NM ISO 21150 Norme Marocaine 2008 Indice de classement NM 03.5.148 Cosmétiques Microbiologie Détection d’Escherichia coli Norme Marocaine homologuée Par arrété du Ministre de Industrie, du Commerce et des Nouvelles Technologies N° 2736-07 du 7 Janvier 2008, publié au B.O n° $606 du 21 Février 2008. Correspondance La présente norme reprend intégralement la norme ISO 2150/2006 + Rectificatif technique 1/2006. Modifications Examinée et adoptée par le comité technique de normalisation des produits d’hygiéne, de nettoyage et de désinfection Editée et diffusée par le Service de Normalisation Industrielle Marocaine (SNIMA) © SNIMA 2008 ICS : 71.10.70NM ISO 21150 2008 Indice de classement NM 03.5.148. A Droits d'auteur Droit de reproduction réservés sauf prescription différente aucune partie de cette publication ne peut étre reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé électronique ou mécanique y compris la photocopie et les microfilms sans accord formel. Ce document est & usage exclusif et non collectif des clients de I'IMANOR, Toute mise en réseau, reproduction et rediffusion, sous quelque forme que ce soit, méme partielle, sont strictement interdites. Angle Avenue Kamal Zebdi et Rue Dadi Secteur 21 Hay Riad - Rabat @IMANOR 2016 ~ Tous droits réservés Tel :05 37 57 19 48/43/51/52 Fax : 08 37 71 17 73 Email: normalisation@imanor.gov.maNORME INTERNATIONALE iSO 21148:2005, RECTIFICATIF TECHNIQUE 1 Publié 2008-11-01 Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques RECTIFICATIF TECHNIQUE 1 Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination TECHNICAL CORRIGENDUM 1 Le Rectiicatif technique 1 a FISO21148:2005 a été élaboré par le Comité technique ISO/TC 217 Cosmétiques. Page 5, paragraphe 4.13 c) Remplacer ade 85 mm et 100 mm» par «de 85 mm & 100 mm». :2006(F) ICS 07.100.99; 71.100.70 Réf. n® ISO 21148:2006/Cor. 8180 2008 ~ Tous srots reserves Pubié en SuisseISO 21150:2006(F) Sommaire Page Avant-propos. wiv Introduction... 1 Domaine d'application Références normatives .. Termes et définitions... Principe. Diluants et milioux de culture.. Généralités Diluant pour la suspension bactérienne (Solution typtonese) Milieux de culture... Appareillage et verrerie.... Souches de micro-organismes ... Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire Mode opératoire.. 9.1 Recommandations générales.. 9.2 Préparation de la suspension initiale dans le milicu liquide de 9.3 Incubation du milieu liquide d'enrichissement ensemencé... 9.4 Recherche et identification d'Escherichia coli 10 Expression des résultats (recherche d'Escherichia coll) 11, _ Noutralisation des propriété antimicrobionnes du produit 114 Généralités 44.2. Préparation de inoculum. 11.3. Validation de la méthode de recherche, 12 Rapport d'essai Annexe A (informative) Autres milieux liquides d'enrichissement. Annexe B (informative) Neutralisants de l'activité antimicrobienne des conservateurs et liquides de ringage.. Soe 7 = Bibliographie. (© 150 2006 ~ Tous droits réservés iISO 21150:2006(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale diorganismes nationaux de normalisation (comités membres de I!SO). elaboration des Normes internationales est en général confige ‘aux comités techniques de I'\SO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique créé a cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec 'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concemne la normalisation électrotechnique. Les Normes internationales sont rédigées conformément aux regies données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tache principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert ‘approbation de 75% au moins des comités membres votants, attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire fobjet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait étre tenue pour responsable de ne pas avoir identife de tols droits de propriété et averti de leur existence. LISO 21150 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques. (©150 2006 — Tous diols servesISO 21150:2006(F) Introduction Les examens microbiologiques des produits cosmétiques doivent étre réalisés