NM ISO 22718 Norme Marocaine 2008 Indice de classement NM 03.5.149 Cosmétiques Microbiologie Détection de Staphylococcus aureus Norme Marocaine homologuée Par arrété du Ministére de "Industrie, du Commerce et des Nouvelles ‘Technologies N° 2736-07du 7 Janvier 2008, publ 21 Février 2008. 1 B.O n° 5606 du Correspondance La présente norme reprend intégralement la norme ISO 22718/2006. Modifications Examinée et adoptée par Ie comité technique de normalisation des produits Whygiéne, de nettoyage et de désinfection Editée et diffusée par le Service de Normalisation Industrielle Marocaine (SNIMA) © SNIMA 2008 ICS : 71.100.70NM ISO 22718 2008 Indice de classement NM 03.5.149 A Droits d'auteur N réservés sauf Prescription diferente aucune partie de cette publication ne peut étre reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé 6lectronique ou mécanique y compris la photocopie et les microfilms sang accord formel. Ce document a8 Usage exclusif et non collectif des Clients de |'IMANOR, Toute mise en réseau, reproduction et rediffusion, sous ‘ous droits réservés aa/eapeai gt Rue Dad Secteur 2 hay Rind “Raber © IMANOR 2016 — an 272719 48/89/5/52-Faxsos sre malt: normalisaton@imanorgegiISO 22718:2006(F) Sommaire Page Avant-propos Introduction 1 Domaine d'application. 2 _Références normatives Termes ot definitions... Principe... Diluants et mil Généralités Seon Diluant pour la suspension bactérioni Milieux de culture.. Appareillage et verrerio. ux de culture ne (Solution de tryptone et de chlorure de sodium). Souches de microorganismes.. Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire .. 9 Mode opératoire. 9.1 Recommandations générales . 7 esareenen 82 Préparation de la suspension initiale dans le milieu liquide d'entichiseoment, 83 Incubation du milieu liquide d'enrichissement ensemencé esi 9.4 Détection et identification de Staphylococcus aureus... 10 Expression des résultats (détection de Staphylococcus aureus) 11 Neutralisation des propriétés antimicrobionnes du produit. HA Généralités nu bi 7 11.2 Préparation de inoculum... 14.3 Validation de la méthode de recherche... 12 Rapport des: Annexe A (informative) Autres Annexe B (informative) Neutralisants de activité antimicrobienne des conservateurs et liquides de ringage... ‘ os a « eux. Bibliographie.. 2000 ~ Tous dais reserves iiISO 22718:2006(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de TISO), L'élaboration des Normes intemationeles est en général confiee aux comités techniques de ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire parte du Comité technique créé a cet effet. Les organisations intemationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec IISO participent également aux travaux. LISO collabore étroitement avec ‘a Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui conceme la normalisation électrotechnique, Les Normes intemationales sont rédigées conformément aux régles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tache principale des comités techniques est délaborer les Normes intemationales, Les projets de Normes intemationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres. pour vote. Leut Publication comme Normes internationales requiert approbation de 75% au moins des comités membres votants, Guatantion est appelée sur le fat que certains des éléments du présent document peuvent faire lobjet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait étre tenue pour responsable de ne as avoir identifié de tels droits de propriété et avert de leur existence, UISO 22718 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques. v ©180 2008 Tous dots réservésISO 22718:2008(F) Introduction Be namens microbiologiques des produits cosmétiques doivent ate réalisés conformément a une analyse Ge risque eppropriée afin de garantir leur qualité et la sécurité des consommateurs, analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs parametres tels que — altération potentielle des produits cosmétiques, — Ie caractére pathogene des microorganismes, — lesite dapplication du produit cosmetique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc), — la catégorie dutlisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans). Gout les