0524 랩미팅 발표

Development of an efficient vitrification method

for chondrocyte sheets for clinical application
Asuka Hayashi a, Miki Maehara b, Ayuko Uchikura a, Hitomi Matsunari a,c, Kazuaki Matsumura d,
Suong-Hyu Hyon e, Masato Sato b,c, Hiroshi Nagashima
Introduction
• 연골세포 시트를 이용한 재생 치료는 osteoarthritis(골관절염) 치료에 효과가 있음이 보고됨

• 연골세포 시트의 장기 보존과 운송을 위해서는 냉동 보존 기술이 필수적

• 본 연구는 임상 적용을 위한 실용적인 연골세포 시트 냉동 보존 기술을 개발하고자 함

• 이전에 개발된 vitrification 방법은 복잡하여 일상적인 임상 적용에 어려움이 있었기 때문에
이를 간소화하고 실용화하는 것이 목표

• 개발한 방법들을 토끼 연골세포 시트의 vitrification을 기반으로 실험 진행 후 결과 보고

Materials and methods

(a) circulating vitrification bag

- 연골세포 시트를 위생적이고 효율적으로 처리할 수 있는 용기로 개발됨

- 폴리에틸렌 bag에 다양한 용액을 주입하고 배출할 수 있는 관이 부착되어 있음

- 세포 시트를 나일론 메시 사이에 넣어 고정한 후 백에 삽입하여 유리화 과정이 진행됨

- 회전 진동 장치에 부착하여 용액을 순차적으로 주입 및 배출하며 vitrification 진행

- 연골세포 시트의 vitrification을 실용적으로 활용할 수 있도록 설계됨

• 순환 유리화 백은 세포 시트의 유리화를 위한 용기로, 유리화 전후
과정에서 용액을 순차적으로 세척할 수 있게 해줍니다. 세포 시트
는 두 개의 나일론 망 사이에 끼워지고, 공기를 제거한 후 지퍼를
닫아 백에 삽입되었습니다. 쉐이커에 부착된 백에 다양한 용액이
주입되고 배출되었습니다. 세포 시트는 평형 용액, 유리화 용액에
차례로 노출되었으며, 액체 질소 증기에 의해 유리화되었습니다.
재가열은 가열 플레이트와 사전 가열된 젤 팩을 사용하여 빠르게
진행되었고, 이후 재가열, 희석, 세척 과정을 거쳤습니다. 세포 시
트는 나일론 망에서 제거된 후 생존율 평가를 위해 효소 처리되었
습니다.
Materials and methods
⒝ vitrification storage box
- 연골세포 시트의 장기 보존과 운송에 유용한 장치로 개발 됨

- 장기간 안정적으로 유리화 상태를 유지할 수 있도록 설계 됨

Materials and methods
⒞ Vitrification and rewarming procedures
- 일본 백색 토끼 연골세포 시트를 사용하여 유리화 및 rewarming 후 구조적 특성과 세포 생존
율을 평가

- 다양한 용액을 사용하여 단계별로 유리화 및 rewarming 과정을 진행

• 유리화 및 재가열 용액은 이전 보고서【4】에 따라 준비되었습니다.
기본 용액으로 20% 송아지 혈청이 첨가된 HEPES(20 mM)-완충 조
직 배양 배지-199를 사용했습니다. 투과성 냉동보호제로는 DMSO
와 에틸렌 글리콜(EG)을 사용했으며, 비투과성 냉동보호제로는 설
탕과 카르복실화된 폴리-L-리신을 사용했습니다. 평형 용액은 10%
DMSO와 10% EG를 기본 용액에 혼합하여 만들었고, 유리화 용액
은 20% DMSO, 20% EG, 10% 카르복실화된 폴리-L-리신, 0.5 M 설탕
을 포함하여 준비했습니다. 재가열 용액과 희석 용액은 각각 1 M
과 0.5 M 설탕을 포함하여 준비했으며, 기본 용액은 세척 용액으
로 사용했습니다. 유리화 용액은 얼음 위에서 차갑게 사용되었고,
다른 모든 용액은 실온(24~27°C)에서 사용되었습니다.
Procedure
1. 연골세포 시트 준비:

1. 일본 흰 토끼의 무릎 연골에서 얻은 1차 배양 세포를 사용했습니다.

2. 세포를 온도 반응성 배양 접시에 플레이트하여 단층 세포 시트를 형성했습니다.

3. 두 개의 세포 시트를 겹쳐 이중층 시트를 형성한 후 추가 배양했습니다.

