Mechanisms of TLR Signal Transduction

The PAMP-mediated dimerization of TLR ectodomains is a fundamental feature of the signaling

process, as ectodomain dimerization results in the coordinate dimerization of the cytosolic TIR
domains of these PRRs. Whether present at endosomes or the plasma membrane, TIR domain
dimerization results in the activation of massive changes in cellular activities, which include
changes in gene transcription, splicing, translation e ciency, autophagy, glycolysis, and
oxidative phosphorylation. The downstream mechanisms that link dimerized TLRs to these
responses are under investigation, but all initiating signals appear to emanate from a dimerized
TIR domain. As such, our attention will begin at this level.

Upon microbial detection, dimerized receptor TIR domains are detected by the receptor-
proximal membrane proteins TIRAP (also known as MAL) and TRAM. TIRAP/MAL is a
peripheral membrane protein that surveys the inner lea ets of the plasma and endosomal
membranes through the actions of an N-terminal phosphoinositide binding domain. At its C
terminus, TIRAP/MAL contains a TIR domain, which recognizes dimerized TIR domains of most
TLRs and is necessary for signaling by TLRs 2, 4, 7, and 9. Of note, the requirement of TIRAP/
MAL for TLR signaling is most easily observed when natural PAMPs are utilized as
immunostimulatory agents. The use of unnatural stimuli (e.g., DNA containing
phosphorothioate linkages) or high concentrations of natural stimuli can bypass the genetic
requirement for TIRAP/MAL in TLR signaling. Upon PAMP recognition by a TLR, TIRAP/MAL
detects the dimerized TIR domain and stimulates the assembly of a large oligomeric sca old of
cytosolic proteins known as a supramolecular organizing center (SMOC). SMOCs operate in
multiple innate immune pathways and are considered the principal subcellular sites of signals
that drive cellular responses to microbial detection. SMOCs are not present in resting cells, but
are assembled within minutes of TLR dimerization. The SMOCs that govern TLR signaling
include the myddosome, which is seeded by TIRAP/MAL and the putative tri osome, which
may be seeded by a related protein known as TRAM (described below).

The myddosome was rst de ned in cell-free systems that measured the stoichiometry of its
minimal components. Subsequent structural studies illustrated the helical nature of the
myddosome, which is a theme that extends to SMOCs that regulate other innate immune
signaling pathways. The core of the myddosome contains multiple copies of the protein MyD88
and members of the IRAK family of serine threonine kinases. Speci cally, in cell-free systems
using recombinant proteins, six to eight molecules of MyD88 interact with four molecules each
of IRAK4 and IRAK2. While it is unclear if these stoichiometries represent features of natural
myddosomes, the endogenous components of this SMOC can be isolated as a stable complex
from cells stimulated with TLR ligands. Moreover, the TLR4-induced assembly of myddosomes
containing GFP-MyD88 variants has been visualized at the plasma membrane in living cells.
Mechanistically, it appears that the myddosome components are engineered for
oligomerization, as the TIR domains of TLRs and TIRAP/MAL function to interact with the C-
terminal TIR domain of MyD88. The N-terminal Death domain in MyD88 then recruits IRAKs
(which also contain Death domains). This sca old of TIR- and Death-domain-containing
proteins represents the core of the myddosome. IRAK1 is also likely present in myddosomes,
although the relative importance of IRAK1 and IRAK2 may di er in humans and mice. The tight
packing of the IRAKs within the myddosome activates their latent kinase activity, driving
autophosphorylation and the subsequent recruitment of the E3 ubiquitin ligase TRAF6.
Within the myddosome, TRAF6 serves two functions. This enzyme activates the kinase TAK1,
which stimulates IkB kinase (IKK)-mediated NF-kB and mitogen-activated protein kinase
(MAPK)-mediated AP-1 transcriptional responses. The activities of these and other TLR-
induced transcription factors will be discussed in detail below. In addition, TRAF6 mediates the
recruitment of the IKK-related kinase TBK1 to the myddosome. Myddosome-associated TBK1
functions to stimulate the rapid induction of glycolysis that occurs within minutes of TLR
fi
fi
ff
ffi
fl
ff
fi
ff
ff
 activation. This process is mediated by the kinase AKT (a substrate of TBK1) and results in the
phosphorylation of hexokinase, a master regulator of glycolytic metabolism. The consequences
of this early glycolytic shift in the cell are unclear, but it may serve as the rst step in the long-
term metabolic changes that occur. These long-term changes include an inhibition of oxidative
phosphorylation within mitochondria and the consequential enhanced production of acetyl-
CoA moieties that fuel the need for histone modi cations associated with durable
transcriptional activities in the nucleus. Additional metabolic e ects include an increase in
glucose utilization to fuel the emphasis on glycolysis in TLR-stimulated cells, the downstream
consequences of which include increases in ATP and lipid production, which may bolster
protein synthesis and secretory activities associated with TLR signaling. While TBK1 (and its
close homolog IKKε) promotes rapid glycolysis, other factors contribute to these metabolic
e ects, including phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and its upstream TIR domain containing
regulator BCAP. The relationship between the BCAP-PI3K-AKT pathway and the TBK1- AKT
pathway is unde ned.