cosmétiques et autres produits topiques, la détection agents pathogénes pour la peau tele que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans peut etre lusts. Le vechertne autres sortes de microorganismes peut aussi présenter un interét car coux-ci (y compris des iaieteurs og ceoramination fécele, par exemple Escherichia col) laissent penser & une défaillance de hygiéne au cours do processus de fabrication, ©180.2008 — Tous crots reservés180 22718:2006(F) NORME INTERNATIONALE —_—)1. ems Cosmétiques — Microbiologie — Détection de Staphylococcus aureus 1 Domaine d'application La présente Norme intemationale donne des lignes directrices générales pour la détection et identification du microorganisme spécifié Staphylococcus aureus dans les produits cosmétiques. Les microorganismes considérés comme spécifiés dans la présente Norme intemationale peuvent différer d'un pays a Tautre, suivant les pratiques ou réglementations nationales Pour garantir la qualité du produit et la sécurté des consommateurs, il est préférabir deffectuer une analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relevent de la Présente Norme internationale, Les produits considérés présenter un faible risque microbiologique ‘comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, ceux ayant des valeurs de PH extrémes, etc, La méthode décrite dans la présente Norme internationale repose sur la détection de Staphylococcus aureus dans un milieu liquide non sélectif (milieu liquide d'enrichissement), suivie de son isolement sur un milieu {gelosé sélectif. D'autres méthodes peuvent étre appropriées en fonction du niveau de detection exigé NOTE Pout la détection de Staphylococcus aureus, il ast possible de réaiser des sous-cullures sur des mieux de culture non sélectfs avant de procéder aux étapes appropriées identification (en uliisant, par exemple des hic diidentincation), En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans le présent domaine d'application, il se aut que la présente méthode ne soit pas adaptée, en tous points, a quelques produits (par exemple certains Produits non miscibles a 'eau). Une autre Norme internationale (t1SO 18415 (10) peut convenir. Il est possible die remplacer les essais présentés ici par autres méthodes (automatisées, par exemple) sous reserve que leur equivalence ait été démontrée ou que le méthode ait été validée par ailleurs, 2 Références normatives Les documents de référence suivants sont indispensables pour application du présent document. Pour les références datées, seule 'édition citée s‘applique. Pour les références non dalées, la demnisre édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements), 1S0 21148:2005, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des souches microbiennes utilisées our la détermination de V'activité bactéricide et fongicide 3 Termes et définitions Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants e'appliquent. 34 produit Portion d'un produit cosmétique identifé, recue au taboratoire pour essais © 180 2008 Tous srots reserves180 22748:2006(F) 3.2 échantillon Portion du produit (au moins 1 g ou 1 mi) utilise dans essai pour préparer la suspension initiale 33 ‘suspension initiale ‘suspension (ou solution) de 'échantilon dans un volume défini d'un milieu liquide c'enrichissement approprié 34 dilution(s) de 'échantilion dilution(s) de la suspension initiale 5 roorganisme spécifié bactérle aérobie mésophile ou levure dont la présence dans un produit cosmétique est indésirable parce Quelle est reconnue comme une espéce pathogane pour la peau susceptible d'étre néfaste pour la santé humaine ou parce que c'est un indicateur de défaillance de Ihygiéne dans le processus de fabrication 36 Staphylococcus aureus cocci Gram positif, principalement regroupés en grappes, colonies lisses généralement pigmentées en jaune NOTE 1 Les principales caracteristiques pour Videntification sont es suivantes: croissance sur milieu sélectt spécifique, catalase positive, coagulase postive. NOTE? _Siephylococcus aureus est une bactérie pathogéne opportuniste chez thomme, qui peut également étre Présonte sur a peau dindividus sains sans engender de troubles, Sa présence est indesirable dans les