PyroGen® rFC 特刊

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拯救內毒素測試的未來
PyroGene® rFC
Recombinant Factor C (rFC) Endotoxin Detection System

什麼是 PyroGene® 從兔子到鱟 - 內毒素偵測的歷史

®
PyroGene 是偵測內毒素的一項新方法，它是 自從製藥工業開始製造血管注射劑開始，熱原
利用基因重組技術所製成的重組 C 蛋白 檢測就是一個必須的工作，因為過高的熱原注
(recombinant Factor, rFC)，當重組 C 蛋白被內毒 射進入人體，會造成發熱、休克、甚至死亡。
素的活化作用啟動後，經由單一步驟的終端測 在整個 20 世紀，兔子熱原實驗一直都是測試
試(End-Point)，可估算酵素造成的螢光基質裂 熱原的標準方法，延用至今。這個實驗需要將
解，進而測出內毒素的含量。 產品樣本注射進入兔子的耳朵，如果兔子體溫
PyroGene®和所有的 LAL 實驗一樣具有偵測內 升高，則確認樣本內有熱原存在。
毒素的能力，其可偵測範圍也和其他定量 LAL 1970 年間，LAL 實驗逐漸被商品化。到了
實驗相去不遠。然而，和一般 LAL 實驗不同的 1977 年 11 月 4 號，美國食品及藥物管理局
是 ， 它 的 Factor C 並 非 取 自 鱟 (Horseshoe (FDA)正式發佈一項公告，對於注射於動物或人
Crab)，而是利用人工重組蛋白，這種做法提供 體的針劑，包括生物性產品及醫療器材，將
了幾項顯著的優點，特別是…… LAL 列入成品放行的內毒素正式測試方法。
＊ 不需要由鱟身上取血。 FDA 解釋，“LAL 被廣泛認為較兔子熱原測試來
＊ 降低每批試劑間的差異性。 的快速且經濟實惠，只需要少量的樣品即可完
＊ 提供較 LAL 實驗更明確的內毒素偵測。 成。此外，由於 LAL 的實驗較兔子熱原實驗操
＊ 不含鱟血，鱟血會在不含內毒素的狀態 作簡易，可以在一天內完成多組試驗。”
下造成偽陽性反應。 為了取得 LAL 實驗所需的試劑，人們從海底
捕捉鱟(Horseshoe Crab)，從牠們身上抽取少量
血液後，再將其毫髮無傷的放回大海，接著分
離溶解鱟血中的變形細胞，以取得細胞中的蛋
白質。
由於 LAL 方法成為多數使用者普遍偏好的熱
原測試實驗，而各種不同的實驗方法也漸漸開
始發展，每一種方法都有其特殊的優點。舉例
來說，LAL 凝膠法(PYROGENT®)提供簡易的定
性結果(陰性/陽性)。基質終點比色法
Assay Priciple of LAL & rFC (PyroGene) (Chromogenic End-point LAL, OCL-1000®)操作簡
單，提供定量結果，和一般利用蛋白質凝集的 還在穴中未孵化的卵翻至地面。所以在很多區
實驗方法相較下干擾也較少。動力比濁法 域，海灘上充滿大量的鱟卵。這些卵變成了紅
(Kinetic Turbidimetric, PYROGENT-5000®) 提供 腹濱鷸及其他從南非飛到加拿大北邊、途中經
定量結果，但其原理與凝膠法相致，也限制了 過德拉威海灣的候鳥的食物來源。紅腹濱鷸會
它與產品樣本的相容性，干擾比較大。但針對 在德拉威海灣停留兩個星期，並吃下近百萬顆
水質樣品的測試，動力比濁法不失為一個經濟 鱟卵，這一點也不誇張。儘管鱟產下了為數上
實惠的選擇。動態基質比色法(Kinetic-QCL®)提 億的卵，自然界仍發揮了它的平衡機制，幾世
供了自動化技術及更高的測試敏感度，可達 紀以來環境都未受到干擾，但不幸的是，這個
0.005EU/ml，更適用於廣泛的檢體樣品及大量檢 事實卻早已發生改變。
測數量的使用。
近期，幾乎所有國家藥典，包含美國食品藥物
管 理 局 (FDA) 、 美 國 藥 典 (USP) 、 歐 洲 藥 典
(EP)、日本藥典(JP)都認可了所有內毒素偵測方
法。
今日，鱟的族群數量遭到威脅
因為鱟仍保有三億年前的原貌，未發生演化，
所以被稱為“活化石”。在美國，鱟的族群分布範
圍北至緬因州，南至墨西哥猶加敦群島，在大 有資料顯示，鱟的族群數量，以及依賴鱟卵為
西洋沿岸中部，特別是德拉威海灣，數量最為 食的紅腹濱鷸，在 1990 年開始大量銳減。這個
密集。 問題可歸因於幾個因素：
在美國，鱟為鰻魚和海螺的主要用餌。相較於
用於 LAL 工業的低死亡率，用於此用途的鱟，
死亡率為 100%。基於鱟用於餌的使用量從一年
幾百隻到 1970 年代的一年數萬隻，美國政府於
是對鱟的使用量訂出限額。
也有人認為，鱟對海灘的高使用率，造成可築
巢的地點減少。
地球暖化造成南北極冰山的快速融化崩解，也
間接造成海水濃度的劇烈變化，而在鱟的不同
成長過程中對海水鹽分濃度有極度的特殊要
求，生育期約 0.7%，成長期約 0.5%，也因此而
受到很大的影響。
每年春天的漲潮期間，數以千計的鱟迴游至大 另外，偶發性的自然災害或是人為破壞也會影
西洋沿岸中部產卵。在德拉威海灣附近，五月 響到鱟的生存條件，譬如 2010 年發生的墨西哥
到六月的新月及月圓漲潮期為產卵的高峰期。 灣石油漏油事件，其後續影響層面也備受到關
在求愛期間，公鱟會緊緊扣住母鱟背上的甲 注。
殼，然後母鱟將公鱟推向漲潮線，並在此受
環境保護團體擔心，種種現象已危及鱟的生命
精。之後，母鱟在漲潮線挖洞，產下每次近
週期，並且連帶影響到候鳥的食物來源需求。
20,000 顆體積小巧、呈現微綠色的卵。鱟離巢
針對此現象，已頒布漁業限制，減少捕撈用來
時，海浪沖刷沙子，將卵覆蓋。小鱟將在下一
製餌的鱟。此外，相關單位已著手研究鱟的族
個漲潮期被孵化，然後藉由海浪被帶進海裡。
群數量穩定性。我們無法確定，在將來捕鱟的
每年春季，這個生命週期在大西洋沿岸中部週
限制會變得多麼嚴格。
而復始。
儘管 LAL 工業從鱟身上採血的方法致死率非
當產卵季節過去，母鱟會挖掘之前的巢穴，將