The means by which TRAF6 coordinates myddosome activities that lead to transcription or
glycolysis are unclear. In fact, much remains mysterious regarding TRAF6 function. While this
protein is well-recognized to operate as a ubiquitin ligase, its activities in the myddosome
overlap with those of the E3 ubiquitin ligases pellino-1 and 2. Cells lacking all three of these
enzymes are defective for interleukin-1 (IL-1) induced ubiquitination of myddosome component
proteins, whereas cells lacking TRAF6 alone are not defective for these responses. In addition,
TRAF6 mutants that lack enzymatic activity retain the ability to mediate rapid myddosome-
directed transcriptional responses, but these responses cannot be sustained. The relative
importance of TRAF6 and pellino-1 and 2 in TLR signaling remain to be de ned. Similarly,
additional studies are necessary to understand the importance of the enzymatic activities
versus sca olding activities of TRAF6 for myddosome signaling. In summary, while the
myddosome has emerged as a central mediator of TLR signaling, several questions regarding
its operation and regulation cannot yet be answered.

In addition to the myddosome, the putative tri osome operates as a SMOC in the TLR
pathways. Genetic de ciencies of MyD88 (or other myddosome components) ablate signaling
by all TLRs except TLR4 and TLR3. Downstream of TLR4 and TLR3, MyD88-independent
cellular responses have been de ned. The rst response identi ed was the expression of genes
encoding interferons (IFNs) and IFN-stimulated genes (ISGs). In macrophages and conventional
dendritic cells (DCs), TLR3- or TLR4-induced IFN expression is not driven by the myddosome,
but rather depends on the proteins TRAM, TRIF, and TRAF3. Evidence supports the idea that
these respective proteins operate in a manner analogous to TIRAP/MAL, MyD88, and TRAF6
within the myddosome. Like TIRAP, TRAM is a peripheral membrane protein that surveys the
plasma and endosomal membranes for dimerized TLR4. TRAM accomplishes this task through
the actions of a bipartite localization domain consisting of an N-terminal myristoylation motif,
which is adjacent to a phosphoinositide-binding motif. Upon detection of dimerized TLR4 in
endosomes, TRAM is thought to interact with TRIF and promote TRAF3-dependent activation
of the kinase TBK1. TBK1 then drives the induction of IFN and ISG expression and may also
induce similar glycolytic responses that occur when TBK1 is activated within myddosomes. An
explanation for why TRIF (but not MyD88) can promote TBK1-mediated IFN responses was
o ered by the identi cation of a 39-amino-acid pLxIS motif present within TRIF. When
phosphorylated by TBK1, this motif interacts with the IFN-inducing transcription factor IRF3,
which is also a TBK1 substrate. TRIF, not MyD88, therefore has the ability to recruit the TBK1-
IRF3 enzyme-substrate pair, leading to IRF3 activation and IFN expression. The activities of
TRAM to drive TRIF (tri osome)-dependent responses is restricted to TLR4. TRAM has no
ability to interact with TLR3, nor does this protein regulate TLR3 signaling. Whether a TRAM-
like or TIRAP/MAL-like sorting adaptor operates to link TLR3 to TRIF is unclear.
ff
ff
ff
fi
fi
fi
ff
fi
fi
ff
fi
fi
ff
fi
fi
 The above-described sequences of events are commonly associated with signaling by all TLRs
in all mammalian cell types examined. Thus, fundamental features of TLR biology include the
following: (1) PAMP-mediated TLR dimerization, (2) TLR dimer-mediated SMOC assembly, and
(3) SMOC-mediated activation of kinases that drive transcription and glycolysis. This latter
point highlights the ‘‘organizing’’ nature of these organizing centers, as diverse upstream stimuli
feed into SMOCs to generate diverse downstream cellular responses.

The location in the cell where SMOC assembly occurs has signi cant in uence over the nature
of the downstream e ector responses induced by TLRs. An example of location-dependent
signaling was illustrated by studies of TLR4. Whereas MD2- TLR4 interacts with LPS at the cell
surface, this receptor must translocate (in a CD14-dependent manner) to plasma membrane
subdomains known as lipid rafts. Rafts are enriched in phosphoinositides, in particular
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PI(4,5)P2, which forms high-a nity interactions with the
localization domain of TIRAP/MAL. Translocation of dimerized TLR4 to plasma membrane rafts
therefore positions ligand-bound TLR4 dimers in proximity to TIRAP/MAL. These events
promote the TIRAP/ MAL-dependent assembly of myddosomes from this subcellular location.
TLR4 is then thought to undergo endocytosis, and it is from endosomes that dimerized TLR4
engages TRAM to initiate TRIF-dependent signaling. Notably, the process of TLR4 endocytosis
is not mediated by TLR4 itself. Rather, TLR4 is cargo for an LPS-induced endocytosis response
mediated by CD14. In macrophages, CD14 is constitutively (but slowly) internalized into
endosomes and degraded in lysosomes. Upon LPS binding, CD14 endocytosis is greatly
accelerated, leading to the co-incident endocytosis of TLR4. LPS-induced CD14 endocytosis
proceeds normally in TLR4-de cient cells, but TLR4 endocytosis is strictly dependent on
CD14. Moreover, TLR4 mutants containing signaling-incompetent TIR domains are as capable
of LPS- induced endocytosis as wild-type TLR4, thus establishing a cellular response to LPS
that is not mediated by TLR4 signaling. The process by which TLR4 is selected as cargo for
endocytosis is not only dependent on CD14, it is also dependent on the actions of MD2. MD2
mutants that bind TLR4 but cannot dimerize TLR4 are unable to promote LPS- induced
endocytosis. This nding indicates that dimerized TLR4 pairs are selectively internalized into
cells. Thus, the extracellular domain of TLR4 is not simply a ligand-binding domain, it is also a
motif that promotes endocytosis upon ligand binding. Direct evidence supporting this
statement derives from studies demonstrating that TLR4 mutants lacking their entire cytosolic
domains retain the ability to be selected as cargo for CD14- and MD2- dependent endocytosis.
Thus, unlike other well-de ned endocytosis-promoting motifs, which are typically contained in
the cytosolic tail of transmembrane receptors, the extracellular domain of TLR4 represents its
endocytosis motif.