predults Cosmétiques en raison de son caractére potentilloment pathogene, a7 milieu liquide d'enrichissement milieu liquide non sélectif contenant des neutralisants etlou agents dispersants appropriés, validé pour Ie produit soumis & essai 4 Principe La premiére étape du mode opératoire est de procéder a lenrichissement en utilisant un milieu liquide non sélectif pour augmenter le nombre de microorgenismes, de facon a éviter le risque dinhibition per les ingrédients sélectifs présents dans les milioux de culture sélectitsidifférentiels, La seconde étape de essai (isolemient) est réalisée sur un milieu sélectif, avant les essais d'dentification Linhibtion potentielle de la croissance microbienne par féchantillon doit étre neutralisée pour permettre la recherche des microorganismes viables |"l. Dans tous les cas et quelle que soit la méthode employes, la eutralisation des propnétés antimicrobiennes du produit doit étre vérifiée et validée [2 [I 5 Diluants et milieux de culture 5.1 Généralités Des instructions générales sont données dans TISO 21148. Lorsque [2 présent document mentionne ‘utilisation d'eau, utiliser de eau distilée ou de l'eau purifiée comme spécifié dans ISO 21748, Le milieu liquide d'enrichissement est utilisé pour disperser 'échantilon et pour augmenter la population Imicrobienne initiale. I peut contenir cles neutralsants si 'échantillon & soumettre a essai possede des Propriétés antimicrobiennes. Liefficacité de a neutralisation doit étre démontrée (voir Article 11), Annexe 8 fournit des informations relatives aux neutralisents appropriés, ai 18 180 2008 Tous artis reservesISO 22718:2006(F) Le milieu liquide d'enrichissement suivant peut étre utilisé pour vérifer la présence de Staphylococcus aureus conformément a la présente Norme internationale, & condition davoir été validé conformément a lAvticle 11 Diautres diluants et milieux de culture sont utiisables ella ét8 démontré que leur emploi convient. 5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de sodium) 5.24 Généralités Le diluant est utilisé pour préparer la suspension bactérienne utlisée pour la validation (voit Article 11) 5.22 Composition — tryptone, peptone de caséine 109 — chlorure de sodium 85g — eau 1.000 mi 5.2.3 Préparation Dissoudre les composants dans eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipionts appropriés. Stériliser a autoclave 4 121 °C pendant 15 min Aprés stérilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,0 0,2, le mesurage étant effectué & température ambiante. 5.3 Milieux de culture 53.4 Généralités Les milieux de culture peuvent éire préparés comme indiqué ci-dessous ou a partir de milieux de culture déshydratés conformément aux instructions du fabricant. II convient de suivre les instructions données par le fournisseur de ces milieux, NOTE est possible dutliser des milieux préts & emploi quand leur composition et/ou leurs performances do croissance sont comparables & celles des formules indiquées ici 5.3.2, Milieu gélosé pour validation (voir Article 11) milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja (SCDA) ou gélose trypto-caséine soja (TSA) 5.3.24 Composition — peptone de caséine 1809 — peptone de soja 509 = chlorure de sodium 509 — geldagar 16.09 — eau 4.000 mi © 180 2006 ~ Tous drits réservésISO 22718:2006(F) 53.22 Préparation Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans Teau en mélangeant tout en chauffant, Répartir dans des récipients appropriés. Steriiser & l'autoclave & 121 °C pendant 15 min Aprés stérlisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,3 + 0,2, le mesurage étant effectué & température ambiante, 5.3.3 Milieu liquide d’enrichissoment 5.3.3.1 Bouillon Eugon LT 100 53.34.41 Généralités Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l'échantillon: lécithine et polysorbate 80 ainsi qu'un agent dispersant: octoxynol 9 5.3.34.2 Composition — peptone de casdine 1609 — peptone de soja 509 — Leystine 079 — chlorure de sodium 409 — sulfite de sodium 029 — glucose 589 — leeithine dceut 1.09 — polysorbate 80 509 — octoxynal 8 1.09 — eau 1.000 mi 5.3.3.1.3 Préparation Dissoudre les composants dans 'eau bouillante dans ordre suivant: polysorbate 80, octoxynol 9 et lécithine Goeuf jusqu’ dissolution compléte. Dissoudre les autres composents en mélangeant tout en chauffant Répartir le milieu dans des récipients appropriés, Sterliser & autoclave a 121 °C pendant 15 min. Apres stériisation et reffoidissement, le pH doit étre égal a 7,0:0,2, le mesurege étant effectue a température ambiante, 5.3.3.2 Autres milieux liquides d'enrichissement Diautres milieux liquides c'enrichissement peuvent étre utlisés sils sont appropriés (voir Annexe A). 