2. 유리화 및 재가온 용액 준비:

1. 다양한 농도의 DMSO와 EG를 포함한 용액을 준비했습니다.

2. 세포 보호를 위한 Sucrose and carboxylated poly-L-lysine을 사용했습니다.

Procedure
1. 순환 유리화 백 방법:

1. 세포 시트를 나일론 메시 사이에 넣어 순환 유리화 백에 삽입

2. 회전 진동 장치에 부착하여 용액을 순차적으로 주입 및 배출하며 유리화 과정을 진행

3. 액체 질소 증기(약 -150°C)에 노출하여 급속 냉각

4. 재가온 시 45°C 가열판과 38°C 젤 팩을 사용하여 빠르게 가온

2. 비교를 위한 envelope 방법:

1. 기존에 보고된 방법으로 세포 시트를 알루미늄 호일에 싸서 유리화 및 재가온

Result①
구조적 완전성 유지:

1. 순환 유리화 백을 사용한 모든 샘플(n=7)에서 연골세포 시트의 구조적 완전성이 유지됨

2. 유리화된 샘플은 비유리화 샘플과 유사한 세포 생존율을 보였습니다(유리화 샘플: 91.0

± 2.9%, 비유리화 샘플: 90.0 ± 3.0%).

세포 외기질 유지:

유리화된 연골세포 시트는 프로테오글리칸과 II형 콜라겐의 밀집된 분포를 유지함

• 순환 유리화 백 방법을 사용하여 토끼 연골 세포 시트를 유리화하고, 재가열 후 시트 구조의 무결성 및 구성 세포의 생존율
이 조사되었습니다. 모든 유리화된 시트(n=7)는 시각적인 손상이 없었으며 비유리화된 세포 시트와 동일한 외관을 보였으
며, 평균 세포 생존율은 91.0 ± 2.9%였습니다(Table 2). 이 세포 생존율은 겹침 방법으로 유리화된 세포 시트(n=7; 89.5 ± 1.4%)
및 비유리화된 대조군(n=7; 90.0 ± 3.0%)의 생존율과 동일했습니다.

• 또한, 유리화 및 재가열 후 회복된 세포 시트의 일부는 histochemical 염색 및 immunostaining을 사용하여 프로테오글리칸 및
2형 콜라겐의 분포를 조사하기 위해 분리되었습니다. 겹침 방법으로 유리화된 세포 시트 및 비유리화된 세포 시트와 유사
하게, 순환 유리화 백 방법으로 유리화된 세포 시트는 조직 단면 전체에 강한 사프라닌-O 염색을 보였습니다. 이러한 결과
는 프로테오글리칸이 연골 세포 시트 전체에 밀집되고 균일하게 분포되어 있음을 나타냈습니다. 또한, 세포 시트는 2형 콜
라겐의 균일하고 풍부한 분포를 보였습니다. 이러한 데이터는 순환 유리화 백 방법을 사용한 세포 시트의 외세포 매트릭스
가 cryopreservation 이후에 유지되었음을 보여주었습니다.
Result②
장기 보존 후에도 높은 생존율:

유리화 저장 상자를 사용한 장기 보존 후에도 세포 시트는 높은 생존율을 유지함(유리화

샘플: 81.2 ± 1.0%, 비유리화 샘플: 84.3 ± 1.8%).
유리화 보관 상자를 사용하여 토끼 연골 세포 시트를 장기
보관하고, 재가열 후 세포 시트의 구조 및 세포 생존율이 평
가되었습니다(Table 3). 액체 질소 용기 내 LN 증기에서 1개
월 및 6개월 동안 저장된 유리화된 세포 시트에는 시각적인
손상이 없었습니다(Fig. 4). 또한, 1개월 및 6개월 동안 보관
된 후의 세포 생존율(각각 79.2 ± 2.6% 및 81.2 ± 1.0%)은 유
리화 후 즉시 재가열된 세포 시트(80.1 ± 2.5%) 및 비유리화
된 대조군(84.3 ± 1.8%)과 동일했습니다.
Conclusion
• circulating vitrification bag 은 유리화 연골세포 시트를 임상적으로 적용하는 데 효과적인 접
근법임을 말함.

• vitrification storage box는 vitrification cell sheet의 장기 보존에 유용하며, 이는 연골세포 시트

의 냉동 보존 임상 적용 가능성을 더욱 높여줌.

• 이러한 방법들은 연골세포 시트 치료의 임상적 적용을 확대하고 산업화를 촉진하는 데 기여

할 수 있음.