Trans-acting factors that promote CD14-dependent TLR4 endocytosis remain poorly de ned,
but several have been implicated. One such biosynthetic regulator is the enzyme α1,6
fucosyltransferase (Fut8), which promotes the core fucosylation of CD14. In the absence of
Fut8, the ability of CD14 to promote TLR4 endocytosis and signaling is defective, although
these phenotypes are only observed in broblasts (not phagocytes). In macrophages, LPS
stimulates CD14- dependent uxes in intracellular calcium that are necessary for TLR4
endocytosis. Calcium uxes may derive from multiple sources, as the chanzyme TRPM7 and
inositol 1,4,5-trisphosphate (IP(3)) are implicated in these regulatory events. ITAM-containing
receptors and the tyrosine kinase Syk have also been implicated in TLR4 endocytosis and
TRIF-dependent IFN expression.

This separation of the sites of PAMP detection from signaling observed in the TLR4 pathway
extends to TLR2, TLR7, and TLR9. Bacterial lipoproteins have recently been found to promote
the TLR2-dependent expression of a subset of ISGs, and viral glycoproteins can drive TLR2-
dependent expression of IFNs and ISGs in in ammatory monocytes. The studies that reported
these ndings di er in the signaling mechanisms proposed, but all concluded that the type I
IFN responses induced by TLR2 require endocytosis. All studies also reported a requirement of
fi
ff
fi
ff
fl
fi
fl
fi
fi
fl
fi
ffi
fl
fi
 MyD88 for the type I IFN responses induced by TLR2, but there remains no consensus on how
MyD88 can induce such responses. The nding that these TLR2-dependent type I IFN
responses occur after endocytosis suggests that myddosomes at the plasma membrane do
not have the capacity to induce type I IFN expression, whereas myddosomes from endosomes
may be uniquely endowed with this capacity. Studies of TLR7 and 9 signaling underscore this
statement.

TLR7 and 9 signaling depends on MyD88, and when natural ligands such as viruses are used
as stimuli, TIRAP/MAL is also required. However, depending on the ligand used to stimulate
these receptors, di erent MyD88-dependent responses are induced. Certain sequences of
CpG DNA oligonucleotides induce transcriptional responses that are either heavily biased
toward in ammatory cytokine expression or cytokine and IFN expression. DNAs that induce
these di erent responses accumulate in di erent endosomal compartments, with IFN-inducing
DNAs accumulating in early endosomes and cytokine-inducing DNAs accumulating in later
endosomal compartments. Additionally, in plasmacytoid DCs (pDCs), genetic disruption of the
adaptor protein (AP)-3 complex lead to a dissociation of cytokine and IFN expression. These
ndings lead to the model whereby TLR7 and 9 induce myddosome assembly and signaling
from two di erent locations within the endosomal network.

While the conclusion that IFN-inducing activity is restricted to endosomal TLRs is supported by
studies from several laboratories, this theme appears to only apply to type I IFNs. Type III IFNs
(also known as IFNλ) can be induced by TLRs located at the plasma membrane or endosomes.
Type III IFNs are induced by a process dependent on MyD88 and appear to be co-regulated
with in ammatory cytokines and chemokines, as opposed to type I IFNs. For example,
blocking endocytosis in human monocytes prevents TLR4-induced type I IFN expression, but it
does not prevent TLR4-induced type III IFN or cytokine expression. The co-regulation of
cytokines and type III IFNs by the TLR pathway is probably most important at barrier surfaces,
as the receptor for this IFN family is highly expressed by epithelial cells that line the intestine,
lung, liver, and skin. Recent studies have indicated that type III IFNs promote the reinforcement
of barrier functions, a process central to host defense. Like the process of in ammation, barrier
integrity may be considered a central feature of immunity, regardless of the nature of the
infection. This suggestion may explain why TLR signaling coordinates cytokine and type III IFN
expression.

It remains mysterious as to how myddosomes can induce IFN expression in response to some
ligands in some cell types and not others, especially because studies in pDCs identi ed
canonical myddosome components (e.g., IRAK4, IRAK1, and TRAF6) in these responses.
Notably, the IFN response induced in pDCs is typi ed by the expression of IFNa, as opposed
to IFNb, which characterizes TLR-induced IFN responses in other cell types. IFNα expression
in pDCs depends highly on IRF7, whereas IFNb responses in other cells are dominated by
IRF3-dependent events downstream of TBK1. Another myddosome response that is cell type
dependent occurs speci cally in B cells, where TLRs drive the mitosis of these cells. Other cell
types do not link TLR signaling to cell division. Like IFN expression in pDCs, the mitotic
response to TLR ligands in B cells is dependent on canonical myddosome components, which
makes these observations all the more curious. TRIF signaling downstream of TLR4 also
displays cell type (or species-speci c) activities. For example, LPS signaling promotes the
release of IL-1β from human and porcine monocytes. This process is mediated by CD14, TLR4,
TRIF, and the in ammasome regulator NLRP3. Human monocyte-derived macrophages and
murine macrophages are unable to link TLR4-TRIF signaling to the release of IL-1β. Cell type
and/or species-speci c regulators may exist that endow these SMOCs with the ability to
diversify e ector responses that TLRs can induce.