4 (© 1S0 2008 - Tous dros réservésISO 22718:2006(F) 5.3.4 Milieu gélosé sélectif pour isolement de Staphylococcus aureus 83.4.1 Gélose Baird Parker 5.3.4.1.4 Milieu de base 5.3.4.1.1.1 Composition — peptone de caséine 10.09 — extrait de levure 109 — extrait de viande 509 — pyruvate de sodium 10.09 — Loicine 12.09 — chlorure de lithium 5.09 — gélose 12982299 — eau compléter au volume final de 950 mi 53.4.1.1.2 Préparation Dissoudre tous ces composants ou la base compléte déshydratée dans eau a ébulition. Transférer le milcu ar Portions de 100 mi dans des fioles ou flacons de capacité appropriée. Stériiser a autoclave @ 121 °C pendant 15 min, Antes sterilisation et refroidissement, le pH doit @tre de 7,2 + 0,2, le mesurage étant effectué & température ambiante. 53.4.1.2 Solution de tellurite de potassium 53.4.1.21 Composition — tellurite de potassium (K,Te0,) 109 — eau 100 mi 53.41.22 Préparation Dissoudre le tellurte de potassium complétement dans eau en chauffant au minimum. Stérliser par fitration sur des membranes ayant une porosité de 0,22 ym. La solution peut &tre conservée & 3aGz 2 °C Pendant une période maximale de un mois, Rejeter la solution en cas de formation d'un précipts En principe, la poudre se dissout facilement. Sill persiste dans eau une substance blanche incoluble, i convient de rejeter la poucte. 4) En fonction des proprités gélifantes de tagar. 1©1S0 2006 — Tous ait sensISO 22718:2006(F) 5.3.4.1.3 _ Emulsion de jaune d'oeuf (concentration de 20% approximativement ou selon les instructions du fabricant) Si Ton ne dispose pas d'une préparation commerciale, préparer le miliou de ia fagon suivante. ic jaune dune motte de coquille dans Fautre, et ce plusieurs fois de suite, Mettre les jaunes dane ure fs Sterile et sjouter quatre fois leur volume c'eau sterile. Bien mélanger. Chauffer ce mélange 47 °C pendent 2) et le laisser reposer pendant 18h @ 24h a 3°C+2°C pour quun précipilé se forme. Reever aseptiquement le surnageant et le transférer dans une fiole sterile fraiche en vue de son utilisation Lemulsion peut étre conservée 4 3 °C +2 °C pendant 72h au plus 6.3.41.4 Milieu complet 5.3.41.4.1 Composition — milieu de base (6.3.4.1.1) 100 mi — Solution de tellurte de potassium (5.3.4.1.2) 1,0 — émuision de jaune d'oeuf (5.2.4.1.3) 5.09 5. 42 Préparation Fara fondre le milieu de base (5:3.4.1.1), pus le laisser efroidir usqu‘a environ 47 °C, Dans des conditions Ssentques, ajouter les deux autres solutions (5.3.4.1.2 et 5.3.41.3) préalablement chautfées & 47 °C, en mélangeant bien aprés chaque ajout 5.3.4.2 Autres milieux gélosés sélectifs ‘Qutres milieux gélosés sélectifs peuvent étre utlisés (voir Annexe A), 6 Appareillage et verrerie equipement de laboratoire, fappareillage et la verrerie sont décrits dans ISO 21148. 7 Souches de microorganismes Pour la validation des conditions d'essai, on utlise la souche représentative suivante: — Staphylococcus aureus ATCC?) 8538 (souche équivalente: CIPS) 4.83 ou NCIMB*) 9516), Fe onvient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le foutnisseur de la souche de référence, Le souche peut étre conservée en laboratoire conformément 4 IEN 12353 2) ATCC: American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types) 3) CIP: Collection de rinstitut Pasteur 2 NCIMB: National Collection of industrial and Marine Bacteria (Collection natonale de bactérios industieles et marines), 6 ©180 2006 Tous drote réservésISO 22718:2006(F) 8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire Si nécessaire, stocker les produits 4 soumettre a essai a température ambiante Ne pas incuber, réfrigérer ou congeler les produits (3.1) et échantilons (3.2) avant ou aprés analyse. Heonvient deffectuer "échantilonnage des