlisis de los tumores mediante estos met nce significativo en el manejo con re 1 de factor de crecimient a proliferacién de las cé dos representa un av pecto a los métodos convencionales para definir el pronésti basados en la estadificacidn clinica y el grado histologico, 3, Prediccién de la respuesta al tratamiento. La inmunohist ‘quimica se emplea de forma amplia para predecir la respus terapéutica en dos tumores importantes: carcinoma de mama de prostata, El crecimiento de ambos tumores estd regulado por anos y andrégenos, respectivamente. Los re lan el crec hormonas: estrdget ceptores especificos para estas hormonas que regul: iento se localizan sobre las células tumorales respectivas. Los alta positividad del receptor responden de manera tumores con sna de estas ho favorable a la eliminacién de la fuente end monas -ooforectom{a en el cancer de mama positivo para es- trégeno y orquiectomia en el carcinoma de préstata posit para los andrégenos-, También se administra tratamie ‘onal para reducir sus niveles: estrogenoterapia, para el ci de prostata, y androgenoterapia, para el céncer de mama. Los resultados de los receptores de estrégenos y de progesterona en el cdncer de mama presentan una correlacién prondstic ficativa, aunque la utilidad prondstica de los niveles de tores de andrégenos en el cdncer de prostata es limita 4. Infecciones. Las tinciones inmunohistoquimicas en Ja actualidad para confirmar agentes infecciosos ¢ ‘dos mediante el uso cle anticuerpos especificos cont el RNA microbiano, como la deteccién de virus HE HPV, herpesvirus-, bacterias -p. ej, Helicobacter py sitos Pneumocystis carini-, etcétera, En el Capitulo 10 se describiran los aspectos aplic: citogenética. En este capitulo el comentario se centra ves consideraciones téenicas ‘Las células somiticas humanas son diploides y cont cromosomas: 22 pares de autosomas y un par de crome= saales (XX en las mujeres y XY en los varones). Los gamet permatozoides y évulos) contienen 23 cromosomas y se < nan células haploides Todos los 6vulos contienen 23 cromosomas {el sexual es X), mientras que los espermatozoides contienen 23 cromosomas (el sexual puede ser X 0 Y). En consecuenca, el sexo de la descenclencia depende de la contribucién cromosomica p terna, lo que implica que el Svulo fertlizado por un espermato- zoide con un cromosoma X da como resultado un cigoto feme- nino, mientras que el Svulo fertilizado por un espermatozoide ‘con tn cromosoma Y produce un cigoto masculino. Cariotipo El cariotipo se define como la secuencia ce cromosomas ali- neados de acuerdo con su tamaio, la localizacion del centre mero y el patrén de bandas, En el Capitulo 3, se describ la es tructura de los cromosomas, a determinacién del cariotipo de un individuo es una he- rramienta importante para el anélisis citogenético. A continsa cién, se mencionan las caracteristicas principales del cariotipo Escaneado con CamScanner