conformément & une analyse de risque appropriée afin de garantir leur qualité et la sécurité des consommateurs, Lanalyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramétres tels que les suivants: — altération potentielle des produits cosmétiques; — le caractére pathogene des micro-organismes; — le site c'application du produit cosmetique (cheveux, peau, yeux, muqueuses, etc.): — lacatégorie dlutilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans, etc.) Pour les cosmétiques et d'autres produits topiques, la recherche d'agents pathogénes pour la peau, tels que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans peut étre justifiée. La recherche dlautres sortes de micro-organismes peut aussi présenter de linterét, car ceux-ci (y compris des indicateurs de contamination fécale, par exemple Escherichia coll laissent penser a une défaillance de 'hygiéne au cours du processus de fabrication. (0180 2006 — Tous dit reservesNORME INTERNATIONALE ISO 21150:2006(F) ie — Détection d'Escherichia coli Cosmétiques — Microbi 4 Domaine d'application La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour la recherche et identification du micro-organisme spécifié Escherichia coli dans les produits cosmétiques. Les micro-organismes Considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer d'un pays @ un autre, suivant les pratiques ou les réglementations nationales. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conselié deffectuer une analyse appropriée du risque microbiologique afin de determiner les types de produits cosmétiques qui relevent de la présente Norme intemationale, Les produits dont on considere quills présentent un faible risque Mnicrobiologique comprennent ceux ayant une faible activité de eau, les produits hydro-alcooliques, ceux ayant des valeurs de pH extremes, etc La présente Norme internationale spécifie une méthode basée sur la recherche d'Escherichia coli dans un milieu liquide non sélectt (milieu liquide c'enrichissement), suivie de Tisolement du micro-organisme sur un mnilieu gélosé sélectif. D’autres méthodes peuvent étre appropriées en fonction du niveau de recherche requis. NOTE Pourla recherche ¢ Escherichia col, il est possible de réaliser des subcultures sur des miieux de culture non ‘elects avent de procéder aux étapes appropriges didentiication (en utilisant, par exemple, des kits didentiication} En raison de la grande variéte de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d'application, la presente méthode pourrait ne pas étre, en tout point, adaptée a certains produits (par exemple a certains produits non miscibles dans l'eeu). D'autres Normes internationales peuvent étre plus adeptées. D'autres méthodes (par exemple automatisées) peuvent se substituer aux essais présentés ici, sous réserve que leur equivalence ait été démontrée ou que la methode ait été validée par ailleurs. 2. Références normatives Les documents de référence suivants sont indispensables pour 'application du présent document, Pour les réferences datées, seule lédition citée s'applique. Pour les références non datées, la demiére écition du document de référence (y compris les éventuels amendements) s‘epplique. 180. 21148:—"), Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques 3 Termes et définitions Pour les bescins du présent document, les termes et definitions suivants s'appliquent. 34 produit portion d'un produit cosmétique identifi, regue au l2boratoire pour essais 1) A pubtier. (©180 2006 ~ Tous droitsIso 21160: 32 échanttillon Portion du produit (au moins 1 g ou 1 mi) utlisée dans essai pour préparer la suspension initiale 33 suspension initiale suspension (ou solution) de 'échantion dans un volume défini d'un milieu liquide d'enrichissement approprié 34 dilution(s) de I'échantition dilution(s) de la suspension initiale 35 micro-organisme spécifié bactérie aérobie mésophile ou levure dont la présence dans un produit cosmétique est indésirable parce Quelle peut causer des infections de la peau ou des yeux ou peut éire reconnue comme un indicateur de defaillance de hygiéne dans le processus de fabrication 36 Escherichia coli bacille Gram négatif, mobile, en