produits cosmétiques a analyser conformément & la description donnée dans ISO 21148. Analyser les échantilons selon la description donnée dans ISO 21140 at conformément au mode opératoire suivant, 9 Mode opératoire 9.4 Recommandations générales Liiiser du matériel et des équipements stérles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer TSchantilon, la suspension initiale et les dilutions. En cas de préparation de la suspension intiale dane un agent solubilisant appropri, le temps écoulé entte la fin de la préparation et le moment ou inoculum entre en contact avec le milieu liquide denrichissement ne doit pas dépasser 45 min, sauf indications particuléres mentionnées dans la documentation ou les protocoles établis. 9.2 Préparation de la suspension initiale dans le milieu liquide d'enrichissement 924 Généralités Lenrichissement est préparé a partir dun échantiion (3.2) d'au moins 1g ou 1 ml du produit soumis a essai Préalablement mélangé avec soin, qui est dispersé dans au moins 9 mi de milieu liquide fenrichissement Noter, 5, le volume ou le poids exact de Féchantillon, || faut verifer la métnode pour s‘assurer que la composition (avec ajout éventuel de neutralisant) et le volume du bouillon donnent des résultats salisfaisants (voir 11.3), seme immeans certains cas et lorsque cela est réalisabl, ta fitration du produit cosmétaue sur une membrane qui est ensuite immeraée dans le mile lnuide denrchissement faite la neutralsation des propriétés antimcrobionea ac produit (voir 11.3), 9.2.2 Produits miscibles a l'eau Transférer léchantilon de produit, 6, dans un récipient approprié contenant un volume adéquat de bouillon 9.2.3 Produits non miscibles a eau Transférer échantilon de produit S. dans un récjpient approprié contenant une quantité adéquate agent solubilisant (par exemple polysorbate &0). Répartir féchantilon dans fagent solubilisant et ajouter un volume adéquat de bouillon 9.2.4 Produits filtrables Utiiser une membrane fitrante ayant une porosité nominale inférieure ou égale & 0,45 pm. Transférer Téchantilon, 5, sur a membrane d'un appareil de firation (voir ISO 21148). Fitter imm&diatement et laver la membrane en utilisant des volumes définis d'eau etiou de diluant, Transtérer et immerger la membrane dans un tube ou une fiole de dimension appropriée, contenant un volume adéquat de bouillon, (2180-2006 — Tous droits réservésIso 22718:2006(F) 9.3. Incubation du milieu liquide d'enrichissement ensemencé Incuber la suspension initiale préparée dans le milieu liquide (voir 9,2) & 32,5 °C 42,5 °C, pendant au moins 20 h (durée maximale 72 h), 9.4 Détection et identification de Staphylococcus aureus 9.4.1 Isolement A Taide dune anse stérile, étaler par stries une aliquote du milieu liquide d'enrichissement incubé a la surface de la gélose Baird Parker en vue dobtenir des colonies isolées Retourner la boite de Pétri et incuber & 32,5 °C + 2,5 °C, pendant au moins 24 h (durée maximale 48 h). Verifier la présence de colonies caractéristiques (Tableau 1), Tableau 1 — Caractéristiques morphologiques de Staphylococcus aureus sur milieu sélectif Milieu sélecti. ‘Aspact des colonies de Staphylococcus aureus ] geIose Baird Parker Colonies noires et brilantes, entourées dun halo clair (de 2 mm & 5 mm) 8.4.2 Identification de Staphylococcus aureus 9.4.24 Généralités Provéder aux essais suivants pour les colonies suspectes isolées sur gélose Baird Parker. La présence de ‘Staphylococcus aureus peut étre confirmée par dautres essais culturaux ou biochimiques appropriés. 94.2.2 Coloration Gram Cet essai est décrit dans ISO 21148, Verifier la présence de cocci a Gram positif en grappes 94.2.3 Recherche de la catalase Cet essai est décrit dans ISO 21148, Verifier sila recherche de la catalase est positive, 9.4.2.4 Recherche dela coagulase A side dune anse dlensemencement, transférer des colonies suspectes représentatives bien isolées de la surface de la gélose Baird Parker dans des tubes stériles contenant chacun 0,5 mi de plasma de mammiféres, de préférence lapin ou cheval, avec ou sans additfs appropriés Incuber a $7 °C +2 °C et examiner les tubes au bout de 3h, 4 h, 6 h et jusqu'a 24 h sil nly a pas coagulation dans les 6 h, sauf spécification contraire donnée par le fabricant. Toute coagulation positive survenue dans les 24 h doit étre confirmée, Soumettre & essai et en méme temps que les colonies suspectes, des témoins en se conformant aux recommandations du febricant, Verifier sila recherche de la coagulase est positive. 