This diversity of e ector functions induced by myddosomes can not only be demonstrated by
dissecting the behavior in natural contexts, but can be demonstrated through the use of
fi
fl
ff
fl
ff
ff
fl
ff
ff
fi
fi
fi
ff
fi
fi
fl
fi
 synthetic biology. For example, myddosomes have been engineered to contain the
aforementioned IFN-inducing pLxIS motif appended onto MyD88. When introduced into cells,
these synthetic myddosomes induce potent IFN responses to natural upstream stimuli.
Similarly, myddosomes can be engineered to link TLR signaling to the induction of necroptosis,
a rapid cell death pathway that proceeds independently of caspase activity. The nding that
myddosomes display natural and programmable signaling exibility likely explains the common
design principles that operate in other SMOCs in the innate immune system. Indeed,
in ammasomes have also been engineered to induce unnatural cellular responses using
strategies similar to those used to engineer novel myddosome activities.

In addition to the TLR pathways and the receptors that stimulate in ammasome activities, the
TNF receptor pathways, RIG-I like receptor (RLR) pathways, and cGAS-STING pathways (all of
which promote in ammation) utilize SMOCs as signaling organelles. Speci cally, proteins that
sit at the apex of each of these pathways seed the assembly of a receptor-proximal oligomeric
signaling platform. One possible explanation for common use of SMOCs in innate immune
signal transduction has been proposed. The oligomeric nature of these signaling organelles is
thought to increase the threshold for e ector enzyme activation, thus creating the possibility of
all-or-nothing cellular responses to receptor activation. Real-time imaging and systems-based
transcriptional analyses of cells stimulated with TLR ligands underscore the likelihood that this
hypothesis is correct. For example, single cell analysis of TLR-induced NF-κB translocation
into the nucleus demonstrated that increasing the dose of PAMP does not change the rate of
transcription factor translocation. Rather, increasing the dose changes the percentage of cells
that permits NF-κB translocation. Single cell RNA sequencing analysis reinforced this idea, as
increasing the dose of LPS used to stimulate macrophages did not change the amount of
cytokine transcripts in each cell. Rather, changing the dose of LPS altered the percentage of
cells that induced cytokine mRNAs. It therefore appears that the cellular responses to TLR
ligands are naturally designed for an all-or-nothing response to microbial encounters. This type
of response may be facilitated by oligomerizing activities that allow a small number of
dimerized TLRs (perhaps only a pair of TLRs) to induce myddosome assembly and signaling.
fl
fl
ff
fl
fl
fi
fi
Mecanismos de transducción de señales TLR

La dimerización de los ectodominios de los TLR mediada por los PAMP es una característica
fundamental del proceso de señalización, ya que la dimerización de los ectodominios da lugar
a la dimerización coordinada de los dominios TIR citosólicos de estos PRR. Ya sea en los
endosomas o en la membrana plasmática, la dimerización de los dominios TIR da lugar a la
activación de cambios masivos en las actividades celulares, que incluyen cambios en la
transcripción de genes, el splicing, la e ciencia de la traducción, la autofagia, la glucólisis y la
fosforilación oxidativa. Se están investigando los mecanismos posteriores que vinculan a los
TLR dimerizados con estas respuestas, pero todas las señales iniciadoras parecen emanar de
un dominio TIR dimerizado. Como tal, nuestra atención comenzará en este nivel.

Tras la detección microbiana, los dominios TIR dimerizados del receptor son detectados por
las proteínas de membrana proximal del receptor TIRAP (también conocida como MAL) y
TRAM. TIRAP/MAL es una proteína de membrana periférica que sondea las valvas internas de
las membranas plasmática y endosomal a través de las acciones de un dominio N-terminal de
unión a fosfoinositidos. En su extremo C, TIRAP/MAL contiene un dominio TIR, que reconoce
los dominios TIR dimerizados de la mayoría de los TLR y es necesario para la señalización por
los TLR 2, 4, 7 y 9. Es de destacar la necesidad de un dominio TIR para la señalización por
TLR. Cabe destacar que el requisito de TIRAP/MAL para la señalización TLR se observa más
fácilmente cuando se utilizan PAMP naturales como agentes inmunoestimulantes. El uso de
estímulos no naturales (por ejemplo, ADN que contiene enlaces fosforotioato) o altas
concentraciones de estímulos naturales puede eludir el requisito genético de TIRAP/MAL en la
señalización TLR. Tras el reconocimiento del PAMP por un TLR, TIRAP/MAL detecta el dominio
TIR dimerizado y estimula el ensamblaje de un gran andamio oligomérico de proteínas
citosólicas conocido como centro organizador supramolecular (SMOC). Los SMOC operan en
múltiples vías inmunitarias innatas y se consideran los principales sitios subcelulares de las
señales que impulsan las respuestas celulares a la detección microbiana. Los SMOC no están
presentes en las células en reposo, pero se ensamblan a los pocos minutos de la dimerización
de los TLR. Los SMOC que gobiernan la señalización TLR incluyen el middosoma, que está
sembrado por TIRAP/MAL y el putativo trifosoma, que puede estar sembrado por una proteína
relacionada conocida como TRAM (descrita más adelante).