colonies lisses NOTE 1 Les principales caractéristques pour Iidentifcation sont les suivantes: catalase positive, oxydase négative, fermentation du lactose, production dindole, croissance sur milieu sélect# contenant des sels bilaires avec des colonies caracteristques. NOTE2 Escherichia col peut étre isolé a parir de sources envronnementales humides (sit, eau, sol) et cest un Indicateur de contamination fécae, 37 milieu liquide d'enrichissement milieu liquide non sélectif contenant des neutralisants et/ou des agents dispersants appropriés, validé pour le produit en essai 4 Principe La premiere étape du mode opératoire est de procéder a lenrichissement en utilisant un milieu liquide non sélectif pour augmenter le nombre de micro-organismes sans risque diinhibtion par les ingrédiants sélecti's qui sont présents dans les milieux de culture sélectifs/différentiels. La seconde étape de essai (isolement) est réalisée sur un milieu sélectif, avant les essais didentification. inhibition potentielie de ta croissance microbienne par léchantillon doit étre neutralisée pour permettre la recherche des micro-organismes viables (1. Dans tous les cas et quelle que soit la méthode employee, la neutralisation des propriétés antimicrobiennos du produit dot étre verifiée et validée (6117118) 5 Diluants et milieux de culture 5.1 Généralités Utiliser les instructions générales données dans ISO 21148. Lorsque le présent document mentionne ‘utiisation d'eau, utliser de l'eau distilée ou de eau punifée telle que spécifiée dans ISO 21148, Le milieu liquide denrichissement est utlisé pour disperser 'échantillon et pour augmenter la population microbienne initiale. |! peut contenir des neutralisants si 'échantilon a soumettre a essal posséde des Propriétés antimicrobiannes. L'efficacité de la neutralisation doit étre démontrée (voir Article 11). L’Annexe B Tournit des informations relatives aux neutralisants appropriés, 2 (© 150 2006 ~ Tous droits réservésISO 21150:2006(F) Le milieu liquide denrichissement suivant est adapté pour vérifier le présence d'Escherichia coli conformément a la présente Norme internationale, & condition d'avoir été validé conformément a lAricle 11 Diautres diluants et milieux de cuiture sont utilsables si leur aptitude a 'emploi a été démontrée, 5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (Solution tryptone-sel) Le diluant est utilisé pour préparer la suspension bactérienne utilisée pour la validation (voir Article 11) 52.4 Composition Tryptone, digestion pancréatique de caséine 109 Chlorure de sodium 859 Eau 1.000 mi 5.22 Préparation Dissoudre les composants dans eau en mélangeant tout en chautfant. Répartir dans des récipients appropriés. Steriiser @ autoclave 8 121 °C pendant 15 min, Aprés sterilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,0 + 0,2, le mesurage étant effectué a la température ambiante. 5.3 Milieux de culture 534 Généralité Les milieux de culture peuvent étre préparés comme indiqué ci-dessous, ou a partir de milieux de culture déshydratés conforméement aux instructions du fabricant. Il convient de suivre les instructions données par le fournisseur de ces milieux. NOTE _ILest possible duiliser des mileux préts & Temploi quand leur composition et/ou lours performances de croissance sont comparables & celles des formules indiquées ici 5.3.2 Milieu gélosé pour validation [milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja (SCDA) 0u gélose trypto-caséine soja (TSA)] 5.3.2.4 Composition Peptone pancréatique de casdine 1509 Peptone papaique de soja 509 Chilorure de socium 509 Gélose 1509 Eau 4000 mi 8 2 Préparation Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients appropriés. Stériliser & autoclave 8 121 *C pendant 15 min. 180.2006 ~ Tous crots eoservéeISO 21150:2006(F) Aprés sterilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7.3 + 0,2, le mesurage étant effectué a la température ambiante, 5.3.3 Ml 6.3.34 53.3.1 ieu liquide d'enrichissement Bouillon Eugon LT 100 Généralités Ce milieu contient — des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans Téchantillon: lécithine et polysorbate 80, et — un agent dispersant: octoxynol 9. 