8 © 1S0 2006 ~ Tous droite réservésISO 22718:2006(F) 10 Expression des résultats (détection de Staphylococcus aureus) Si identiication des colonies confirme la présence de cette espéce, exprimer le résultat sous la forme: Présence de Staphylococcus aureus dans échantillon, Si fon nobserve pas de croissance aprés l'entichissement et/ou si identification des colonies ne confirme as la présence de cette espace, exprimer le résultat sous la forme: ‘Absence de Staphylococcus aureus dans léchantilon, S. 11 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit 11.1 Généralités Les différents essais décrits ci-dessous démontrent que le microorganisme peut se développer dans les conditions de ranalyse. 11.2 Préparation de l'inoculum Avant lessai, ensemencer la surface de la gélose tryptone-soja ou tout autre milieu approprié (non sélectif et on neutralisant) avec Staphylococcus aureus (voir Article 7). Incuber la bolte & 32,5 °C +2,5°C, pendant 18h 24h, Uliliser une anse stérile pour récoiter la culture @ la surface du milieu, Mettre en suspension dans le diluant (8.2) pour obtenir une suspension ajustée titrant environ 1x 108 UFC par mi (par exemple en utilisant un spectrophatomatre) voir ISO 21148:2005 (Annexe C), Utliser cette suspension ajustée et ses dilutions dans un délai maximal de 2 h. 11.3 Validation de la méthode de recherche 3 1 Mode opératoire 14.3.4.1 Dans des tubes contenant 8 mi de diluant, préparer une dilution de la suspension ajustée en vue dlobtenir entre 100 UFC et 500 UFC par ml. Pour dénombrer la concentration finale en microorganismes viables dans fa dilution, transférer 1 ml de cette dilution dans une boite de Pétri et verser de 15 ml a 20 mi du milieu gélosé en surfusion maintenu dans un bain-marie & une température ne dépassant pas 48°C. Laisser solidifier, puis incuber a 32,5 °C + 2,5 °C, pendant 20 h A 24 h, 11.3.1.2 Préparer en double la suspension initiale dans les conditions choisies pour "essai (au moins 1g ou 1 mi de produt soumis & essai, volume défini de milieu liquide d'enrichissement) dans un tube ou une fiole. Sion utilise la méthode de fitration sur membrane, fitrer en double au moins 1 ml de produit soumis 4 essai et transférer chaque membrane dans un tube ou une fiole contenant le milieu liquide d'enrichissement dans les conditions choisies pour lessai 11.3.1.3, Dans des conditions aseptiques, introduire 0,1 ml de la dilution de la suspension ajustée (1.3.1.1) de microorganismes dans 'un des deux tubes ou fioles (essai de validation). Mélanger, puis incuber les deux tubes ou fioles (essai de validation et témoin non ensemeneé) & 32,5 °C #2,5°C, pendant 20h 2 24h, 11.3.1.4 Procéder & un isolement pour chaque tube ou fiole (essai de validation et témoin non ensemencé). A Taide dune anse stérile, prélever une aliquote (mémes conditions que lors de lessai) du mélange incubé et ensemencer par stries la surface de la bolte de Pétri (diamétre 85 mm & 100 mm) contenant approximativement de 15 ml a 20 mi de gélose Baird Parker. Incuber les boites @ 325°C +25 °C. Pendant 24h a 48 h. 180 2008 ~ Tous seis réservésISO 22718:2006(F) 11.3.2 Interprétation des résultats de validation Verifier que la dilution de la suspension ajustée (11.3.1.1) de bactéries contient entre 100 UFC et 500 UFC ar ml La neutralisation et la méthode de recherche sont validées si fon constate un développement caractéristique de Staphylococcus aureus dans Ia boite de validation et labsence de développement dans la boite témoin. Quand on observe un développement dens la boite témoin (produits contaminés), la neutralisation et la méthode de recherche sont validées si fon ratrouve Staphylococcus aureus dans la boite de validation, Llabsence de développement dans jes boites de validation indique quill subsiste une activité antimicrobienne et quil est nécessaire de modifier les conditions de la méthode, en augmentant le volume de bouillon nutritif (la