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常低，根據獨立研究顯示只有 7%，但隨著商業 憂的偽陽性反應，不但須另外增加阻抗劑費
需求的快速增加，其對鱟的需求數量也在逐步 用，也會造成實驗人員的許多額外工作。但因
攀高。近期，漁業規範相關單位討論顯示，將 為 rFC 只針對內毒素反應，不會對 Glucan 多醣
來鱟的使用限制可能衝擊 LAL 製造商，假如鱟 體反應，所以不會產生偽陽性反應。(見圖 2)
的數量繼續減少，可能就無法繼續穩定的供應
LAL 製造商利用。製藥工業、醫材工業及許多
必須依賴 LAL 測試產品才能上市的工業，將需
要其他替代方案。未來，若是鱟的生態產生變
化，使用限制更加嚴格時，利用基因工程所研
製 PyroGene®將會是您測試內毒素時唯一可以信
賴的選擇。

PyroGene®改善了內毒素偵測試驗
可預測的實驗表現
根據 LAL 的生物特性，動物血中的差異，例 圖 2：Glucan 多醣體在動力比色法與 rFC 螢光法
如季節性差異和環境因素，常引起商品批次間 的比較。無論有沒有加阻抗劑，rFc 螢光法不會產
的不穩定，而導致最終成品的變異。由於 rFC 生偽陽性反應，可見其對內毒素的專一性。

試驗是利用重組的 C 蛋白(rFC)，它保留了所有 和其他 LAL 試驗不相上下的偵測能力

LAL 測試中使用者熟知的內毒素反應性。然 為了證明 rFC 偵測內毒素的能力，Lonza 針對
而，且因為試劑中只含有 rFC，並無其他傳統 不同品種的細菌做了研究。圖 3 包含了 rFC、動
LAL 反應序列中所含有的干擾因素，所以更能 態比色法(Kinetic Chromogenic LAL)和動態比濁
掌握實驗品質，批次間的穩定性更高，測試結 法(Kinetic Turbidimetric LAL)等比色法對不同來
果的再現性也更好。這對執行陽性產品對照組 源的純內毒素作出的實驗結果。結果顯示了 rFC
(Positive Product Controls, PPCs)測試時，更能帶 和其他比色法相似，都可從不同來源的物質中
來更好的再現性及較少的回收率變異性。(見圖 辨別出內毒素，由此可證明 rFC 具有和其他
1) LAL 方法相抗衡的內毒素偵測能力。