53.312 Composition Peptone pancréatique de caséine Peptone papaique de soja Leoystine Chiorure de sodium Sulfite de sodium Glucose Lécithine d'ceut Polysorbate 60 Octoxynol 9 Eau 53.3.1.3 Préparation 15.09 509 079 409 029 559 109 5.09 109 4.000 mi Dissoudre successivement dans l'eau bouillante le polysorbate 80, l'octoxynol 9 et la lécithine d'couf jusqua dissolution complete. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant. Répattir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser a autoclave 4 121°C pendant 15 min. Aprés stéfilisation et reffoidissement, le pH coit étre de 7,1+0,2, le mesurage étant effectué a la température ambiante. 63.3.2 Autres milieux liquides d'enrichissement Diautres milieux liquides d'enrichissement peuvent étre utiisés sis sont appropriés (voir Annexe A), 5.3.4 Miliou gélosé sélectif pour isolemont d'Escherichia coli 53.4.1 63.444 Gélose MacConkey Composition Digestion pancréatique de gélatine 17.09 © 180 2008 Tous droits réservésDigestion pancréatique de caséine 189 Digestion pepsique de tissu animal 159 Lactose 10,09 Mélange de sels biliaires 189 Chlorure de sodium 5.09 Gélose 13,59 Rouge neutre 30,09 Cristal violet 4,0 mi Eau 1.000 mi 3.4.1.2 Préparation Dissoudre tous les composants solides dans l'eau et faire bo Répartir dans des récipients appropriés et stériiser 4 121 °C pendant 15 min 1SO 21150:2006(F) ilir pendant 1 min pour dissoudre ‘Apras sterilisation ot refroidissement, le pH doit étre de 7,1 + 0,2, le mesurage étant effectue a la temperature ambiante, 53.5 Miliou gélosé sélectif pour confirmation de la présence d'Escherichia coli 53.5.1 Gélose de Lovine a 'éosino ot au blou de méthyléne 5.3.5.1.1 Composition Digestion pancréatique de gétatine 10.09 Dihydrogénophosphate de potassium (KHPO,) 2.09 Gélose 15,09 Lactose 10.09 Eosine Y 400 mg Bleu de methyléne 65mg Eau 1.000 mi 5.3.5.1.2 Préparation Dissoudre a digestion pancréatique de gélatine, le phosphate de potassium dibasique et la gélose dans reau tout en chauffant, puis laisser refroidir. Juste avant utlisation, faire fondre le gel de gélose, ajouter les ingrédients restants sous forme de solutions, dans les quantités suivantes, et mélanger: pour chaque 100 mi de gélose fondue — Smldune solution de lactose 20 %, — 2mldune solution diéosine ¥ a 2%, et — 2 ml dune solution de bleu de méthyléne a 0,033 %, (© 180 2008 - Tous droits réservésISO 21150:2006(F) Ise peut que le milieu fini ne soit pas limpide, Répartir dans des récipients appropriés et stérliser & 121 °C pendant 15 min. Aprés stérilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,1 + 0,2, le mesurage étant effectué a la température ambiante, 6 Appareillage et verrerie equipement de laboratoire, lappareiliage ot Ia verrerie sont décrits dans ISO 21148. 7 Souches de micro-organismes Pour la validation des conditions dessai,ulliser la souche représentative suivante: Escherichia coli ATCC?) 8739 {souche équivalente: CIPS) 53.126 ou NCIMB4) 8545 ou NBRC®) 3972 ou KCTC®) 2571 ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale} Il convient de reconstituer la culture conformement aux méthodes indiquées par le fournisseur de la souche de référence, La souche peut étre conservée au laboratoire conformément a EN 12353 [4 8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire Si nécessaire, stocker les produits 8 soumettre a essai la température ambiante. Ne pas incuber, refrigerer ou congeler les produits (3.1) et les échantilons (3.2) avant ou aprés analyse. Effectuer féchantilonnage des produits cosmétiques conformément ISO 21148. Analyser les échantillons conformément a ISO 21148 et selon le mode opératoire décrt a !Avticle 9 9 Mode opératoire 9.1 Recommandations générales Utiser du matériel et des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer "échantilon, la suspension initiale et les dilutions. En cas de préparation de la suspension initiale dans un agent solubilsant approprié, le temps écoulé entre la fin de la préparation et le moment oi linoculum entre en contact avec le milieu liquide dienrichissement ne doit pas dépasser 45 min, sauf indications particuliéres mentionnées dans la documentation ou dans les protocoles établis 2) ATCC: American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types). 