quantité de produit restant la méme), ou en incorporant une quantie suffisante c'agent inactivant dans le milieu liquide denrichissement, ou encore en combinant ces modifications, de fagon a permettre le développement de Staphylococcus aureus. i, malgré introduction d'agents inactivants appropriés et une augmentation substantielle du volume de bouillon, il reste impossible d'obtenir des cultures viables comme décrt plus haut, indiquer que le produit cosmétique n'est pas susceptible d'étre contaminé par Staphylococcus aureus, 12 Rapport d'essai Le rapport d'essai doit spécifier les informations suivantes: 2) toutes les informations nécessaires Identification compléte du produit; b) laméthode utlisée; ©) les résultats obtenus; 4) tous les détails opératoires pour la préparation de la suspension initiale; @) la description de la méthode, avec les neutralisants et milieux utilisés; f) _lavalidation de la méthode, méme si fessai a été réalisé séparément; 9) tout point non spécifié dans le présent document ou proposé comme une option, ainsi que des précisions concernant les incidents ayant pu infuer sur les résultats, daivent étre rapportés. 10 © 180 2006 ~ Tous droits eservesAnnexe A (informative) Autres milieux Al Autres milieux d'enrichissement A.11 Milieu liquide hydrolysat de caséine-soja A411 Composition — digestion papaique de peptone de soja digestion pancréatique de caséine chlorure de sodium eau AAA.2 Préparation 1509 509 1.000 mi ISO 22748:2006(F) Dissoudre ces composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau en chauffant si nécessaire. Stérliser & autoclave & 121 °C pendant 18 min Aprés stérlisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,3 + 0.2, le mesurage étant effectué température ambiante, Répattir le milieu dans des récipients appropriés, AY 2 Bouillon neutralisant DIE (bouillon neutralisant de Dey/Engley) (71 A424 Composition ©0180 2006. glucose lécithine de soja thiosulfate de sodium pentahyarate polysorbate 80 digestion pancréatique de caséine bisulfite de sodium extrait de levure thioglycolate de sodium Violet de bromocrésol eau ous diols reserves 10.06 708 609 509 509 259 289 109 0.029 1000 mi "Iso 22718:2006(F) AA.2.2 Préparation Dissoudre tous ces composants ou le milieu complet déshycraté successivement dans l'eau bouillante jusqu’a dissolution complete. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser a fautoclave a 121°C pendant 15 min Aprés stérilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,8+0,2, le mesurage étant effectué a température ambiante. A.1.3 Bouillon Letheen modifié A134 Composition — digestion pepsique de viande 20,09 — digestion pancréatique de caséine 5.09 — extrait de boeuf 5.09 — extrait de levure 2.09 — Keithine arg — polysorbate 80 509 — chlorure de sodium 50g — bisulfite de sodium O19 — eau 1000 mi AA32. Préparation Dissoudre successivement dans l'eau bouillante le polysorbate 80 et la Iécithine jusqu'a dissolution compléte. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant. Mélanger doucement pour éviter toute formation de mousse. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stérilser @ fautoclave & 121°C pendant 15 min, Aprés stérilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,2 +: 0,2, la mesure étant effectuée a la temperature ambiante. A.2 Autres milieux gélosés sélectifs A.2.1 Gélose Mannitol-sel (gélose Chapman) A.24.4. Composition — extrait de boeuf 109 — digestion pancréatique de caséine 5.09 — digestion pancréatique de boouf 5.09 — chlorure de sodium 75,09 — Demannito! 10.09 — gélose 15.09 12 {© 180 2008 ~ Tous eros reservesISO 22718:2006(F) — rouge de phénol 0,028 g — eau 1000 mi Al 2 Préparation Métanger, chauffer en agitant souvent et laisser boullir pendant 1 minute pour dissoudre. Répartic comme i convient, puis stériliser. aereaaetlsation t refroidssement, le pH dott etre de 7.4 +0,2, le mesurage étanteffectué a température ambiante, A.2.2 Gélose Vogel-Johnson A221 Composition — digestion pancréatique de caséine 10,09 — extrait de levure 50g — mannitol 10.09 — phosphate de potassium dibasique 5.09 — chlorure de lithium 509 — glycine 10.09 — gélose 16.09 — rouge de phénol 0,025 g — eau 4.000 mi A222 Préparation