El middosoma se de nió por primera vez en sistemas libres de células que medían la
estequiometría de sus componentes mínimos. Estudios estructurales posteriores ilustraron la
naturaleza helicoidal del middosoma, un tema que se extiende a los SMOC que regulan otras
vías de señalización inmunitaria innata. El núcleo del middosoma contiene múltiples copias de
la proteína MyD88 y miembros de la familia IRAK de serina-treonina-cinasas. Concretamente,
en sistemas libres de células que utilizan proteínas recombinantes, de seis a ocho moléculas
de MyD88 interactúan con cuatro moléculas cada una de IRAK4 e IRAK2. Aunque no está
claro si estas estequiometrías representan características de los middosomas naturales, los
componentes endógenos de este SMOC pueden aislarse como un complejo estable a partir de
células estimuladas con ligandos TLR. Además, el ensamblaje inducido por TLR4 de los
middosomas que contienen variantes de GFP-MyD88 se ha visualizado en la membrana
plasmática de células vivas. Mecánicamente, parece que los componentes del middosoma
están diseñados para la oligomerización, ya que los dominios TIR de los TLR y TIRAP/MAL
interactúan con el dominio TIR C-terminal de MyD88. El dominio de muerte N-terminal de
MyD88 recluta entonces a las IRAKs (que también contienen dominios de muerte). Este
andamiaje de proteínas que contienen dominios TIR y Death representa el núcleo del
midosoma. Es probable que IRAK1 también esté presente en los middosomas, aunque la
importancia relativa de IRAK1 e IRAK2 puede diferir en humanos y ratones. El apretado
empaquetamiento de las IRAKs dentro del middosoma activa su actividad quinasa latente,
fi
fi
 impulsando la autofosforilación y el subsiguiente reclutamiento de la E3 ubiquitina ligasa
TRAF6.

Dentro del midosoma, TRAF6 desempeña dos funciones. Esta enzima activa la quinasa TAK1,
que estimula las respuestas transcripcionales NF-kB mediada por la quinasa IkB (IKK) y AP-1
mediada por la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). Las actividades de estos y
otros factores de transcripción inducidos por TLR se discutirán en detalle más adelante.
Además, TRAF6 media en el reclutamiento de la quinasa TBK1 relacionada con IKK al
middosoma. La función de la TBK1 asociada al middosoma es estimular la rápida inducción de
la glucólisis que se produce a los pocos minutos de la activación del TLR. Este proceso está
mediado por la quinasa AKT (un sustrato de TBK1) y da lugar a la fosforilación de la
hexoquinasa, un regulador maestro del metabolismo glucolítico. Las consecuencias de este
cambio glucolítico temprano en la célula no están claras, pero puede servir como primer paso
en los cambios metabólicos a largo plazo que se producen. Estos cambios a largo plazo
incluyen la inhibición de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y el consiguiente
aumento de la producción de acetil-CoA, que alimenta la necesidad de modi caciones de las
histonas asociadas a actividades transcripcionales duraderas en el núcleo. Los efectos
metabólicos adicionales incluyen un aumento en la utilización de glucosa para alimentar el
énfasis en la glucólisis en las células estimuladas por TLR, cuyas consecuencias posteriores
incluyen aumentos en la producción de ATP y lípidos, que pueden reforzar la síntesis de
proteínas y las actividades secretoras asociadas con la señalización TLR. Mientras que TBK1
(y su homólogo cercano IKKε) promueve la glucólisis rápida, otros factores contribuyen a estos
efectos metabólicos, incluyendo la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y su regulador BCAP que
contiene dominio TIR aguas arriba. La relación entre la vía BCAP-PI3K-AKT y la vía TBK1- AKT
no está de nida.

No están claros los medios por los que TRAF6 coordina las actividades del middosoma que
conducen a la transcripción o a la glucólisis. De hecho, la función de TRAF6 sigue siendo un
misterio. Aunque se sabe que esta proteína funciona como una ubiquitina ligasa, sus
actividades en el middosoma se solapan con las de las ubiquitina ligasas E3 pellino-1 y 2. Las
células que carecen de estas tres enzimas no son inmunes a ellas. Las células que carecen de
estas tres enzimas son defectuosas para la ubiquitinación inducida por la interleucina-1 (IL-1)
de las proteínas componentes del middosoma, mientras que las células que carecen
únicamente de TRAF6 no son defectuosas para estas respuestas. Además, los mutantes de
TRAF6 que carecen de actividad enzimática conservan la capacidad de mediar respuestas
transcripcionales rápidas dirigidas por el middosoma, pero estas respuestas no pueden
mantenerse. Queda por de nir la importancia relativa de TRAF6 y pellino-1 y 2 en la
señalización TLR. Del mismo modo, son necesarios estudios adicionales para comprender la
importancia de las actividades enzimáticas frente a las actividades de andamiaje de TRAF6
para la señalización del middosoma. En resumen, aunque el middosoma se ha revelado como
un mediador central de la señalización por TLR, aún no se ha dado respuesta a varias
cuestiones relativas a su funcionamiento y regulación.