3) CIP: Collection de rinsttut Pasteur 4) NCIMB: National Collection of Industrial end Marine Bacteria (Collection nationale de bactéries industieles et marines). 5) NBRC: National Biological Resource Center (Centre de national de ressources biologiques), 8) KCTC: Korean Collection for Type Culture (Collection coréenne de cultures types) 6 (© 150 2008 - Tous arts reservesISO 21150:2006(F) 9.2 Préparation de la suspension initiale dans le milieu liquide d'enrichissement 924 Généralités Lenrichissement est préparé a partir d'un échantilon (3.2) d'au moins 1 g ou 1 mi du produit soumis a lessai préalablement mélangé avec soin, qui est dispersé dans au moins 9 ml de milieu liquide d'enrichissement Noter Sle volume ou la masse exact(e) de léchantillon, La méthode doit étre veriiée pour s'assurer que la composition (avec ajout éventuel de neutralisent) et le volume du bouillon donnent des résultats satisfaisanis (voir 11.3) NOTE __Dans certains cas et lorsque cela est réalisable, la filtration du produit cosmetique sur une membrane qui est ensuite immergée dans le mileu liquide denrichissement faciite la neutralisation des proprités antimicrobiennes du produt (voir 11.3). 9.2.2 Produits miscibles dans l'eau Transférer l'échantillon $ de produit dans un récipient approprié contenant un volume adéquat de bouillon (633), 9.2.3. Produits non miscibles dans "eau Transférer l’échantillon S de produit dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate d'agent solubilisant (par exemple polysorbate 80). Disperser léchantilon dans lagent solubiisant et ajouter un volume adéquat de bouillon (5.3.3) 9.2.4 Produits filtrables Utiliser une membrane fitrante ayant une porosité nominale inférieure ou égale 0.45 um, ‘Transférer léchantillon S surla membrane d'un appareil de fitration (voir ISO 21148). Filtrer immeédiatement et laver la membrane en utilisant des volumes définis d'eau (5.1) et/ou de diluant (5.2) Transférer et immerger la membrane dans un tube ou une fiole de dimension appropriée, contenant un volume adéquat de bouillon (5.3.3), 9.3 Incubation du milieu liquide d'enrichissement ensemencé Incuber la suspension initiale préparée dans le milieu liquide (voir 9.2) & (32,5+ 2,6) °C, pendant au moins 20h (72 h au maximum), 9.4 Recherche et identification d'Escherichia coli 9.4.1 Isolement A Ieide dune anse stérile, étaler par stries une aliquote du milieu liquide dlenrichissement incubé (9.3) a la surface de la gélose MacConkey (5.3.4.1), en vue dobtenir des colonies isolées. Retourer la bolte de Pétri et ncuber & (32,5 + 2,5) °C, pendant au moins 24 h (48 h au maximum), Verifier la présence de colonies caractéristiques (voir Tableau 1) © 180 2008 — Tous crits réservésISO 21150:2006(F) Tableau 1 — Caractéristiques morphologiques d'Escherichia coli sur gélose MacConkey Milieu sélectit Caractéristiques morphologiques de la colonie d'Escherichia coll Gélose MacConkey Rouge brque; paut ire entourée dune zone de bile précipitée, 9.4.2 Identification d'Escherichia coll 9.4.21 Généralités Proceder aux essais suivants pour les colonies suspectes isolées sur la gélose MacConkey. La présence Escherichia coli peut étre confirmée par d'autres essais culturaux ou biochimiques appropriés. 9422 Coloration de Gram Réaliser 'essai déerit dans IISO 21148, Verifier la présence de bacilles & Gram négatif(baciles) 242.3 Culture sur gélose de Levine & léosine et au bleu de méthyléne (gélose EMB) Ensemencer la surface de la gélose EMB avec les colonies suspectes isolées développées sur la gélose MacConkey, de maniére que des colonies isolées se développent. Retourner ia bolte de Petr et incuber & (325+ 2,5) °C pendant au moins 24 h (48 h au maximum) Verifier la présence de colonies caractéristiques telles que spécitiges dans le Tableau 2. Tableau 2— Caractéristiques morphologiques d'Eschorichia coli sur gélose EMB Milieu sélectit Caractéristiques morphologiques de la colonie d’Escherichia coli Gélose EMB Reflets métaliques sous lumiére réfiéchie et aspect bleu-noir sous lumiare transmise 10 Expression des résultats (recherche d'Escherichia coli) Si identification des colonies confirme la présence de cette espéce, exprimer le résultat sous la forme: «Présence d'Escherichia coli dans !'