Dissoudre les composants et faire boul la solution pendant 1 minute. Stériser, faire refroidit a une fempérature comprise entre 45 °C et 50 °C, puis ajouter 20 ml de solution de tellurte de potaesiam cleric. sees usation et refreisissement, le pH doit etre de 7.20.2, la mesure étant effectuée a la température ambiante, 13 (© 180.2006 ~ Tous dros reservesISO 22718:2006(F) Annexe B (informative) Neutralisants de I'activité antimicrobienne des conservateurs et liquides de rincage Conservateur ‘Composés chimiques pouvant neutraliser activité antimicrobienne| dos conservatours Exemples de neutralisants adéquats et de Tiquides do rincage (pour les méthodes do filtration sur membrane) Produits phénolques: parabens, Phénoxyéthanol, jphanyletnancl, fanilides te. Lécthine, polysorbate 80, condensat oxyde déthyléne datcools gras tensioactits non ioniques Polysorbate 80, 30 gi + lécithine, 3 gf (Condensat doxyde déthyléne dalcools gras 7 gil lecthine, 20 gi + polysorbate 80, 4 gi Bouillon neutralisant D/E* Liquide de ringage: eau disttée; tryptone, 1 g/|+ NaC9 gf, polysorbate 80, 5 ofl |Ammeniums quaternaires, tensioactifscationiques: Lécithine, saponine, polysorbate 80, Jdodécyisulfate de sodium, condensat Jdoxyde dthyiene d'alcools gras Polysorbate 60, 30 gil + dodecylsulfate de sodium, 4g/\+ lécithine, 3 gl. Polysorbate 80, 30 gf + saponine, 30g/+ tecthine, 3 gf Bouillon neutralisant DIE * Liquide do ringage: eau distilée: typtone, ‘1gll+ NaCl, 9g; polysorbate 89, 5 gi, Alcéhydes, agents |gensrateurs de formaldehyde Glycine, nisticine Lécithine, 3 g/ + polysorbate 80, 30 g/l + L-tistidine, 1 gf. Polysorbate £0, 30 gil + saponine, 30 gf + L-histidine, 1 gl + L-cystéine, 1 oft Bouillon neutralisant DIE ® Liquide de ringage: polysorbate 60, 3 gil + L-nistdine, 0.5 of. lOxydants Thiosulfate de sodium Thiosulfate de sodium, 5 af, Isothiazalinonas, Léctthine, saponine, amines, sulfates, /mercaptans, bisulte de sodium, Liquide de ringage: thiosulfate de sodium, 3 gf Polysorbate 80, 20 gil + saponine, 30 gi + lecthino, 3 gi imidazoles Peer ce erent: Liquide de ringage: tryptone, 1 gil + NaCl, 9 gf polysorbate 80,5 gf. Polysorbate 80, 30 gil+ saponine, 20 gf + Keithine, 3 gi. Biguanides Lécitnine, saponine, polysorbate 80 Liquide de ringage:tryptone, 1 gil + NaCl, 9 gi Polysorbate 80, 5 gf Sels métaliques (Cu, Zn, Hig) organo-mercunels Bisulfite de sodium, L-cysteine, composes sulthydryits, acide thioglycolique Thioglycolate de sodium, 0.5 git ou S gf Leoysigine, 0,8 g/l ou 1,5 gf Bouilon neutralisant DIE ® Liquide de ringage: thioglycolate de sodium, 0.5 ail NOTE Voir Réterenoes [6] 8 [11] dane la Bibiograpie, [+ _Ecuilon neutatsant DIE (Boullon neuraisant de Dey/Engley), vor Annexe A 14 © 180 2008 — Tous cals réservésfo} 2 8) [4] 8) 6 m [8] 19) [10] (ny (©1850 2008 - Tous droits reserss ISO 22718:2006(F) Bibliographie COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, publié par European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association, 1997 CTFA, Microbiology Guidelines, publié par Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association ISBN 1-882621-32-8, 2001 EP, Examen microbiologique des produits non stériies, 4me édition, publié par la Pharmacopée européenne, 2002 FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8° édition, publié par U.S. Food and Drug Administration, 1998, http J/www cfsan fda qov/~ebam/bami-23.htm| J.P 14, General Tests — Microbial Limit test, publié par la Pharmacopée du Japon, 2001 USP 28, Microbial Limit test (61), publié par la Pharmacopée des Etats-Unis, 2005 ATLAS, R.M. Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993, SINGER, S. The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media, Cosmetics and Toiletries, 102, 55, December 1987 180 21149, Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des bactéries aérobies mésophiles ISO 18415, Cosmétiques — Microbiologie — Détection des _micro-organismes —spécitiés (Staphylococcus aureus, Escherichia Col, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans) el des micro. organismes non spécifiés EN 1040, Antiseptiques ot désinfectants chimiques — Activité bactéricide de base — Méthode d'essai et prescriptions (phase 1) 15