Además del middosoma, el putativo trifosoma funciona como un SMOC en las vías TLR. Las
de ciencias genéticas de MyD88 (u otros componentes del middosoma) anulan la señalización
por todos los TLR excepto TLR4 y TLR3. Aguas abajo de TLR4 y TLR3, se han de nido
respuestas celulares independientes de MyD88. La primera respuesta identi cada fue la
expresión de genes que codi can interferones (IFN) y genes estimulados por IFN (ISG). En
macrófagos y células dendríticas convencionales (DCs), la expresión de IFN inducida por TLR3
o TLR4 no está dirigida por el middosoma, sino que depende de las proteínas TRAM, TRIF y
TRAF3. Las pruebas apoyan la idea de que estas proteínas respectivas operan de forma
análoga a TIRAP/MAL, MyD88 y TRAF6 dentro del middosoma. Al igual que TIRAP, TRAM es
una proteína de membrana periférica que sondea las membranas plasmática y endosomal en
busca de TLR4 dimerizado. TRAM lleva a cabo esta tarea a través de las acciones de un
fi
fi
fi
fi
fi
fi
fi
dominio de localización bipartito que consiste en un motivo de miristoilación N-terminal, que
es adyacente a un motivo de unión a fosfoinositidos. Tras la detección de TLR4 dimerizado en
endosomas, se cree que TRAM interactúa con TRIF y promueve la activación dependiente de
TRAF3 de la quinasa TBK1. A continuación, TBK1 impulsa la inducción de la expresión de IFN
e ISG y también puede inducir respuestas glucolíticas similares a las que se producen cuando
TBK1 se activa dentro de los middosomas. La identi cación de un motivo pLxIS de 39
aminoácidos presente en TRIF ofrece una explicación de por qué TRIF (pero no MyD88) puede
promover respuestas IFN mediadas por TBK1. Cuando es fosforilado por TBK1, este motivo
interactúa con el factor de transcripción IRF3 inductor de IFN, que también es sustrato de
TBK1. Por tanto, TRIF, y no MyD88, tiene la capacidad de reclutar al par enzima-sustrato
TBK1-IRF3, lo que conduce a la activación de IRF3 y a la expresión de IFN. Las actividades de
TRAM para impulsar respuestas dependientes de TRIF (tri osome) están restringidas a TLR4.
TRAM no tiene capacidad para interaccionar con TLR3, ni esta proteína regula la señalización
de TLR3. No está claro si un adaptador de clasi cación similar a TRAM o TIRAP/MAL actúa
como enlace entre TLR3 y TRIF.

Las secuencias de eventos descritas anteriormente están comúnmente asociadas con la

señalización por todos los TLR en todos los tipos de células de mamíferos examinados. Así
pues, entre las características fundamentales de la biología de los TLR se incluyen las
siguientes: (1) dimerización de TLR mediada por PAMP, (2) ensamblaje de SMOC mediado por
dímeros de TLR, y (3) activación mediada por SMOC de quinasas que impulsan la
transcripción y la glucólisis. Este último punto pone de relieve la naturaleza "organizadora" de
estos centros organizadores, ya que diversos estímulos ascendentes alimentan los SMOC para
generar diversas respuestas celulares descendentes.

El lugar de la célula en el que se produce el ensamblaje del SMOC in uye signi cativamente en
la naturaleza de las respuestas efectoras posteriores inducidas por los TLR. Los estudios
sobre TLR4 ilustran un ejemplo de señalización dependiente de la localización. Mientras que
MD2- TLR4 interactúa con LPS en la super cie celular, este receptor debe translocarse (de
forma dependiente de CD14) a subdominios de la membrana plasmática conocidos como
balsas lipídicas. Las balsas están enriquecidas en fosfoinositidos, en particular fosfatidilinositol
4,5-bifosfato PI(4,5)P2, que forma interacciones de alta a nidad con el dominio de localización
de TIRAP/MAL. La translocación del TLR4 dimerizado a las balsas de la membrana plasmática
posiciona los dímeros de TLR4 unidos al ligando en proximidad a TIRAP/MAL. Estos eventos
promueven el ensamblaje de middosomas dependiente de TIRAP/MAL desde esta localización
subcelular. Se cree que TLR4 se somete entonces a endocitosis, y es desde los endosomas
donde TLR4 dimerizado se une a TRAM para iniciar la señalización dependiente de TRIF. En
particular, el proceso de endocitosis de TLR4 no está mediado por el propio TLR4. Más bien,
TLR4 es la carga para una respuesta de endocitosis inducida por LPS mediada por CD14. En
los macrófagos, CD14 se internaliza de forma constitutiva (pero lenta) en los endosomas y se
degrada en los lisosomas. Al unirse al LPS, la endocitosis de CD14 se acelera enormemente,
lo que conduce a la endocitosis coincidente de TLR4. La endocitosis de CD14 inducida por
LPS se produce normalmente en células de cientes en TLR4, pero la endocitosis de TLR4
depende estrictamente de CD14. Además, los mutantes de TLR4 que contienen dominios TIR
incompetentes para la señalización son tan capaces de endocitosis inducida por LPS como
TLR4 de tipo salvaje, estableciendo así una respuesta celular a LPS que no está mediada por
la señalización de TLR4. El proceso por el cual TLR4 es seleccionado como carga para
endocitosis no sólo depende de CD14, sino también de las acciones de MD2. Los mutantes
MD2 que se unen a TLR4 pero no pueden dimerizar TLR4 son incapaces de promover la
endocitosis inducida por LPS. Este hallazgo indica que los pares TLR4 dimerizados se
internalizan selectivamente en las células. Así pues, el dominio extracelular de TLR4 no es
simplemente un dominio de unión a ligando, sino también un motivo que promueve la
endocitosis tras la unión a ligando. Las pruebas directas que apoyan esta a rmación se
derivan de estudios que demuestran que los mutantes de TLR4 que carecen de sus dominios
fi
fi
fi
fi
fi
ff
fl
fi
fi
 citosólicos completos conservan la capacidad de ser seleccionados como carga para la
endocitosis dependiente de CD14 y MD2. Así pues, a diferencia de otros motivos bien
de nidos que promueven la endocitosis, que suelen estar contenidos en la cola citosólica de
los receptores transmembrana, el dominio extracelular de TLR4 representa su motivo de
endocitosis.