échantillon So, Si Ton n'observe pas de croissance aprés lenrichissement et/ou si lidentification des colonies ne confirme pas la présence de cette espece, exprimer le résultat sous la forme «Absence d Escherichia coli dans léchantillon So, 11 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit 44.1 Généralités Les différents essais décrits en 11.2 et en 11.3 démontrent que le micro-orgenisme peut se développer dans les conditions de analyse. 8 © 180 2008 Tous dots réservésISO 21150:2006(F) 11.2 Préparation de inoculum ‘Avant essai, ensemencer la surface du milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja (SCDA) ou de la gélose tryptone-soja (TSA) (5.3.2) ou tout auire milieu approprié (non sélectif et non neutralisan!) avec Escherichia col. Incuber la boite a (32,5 + 2,5) °C, pendant 18 h 4 24 h Utiliser une anse sterile pour récolter la culture & la surface du milieu. Mettre en suspension dans le diluant (5.2) pour obtenir une suspension ajustée titrant environ 1 x 10® UFC par ml (par exemple en utilisant un spectrophotometre, ISO 21148, Annexe C). Utiliser cette suspension ajustée et ses dilutions dans un délai maximal de 2 h. 11.3 Validation de la méthode de recherche 41.3.1 Mode opératoire 11.3.1.1 Dans des tubes contenant 9 mi de diluant (5.2), préparer une dilution de la suspension ajustée (11.2) en vue d'obtenir entre 100 UFC/ml et $00 UFCiml. Pour dénombrer la concentration finale en micro- organismes viables dans la dilution, transférer 1 mi de cette dilution dans une botte de Pétri et verser de 15 mi 4 20 ml du milieu gélosé en surfusion (6.3.2) maintenu dans un bain-marie a une température ne dépassant as 48 °C. Laisser solidifier, puis incuber a (32,5 + 2,5) °C, pendant 20 h a 24 h. 11.3.1.2 __Préparer en double la suspension initiale (9.2) dans les conditions choisies pour fessai (au moins 1g ou 1 mide produit soumis a essai, volume défini de milieu liquide d'enrichissement) dans un tube ou une ficle. Si 'on utilise a méthode de fitration sur membrane (9.2.4), fitrer en double au moins 1 ml de produit soumis @ lessai et transiérer chaque membrane dans un tube ou une ficle contenant le milieu liquide Genrichissement dans les conditions choisies pour ress 11.3.1.3 Dans des conditions aseptiques, introduire 0,1 ml de la dilution de ta suspension ajustée de micro-organismes dans un des deux tubes ou fioles (essai de validation). Mélanger, puis incuber les deux tubes ou floles (essai de validation et témoin non ensemencé) a (32,5 = 2,5) °C, pendant 20 h 2 24 h. 11.3.1.4Procéder a un isolement pour chaque tube ou fiole (essai de validation et témoin non ensemencé). A Ieide d'une anse stérile, prélever une aliquote (mémes conditions que lors de essai) du mélange incubé sur la surface du milieu gélosé MacConkey (approximativement 15 mi a 20 ml) de la boite de Pétri (diamétre de 8 mm a 100 mm). Incuber les boites a (32,5 + 2,5) °C, pendant 24 h a 48 h. 11.3.2 Interprétation des résultats de validation Verifier que la dilution de la suspension ajustée de bactéries contient entre 100 UFC/ml et 500 UFCiml La neutralisation et la méthode de recherche sont validées si on constate un développement ceractéristique Escherichia coli dans ta boite de validation et absence de développement dans la bolte témoin. Quand on observe un développement dans la botte témoin (produits contamings), la neutralisation et la méthode de recherche sont validées si fon retrouve Escherichia coli dans la boite de validation. Llabsence de développement dans les boltes de validation indique quill subsiste une activité antimicrobienne et quil est nécessaire de modifier les conditions de la méthode, en augmentant le volume de bouillon nutri la quantité de produit restent la méme, ou en incorporant une quentité suffisente d'agent inactivant dans le milieu liquide denrichissement, ou encore en combinant ces modifications, de fagon a permettre le développement d'Escherichia col, i, malgré lintroduction d'agents inactivants appropriés et une augmentation substantielle du volume de bouillon d'enrichissement, il reste impossible dobtenir des cultures viables comme décrit plus haut, indiquer que le produit cosmétique n'est pas susceptible d'étre contaminé par Escherichia col (© 150 2005 Tous date reservesISO 21150:2006(F) 12 Rapport d'essai Le rapport dessai dott spécifir les informations suivantes. 