圖 1：利用 8 個批次的標準液所產生的標準曲線， 圖 3：不同類型之內毒素在不同方法中的結果，可見

在 0.01-10EU/mL 間呈現很好的線性關係，其中螢 rFc 螢光法與其他方法表現不差。
光(RFU)對數值與內毒素(EU/mL)呈穩定對比。
和其他試驗相當的內毒素回收率
rFC 試驗具有內毒素專一性
Lonza 對於已知量的內毒素回收率也同樣做了
利用 LAL 的內毒素偵測試驗時最叫人傷腦筋 比較。我們的全球性、各中心的研究包含了利
的是在 LAL 有兩個酵素反應路徑，分別由內毒 用動態比色法和 rFC 對 10 種製藥或相關產品做
素及 Glucan 多醣體觸發反應。由 Glucan 多醣體 了測試。這些多中心的待測樣品包含了注射用
所引起的陽性反應，是 LAL 試驗中最為叫人擔 水 、 乳 酸 化 林 格 式 注 射 液 (Lactated Ringer’s

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USP) 、 0.9% 氯 化 鈉 注 射 液 (0.9% Sodium 新世紀、新科技
Chloride Injection USP) 、 紅 血 球 生 成 素 以 LAL 為基礎的測試方法持續主導了實行內
(Erythropoietin) 、 25% 人 類 血 清 蛋 白 溶 劑 毒素偵測實驗的品管實驗室。鱟的祖先及牠們
(Albumin Human USP 25% solution)、萬古黴素 的血液凝集系統可追朔到數千萬年前。所以，
(Vancomycin HCI USP) 及 血 液 透 析 液 LAL 實驗方式的革新事實上在遠古之前早已打
(Homodialysate)。每一項產品都使用 0.1EU/ml 下基礎。人類花了一些時間研發並在技術上不
的內毒素作回收測試，並在六個不同的地點、 斷超越，鱟也將在未來繼續支援我們內毒素的
各由三個操作者進行動態比色法以及 rFC 試 偵測科技。LAL 試劑中，C 蛋白(Factor C)是鱟
驗。圖四說明了回收測試的回收結果，除了血 血中對內毒素十分敏感的反應酵素，而利用基
清蛋白之外，結果都合乎美國藥典所限定的 因重組技術所製成的重組 C 蛋白(recombinant
50%~200%允收範圍(3)。 Factor，rFC)，螢光法 rFC(Pyrogene® rFC)便由
Lonza 另外做了一項研究，利用動態比濁法， 此發展而來。
以 0.1EU/ml 的內毒素對注射用水作回收測試。 螢光法 rFC 為 LAL 試驗寫下的革命性的一
在同一地點、由三個操作者進行實驗。表格 1 頁，它和其他使用比色法的內毒素測試方式一
顯示了 rFC 內毒素回收測試的偵測能力和其他 樣，都需依照美國藥典<1225>“確效簡要程序”
方法大致相同。 的 規 範 使 用 。 美 國 藥 典 論 壇 (Pharmacopeial
總而言之，針對內毒素回收測試能力，無論是 Forum)在 2010 年(Vol.36(1)[Jan.-Feb. 2010])發表
水或是其他樣本，rFC 和其他 LAL 方法皆不相 了 PyroGene®與現行藥典所許可的方法的比較數
上下。 據，確實允許 PyroGene®使用在最終產品放行的
Chromogenic Turbidimetric rFc
內毒素測試。歡迎來函索取相關文件。
Average
0.092 0.112 0.105
EU/mL PyroGene® 象 徵 了 長 久 以 來 技 術 革 新 中 的 未
Standard 來，它提供：
0.009 0.009 0.012
Deviation
＊ 更強的內毒素特異性
表格一：0.1EU/ml 的內毒素對注射用水作回收測試。
＊ 每批產品間的一致性
標準曲線合乎線性要求 ＊ 不會和 Glucan 多醣體產生反應
一個美國藥典可接受的測試方法，所得到的結 ＊ 不依賴鱟的使用
果必須和待測物的濃度成比例(2)。同樣的，內毒 PyroGene®呈現了除了 LAL 之外，另一項可信
素測試也須經相關系數去證明其線性數據。表 賴、並且對環境有利的新選擇。
格 2 整理了多個實驗中心的 18 組 rFC 標準曲線
之線性迴歸，每一條標準曲線都是由 4 個內毒
素標準組成(0.01、0.1、1.0 和 10EU/ml)，每組
皆三重複。這 18 條標準曲線的相關係數都較美
國食品藥物管理局對內毒素定量測試所要求的
規格 0.980 來的精確(4)。 Recombinant Factor C (rFC)
Standard Curve Range
Mean CV%
Characteristic Min Max
Correlation 0.996 0.1% 0.995 0.998
Slope 0.865 1.9% 0.831 0.901
Y-intercept 3.398 1.1% 3.307 3.450
表格二：由 6 個實驗室試驗，總共 18 組標準曲線所
統計的線性迴歸數據。

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