Los factores trans-actores que promueven la endocitosis TLR4 dependiente de CD14 siguen
estando mal de nidos, pero se han implicado varios. Uno de estos reguladores biosintéticos
es la enzima α1,6 fucosiltransferasa (Fut8), que promueve la fucosilación del núcleo de CD14.
En ausencia de Fut8, la capacidad de CD14 para promover la endocitosis y la señalización de
TLR4 es defectuosa, aunque estos fenotipos sólo se observan en broblastos (no en
fagocitos). En los macrófagos, el LPS estimula ujos de calcio intracelular dependientes de
CD14 que son necesarios para la endocitosis de TLR4. Los ujos de calcio pueden provenir de
múltiples fuentes, ya que la chanzima TRPM7 y el inositol 1,4,5-trisfosfato (IP(3)) están
implicados en estos eventos reguladores. Los receptores que contienen ITAM y la tirosina
quinasa Syk también están implicados en la endocitosis de TLR4 y en la expresión de IFN
dependiente de TRIF.

Esta separación de los sitios de detección de PAMP de la señalización observada en la vía

TLR4 se extiende a TLR2, TLR7 y TLR9. Recientemente se ha descubierto que las
lipoproteínas bacterianas promueven la expresión dependiente de TLR2 de un subconjunto de
ISGs, y las glicoproteínas virales pueden impulsar la expresión dependiente de TLR2 de IFNs e
ISGs en monocitos in amatorios. Los estudios que informaron de estos hallazgos di eren en
los mecanismos de señalización propuestos, pero todos concluyeron que las respuestas de
IFN de tipo I inducidas por TLR2 requieren endocitosis. Todos los estudios también informaron
de un requisito de MyD88 para las respuestas de IFN de tipo I inducidas por TLR2, pero sigue
sin haber consenso sobre cómo MyD88 puede inducir tales respuestas. El hallazgo de que
estas respuestas de IFN de tipo I dependientes de TLR2 se producen después de la
endocitosis sugiere que los middosomas de la membrana plasmática no tienen la capacidad
de inducir la expresión de IFN de tipo I, mientras que los middosomas de los endosomas
pueden estar dotados de forma única de esta capacidad. Los estudios sobre la señalización
de TLR7 y 9 subrayan esta a rmación.

La señalización de TLR7 y 9 depende de MyD88, y cuando se utilizan ligandos naturales como

los virus como estímulos, también se requiere TIRAP/MAL. Sin embargo, dependiendo del
ligando utilizado para estimular estos receptores, se inducen diferentes respuestas
dependientes de MyD88. Ciertas secuencias de oligonucleótidos de ADN CpG inducen
respuestas transcripcionales fuertemente sesgadas hacia la expresión de citoquinas
in amatorias o hacia la expresión de citoquinas e IFN. Los ADN que inducen estas diferentes
respuestas se acumulan en diferentes compartimentos endosómicos, con los ADN inductores
de IFN acumulándose en endosomas tempranos y los ADN inductores de citocinas
acumulándose en compartimentos endosómicos tardíos. Además, en las DCs plasmocitoides
(pDCs), la disrupción genética del complejo de la proteína adaptadora (AP)-3 condujo a una
disociación de la expresión de citoquinas e IFN. Estos hallazgos conducen al modelo según el
cual TLR7 y 9 inducen el ensamblaje de los middosomas y la señalización desde dos
localizaciones diferentes dentro de la red endosomal.

Aunque la conclusión de que la actividad inductora de IFN está restringida a los TLR
endosomales está respaldada por estudios de varios laboratorios, este tema parece aplicarse
únicamente a los IFN de tipo I. Los IFN de tipo III (también conocidos como IFNλ) pueden ser
inducidos por TLR situados en la membrana plasmática o en endosomas. Los IFN de tipo III
(también conocidos como IFNλ) pueden ser inducidos por TLR situados en la membrana
plasmática o en los endosomas. Los IFNs de tipo III son inducidos por un proceso
dependiente de MyD88 y parecen estar co-regulados con citoquinas in amatorias y
fl
fi
fi
fl
fi
fl
fl
fi
fl
fi
 quimioquinas, a diferencia de los IFNs de tipo I. Por ejemplo, el bloqueo de la endocitosis en
monocitos humanos impide la expresión de IFN de tipo I inducida por TLR4, pero no impide la
expresión de IFN de tipo III o citoquinas inducida por TLR4. La corregulación de las citocinas y
los IFN de tipo III por la vía TLR es probablemente más importante en las super cies de
barrera, ya que el receptor de esta familia de IFN está altamente expresado por las células
epiteliales que recubren el intestino, el pulmón, el hígado y la piel. Estudios recientes han
indicado que los IFN de tipo III promueven el refuerzo de las funciones de barrera, un proceso
fundamental para la defensa del huésped. Al igual que el proceso de in amación, la integridad
de la barrera puede considerarse una característica central de la inmunidad,
independientemente de la naturaleza de la infección. Esta sugerencia podría explicar por qué
la señalización TLR coordina la expresión de citocinas e IFN de tipo III.