2) une référence @ la présente Norme internationale (ISO 21180:2006) ) toutes les informations nécessaires & lidentification complete du produit; ©) la méthode utilisée; 4) les résultats obtenus; €) tous les détails opératoires pour la préparation de la suspension intial: ) la description de la méthode, avec les neutralisants et les milieux utilisés, 9) lavalidation de la méthode, méme si essai a été réalisé séparément fh) tout point non spécifié dans le présent document ou proposé comme une option ainsi que des précisions concernant les incidents ayant pu influer sur les résultats, 40 {© 1SO 2006 - Tous droits réearvesISO 21150:2006(F) Annexe A (informative) Autres milieux liquides d'enrichissement 1 Milieu liquide lactosé, avec neutralisants et agents dispersants Ce milieu contient — des ingrédients qui neutralisent jos substances inhibitrices présentes dans |'échantilon’ lécithine et polysorbate 80, et — un agent dispersant: octoxynol 9 AAA Composition Extrait de boeuf 3.09 Digestion pancréatique de gélatine 509 Lactose 509 Lecithine d'cout 109 Polysorbate 80 5.09 Octoxynol 9 1.09 Eau 1.000 mi AA.2 Préparation Mélanger dans feau boullante dans ordre suivant: polysorbate 80, octoxyncl 9 et Iécithine d'ceuf jusqu’a dissolution compléte. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chautfant. Répartir le milieu dans des récipients eppropriés. Sterliser & lautoclave @ 121 °C pendant 18 min. Refroidir le milieu aussi rapidement que possible apres stériisation. Le pH doit étre de 6.9 * 0,2, le mesurage étant effectué a la température ambiante. A.2 Milieu liquide lactosé A.2.1 Composition Extrait de boeut 309 Digestion pancréatique de gélatine 5.09 Lactose 5.09 Eau 1.000 mi © 1SO 2006 ~ Tous droits réservés 11ISO 21150:2006(F) A.2.2 Préparation Dissoudre les composants dans l'eau, Réparttir le miliou dans des récipients appropriés. Steriliser & autoclave 8121 °C pendant 15 min, Refroidir le milieu aussi rapidement que possible aprés sterilisation, Le pH doit etre de 6,9 + 0,2, le mesurage étant effectué a la température ambiante, A.3 Miliou liquide tryptone-soja-Iécithine-polysorbate 80 (bouillon SCDLP 80) A3.1 Composition Peptone de caséine 17.09 Peptone de soja 308 Chlorure de sodium 509 Dihydrogénophosphate de potassium 259 Giucose 259 Lécithine 408 Polysorbate 60 709 Eau 4.000 mi A3.2 Préparation Dissoudre tous ces composants ou le milieu complet déshydraté successivement dans teau bouillante jusqu’a dissolution complete, Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Sterliser 4 autoclave 2 121 °C pendant 16 min, Apras sterilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,2 + 0,2, le mesurage étant effectue 3 température ambiante, A.4 Bouillon neutralisant DIE (bouillon neutralisant de Dey/Engley){"" 4.1 Compos Glucose 10.09 Lécithine de soja 709 Thiosulfate de sodium pentahydraté 609 Polysorbate 60 509 Digestion pencréatique de caséine 509 Bisulfite de sodium 289 Extrait de levure 289 Thioglycolate de sodium 1,09 Violet de bromocrésol 0.029 Eau 4.000 mi 12 (© 180 2006 - Tous droits eservesA.4.2 Préparation 1SO 21150:2006(F) Dissoudre tous ces composants ou le milieu complet déshydraté successivement dans feau boulllante jusqu'a dissolution complete. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériiser & autoclave 4 121°C pendant 15 min, Aprés sterilisation et refroidissement, le pH doit étre de 7,6 + 0,2, le mesurage étant effectué & température ambiante. AS Bouillon Letheen modifié A.5.1 Composition Digestion pepsique de viande Digestion pancréatique de caséine Extrait de boeuf Extrait de levure Lécithine Polysorbate 80 Chlorure de sodium Bisulfite de sodium Eau A.5.2 Préparation 2009 509 509 209 o79 509 509 O19 4.000 mi Dissoudre dans eau bouillante et dans ordre suivant le polysorbate 80 et [a lécithine, jusqu’a dissolution compléte. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant, Mélanger doucement pour @viter toute formation de mousse. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Steriliser & autoclave & 121 °C pendant 15 min, Aprés stériisation et refroidissement, le pH doit atre de 7,2 + 0,2, le mesurage étant effectué température ambiante, © 180 2006 ~ Tous orots reserves 413ISO 21150:2006(F) Annexe B (informative) Neutralisants de I'activité antimicrobienne des conservateurs et liquides de ringage ‘Composés chimiques pouvant neutraliser Exomples de neutralisants adéquats ‘et do iquides do ringage®)'"2) Conseratour recive sntnerbionne ‘os conserveeure (pourtes metodo de tat sur membrane) Reais pereimes —‘[eactine Payeotte 6050 gh amine, 39 puatens Poysorate 60 Condensal one dhyne facets gas, 791 eenoneiharch Siodttn! Sons pees 80,4 enone condencat sony Sten sco ras ot pa ” es sseoreemiianschine Bouton reuraisnt OF eae Lid de nage: eau tite; typtone 19 +HlaCl 9g + polysorbate £0, § gt [Ammoniums quateraires Tensioactits cationiques Lécihine, saporine, plyeorbate 6, odécytcitate de codium [condensat eonyde ethylene dalcools aras Polysorbate 60, 0 9h + dodeeyisutate de sodium, 491+ leanne, 39h Poyeorbate 80, 30 gf + saporine, 30 gf+ écthine, 3a ouilon neuralisant DIE® Liquide de ringage: eau ctl; tryptone, 1 of ‘NaCl 9 af ¢polysorbate 80, § of Aldehydes Agents générateurs ae fomalcenyce [Giyeine, histaine ecthine, 991+ polyserbate 80, 80 gf + Livstidine to Polysorbete €0, 30 g + eaponine, 30 gl + L-tstidina, tails Leysteine, tg Bouilon neuraisant DIE® Ligue ae ringage:polyeerbate 80, 3g + L-hstisine, 0591 [Oxyants Thiosutate de sosium Thiosutate de sodium. 5a Liguile de ringage:tiosuifate do soclum, 3.9 eathiazolnones, midazoles Lécthine, saponine Amines, sulfates, mercaptans,bisulte [ae sodium, thigialate de sodium Polysorbate 60, 30 9+ saporine, 39 gf lecthine, Sof Liquid ringage: trypfone, t 9+ NaCl, 997 + polysorbate £0, 5g Piguarides [chine saponine, poysarbate 60 Poysorbate 60, 90 gf + saporine, 80 gf + lechine, 30h Ligue oe ngage: typtone, 1 f+ NaCl, 9g ‘ polysarbate £0, 591 Sele mataligues (Cu, Zn, Hg) Creane-mercuils sui de sodium, Loyseine Composée suhydryiés, acide thioglycolique Thioaiyeoate de sodium, 0. gious gi Leoytine, 0,8 9f ou 15 gt. Boullon neuiralisant DIES Linuile de ningaye:thiogicolate de sodium, 0.5 => uaon ela IE (oullon nels de Ooyrgloy), vi Annee A 14 © 180 2008 Tous dots résenésISO 21180:2006(F) Bibliographic iu ISO 18415:—7), Cosmétiques — Microbiologie — Détection des micro-organismes spécifiés (Staphy- lococeus aureus, Escherichia Col, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans) ef des micro- lorganismes non spéciiés (2) 180.21148:—P, Cosmetiques — Microbiologie — Dénombrement et recherche dle bactéies aérobies mésophiles By) EN 1040:—7), Antiseptiques et désinfectants chimiques — Activité hactéricide de base — Méthode essai et prescriptions (phase 1) [4] EN 12963, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des souches microbiennes utilisées pour a determination de Facivté bactéricide of fongicide [5] COLIPA, Guidetines on Microbial Qually Management, 1997 publié par European Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association (COLIPA) (a) CTFA, Microbiology Guidelines, 2001 publié par Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association ISBN 1-882621-32-8 171 EP, Examen microbiologique des produits non stéiles, 4° édition, 2002 publié par la Pharmacopée européenne [8] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8 édition, 1995 publié par U.S, Food and Drug Administration [8] JP 14, General Tests — Microbial limit test, 2001 publié par la Pharmacopée du Japon [10] USP 28, Microbial lim fost (61), 2005 publié par la Phermacopée des Etats-Unis [11] ATLAS, RIM, Hanabook of Microbiological Moai, CRC Press, !SBN 0-8493-2944.2, 1998 [12] SINGER, S, The Use of Preservative Neutraizers in Diuents and Plating Media, Cosmetics end Toiletries, 102, 55, Décembre 1987 7) A publier. £©180 2006 - Tous droits reserves