Sigue siendo un misterio cómo los middosomas pueden inducir la expresión de IFN en
respuesta a algunos ligandos en algunos tipos celulares y no en otros, especialmente porque
los estudios en pDCs identi caron componentes canónicos de los middosomas (por ejemplo,
IRAK4, IRAK1 y TRAF6) en estas respuestas. En particular, la respuesta de IFN inducida en las
pDC se caracteriza por la expresión de IFNa, a diferencia de IFNb, que caracteriza las
respuestas de IFN inducidas por TLR en otros tipos celulares. La expresión de IFNα en los
pDC depende en gran medida de IRF7, mientras que las respuestas de IFNb en otras células
están dominadas por eventos dependientes de IRF3 aguas abajo de TBK1. Otra respuesta
middosómica que depende del tipo celular se produce especí camente en las células B,
donde los TLR impulsan la mitosis de estas células. Otros tipos celulares no vinculan la
señalización TLR a la división celular. Al igual que la expresión de IFN en los pDC, la respuesta
mitótica a los ligandos TLR en los linfocitos B depende de los componentes canónicos del
middosoma, lo que hace aún más curiosas estas observaciones. La señalización TRIF
descendente de TLR4 también muestra actividades especí cas del tipo celular (o de la
especie). Por ejemplo, la señalización de LPS promueve la liberación de IL-1β a partir de
monocitos humanos y porcinos. Este proceso está mediado por CD14, TLR4, TRIF y el
regulador del in amasoma NLRP3. Los macrófagos humanos derivados de monocitos y los
macrófagos murinos son incapaces de vincular la señalización TLR4-TRIF a la liberación de
IL-1β. Es posible que existan reguladores especí cos del tipo de célula y/o de la especie que
doten a estos SMOC de la capacidad de diversi car las respuestas efectoras que pueden
inducir los TLR.

Esta diversidad de funciones efectoras inducidas por los middosomas no sólo puede
demostrarse diseccionando el comportamiento en contextos naturales, sino también mediante
el uso de la biología sintética. Por ejemplo, los middosomas se han diseñado para que
contengan el motivo pLxIS inductor de IFN añadido a MyD88. Cuando se introducen en las
células, estos middosomas sintéticos inducen potentes respuestas de IFN a estímulos
naturales. Del mismo modo, los middosomas pueden diseñarse para vincular la señalización
TLR a la inducción de la necroptosis, una vía de muerte celular rápida que se produce
independientemente de la actividad de las caspasas. El hallazgo de que los middosomas
muestran una exibilidad de señalización natural y programable explica probablemente los
principios de diseño comunes que operan en otros SMOC del sistema inmunitario innato. De
hecho, los in amasomas también se han diseñado para inducir respuestas celulares no
naturales mediante estrategias similares a las utilizadas para diseñar nuevas actividades de los
middosomas.

Además de las vías TLR y los receptores que estimulan las actividades del in amasoma, las
vías del receptor TNF, las vías del receptor similar a RIG-I (RLR) y las vías cGAS-STING (todas
las cuales promueven la in amación) utilizan los SMOC como orgánulos de señalización. En
concreto, las proteínas que se sitúan en el vértice de cada una de estas vías siembran el
ensamblaje de una plataforma de señalización oligomérica receptor-proximal. Se ha propuesto
una posible explicación para el uso común de los SMOC en la transducción de señales
fl
fl
fl
fl
fi
fi
fi
fi
fi
fl
fl
fi
inmunitarias innatas. Se cree que la naturaleza oligomérica de estos orgánulos de señalización
aumenta el umbral para la activación de enzimas efectoras, creando así la posibilidad de
respuestas celulares de todo o nada a la activación del receptor. Las imágenes en tiempo real
y los análisis transcripcionales basados en sistemas de células estimuladas con ligandos TLR
subrayan la probabilidad de que esta hipótesis sea correcta. Por ejemplo, el análisis unicelular
de la translocación de NF-κB al núcleo inducida por TLR demostró que el aumento de la dosis
de PAMP no cambia la tasa de translocación del factor de transcripción. Más bien, el aumento
de la dosis cambia el porcentaje de células que permite la translocación de NF-κB. El análisis
de secuenciación del ARN unicelular reforzó esta idea, ya que el aumento de la dosis de LPS
utilizada para estimular a los macrófagos no modi có la cantidad de transcritos de citoquinas
en cada célula. Más bien, el cambio de la dosis de LPS alteró el porcentaje de células que
indujeron ARNm de citoquinas. Por lo tanto, parece que las respuestas celulares a los ligandos
TLR están diseñadas de forma natural para una respuesta de todo o nada a los encuentros
microbianos. Este tipo de respuesta puede verse facilitada por actividades de oligomerización
que permiten que un pequeño número de TLR dimerizados (quizás sólo un par de TLR)
induzcan el ensamblaje y la señalización de los middosomas.
fi